CN113278549B - 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
一株蜡样芽孢杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113278549B CN113278549B CN202110545291.2A CN202110545291A CN113278549B CN 113278549 B CN113278549 B CN 113278549B CN 202110545291 A CN202110545291 A CN 202110545291A CN 113278549 B CN113278549 B CN 113278549B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus cereus
- strain
- brown algae
- building
- algae polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus XY‑1，于2020年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院9号楼5楼，保藏号为GDMCC NO：61383。本发明筛选所得Bacillus cereus XY‑1，以褐藻多糖为唯一碳源，能够确保在该培养基上生长的菌均能利用褐藻多糖，从而提高筛菌效率；该菌株能够将褐藻多糖降解为低分子量的寡糖，分离纯化后可满足多种需求。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及的是一株蜡样芽孢杆菌及其应用。
背景技术
在海洋生物中，海洋藻类作为一种新的生物活性物质来源越来越受到广泛关注。海藻分红藻、褐藻和绿藻三大类，褐藻是海洋藻类中的第二大种群，因其含有绿棕色的藻褐素而得名。褐藻多糖是一种广泛应用的、高附加值、高活性天然产物，褐藻在海洋中储量大、可再生，使得褐藻多糖的分离提取、结构测定和生理活性成为目前研究的主要内容。
褐藻多糖广泛存在于各种褐藻体内，已有大量研究表明褐藻多糖具有多方面的保健功能，如抗凝血、降血糖、降血脂、清毒素、灭有害菌、调节机体免疫力、抗肿瘤及抗辐射等。但人体无法直接利用褐藻多糖，降解褐藻多糖成为寡糖对资源利用以及提高其生物活性都有重要意义。
蜡样芽孢杆菌分布广泛，常见于土壤、灰尘和污水中，在植物性食品和许多生熟食品中也常见，是一种好氧性、但在厌氧情况下也可很好生长的革兰氏阳性杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列；能够形成芽孢，其芽孢呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端。现有技术中可降解褐藻多糖的菌株使用的培养基不是以褐藻多糖为唯一碳源，这将导致相应菌株并不能有效地降解褐藻多糖，而且现有技术筛选所得菌株只能将褐藻多糖降解为两种聚合度的寡糖，不能满足多种需求。
发明内容
本发明目的在于筛选出一株蜡样芽孢杆菌，以褐藻多糖为唯一碳源，能够确保在该培养基上生长的菌均能利用褐藻多糖，从而提高筛菌效率；该菌株能够将褐藻多糖降解为多种聚合度的寡糖，分离纯化后可满足多种需求。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一株蜡样芽孢杆菌，命名为Bacillus cereus XY-1，于 2020 年12月 23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院9号楼5楼，保藏号为GDMCC NO：61383，所述蜡样芽孢杆菌16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
上述Bacillus cereus XY-1在降解褐藻多糖中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益的技术效果：
本发明筛选所得Bacillus cereus XY-1，以褐藻多糖为唯一碳源，能够确保在该培养基上生长的菌均能利用褐藻多糖，从而提高筛菌效率；该菌株能够将褐藻多糖降解为低分子量的寡糖，分离纯化后可满足多种需求。
保藏信息说明
Bacillus cereus XY-1于 2020 年12月 23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：61383。
附图说明
图1为本发明菌株Bacillus cereus XY-1在MRS固体培养基上培养48h所得菌落图。
图2为本发明菌株Bacillus cereus XY-1革兰氏染色在100倍物镜下观察。
图3是褐藻多糖酶解前后GPC出峰图。
图4是各单糖混合标准品HPLC出峰图。
图5是褐藻多糖酶解前HPLC出峰图。
图6是褐藻多糖酶解后HPLC出峰图。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Bacillus cereus XY-1即指蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）XY-1。
实施例中使用的各培养基组成：
1L MRS固体培养基的组成是：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉10g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁 0.2g，硫酸锰 0.05g，葡萄糖10g，琼脂 15g。
1L MRS液体培养基的组成是：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉10g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁 0.2g，硫酸锰 0.05g，葡萄糖10g。
以褐藻多糖替代葡萄糖作为唯一碳源，其它成分与MRS固体培养基相同（即为MRS-H固体培养基）：
1L MRS-H固体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉10g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三铵2g，硫酸镁 0.2g，硫酸锰 0.05g，褐藻多糖 10g，琼脂 15g。
