CN112430549A - 一种生产普鲁兰多糖的天然菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，公开了一种生产普鲁兰多糖的天然菌株及其应用。本发明所述天然菌株保藏编号为CCTCC NO：M 2020207。本发明从我国各地采集的新鲜自然蜂蜜中分离到了保藏的Aureobasidium spp.XCC菌株，在发酵过程中可以转化140.0g/L的葡萄糖产生110.2±1.2g/L的普鲁兰多糖，葡萄糖的转化率达到80％以上，生产强度达到0.80g/L/h，这是目前Aureobasidium spp.这属天然酵母菌中发酵葡萄糖生物合成普鲁兰多糖产量最高的菌株。同时，合成普鲁兰多糖分子量高达3×10⁵，高于目前市售的商品化普鲁兰多糖的平均分子量。

Description

一种生产普鲁兰多糖的天然菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种生产普鲁兰多糖的天然菌株及其应用。

背景技术

Aureobasidium spp.的中文是短梗霉属，属于半子囊真菌、具有酵母菌状细胞和丝状的二形态酵母菌状真菌，可以产生普鲁兰多糖等产物。普鲁兰多糖主要是由Aureobasidium spp.不同菌株产生的一种线性的胞外葡聚糖，在结构上是由α-(1→6)糖苷键将重复的麦芽三糖单元连接而成；这种连接方式使普鲁兰多糖具有较好的结构柔性、水溶性、粘附性、不透氧性、成膜性和易降解性等特点。因此，它在食品、化妆品、生物医药等领域的用途广泛而备受关注。我国在2006年批准普鲁兰多糖为食品添加剂新品种。在日本，普鲁兰多糖与淀粉一起被归类为无使用限制的添加剂。无论是急性、亚急性、慢性试验和变异源性试验都表明，普鲁兰多糖不引起任何生物学毒性，在自然界可被微生物降解利用，不会引起环境污染。目前市售价格23万/吨左右，进口价格30万/吨。

普鲁兰多糖的生物合成受到碳源种类和浓度的严重影响。为了防止在高浓度葡萄糖存在时发生葡萄糖阻遏作用，目前通常是利用蔗糖作为原料生物合成普鲁兰多糖。但目前蔗糖资源有限，价格较高；而葡萄糖可由商品化的高活力α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶水解淀粉获得，制备工艺简单，且淀粉来源方便、价格合理。所以利用葡萄糖生产普鲁兰多糖，而不用蔗糖成为需要解决的技术关键问题之一。此外，因普鲁兰多糖生物合成必须在高糖(尤其葡萄糖)的培养基中进行，所以高浓度的葡萄糖对生产菌株的生长和普鲁兰多糖生物合成具有强烈阻遏作用，所以筛选能耐高渗透压、葡萄糖阻遏作用很小的天然Aureobasidiumspp.菌株成为需要解决的另一个技术关键问题。

Aureobasidium spp.菌株在利用上述高浓度蔗糖生产普鲁兰多糖的同时，还可产生果糖基转移酶(Fructosyltransferases)，该酶催化蔗糖合成果寡糖(Fructooligosaccharides)，这不可避免地导致普鲁兰多糖合成量的降低。如果利用耐高渗透压、葡萄糖阻遏作用很小的天然Aureobasidium spp.菌株发酵葡萄糖生产普鲁兰多糖，就可以避免果寡糖的产生，从代谢流的角度来说，可以使更多的葡萄糖流向普鲁兰多糖的生物合成，增加普鲁兰多糖产量，这是本发明所要解决的又一个关键技术问题。

