CN111100829A - 一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株，该菌株分离自腐烂的海带，分类命名为Bacillus sp.，其降解褐藻多糖得到的产物只有褐藻三糖和褐藻四糖，该菌株于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019312。本发明的有益之处在于：本发明提供的菌株可以将海藻酸钠降解成褐藻三糖和褐藻四糖，降解产物的聚合度种类只有两种，大大减少，方便进一步分离降解产物，从而得到单一聚合物的褐藻寡糖。

Description

一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株
技术领域
本发明涉及一株菌株，具体涉及一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株，属于海洋生物技术领域。
背景技术
褐藻胶是：以互为差向异构体的半乳糖醛酸、古罗糖醛酸为单体，通过1，4糖苷键连接，以G嵌段或M嵌段、M和G随机交替连接M\G嵌段的形式组成的多糖。
褐藻的细胞壁是褐藻胶主要存在的部位。
褐藻胶裂解酶能通过β-消除反应催化褐藻胶降解产生褐藻胶寡糖，不同来源的褐藻胶裂解酶通过相同的方式作用于褐藻胶。褐藻胶寡糖具有多种生物活性，如：促进植物生长、提高植物抗逆性、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等，在农业、功能食品开发、医药等领域具有广阔的开发前景。
制备褐藻胶寡糖的方法主要是化学降解法和酶解法。化学降解法存在许多问题，如：操作步骤繁琐、需要使用刺激性的化学试剂、反应剧烈、易腐蚀设备、会造成环境污染、制备的褐藻胶寡糖产量较低等，而酶解法却具有反应更加温和、底物专一性强、产量较高、副产物少、环境友好等优势。因此，酶解法是目前制备褐藻胶寡糖的主要方法。
使用酶解法来制备褐藻胶寡糖时，需要先获得褐藻胶裂解酶，再利用褐藻胶裂解酶对底物进行降解。
使用现有的褐藻胶裂解酶降解底物（海藻酸钠）时，降解产物（褐藻寡糖）的聚合度种类繁多，降解产物含有褐藻二糖、褐藻三糖、褐藻四糖、褐藻五糖、褐藻六糖等。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株可降解特定片段褐藻多糖、使降解产物的聚合度种类只有两种的菌株。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株，其特征在于，该菌株分离自腐烂的海带，分类命名为Bacillus sp.，其降解褐藻多糖得到的产物只有褐藻三糖和褐藻四糖，该菌株于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019312。
本发明的有益之处在于：本发明提供的菌株可以将海藻酸钠降解成褐藻三糖和褐藻四糖，降解产物的聚合度种类只有两种，大大减少，方便进一步分离降解产物，从而得到单一聚合物的褐藻寡糖。
附图说明
图1是菌株LE6的系统发育树；
图2是褐藻胶寡糖粉末的薄层层析结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的驯化和筛选
经过对产酶菌种的经年研究，我们从腐烂的海带中分离得到了一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株，该菌株具体是通过下面的方法筛选得到的：
2019年4月19日，我们从黄海海域采摘回来5棵腐烂的海带，将这5棵腐烂的海带分别均质后留清液，并将清液分别涂布于5个MAlg平板培养基上，这5个MAlg平板培养基分别记为LA、LB、LC、LD、LE，之后将这5个MAlg平板培养基于30℃恒温培养24h，然后将各平板培养基上的单菌落挑至新的MAlg平板培养基上，其中：
从标记为LA的平板培养基上挑出了5个单菌落，分别记为LA1、LA2、LA3、LA4、LA5；
从标记为LB的平板培养基上挑出了3个单菌落，分别记为LB1、LB2、LB3；
从标记为LC的平板培养基上挑出了6个单菌落，分别记为LC1、LC2、LC3、LC4、LC5、LC6；
从标记为LD的平板培养基上挑出了4个单菌落，分别记为LD1、LD2、LD3、LD4；
从标记为LE的平板培养基上挑出了6个单菌落，分别记为LE1、LE2、LE3、LE4、LE5、LE6；
然后，将这24个新的MAlg平板培养基于30℃恒温培养24h，之后从中挑选出降解圈最明显的那个单菌落，在这一步，我们从标记为LE6的MAlg平板培养基上挑选到了降解圈最明显的单菌落，我们将该单菌落对应的菌株记为LE6，最后将该单菌落挑至MAlg斜面培养基上并于-80℃保存。
MAlg培养基的配方：海藻酸钠5g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
二、菌株LE6的鉴定
我们用试剂盒抽提法提取了菌株LE6的DNA，然后经PCR扩增获得了菌株LE6的16SrDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行了相似性比对，比对结果：菌株LE6为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
获得菌株LE6的16SrDNA后，我们又用MEGA 5.1 软件（Neighbor-Joining）构建了该菌株的系统发育树（如图1所示），并分析了各菌株的进化关系，分析结果：菌株LE6为芽孢杆菌属。
三、菌株LE6在降解褐藻多糖中的应用
Alg培养基：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
种子培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
发酵培养基：海藻酸钠5g/L，葡萄糖3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
Step1：制备种子液
先将菌株LE6于Alg平板培养基上活化，然后挑取2环接种于种子培养基（100mL）中，30℃、200rpm发酵培养24h，得到种子液。
Step2：发酵产酶
按2%（体积分数）的接种量将种子液接种到发酵培养基（100mL）中，30℃、200rpm发酵培养24h，得到发酵液。
Step3：制备粗酶液
将发酵液在4℃下8000rpm离心10min，除去菌体，得到粗酶液。
Step4：酶解（降解）
配制褐藻胶溶液：将海藻酸钠加入到磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，海藻酸钠的浓度为3g/L。
将粗酶液以1:9的体积比加入到褐藻胶溶液中，在35℃下酶解22h，得到褐藻胶寡糖溶液。
Step5：分离纯化褐藻寡糖
对褐藻胶寡糖溶液依次进行超滤、纳滤、喷雾干燥操作，最终得到褐藻胶寡糖粉末。
四、产物检测
我们利用薄层层析法（TLC）对得到的褐藻胶寡糖粉末进行了初步的检测，具体的：
使用 Silica Gel 60 F254 硅胶板（德国默克），上样量为8 µL，展开剂体系为正丁醇:甲酸: 水=4:5:1（V:V:V），将硅胶板置于层析缸中进行两次展开，每次展开后室温下风干，用硫酸: 乙醇=1:9（V:V）作为显色剂，再次风干后，置于80℃烘箱烘干半小时。
薄层层析的结果见图2。
由图2可知，降解产物只有褐藻三糖和褐藻四糖。
由此可见，本发明提供的菌株LE6可降解特定片段褐藻多糖，降解产物只有褐藻三糖和褐藻四糖，大大减少了降解产物的聚合度种类，更方便进一步分离降解产物，从而可以更容易得到单一聚合物的褐藻寡糖。
五、菌种保藏
由前面的研究可知，菌株LE6可降解特定片段褐藻多糖，降解产物只有褐藻三糖和褐藻四糖，大大减少了降解产物的聚合度种类，更方便进一步分离降解产物，从而可以更容易得到单一聚合物的褐藻寡糖，在实际生产应用中具有积极的意义，所以我们对菌株LE6进行了保藏，保藏日期为2019年4月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：M 2019312，分类命名为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）LE6。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株，其特征在于，该菌株分离自腐烂的海带，分类命名为Bacillus sp.，其降解褐藻多糖得到的产物只有褐藻三糖和褐藻四糖，该菌株于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019312。
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