实施例1
菌株的分离和鉴定
（1）样品采集：样品为广西南宁农家自制酸菜、酸水果发酵母液，以无菌密封袋密封置于-20℃冰箱保存；
（2）菌种活化：将发酵母液解冻后分别涂布于MRS固体培养基上，于37℃下培养48h；
（3）分离单菌落：分别挑取平板上形态不同的菌落在MRS固体培养基上进行划线，于37℃下培养48h，此过程重复三次以上直至培养出纯菌落；
（4）菌株筛选：将步骤（3）中的纯菌落划线接种于MRS-H固体培养基上，于37℃下培养48h后观察菌株生长情况；
（5）菌株纯化与富集培养：选择步骤（4）中生长状况好的菌株，将这株菌株标记为XY-1，挑取单菌落在MRS-H固体培养基上进行划线，于37℃下培养48h，将此过程重复3次以上直至培养出纯菌落；挑取纯菌落于MRS液体培养基中，在37℃下培养48h，看到试管底部有明显的菌体沉积；
（6）菌落形态观察与革兰氏染色：在MRS固体培养基上划线培养步骤（5）得到的纯菌株XY-1（37℃，48h），观察到菌落为圆形、白色，表面呈毛玻璃状，质地软，易挑起，如图1所示；
挑取XY-1进行革兰氏染色，步骤如下：涂片固定，用结晶紫染1分钟，自来水冲洗，吸去水分；加碘液覆盖涂面染约1分钟，水洗，用吸水纸吸去水分；加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色， 20秒后水洗，吸去水分；番红染色液染1分钟后，自来水冲洗，干燥，在显微镜上进行镜检；在100倍物镜下观察到菌体为杆状，呈紫色（如图2所示），判定为革兰氏阳性菌；
（7）菌株鉴定：挑取步骤（5）纯化所得纯菌送样进行16SrDNA检测，检测结果用NCBI中的Blast程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行了相似性比对，比对结果：XY-1菌株为Bacillus cereus，命名为Bacillus cereus XY-1。
实施例2
褐藻多糖的降解
（1）将实施例1鉴定所得Bacillus cereus XY-1接种在MRS液体培养基中培养48小时，培养结束后进行离心，离心条件为10000g、10min，取上清于40℃旋蒸浓缩至原来体积的1/5，此为粗酶液；
（2）粗酶制备：配制饱和硫酸铵溶液，用氨水将pH调节至与粗酶液一致（粗酶液pH为4.6），在冰浴条件下向粗酶液中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液直至液体中出现明显沉淀，在4℃条件下静置过夜后离心，离心条件：10000g、30min，离心后得到的沉淀重溶于2-3倍体积的磷酸盐缓冲液中（pH与粗酶液相同），冻干后得到粗酶；
（3）褐藻多糖的降解：将1g分子量>10kDa的褐藻多糖溶于100mL纯水中，加入步骤（2）中冻干后所得粗酶1g，酶解12h后沸水浴2min灭酶；
（4）褐藻低聚糖的分离：将酶解后沸水浴灭酶的溶液过3kDa的超滤装置进行超滤，将分子量低于3kDa的低聚糖溶液进行冻干，称重为0.1112g，即低聚糖得率为11.12%，即降解得率为11.12%；
（5）分子量测定：用GPC法测定褐藻多糖酶解前后的分子量，Agilent_1260 高效液相色谱仪，配备TSK-G2500 PWXL色谱柱；样品（20 µL，0.5%）进样后，使用超纯水作为流动相，流速0.5mL/min，柱温30℃，用示差折光检测器（RID）检测多糖峰；
（6）单糖组成测定：用衍生化法测定褐藻多糖酶解前后单糖组成，将200 μL样品（10 mg/mL）用三氟乙酸水解2 小时，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）反应1小时，再用氯仿萃取，最后将水相过0.22 μm微孔滤膜并分析，用Agilent_1260 高效液相系统连接VWD检测器进行HPLC分析，使用C18色谱柱，流动相为乙腈-磷酸盐缓冲溶液，标准品包括D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、L-岩藻糖、D-半乳糖、D-甘露糖醛酸、D-葡萄糖醛酸和D-半乳糖醛酸；245 nm下进行紫外检测。
从图3中可以看出酶解前褐藻多糖出峰时间为11.2732 min，酶解后变为两个峰，出峰时间明显延后，分别为13.0229 min和14.9453 min，由此可以得出结论：该酶能够显著降解褐藻多糖，降低其分子量。
图4中单糖出峰顺序分别为1: D-甘露糖醛酸，2: D-甘露糖，3: L-鼠李糖，4: D-葡萄糖醛酸，5: D-半乳糖醛酸，6: D-葡萄糖，7: D-半乳糖，8: D-阿拉伯糖，9: L-岩藻糖；图5、图6同。
图4、图5进行对照可以看出，降解前的多糖主要含有D-甘露糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-岩藻糖，占比分别为76.47%、10.40%、7.71%、5.42% ；图4、图6进行对照可以看出，降解后的低聚糖主要由D-甘露糖醛酸、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、L-岩藻糖组成，占比分别为85.79%、7.50%、2.80%、3.91%。降解前后褐藻糖的单糖组成基本没有变化，但比例有一定差异。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一株蜡样芽孢杆菌及其应用
<130> JC
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1399
<212> DNA
<213> Bacillus cereus
<400> 1
gtcgagcgat ggattagagc ttgctcttat gaagttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60
tgggtaacct gcccataaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggataac 120
attttgaacc gcatggttcg aaattgaaag gcggcttcgg ctgtcactta tggatggacc 180
cgcgtcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 240