为了防止葡萄糖阻遏作用，CN201710426406专利使用一种通过紫外线诱变获得的非天然的高效生产低分子普鲁兰多糖的出芽短梗霉UVMU6-1生产普鲁兰多糖，取种子液接种到50mL的YPD无糖培养基中，添加5mL 70％的灭菌后的葡萄糖，培养36～48小时。取上述培养种子液接种到含20-40g/L(2-4％)葡萄糖，5.0～10.0g/L酵母膏和1.0～20.0g/L蛋白胨的发酵培养基中，利用盐酸和氨水调节pH值，400转/分钟，pH4.0，空气流量4L/min培养，并通过分批补料的方法向培养基中持续补加葡萄糖。培养100小时后，测定产生的普鲁兰多糖浓度，低分子量普鲁兰多糖浓度可达135g/L，而其天然菌株A.pullulans CGMCC 3.933在同样条件下仅产生30g/L的普鲁兰多糖。但是该工艺使用的出芽短梗霉UVMU6-1因为不耐高渗透压，为了减小葡萄糖阻遏作用是依靠分批补料发酵方式，每次添加低浓度的葡萄糖来维持发酵培养基低渗透压；而且，该菌株生产的是小于20万道尔顿的低分子量普鲁兰多糖(商品普鲁兰多糖平均分子量是20万道尔顿)，一般情况下普鲁兰多糖的分子量越小，产量越高，但生产的低分子量普鲁兰多糖由于机械强度差不但没有市场，同时不能满足工业生产的需求，所以控制合适大小分子量的普鲁兰多糖对于保持高产量普鲁兰多糖非常有必要。CN201710426406专利这种分批补料的方法工艺复杂、不便于自动化生产，补料过程中发酵培养基很容易受到污染，不适合大规模发酵生产；生产的低分子量普鲁兰多糖由于机械强度差没有市场，所以最好还是使用天然的耐高渗透压高产普鲁兰多糖的菌株。

同时，CN201710426466发明专利获得的产黑色素短梗霉A4菌株转化含60g/L～100.0g/L葡萄糖时所产普鲁兰多糖的分子量为81.41万道尔顿，但产量最高只能达到40.4g/L，中间还需用700g/L的葡萄糖进行补料，工艺复杂，不便于自动化生产。CN201610283906专利通过化学(亚硝基呱)诱变获得的出芽短梗霉MHZ-2101菌株转化120g/L葡萄糖所产普鲁兰多糖浓度为90g/L，而野生型出芽短梗霉CGMCCNo.3.4580所产的普鲁兰多糖浓度仅50g/L。

此外，天然菌株大规模使用安全可靠，而物理化学诱变的菌株存在潜在的安全问题。最近几年在普鲁兰多糖生产中最常用的Aureobasidium spp.不同天然菌株分批发酵葡萄糖时发酵液中产生的普鲁兰多糖浓度不超过50.0g/L；发酵蔗糖时发酵液中产生的普鲁兰多糖浓度在30g/L-70.0g/L之间，所用的蔗糖浓度在60g/L-120g/L之间(Sugumaran&Ponnusami,2017)。甚至P16菌株的葡萄糖解阻遏菌株DG41在以葡萄糖为碳源的10升发酵罐中培养132h，普鲁兰多糖浓度也只能达到64.93±1.33g/L(Wang et al.,2017)。参与葡萄糖阻遏作用的关键蛋白是CreA，它含有2个高度保守的Cys2His2型锌指结构。通过对该基因的二次敲除和回补表达，发现CREA基因在P16菌株普鲁兰多糖的合成中具有重要的负调控作用；敲除该基因的菌株DG41在2-脱氧-D-葡萄糖的淀粉培养基可以正常生长，而野生型菌在该培养基中不能生长，从而证实了敲除菌株DG41解除了葡萄糖阻遏效应(见图1)(Wanget al.,2017)。目前常用的产普鲁兰多糖酵母菌菌株大部分分离自植物叶面、土壤和海泥，细胞为酵母状细胞、细胞小、细胞壁薄、细胞中液泡大而少、大部分染色体基因没有出现二倍化(Sugumaran and Ponnusami,2017；Liuet al.,2018)，这就决定了常用的这些产普鲁蓝多糖酵母菌菌株不耐高渗透压、葡萄糖阻遏作用大，在高葡萄糖培养基中不能有效地转化葡萄糖生产高浓度的普鲁兰多糖。要减小葡萄糖阻遏作用，就得用CN201710426406专利所说的分批补料发酵方法，如此便增加了工艺的复杂程度,不便于自动化生产和不能有效地控制杂菌的污染。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种生产普鲁兰多糖的天然菌株，使得所述菌株耐高渗透压、葡萄糖阻遏作用小，能够生产出高于目前商品化普鲁兰多糖分子量的普鲁兰多糖，且具有较高的产率；

