CN109182185A - 一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选方法和应用 - Google Patents

一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选方法和应用 Download PDF

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CN109182185A CN201811088917.6A CN201811088917A CN109182185A CN 109182185 A CN109182185 A CN 109182185A CN 201811088917 A CN201811088917 A CN 201811088917A CN 109182185 A CN109182185 A CN 109182185A
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Abstract

本发明涉及一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选方法和应用，属于微生物菌种技术领域。本发明的运动发酵单胞菌菌株其分类命名为(Zymomonas mobilis)ZM4‑3.6M，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号是：CCTCC NO:M 2018561，保藏日期：2018年08月21日。本发明利用传统自然筛选的方法获得了上述菌株，该菌株可以在pH＝3.5的液体培养基中生长，在pH＝3.6的液体培养基中可正常利用葡萄糖生长，生长速度明显增快，利用葡萄糖及酒精生产速度提高，由此可知，本发明的运动发酵单胞菌菌株ZM4‑3.6M是一种应用前景非常广泛的微生物菌种。

Description

一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选 方法和应用
技术领域
本发明属于微生物菌种技术领域，涉及一株运动发酵单胞菌，更具体地说，本发明涉及一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选方法和应用。
背景技术
运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)是发酵单胞菌属的一个种，由于其具有很强的运动性而得名。运动发酵单胞菌为革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，形态成圆端肥粗的杆状细胞，通常成对，较少成短链；Zymomonas mobilis通过Enter-Doudoroff(ED)途径利用葡萄糖、果糖和蔗糖产生乙醇，以利用糖效率高，产乙醇率高，产生的生物量少，乙醇耐受性强，发酵时不需要加氧，耐高渗透压等诸多优点成为生物能源界产乙醇的主要模式菌株之一。但由于在发酵过程中产生一些副产物例如乙酸、乙醛等酸性物质如果不及时排出会导致菌株发酵环境的pH变低，严重影响菌株中酶的活性和细胞膜所带的电荷量，改变菌株细胞膜的通透性，使菌株的代谢受阻，影响发酵的进行。同时，纤维素酒精的生产中，木质纤维素需要经过预处理及酶水解释放出C6及C5单糖用于后续的酒精发酵。但在这个过程中，pH一般也比较低，如果微生物能够耐受低pH，可以降低pH调节所需要的费用，进一步降低纤维素酒精生产成本。因此有必要筛选可以耐受低pH的产乙醇运动发酵单胞菌，对该菌株运用到工业发酵有重要的意义。
基于上述理由，特提出本申请。
发明内容
本发明针对背景技术中所指出的问题及现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株，本发明的另一目的在于提供上述所述耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的分离筛选方法，本发明的还一目的在于提供上述所述耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的应用。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明采用的技术方案为：一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株，其分类命名为：(Zymomonas mobilis)ZM4-3.6M，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO:M2018561，保藏日期：2018年08月21日。
本发明上述所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M还具有如下性质：
1、微生物学特征
运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株是革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，形态成圆端肥粗的杆状细胞，周生鞭毛运动，长宽为1.4～2.0μm×4.0～5.0μm，通常成对，较少成短链，菌株形态如图2所示；所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株适宜的生长温度为30℃，静止培养或者100rpm培养，能耐受的pH的范围在3.5～8之间。
2、rRNA分析
本发明所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株的5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA基因序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。
为了实现本发明的第二个目的，本发明提供上述所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：
(1)将野生型运动发酵单胞菌ZM4在装有RMG5液体培养基中培养至平台期；
(2)将步骤(1)培养至平台期的菌株菌液转移至新鲜的pH＝4的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长到平台期；
(3)重复步骤2，连续传代培养，直至菌株完全适应pH＝4的生长环境；
(4)将步骤(3)获得的适应pH＝4生长环境的菌株菌液分别转移至pH＝3.5和pH＝3.6的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，继续生长至指数期；
(5)将步骤(4)的菌液再分别转移至对应新鲜的pH＝3.5、pH＝3.6的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长至指数期；
(6)重复步骤5，连续传代，直至菌株适应pH＝3.5和pH＝3.6的生长环境；然后将获得的自然筛选的菌株在正常pH的RMG5固体培养基中划线，获得本发明所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M单菌落。
进一步地，上述技术方案所述的RMG5液体培养基配方包括：10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二氢钾、45g/L葡萄糖，所述RMG5液体培养基的pH＝4。
进一步地，上述技术方案所述的RMG5固体培养基配方包括：10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二氢钾、45g/L葡萄糖，1.5％琼脂。
进一步地，上述技术方案步骤(3)所述传代培养的次数为30次。