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360
aggctttcgg gtcgtaaaac tctgttgtta gggaagaaca agtgctagtt gaataagctg 420
gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480
tacgtaggtg gcaagcgtta tccggaatta ttgggcgtaa agcgcgcgca ggtggtttct 540
taagtctgat gtgaaagccc acggctcaac cgtggagggt cattggaaac tgggagactt 600
gagtgcagaa gaggaaagtg gaattccatg tgtagcggtg aaatgcgtag agatatggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg actttctggt ctgtaactga cactgaggcg cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780
tagagggttt ccgcccttta gtgctgaagt taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840
cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900
ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gaaaacccta 960
gagatagggc ttctccttcg ggagcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020
tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccatc 1080
attaagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140
tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cggtacaaag 1200
agctgcaaga ccgcgaggtg gagctaatct cataaaaccg ttctcagttc ggattgtagg 1260
ctgcaactcg cctacatgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380
agtcggtggg gtaaccttt 1399
Claims (2)
1.一株蜡样芽孢杆菌，其特征在于，命名为Bacillus cereus XY-1，于 2020 年12月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院9号楼5楼，保藏号为GDMCC NO：61383，所述蜡样芽孢杆菌16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在降解褐藻多糖中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110545291.2A CN113278549B (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110545291.2A CN113278549B (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113278549A CN113278549A (zh) | 2021-08-20 |
| CN113278549B true CN113278549B (zh) | 2022-07-05 |
Family
ID=77279877
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110545291.2A Active CN113278549B (zh) | 2021-05-19 | 2021-05-19 | 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113278549B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116570646A (zh) * | 2022-09-07 | 2023-08-11 | 广西华泰药业有限公司 | 一种制备海藻寡糖和香樟精油复合消毒凝胶的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104195080B (zh) * | 2014-08-23 | 2017-01-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 |
| KR101779249B1 (ko) * | 2015-01-19 | 2017-09-18 | 충북대학교 산학협력단 | 혼합배양액을 이용한 폴리히드록시알카노에이트의 생산방법 |
| CN106278493B (zh) * | 2016-07-25 | 2018-03-09 | 五洲丰农业科技有限公司 | 分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法 |
| CN111100827A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-05-05 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 |
| CN111100829A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-05-05 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株 |
| CN107674845B (zh) * | 2017-08-15 | 2020-10-09 | 云南万魁生物科技有限公司 | 一种新型蜡样芽孢杆菌by1及其应用 |