本发明的另外一个目的在于提供上述菌株在生产普鲁兰多糖中的应用以及提供一种生产普鲁兰多糖的方法。

自然界中由自然蜜蜂酿造的蜂蜜是由果糖、葡萄糖、蔗糖等组成的，其中含有70％的单糖(主要是果糖和葡萄糖，比例为1.2:1)、1.3％的蔗糖和12％的其他糖，水分含量大约有17.2％。所以蜂蜜中单糖含量和渗透压非常高，对大部分微生物生长具有强烈抑制作用，自然界中大部分微生物无法生长在渗透压如此之高的蜂蜜中。但是许多嗜渗透压和耐渗透压的微生物，特别是嗜渗透压和耐渗透压的酵母菌可以在蜂蜜中生长和代谢，并且葡萄糖阻遏作用小。由于高浓度葡萄糖(单糖)对Aureobasidium spp.不同菌株的生长和生物合成普鲁兰多糖具有阻遏作用和对细胞生长具有高渗透压的作用，本发明选取蜂蜜作为分离筛选预期天然菌株。

本发明从我国各地采集的新鲜自然蜂蜜中分离到了Aureobasidium spp.XCC菌株(以下简称XCC菌株)，在10-100升不同规格的发酵罐发酵中可以转化140.0g/L的葡萄糖产生110.2±1.2g/L的普鲁兰多糖。葡萄糖的转化率达到80％以上，生产强度达到0.80g/L/h。合成普鲁兰多糖分子量高达3×10⁵。这是目前Aureobasidium spp.这属天然酵母菌中发酵葡萄糖生物合成普鲁兰多糖产量最高的菌株。

细胞超微结构结果显示，XCC菌株培养液中大部分细胞为节孢子，而目前常用的产普鲁蓝多糖酵母菌菌株大部分细胞为出芽酵母状细胞；XCC菌株的细胞要比目前常用的产普鲁蓝多糖短梗霉酵母菌Aureobasidium melanogenum P16菌株(以下简称P16菌株)的大很多；XCC菌株细胞中的液泡小而多(典型的抗渗透压酵母菌)，而P16菌株细胞中的液泡大而少(图2)；XCC菌株细胞壁要厚于P16菌株的细胞壁(图2)；

同时，经过基因组测序发现XCC菌株基因组DNA的大小为51.6Mbp，而P16菌株的基因组DNA的大小仅为25.4Mbp；XCC菌株基因组DNA中重复2次、3次，4次、5次、6次、7次和10次的基因数分别为2339个、64个、36个、5个、3个、1个和1个，而P16菌株基因组DNA中重复2次、3次，4次和5次的基因数分别仅为95个、9个、1个和1个，说明与P16菌株基因组比较，XCC菌株的基因组有大量重复基因，是一株基因组高度重复的菌株；与P16菌株的相应基因拷贝数相比，XCC菌株基因组DNA中与胞外多糖、甘油、海藻糖、糖原、谷胱甘肽和细胞壁合成、液泡合成有关的基因、与HOG1、Ca²⁺离子、CWI等信号通路有关的基因均出现二倍化。

此外，XCC菌株细胞中甘油、海藻糖、糖原和谷胱甘肽量要高于比P16菌株的(表1)；这些结果说明从富含单糖的高渗透压的自然蜂蜜中分离的天然XCC菌株在高葡萄糖培养基中由于细胞壁厚、细胞中液泡小而多、有关的基因出现二倍化、甘油、海藻糖、糖原和谷胱甘肽量含量高和可以抗高渗透压的确可以高产普鲁兰多糖，是普鲁兰多糖发酵工业的重要天然生产菌株。

基于上述从自然界获得的天然菌株的多种优异表现，本发明提出了该天然菌株XCC在发酵生产普鲁兰多糖或在制备发酵生产普鲁兰多糖的微生物产品中的应用。其中，所述发酵生产普鲁兰多糖为发酵葡萄糖生产普鲁兰多糖。

根据上述应用，本发明还提供了一种发酵葡萄糖生产普鲁兰多糖的方法，采用所述天然菌株XCC以葡萄糖为唯一碳源进行发酵生产。

优选地，所述天然菌株XCC制备先成种子液，然后接种到发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖。

进一步优选地，所述方法为：所述天然菌株XCC利用YPD培养基制备成种子液，然后接种到含有高浓度葡萄糖的发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖；所述含有高浓度葡萄糖的发酵培养基成分为：每升发酵培养基含有140g葡萄糖,3.0g酵母菌提取液,0.6g(NH₄)₂SO4,5.0g K₂HPO₄,1.0g NaCl和0.2g MgSO₄·7H₂O。

更优选地，权利要求1或2所述天然菌株利用YPD培养基培养至菌液中细胞浓度达到1.0×10⁸cells/mL以上，一般在48h左右，制备成种子液，然后按10％(v/v)接种量接种到含有高浓度葡萄糖的发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖。

在本发明具体实施方式中，发酵过程中温度是28℃、搅拌速度250rpm、通气量是1.2L无菌空气/min/L，发酵时间120小时。

由以上技术方案可知，本发明从我国各地采集的新鲜自然蜂蜜中分离到了保藏的Aureobasidium spp.XCC菌株，在发酵过程中可以转化140.0g/L的葡萄糖产生110.2±1.2g/L的普鲁兰多糖，葡萄糖的转化率达到80％以上，生产强度达到0.80g/L/h，这是目前Aureobasidium spp.这属天然酵母菌中发酵葡萄糖生物合成普鲁兰多糖产量最高的菌株。同时，合成普鲁兰多糖分子量高达3×10⁵，高于目前市售的商品化普鲁兰多糖的平均分子量。

生物材料保藏信息说明

分类命名：Aureobasidium spp.XCC，已于2020年6月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2020207。

附图说明

图1所示为产普鲁蓝多糖天然短梗霉Aureobasidium melanogenum P16菌株及其葡萄糖解阻遏菌株DG41在2-脱氧-D-葡萄糖的淀粉培养基上的生长情况；其中，P16菌株(A)、敲除CreA基因菌株DG41(B)和CreA基因回补菌株(C)；

图2所示为本发明保藏的XCC菌株与P16菌株的细胞的超微结构；

图3所示为普鲁兰多糖红外光谱；

图4所示为本发明XCC菌株产生的普鲁兰多糖凝胶渗透色谱法(GPC)测定的分子量；

图5所示为XCC菌株产生的普鲁兰多糖¹³C NMR和¹H-NMR的化学位移图。

具体实施方式

本发明公开了一种生产普鲁兰多糖的天然菌株，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述天然菌株及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的天然菌株及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的一种生产普鲁兰多糖的天然菌株做进一步说明。

实施例1：菌株筛选

1、样品的采集和酵母菌细胞的分离

在每年北方5月份槐花盛开时，采集各地充满蜂蜜的蜂巢各100克，通过无菌操作迅速放入无菌离心管中。迅速带回到微生物学实验室，取1-2克蜂蜜接种到50.0mL含有140.0g/L葡萄糖和0.5g/L氯霉素的液体培养基中，通过28℃恒温振荡培养5天。用无菌生理盐水稀释获得的菌悬液，并进行一系列稀释，稀释液通过无菌操作均匀涂布在含有140.0g/L葡萄糖和0.5g/L氯霉素的固体培养基上，在28℃下恒温培养5天，得到各种菌落。根据Aureobasidium spp.不同菌株特有的菌落形态特征，挑取不同菌落，在含有140.0g/L葡萄糖和0.5g/L氯霉素的固体培养基上进行分离纯化，获得纯化的不同菌落，接种到含有140.0g/L葡萄糖和0.5g/L氯霉素的固体培养基斜面上，28℃下恒温培养2天，用无菌的25％(v/v)甘油溶液在-80℃保存所有菌株。

2、高产普鲁兰多糖的天然菌株筛选

挑取斜面上的每一菌株接种到30毫升含有140.0g/L葡萄糖的液体种子培养基(YPD培养基：20.0g/L葡萄糖，10.0g/L酵母菌提取液、20.0g/L蛋白胨)中，该种子培养基在28℃下恒温振荡培养2天,该种子液菌体细胞密度达到1.0×10⁸cells/mL以上。取5毫升种子液接种到含有45毫升生产普鲁兰多糖发酵培养基的三角瓶中(每升发酵培养基含有140g葡萄糖,3.0g酵母菌提取液,0.6g(NH₄)₂SO4,5.0g K₂HPO₄,1.0g NaCl和0.2g MgSO₄·7H₂O)。该三角瓶在28℃和180rpm下振荡培养5天。获得的培养液在100℃下煮沸15分钟，杀死菌体和沉淀蛋白质，冷却至室温。冷却液在8000g和4℃下离心10分钟，去除细胞和沉淀的蛋白质。取10毫升上清液与20毫升无水冷乙醇(在4℃下冷藏)混合，混合液在4℃下放置一晚上。混合液在8000g和4℃下离心10分钟。获得的沉淀物用无菌蒸馏水冲洗3次以上，冲洗过的沉淀物在80℃下干燥到恒重为止，秤重沉淀物，并计算每升培养液中的普鲁兰多糖含量。最终发现XCC菌株产生的普鲁兰多糖产量最高，确定为目标菌株。

实施例2：XCC菌株的形态观察和分类鉴定

把XCC菌株分别培养在上述的YPD培养基平板和土豆汁+10.0g/L葡萄糖+20.0g/L琼脂(PDA)平板上(28℃)培养4天。用普通相机拍摄菌落形态，用荧光显微镜的100×油镜观察培养的酵母菌细胞，并拍照，发现XCC菌株培养在YPD平板上大部分细胞为典型的酵母出芽细胞，即为有透明的节孢子。培养在PDA平板上大部分细胞为含有黑色素和不含有黑色素的厚壁孢子，并且不含有黑色素的厚壁孢子可以通过形成横膈膜进行分裂。

在产普鲁兰多糖培养基中培养时，XCC菌株多数细胞是不含有黑色素的厚壁孢子，这时普鲁兰多糖产量很高，所以是不含有黑色素的厚壁孢子负责普鲁兰多糖的合成。用常规方法提取XCC菌株的基因组DNA。用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC和基因组DNA作为模板通过PCR技术扩增rRNA基因簇的ITS1(Internal Transcribed Spacer)序列(登录号为MF370929)。从网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,last accessed18.10.07获得其他酵母菌的ITS序列，并利用软件DNAMAN(version 4.0)(Lynnon BioSoft,Vandreuil,QB,Canada)对获得的DNA序列进行编辑。利用DNAMAN工具包提供的CLUSTALW计算程序对获得的DNA序列进行比对，并构建系统进化树(1000自举迭代)，对XCC菌株与其他酵母菌株的亲缘关系进行分析。从该进化树得知获得的ITS1序列与Aureobasidium melanogenum相应的ITS序列具有99％相似性，所以XCC菌株应该属于Aureobasidium melanogenum的成员之一，称为Aureobasidium spp.XCC菌株。

实施例3：XCC菌株细胞超薄切片的制备和透射式电子显微镜观察

为了与目前广泛使用的产普鲁兰多糖Aureobasidium melanogenum P16菌株(以下简称P16菌株)细胞进行比较，同时用上述的产普鲁兰多糖发酵培养基培养XCC菌株和P16菌株。培养获得的细胞用3.0％戊二醛(用0.1M磷酸缓冲液配制)预固定3小时，接着用1.0％的锇酸固定2小时。固定的细胞用乙醇进行脱水，脱水的细胞包埋在Epon-812树脂中。包埋的酵母细胞用超薄切片机(LKB-NOVA,日本)制备超薄切片，并用醋酸铅和乙酸铀酰进行染色。制备的酵母菌超薄切片用透射式电子显微镜(H-7000,Hitachi,日本)进行观察和拍照。结果发现XCC菌株培养液中大部分细胞为不含有黑色素的厚壁孢子，而P16菌株大部分细胞为出芽的酵母状细胞；XCC菌株的细胞要比P16菌株的大很多；XCC菌株菌株细胞中的液泡小而多(典型的抗渗透压真菌细胞)，而P16菌株细胞中的液泡大而少(典型的不耐渗透压的真菌细胞)；XCC菌株细胞壁要比P16菌株细胞的厚很多(见图2)。

实施例4：XCC菌株基因组DNA测序和基因注释

XCC菌株和P16菌株基因组DNA的提取按照上述方法进行。提取的基因组DNA完整性、纯度和质量(基因组DNA的量为6.0μg,OD_260/280nm＝1.8-2.0)利用分光光度计进行估计。获得的基因组DNA通过SDS法进行进一步的分离与纯化。使用New England Biolabs公司的Next Ultra^TM DNALibrary Prep Kit for Illumina基因组文库构建试剂盒进行DNA文库构建。构建的文库包含两个：一个是插入片段大小500bp的paired-end文库和一个插入片段大小5kb的mate-pair文库。文库构建完毕后，使用Agilengt 2100生物分析仪(AgilentTechnologies,Palo Alto,CA,USA)和Qubit2.0荧光光度计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分别对文库质量与浓度进行检测，将Illumina PCR过程中得到的接头reads和低质量reads过滤掉。合格后采用Illumina公司的HiSeq^TM2500测序平台和PE125策略对上述两个文库进行上机测序，测序结束后得到原始数据(Raw Data)。

为了消除测序原始数据中的低质量数据，需要对原始数据进行过滤处理，保证后续生物信息分析结果的准确性，经过滤处理后得到的数据称为有效数据(Clean Data)。过滤处理操作步骤如下：(1)去除含低质量碱基超过一定比例的reads：质量值≤38，比例值设为40bp；(2)去除N碱基达到一定比例的reads：比例值设为15bp；(3)去除接头(Adapter)之间重叠(overlap)超过一定阈值的reads：阈值设置为15bp。对过滤处理后得到的有效数据进行组装，使用SOAPdenovo(http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)组装软件进行。分别选取不同的K-mer进行组装，根据获得的N50值确定最优K-mer值，调节-d(K-mer频次过滤)，-R(是否利用reads的K-mer信息鉴定短重复序列)，-u(构建scaffold前，是否屏蔽高覆盖度的contig)等参数，得到初步组装结果。

使用GapCloser软件，对初步组装得到的scaffold进行补gap和优化处理，最终得到scaffold序列文件。将500bp以下的片段过滤掉后，进行基因组组分分析以及基因注释与预测。使用GeneMarks(http://topaz.gatech.edu/)程序对组装好的XCC菌株基因组DNA进行ORF预测，采用了由启发式模型(Heuristic model)参数与GeneMarkS(本地)生成模型结合而成的集成模型。之后在6个数据库中进行全基因组Blast比对分析后，获得全基因组的注释信息(E-value值要低于1*e^-5，最小比对长度≥40％，匹配相似度≥40％)，这6个数据库用KEGG提供的软件进行重复基因的拷贝数进行计算。

经过基因组测序发现XCC菌株基因组DNA的大小为51.6Mbp，而P16菌株的基因组DNA的大小仅为25.8Mbp；XCC菌株基因组DNA中重复2次、3次，4次、5次、6次、7次和10次的基因数分别2339个、64个、36个、5个、3个、1个和1个，而P16菌株基因组DNA中重复2次、3次，4次和5次的基因数分别仅有95个、9个、1个和1个，说明与P16菌株基因组比较，XCC菌株的基因组有大量重复基因；与P16菌株的相应基因拷贝数相比，XCC菌株基因组DNA中与胞外多糖(AmAGS2)、甘油(GPD1和GPD2)、糖原(GS1)、海藻糖(TPS1)、细胞壁(CHI1)、液泡(VSP1)关的基因、与HOG1(HOG1)、Ca²⁺离子(CRZ1)、CWI(SLT2)等信号通路有关的基因均出现二倍化，其他更多区别如表1所示。

表1 P16和XCC菌株基因组的基本特征

实施例5：XCC菌株和P16菌株细胞内的海藻糖、甘油、糖原和谷胱甘肽的定量分析

细胞中的海藻糖、甘油和糖原在酵母菌抗渗透压方面能起着很大的作用，测定细胞中这些物质的量可以知道细胞是否抗渗透压。经过离心洗涤的XCC菌株和P16菌株细胞分别与0.25MNa₂CO₃溶液混合，混合液在90–95℃水浴中处理30分钟，然后加入商品化amyloglucosidase(1.2U/mL)(Cas:A7420MSDS,Sigma,美国)对细胞悬液在57℃下酶解10小时，在这期间不断进行混合均匀。酶解释放出的葡萄糖量利用葡萄糖定量试剂盒(NanjingJiancheng Bioeng Institute,Nanjing,中国)进行定量测定。取上述经过离心洗涤的XCC菌株和P16菌株细胞在80℃下烘干至恒重，准确称重，计算每毫升菌悬液中的菌体干重。根据细胞干重计算每毫克细胞干重中的糖原量。同时利用上述洗涤的细胞与4.0ml预冷的0.5M三氯乙酸(TCA)混合，混合液在0℃下处理20分钟，并随时进行振荡混合。处理过的混合液在4000g下离心5分钟，收集上清液(含有海藻糖),留用。沉淀的细胞用同样的方法再次提取海藻糖两次，三次提取的含有海藻糖的上清液混合均匀，形成12ml的提取液。提取液经过适当稀释，稀释液用用硫酸蒽酮法测定稀释液的OD_510nm值。同时配制不同浓度的标准海藻糖溶液，同样用硫酸蒽酮法测定海藻糖溶液的OD_510nm值，绘制标准海藻糖曲线，根据该标准曲线计算每毫克干重细胞的海藻糖含量。为了测定细胞内的甘油量，需配制两种试剂，试剂1是高碘酸钠试剂，18毫克/ml高碘酸钠(Merck公司生产)(高碘酸钠的用量一般是每升甘油需要50-200mg高碘酸钠)溶解在10％(v/v)醋酸溶液中，加入77mg/mL醋酸铵。试剂2是乙酰丙酮试剂，含有1％(v/v)乙酰丙酮溶液(溶解在异丙醇中)，该试剂必须保存在黑暗中。首先，利用高压细胞破碎仪(Constant Systemltd.,英国)破碎上述的离心洗涤的酵母菌细胞，破碎液经过12,000g离心20分钟，取40μL上清液(无细胞提取液)加入96孔板中，加入40μL试剂1，混合均匀，保温10分钟，再加入125μL试剂2，混合均匀，利用分光光度计在410nm下测定OD_410nm值(25分钟内连续测定)。配制50mg/L–200mg/L的标准甘油溶液，用同样的方法测定在410nm下的OD_410nm值，并制备标准曲线，根据标准曲线计算上清液中的甘油量。利用考马斯亮蓝方法测定上清液中蛋白质含量，计算每毫克蛋白质中的甘油量。酵母细胞中的谷胱甘肽含量利用试剂盒进行测定。测定结果表明XCC菌株细胞中甘油、海藻糖、糖原和谷胱甘肽量明显比P16菌株细胞的高(表2)，说明XCC菌株细胞抗渗透压和其他逆境的能力的确比P16菌株细胞的大。

表2胞内甘油、海藻糖、糖原和谷胱甘肽的相对含量

*(p<0.05)means the difference；**(p<0.01)means the significantdifference.Data are given as mean±SD,n＝3.

实施例6：通过10-100升发酵罐发酵生产普鲁兰多糖

首先把XCC菌株接种到上述的YPD培养基中通过振荡培养48小时作为种子液(细胞密度达到1.0×10⁸cells/mL以上)。700毫升或7升种子液接种到10升发酵罐或100升发酵罐的7升或70升产普鲁兰多糖发酵培养基(含140g/L葡萄糖)中。发酵过程中温度是28℃、搅拌速度250rpm、通气量是1.2L无菌空气/min/L，发酵时间120小时。发酵过程中取发酵液40.0mL按照上述的方法测普鲁兰多糖含量。发现在10-100升发酵罐中XCC菌株可以转化140.0g/L的葡萄糖产生110.2±1.2g/L的普鲁兰多糖。葡萄糖的转化率达到80％以上，生产强度达到0.80g/L/h。

实施例7：普鲁兰多糖的纯化和表征

用上述乙醇沉淀的普鲁兰多糖进行干燥和粉碎，粉碎后的多糖用去离子水溶解。为了去除多糖中的蛋白质，取100mL多糖溶液置于烧杯中，加入氢氧化钙调节pH为11，在60℃下保温20min后，于8000g下离心20min，收集上清液。向收集的上清液中加入磷酸调pH至7.5，在80℃下保温20min后，于8000g下离心20min，收集上清液，将上清液过1μm的滤膜，收集滤液。滤液加乙醇沉淀，对获得的多糖再次进行干燥和粉碎。取2mg纯化好的普鲁兰多糖和从Sigma购买的标准普鲁兰多糖分别与60mg含量为95％的溴化钾粉末混合。混合物在50℃下抽真空处理一晚上。处理过的混合物用傅里叶-红外光谱仪进行分析，记录吸收光谱，分析结果表明XCC菌株产生的普鲁兰多糖红外吸收光谱和标准普鲁兰多糖的红外吸收光谱完全一致。XCC菌株产生的普鲁兰多糖红外吸收光谱和标准普鲁兰多糖的红外吸收光谱如图3所示。

上述纯化的普鲁兰多糖和标准普鲁兰多糖各配制成5.0mg/L的溶液，经过0.22μm膜过滤后，普鲁兰多糖的分子量用凝胶渗透色谱法(GPC)(Waters 1515高效液相仪，以水为流动相，流速为0.5mL/min，柱温为35℃，检测器为示差检测器(RID)与多角度激光散射器联用(MALLS)进行分析，以已知的不同分子量大小的标准普鲁兰多糖作为分子量参照。测定结果表明XCC菌株合成的普鲁兰多糖分子量为3.0×10⁵。产生的普鲁兰多糖凝胶渗透色谱法(GPC)测定的分子量如图4所示。本领域中，分子量在3×10⁵到2×10⁶之间的普鲁兰多糖均可以满足工业生产的需求，本发明所生产的普鲁兰多糖满足了这一要求。

上述纯化的普鲁兰多糖用核磁共振仪(JEOL JNM-ECP 600MHZ,日本)测定¹³C NMR和¹H-NMR的化学位移。结果表明XCC菌株合成和分泌的普鲁兰多糖¹³C NMR和¹H-NMR的化学位移与标准普鲁兰多糖的¹³C NMR和¹H-NMR的化学位移完全一致，说明XCC菌株合成和分泌的胞外多糖就是普鲁兰多糖。XCC菌株产生的胞外多糖经过纯化后进行核磁共振光谱分析,其质子峰位移出现在3.1ppm-5.4ppm之间。环侧基-CH₂OH的特征峰出现在60.38ppm,60.69ppm处,表明结构单元中含2个-CH₂OH基团。由于多糖相连,其糖苷键相连的C1峰移向低场,出现在97.91ppm,99.76ppm和100.21ppm处,证明结构单元含有不等同的C1；一般90-102ppm为α构型，102-112ppm为β构型，且β-D型糖苷键构型端基碳信号一般大于100ppm，该DEPT谱图中异头碳的化学位移均小于102ppm，初步判断为α-D构型。其它各峰出现在66.46ppm-77.74ppm处,小于80ppm，因此该多糖为吡喃糖。由¹H和DEPT NMR特征峰可知,该样品与标准普鲁兰多糖的结构一致。DEPT谱中，CH3显正峰，CH₂显负峰，CH显正峰。产生的普鲁兰多糖¹³C NMR和¹H-NMR的化学位移图如图5所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种生产普鲁兰多糖的天然菌株，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO：M 2020207。

2.根据权利要求1所述天然菌株，其特征在于，基因组DNA的大小为51.6Mbp；基因组DNA中重复2次、3次，4次、5次、6次、7次和10次的基因数分别为2339个、64个、36个、5个、3个、1个和1个，是一株基因组DNA高度重复的菌株；基因组DNA中与胞外多糖、甘油、海藻糖、糖原、谷胱甘肽、细胞壁、液泡合成有关的基因，以及与HOG1、Ca²⁺离子、CWI信号通路有关的基因均出现二倍化。

3.权利要求1或2所述天然菌株在发酵生产普鲁兰多糖或在制备发酵生产普鲁兰多糖的微生物产品中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述发酵生产普鲁兰多糖为发酵葡萄糖生产普鲁兰多糖。

5.一种发酵葡萄糖生产普鲁兰多糖的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述天然菌株以葡萄糖为碳源进行发酵生产。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，权利要求1或2所述天然菌株制备先成种子液，然后接种到发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖。

7.根据权利要求5或6所述方法，其特征在于，权利要求1或2所述天然菌株利用YPD培养基制备成种子液，然后接种到含有高浓度葡萄糖的发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖；所述含有高浓度葡萄糖的发酵培养基成分为：每升发酵培养基含有140g葡萄糖,3.0g酵母菌提取液,0.6g(NH₄)₂SO₄,5.0g K₂HPO₄,1.0g NaCl和0.2g MgSO₄·7H₂O。

8.根据权利要求5-7任意一项所述方法，其特征在于，权利要求1或2所述天然菌株利用YPD培养基培养至菌液中细胞浓度达到1.0×10⁸cells/mL以上，制备成种子液，然后按10％(v/v)接种量接种到含有高浓度葡萄糖的发酵培养基中发酵生产普鲁兰多糖。

9.根据权利要求5-8任意一项所述方法，其特征在于，发酵过程中温度是28℃、搅拌速度250rpm、通气量是1.2L无菌空气/min/L，发酵时间120小时。

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