本发明的第三个目的在于提供上述所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M的应用，所述运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M可应用于乙醇的发酵生产中，所述发酵过程的全部或部分在pH＝3.5～3.6环境下进行。
进一步地，上述技术方案中所述的乙醇发酵生产采用的原料为葡萄糖、果糖或蔗糖。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明利用传统自然筛选的方法获得了能耐受低pH的产乙醇运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M，该菌株在低pH条件下能正常生长和发酵，该菌株可以在pH＝3.5的液体培养基中生长，在pH＝3.6的液体培养基中可正常利用葡萄糖生长，生长速度明显增快，利用葡萄糖及酒精生产速度提高，而野生型菌株在pH＝3.5的RMG5培养基中不生长，在pH＝3.6的培养基中有较长的延迟期；本发明经自然筛选的ZM4-3.6M菌株能在pH＝3.5的RMG5培养基中生长，在pH＝3.6的RMG5培养基中基本没有延迟期。由此可知，本发明的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M是一种应用前景非常广泛的微生物菌种。
附图说明
图1为实施例1中的野生型菌株ZM4经过革兰氏染色后在显微镜下成像10*100的图，图片来源于OLYMPUS显微镜；
图2为实施例1中的ZM4-3.6M经过革兰氏染色后在显微镜下成像10*100的图，图片来源于OLYMPUS显微镜；
图3为实施例2中的野生型菌株ZM4和耐受菌株ZM4-3.6M在pH＝6.2的RMG5中生长的情况图，数据来源于分光光度计；
图4为实施例2中的野生型菌株ZM4和耐受菌株ZM4-3.6M在pH＝6.2的RMG5中生长时葡萄糖的消耗和乙醇的产生情况图，数据来源于HPLC；
图5为实施例2中的野生型菌株ZM4和耐受菌株ZM4-3.6M在pH＝3.8的RMG5中生长的情况图，数据来源于分光光度计；
图6为实施例2中的野生型菌株ZM4和耐受菌株ZM4-3.6M在pH＝3.8的RMG5中生长时葡萄糖的消耗和乙醇的产生情况图，数据来源于HPLC；
图7为实施例2中的野生型菌株ZM4和耐受菌株ZM4-3.6M在pH＝3.5的RMG2中生长的情况图，数据来源于Bioscreen C。
具体实施方式
下面结合实施案例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
实施例1运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M的分离筛选方法。
本实施例的一种运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株是革兰氏阴性、兼性厌氧细菌，形态成圆端肥粗的杆状细胞，周生鞭毛运动，长宽为1.4～2.0μm×4.0～5.0μm，通常成对，较少成短链，菌株形态如图2所示；所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株适宜的生长温度为30℃，静止培养或者100rpm培养，能耐受的pH的范围在3.5～8之间。
本发明上述所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M是通过如下方法进行分离筛选获得的，具体方法如下：
(1)取两颗野生型菌株ZM4(形态如图1所示)在50mL装有40mL pH＝4的RMG5液体培养基(酵母提取物10g/L，磷酸二氢钾2g/L，葡萄糖45g/L)中培养到平台期；
(2)转接菌液到新鲜的pH＝4的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长到平台期；
(3)重复步骤2，一直传代培养，直到菌株完全适应pH＝4的生长环境。
(4)传代30次左右后，将菌液转接到pH＝3.5和pH＝3.6的RMG5液体培养基，使初始OD600nm＝0.1，待其生长到指数期；
(5)转接菌液到新鲜的pH＝3.5和pH＝3.6的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长到指数期；
(6)重复步骤5，一直传代，直到菌株适应pH＝3.5和pH＝3.6的生长环境；
(7)将几种自然筛选的菌株在正常pH的RMG5固体培养基中划线，获得本发明所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M单菌落；
(8)将不同来源的单菌落以及野生型菌株的单菌落在不同pH(pH＝3.5,pH＝3.6,pH＝4,pH＝6四种pH)的RMG5液体培养基中培养；用Bioscreen C仪器测试生长；
(9)比较菌液的生长，选取稳定性较好的菌株再次划线纯化；
(10)每种菌株选取3颗单菌落，用Bioscreen C仪器测试生长；
(11)选取上面的菌株利用摇瓶发酵，记录生长、葡萄糖消耗与酒精生产；
(12)将上述菌株进行基因组测序，具体步骤如下：首先采用超声法Covaris或者Bioruptor将运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M菌株大片段DNA(如基因组DNA、BAC或长片段PCR产物)随机打断并产生DNA片段，然后用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端，再通过3'端加碱基“A”，使得DNA片段能与3'端带有“T”碱基的特殊接头连接，用电泳法选择需回收的目的片段连接产物，再使用PCR技术扩增两端带有接头的DNA片段；最后，用合格的文库进行cluster制备，采用Illumina平台对样品进行测序。该菌的5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA基因序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3所示，其中：PCR扩增采用的上、下游引物序列分别如下：
5S rRNA-F:gcctggcgacgacctac(SEQ ID NO：4)
5S rRNA-R:cttggtggctatagcgtcag(SEQ ID NO：5)
16S rRNA-F:aaaggaggtgatccagccg(SEQ ID NO：6)
16S rRNA-R:agagtttgattctggctcagaac(SEQ ID NO：7)
23S rRNA-F:caaaagcgtgaatagagcaattag(SEQ ID NO：8)
23S rRNA-R:tgaggtaagagcatttggtgg(SEQ ID NO：9)
实施例2运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M的耐受pH性能测试。
(1)将实施例1分离筛选获得的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M与野生型菌株ZM4分别置于pH＝6.2的RMG5培养基中进行培养，将两种菌株的生长情况以及利用葡萄糖产生酒精的情况进行了对比，结果分别如图3、图4和表1所示，可以看出，正常pH培养基中，该菌株和野生型菌株生长基本一致，利用葡萄糖产生酒精也基本一致；其中：所述的RMG5培养基配方包括：酵母提取物10g/L，磷酸二氢钾2g/L，葡萄糖45g/L，用HCl调至pH＝6.2。
表1实施例1分离筛选获得的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M与野生型菌株ZM4在pH＝6.2的RM G5培养基中的生长情况及利用葡萄糖产生酒精情况对比表
(2)将实施例1分离筛选获得的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M与野生型菌株ZM4分别置于pH＝3.8的RMG5培养基中进行培养，将两种菌株的生长情况以及利用葡萄糖产生酒精的情况进行了对比，结果分别如图5、图6和表2所示，可以看出，野生型菌株ZM4在pH＝3.8的液体培养基中生长的延迟期增长，生长速率降低，而本发明的耐受低pH值菌株ZM4-3.6M在pH＝3.8的液体培养基中没有延迟期，本发明的耐受低pH值菌株ZM4-3.6M在18h之内可以利用完所有的葡萄糖产生酒精，而野生型菌株需要在24～48小时内才消耗完葡萄糖生产酒精；其中，RMG5培养基配方同上，仅pH值不同。
表2实施例1分离筛选获得的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M与野生型菌株ZM4在pH3.8的RMG5培养基中的生长情况及利用葡萄糖产生酒精情况对比表
(3)将实施例1分离筛选获得的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M与野生型菌株ZM4分别置于pH＝3.5的RMG2培养基中进行培养，将两种菌株的生长情况以及利用葡萄糖产生酒精的情况进行了对比，结果分别如图7所示，由图7可以看出，野生型菌株ZM4在pH＝3.5的液体培养基中能存活，但无法生长，而本发明实施例1的耐受低pH值菌株在pH＝3.5的液体培养基中基本没有延迟期。其中：所述的RMG2培养基配方具体为：酵母提取物10g/L，磷酸二氢钾2g/L，葡萄糖18g/L，用HCl调至pH＝3.5。
综上所述，对比野生型菌株，本发明的耐受低pH值菌株ZM4-3.6M在低pH下生长有显著优势，适用于工业化推广。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株及其分离筛选方法和应用
<130> 无
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctggcgac gacctactct tccgttgctt aagcaacagt accatcggcg caggacaggt 60
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<210> 2
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cagagccctg tgtttttgct aaacagtcgc taccccctgg cctgtgcccc cttagaatag 1140
ttgcctataa taagggcctc cttcttccga aggtacggag gcaatttgcc gagttccttc 1200
aacacccttc tctcaagcgc cttggtatac tctacctgtc cacctgtgtc ggtttagggt 1260
acggtctata tggagaggct atttcctgga accgcttatg agcatgtcca atccgataag 1320
gacatacaat ttacacgatc cgtcacatct ctccaggtac aggaatatta acctgtttcc 1380
catcgactac ccccttcggg ctcgtcttag gggccgactc accctgcgcg gattagcctt 1440
gcgcaggaac ccttggactt tcggcgatag ggcatctcac cctatttatc gctactcatg 1500
tctgcattcg cacttccgat acctccacag tccattacca gactgcttca caggcttacg 1560
gaacgctccg ctaccactgt tactaatgta acaatcctaa gcttcggtgc atgtcttgag 1620
ccccgttaca tcttcgccgc aaagaccctt atttagacca gtgagctgtt acgctttctt 1680
taaaggatgg ctgcttctaa gccaacctcc tggttgtttt ggggtcttca caagctttcc 1740
cacttagaca tgacttgggg accttagctg taggtcaggg ctgtttccct ctcgacgacg 1800
gaccttagca cccgccgtct gtctcccatg ttaaactcgt tggtattcgg agtttggtta 1860
gatttggtag gtcgcgaaac ccccgcatcc atccagtgct ctacccccaa cggtcatcac 1920
atgaggcact acctcaatag ttttcgcgga gaaccagcta tttcccggct tgattggcct 1980
ttcaccccta aacacagttc atccgataac ttttcaacgt taatcggttc ggacctccag 2040
taagtgttac cttaccttca tcctgaccat gcctagatcg ccgggtttcg ggtctaatgc 2100
atcaaactaa atcgccctat tcagactcgc tttcgctgcg cctacaccta tcggcttaag 2160
cttgcttgat acattaagtc acagacccat tatgcaagag gtacgcagtc aggccttaaa 2220
gaccctccta ctgcttgtaa gcattcggtt tcaggaactg tttcactccc ctaatcgggg 2280
ttcttttcac ctttccctca cggtacttgt tcactatcgg tcatacacga gtatttaggc 2340
ttggagggtg gtccccccat gttcagacaa ggtttcacgt gccccgccct actcaagacc 2400
ttcaatattg ttttaacata cgggactgtc acccactatg gtgtctcttt ccaaagactt 2460
ctgctaacgc aatcaaaggt actggcctac tccgcgttcg ctcgccacta ctaacggaat 2520
ctcggttgat gtcttttcct ccgggtactt agatgtttca gttcgccggg ttcgcttcac 2580
caaagctatg tattcacttt ggtaatatcc ttcccaccta actccgatac tgcagaacaa 2640
tatcgaaatt aaatggtgag gatgggtttc cccattcgga aatctacggg tcaaagattg 2700
ctcacatctc gccgtagctt atcgcagcgt gccacgtcct tcatcgcctg tgtatgccta 2760
ggcatccacc aaatgctctt acctca 2786
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcctggcgac gacctac 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cttggtggct atagcgtcag 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaggaggtg atccagccg 19
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagtttgat tctggctcag aac 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caaaagcgtg aatagagcaa ttag 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgaggtaaga gcatttggtg g 21

Claims (8)

1.一株耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株，其特征在于：其分类命名为：(Zymomonas mobilis)ZM4-3.6M，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCC NO:M 2018561，保藏日期：2018年08月21日。
2.根据权利要求1所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株，其特征在于：所述运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M的5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA基因序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的分离筛选方法，其特征在于：所述方法主要包括以下步骤：
(1)将野生型运动发酵单胞菌ZM4在装有RMG5液体培养基中培养至平台期；
(2)将步骤(1)培养至平台期的菌液转移至新鲜的pH＝4的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长到平台期；
(3)重复步骤2，连续传代培养，直至菌株完全适应pH＝4的生长环境；
(4)将步骤(3)获得的适应pH＝4生长环境的菌株菌液分别转移至pH＝3.5和pH＝3.6的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，继续生长至指数期；
(5)将步骤(4)的菌液再分别转移至对应新鲜的pH＝3.5、pH＝3.6的RMG5液体培养基中，使初始OD600nm＝0.1，待菌液生长至指数期；
(6)重复步骤5，连续传代，直至菌株适应pH＝3.5和pH＝3.6的生长环境；然后将获得的自然筛选的菌株在正常pH的RMG5固体培养基中划线，获得本发明所述的运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M单菌落。
4.根据权利要求3所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的分离筛选方法，其特征在于：所述的RMG5液体培养基配方包括：10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二氢钾、45g/L葡萄糖，所述RMG5液体培养基的pH＝4。
5.根据权利要求3所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的分离筛选方法，其特征在于：所述的RMG5固体培养基配方包括：10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二氢钾、45g/L葡萄糖、1.5％琼脂。
6.根据权利要求3所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的分离筛选方法，其特征在于：步骤(3)所述传代培养的次数为30次。
7.权利要求1所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的应用，其特征在于：所述运动发酵单胞菌菌株ZM4-3.6M可应用于乙醇的发酵生产中，所述发酵过程的全部或部分在pH＝3.5～3.6环境下进行。
8.根据权利要求7所述的耐受低pH的乙醇生产运动发酵单胞菌菌株的应用，其特征在于：所述的乙醇发酵生产采用的原料为葡萄糖、果糖或蔗糖。
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