| CN111100825B (zh) * | 2020-02-27 | 2021-05-11 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株芽孢杆菌及其在工业中的应用 |
-
2021
- 2021-05-19 CN CN202110545291.2A patent/CN113278549B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104195080B (zh) * | 2014-08-23 | 2017-01-18 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 |
| KR101779249B1 (ko) * | 2015-01-19 | 2017-09-18 | 충북대학교 산학협력단 | 혼합배양액을 이용한 폴리히드록시알카노에이트의 생산방법 |
| CN106278493B (zh) * | 2016-07-25 | 2018-03-09 | 五洲丰农业科技有限公司 | 分级酶解法制备含寡糖海藻有机肥的方法 |
| CN107674845B (zh) * | 2017-08-15 | 2020-10-09 | 云南万魁生物科技有限公司 | 一种新型蜡样芽孢杆菌by1及其应用 |
| CN111100827A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-05-05 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 |
| CN111100829A (zh) * | 2020-02-27 | 2020-05-05 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株可降解特定片段褐藻多糖的菌株 |
| CN111100825B (zh) * | 2020-02-27 | 2021-05-11 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株芽孢杆菌及其在工业中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Bacillus cereus MBRH3的鉴定及以海带为原料生产SOD;郝之奎等;《食品与生物技术学报》;20150115;第34卷(第01期);第54-61页 * |
| Phenol degradation performance by isolated Bacillus cereus immobilized in alginate;Aditi Banerjee等;《International Biodeterioration & Biodegradation》;20110830;第65卷(第7期);第1052-1060页 * |
| 芽孢杆菌褐藻胶裂解酶的实验室制备及其基因克隆与表达的研究;刘玉佩;《中国优秀硕士学位论文全文数据库·工程科技I辑》;20120515(第5期);B018-69 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113278549A (zh) | 2021-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109593681B (zh) | 一种防治水产养殖蓝藻水华的复合菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN101451113B (zh) | 一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法 | |
| CN109880758B (zh) | 一种植物乳杆菌诱变菌株及其诱变方法和应用 | |
| CN100368530C (zh) | 一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株 | |
| CN111100825B (zh) | 一株芽孢杆菌及其在工业中的应用 | |
| CN113278549B (zh) | 一株蜡样芽孢杆菌及其应用 | |
| CN118325765A (zh) | 一株褐藻多糖降解菌及其应用 | |
| CN114181857A (zh) | 一种抗氧化发酵乳杆菌及其用途 | |
| CN111944712B (zh) | 一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌和应用 | |
| CN111676170B (zh) | 一株发酵乳杆菌及其在制备共轭脂肪酸中的应用 | |
| CN116536195A (zh) | 克劳氏盐碱芽孢杆菌及其在制备有机微生物菌肥中的应用 | |
| CN113151071B (zh) | 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108102983B (zh) | 一种高产淀粉酶的植物乳杆菌及其应用 | |
| CN112852681B (zh) | 发酵乳杆菌及应用、发酵酸浆及制备方法、淀粉沉淀剂 | |
| CN112877266B (zh) | 植物乳杆菌qs7t及其应用 | |
| CN108004145B (zh) | 一种黑木耳破壁方法 | |
| KR100625299B1 (ko) | 다시마 및 미역을 분해하는 미생물 및 이를 이용한 다시마 및 미역 분해 방법 | |
| CN110923149B (zh) | 一种层出镰刀菌及其应用 | |
| CN112662577A (zh) | 一组降解玉米秸秆产多糖的菌群及其微生物配比 | |
| CN110894472B (zh) | 一种湖北麦冬内生青霉属菌菌株及其应用 | |
| CN111358798A (zh) | 低聚糖阿魏酸酯的新应用 | |
| CN110894471B (zh) | 一种代谢产生湖北麦冬多糖的菌株及其应用 | |
| CN110804558B (zh) | 一种襄麦冬内生青霉属菌菌株及其应用 | |
| CN115260324B (zh) | 一种具有肠道益生活性的佛手多糖的制备方法 | |
| CN115287232B (zh) | 一株戊糖片球菌及其在南酸枣乳酸菌饮料发酵中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |