CN111100827A - 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用，该芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.16120，利用该芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法包括以下步骤：1、活化、驯化培养菌株；2、获取种子菌株；3、制备种子液；4、获取褐藻胶裂解酶粗酶液；5、获取初解溶液：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻浆中，40℃水浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h；6、获取褐藻寡糖：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥。本发明筛选得到的芽孢杆菌可产高活力褐藻胶裂解酶，对底物海藻浆的转化率高，在制备褐藻寡糖时，不仅提高了生产效率，还降低了生产成本。

Description

一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）及其在制备褐藻寡糖中的应用，属于海洋生物技术领域。
背景技术
近年来，随着褐藻胶应用领域的扩展及寡糖降解和分离技术的发展，褐藻胶降解产物——褐藻寡糖的生物活性受到了人们的极大关注。研究发现，褐藻寡糖除了具有溶解性强、稳定性高及安全无毒等理化特征外，还具有重要的生理活性，有文献报道褐藻寡糖具有促进植物根系生长、抑菌、抗病毒活性、类肝素的抗凝、诱导人体单核细胞释放细胞因子、抑制癌细胞增殖等作用。因此，通过降解褐藻胶并分离得到寡糖片段，对开发具有特殊生物活性的新型酸性寡糖分子具有重要意义。
制备纯度高、具有较高生物活性的褐藻寡糖的方法主要有：化学物理降解法、生物降解法。
化学物理降解法存在着反应条件不易控制、耗能高、速度慢、产物回收率低、目的产物不易分离、成本高、后处理过程环境污染严重等不易解决的问题。
生物降解法的代表是酶解法，酶解法反应条件温和、易控制、底物特异性好、催化效率高。
因此，以酶解法为代表的生物降解法取代传统化学物理降解法成为现有技术发展的趋势。
因而，褐藻胶裂解酶的研究开发具有深远的理论意义和应用价值。
目前，对褐藻胶裂解酶的研究主要侧重于产酶菌种的调查和酶的提纯及性质方面。
发明内容
本发明提供了一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）及其在制备褐藻寡糖中的应用。其中：
1、可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）
一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于，该芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年07月17日，保藏编号为CGMCC No.16120。
2、前述保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌在制备褐藻寡糖中的应用
利用前述保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将前述的芽孢杆菌先在分离纯化培养基上进行活化，然后在液体发酵培养基中进行驯化培养；
步骤2：在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后涂布到分离纯化培养基的表面，之后挑取种子菌株；
步骤3：将挑取出来的种子菌株接数环于液体发酵培养基中，培养得到种子液；
步骤4：按2%的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中，震荡培养，得到褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤5：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻悬液中，40℃水浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
步骤6：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
前述的方法，其特征在于，在步骤1中，前述分离纯化培养基的配方为：
蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±0.1。
前述的方法，其特征在于，在步骤1中，前述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠2-10g/L、硫酸铵2-6g/L、硫酸镁 0.5-2g/L、磷酸氢二钾1-4g/L、硫酸亚铁0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
前述的方法，其特征在于，前述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，调pH值至7.3±0.1。
前述的方法，其特征在于，在步骤3中，培养温度为30℃，培养时间为24h。
前述的方法，其特征在于，在步骤4中，培养温度为30℃，摇床的转速为220r/min，培养时间为24h。
前述的方法，其特征在于，在步骤5中，海藻悬液是由40目大小的铜藻粉末和水以1g:20ml的比例混合而成的。
本发明的有益之处在于：
（1）筛选得到保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌可产高活力褐藻胶裂解酶，高活力褐藻胶裂解酶对底物海藻悬液的转化率高，在制备褐藻寡糖时，有利于提高生产效率；
（2）利用保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌制备褐藻寡糖时，由于该芽孢杆菌可产高活力褐藻胶裂解酶，所以生产成本低、生产效率高。
附图说明
图1是保藏编号为CGMCC No.16120的芽孢杆菌及相关菌种的系统发育树；
图2是初解溶液的TLC检测结果；
图3是最终褐藻寡糖的TLC检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的筛选及鉴定
经过对产酶菌种的经年研究，我们从海带中分离得到了一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
该可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.）具体是通过下面的方法筛选得到的：
1、获取出发菌株
2017年03月13日，从烟台獐子岛海边养殖场取得腐烂海带样品，通过初筛和复筛，筛选分离得到了一株出发菌株，初筛和复筛的详细过程如下：
（1）褐藻胶裂解酶产生菌株的初筛
使用研钵将采摘回来的腐烂海带样品研碎，制成样品液。取5只15mL试管，编号1至5，分别加入4.5mL无菌水，1号试管中加入0.5mL样品液，充分混合后用1000μL移液枪吸取0.5mL稀释液移入下一支试管，依次进行梯度稀释，将样品稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。选取各样品10-3、 10-4、10-5三个浓度梯度，用200μL移液枪吸取100μL，涂布于Alg平板培养基上，30℃下恒温培养48 h，待平板上长出菌落后，依据单菌落周围形成透明圈的大小，判断菌株降解海藻酸钠能力的强弱，选取降解海藻酸钠能力强的菌株进行复筛。
Alg平板培养基的配方为：海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁 1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，琼脂20 g/L，调pH 值至7.3±0.1，自来水配制。
（2）褐藻胶裂解酶产生菌株的复筛
将初筛得到的菌株进一步于Alg平板培养基上划线分离纯化3次， 将得到的产褐藻胶裂解酶的菌株接种至Alg培养基中，30℃摇床200r/min发酵1d，然后使用硫酸铜法判断菌株降解海藻酸钠的活性，选取降解海藻酸钠活性最高的菌株为出发菌株。
2、培养菌株
（1）培养基
分离纯化培养基的配方：蛋白胨5 g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±0.1。
液体发酵培养基的配方：海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁 1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，调pH 值至7.3±0.1。
（2）筛选产酶菌株
菌株在分离纯化培养基上活化后，在液体发酵培养基中进行驯化培养，在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后在分离纯化培养基表面进行涂布，以先长出的菌落、有透明水解圈出现的菌落作为原始菌株，再重复以上操作，直至菌落周围有较大透明水解圈出现，最后挑取透明水解圈较大的菌落作为种子菌株。
（3）种子培养
将驯化后的种子菌株接数环于液体发酵培养基（装于25mL试管中）中，30℃培养24h，得到种子液。
3、发酵培养实验
（1）发酵培养条件
在300mL三角瓶中装入100 mL 液体发酵培养基，每一实验组均按2%（体积分数）的接种量将种子液接入到液体发酵培养基中，于30℃、220r/min摇瓶培养36h，将发酵液于4℃、6000r/min离心10min，得上清液（褐藻胶裂解酶粗酶液）及菌体，取一部分菌体，将这部分菌体用玻璃珠研磨，然后分别测定上清液、细胞完整的菌体、细胞破碎的菌体的酶活力。
（2）褐藻胶裂解酶的活力测定
在波长235nm处测定OD值，通过指定的葡萄糖标准曲线确定酶活力。
酶活力单位定义为：每1min透明圈面积增加0.1mm2所需的酶量为一个酶活力单位（EU，enzyme unit）。
测定结果如下：
项目 1 2 3
上清液酶活力 10.4 EU 10.0 EU 10.5EU
菌体（细胞完整）酶活力 1.9 EU 1.6 EU 1.8 EU
菌体（细胞破碎）酶活力 0.2 EU 0.1 EU 0.1 EU
由上述测定结果可知，驯化后的菌株产生的褐藻胶裂解酶主要存在于发酵液（褐藻胶裂解酶粗酶液）中，这表明该褐藻胶裂解酶属于胞外酶，在菌体内合成，并随着发酵分泌到液体培养介质中。
4、结果分析
（1）菌落特征
菌株驯化前，菌落在分离纯化培养基上无透明圈；菌株驯化后，菌落在分离纯化培养基上存在明显的透明圈。
驯化后的菌株，菌落长于分离纯化培养基表面，呈乳白色，革兰氏染色阳性。
（2）菌体的培养特征
驯化后的菌株，在试管中液体培养24h后，液体表面形成菌膜，上层先浑浊，表明该菌株为好氧菌。
（3）生长特征
驯化后的菌株，可在温度15-40℃范围内、pH值5-10范围内生长，最适生长温度为30℃。
（4）基因序列等特征
驯化后的菌株，我们用试剂盒抽提法提取了菌株的DNA，然后经PCR扩增获得了菌株的16SrDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA序列进行了相似性比对，比对结果：该菌株为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
获得菌株的16SrDNA后，我们又用MEGA 5.1 软件（Neighbor-Joining）构建了系统发育树（如图1所示），并分析了各菌株的进化关系，分析结果：该菌株为芽孢杆菌（Bacillussp.）。
依据驯化后的菌株的菌体形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列，我们将该株驯化后的菌株鉴定为芽孢杆菌（Bacillus sp.），为方便后续表达，我们给这株菌株一个代号：芽孢杆菌Alg。
二、菌种保藏
我们将芽孢杆菌Alg保藏在了中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：中国北京，保藏日期为：2018年07月17日，保藏编号为：CGMCC No.16120，分类命名为：芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
三、芽孢杆菌Alg的应用
我们选育得到的芽孢杆菌Alg可产高活力褐藻胶裂解酶，高活力褐藻胶裂解酶作为工具酶，不仅可以应用于藻类原生质体和褐藻寡糖的制备中，还可以应用于褐藻胶的结构测定中，在食品、医药行业中具有广泛的应用前景，另外，对于褐藻胶裂解酶的酶学性质研究也具有十分重要的意义。
下面以将芽孢杆菌Alg应用于褐藻寡糖的制备中为例，详细介绍利用该芽孢杆菌Alg制备褐藻寡糖的方法。
1、活化、驯化培养
将芽孢杆菌Alg先在分离纯化培养基上进行活化，然后在液体发酵培养基中进行驯化培养。
分离纯化培养基的配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉10.0g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±0.1。
液体发酵培养基的配方为：海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁 1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，调pH 值至7.3±0.1。
经试验，液体发酵培养基的配方在以下范围内调整时，对发酵结果不会有较大的影响：
海藻酸钠2-10g/L、硫酸铵2-6g/L、硫酸镁 0.5-2g/L、磷酸氢二钾1-4g/L、硫酸亚铁0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
2、获取种子菌株
在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后涂布到分离纯化培养基的表面，之后挑取种子菌株。
3、制备种子液
将挑取出来的种子菌株接数环于液体发酵培养基中，30℃培养24h，得到种子液。
4、获取褐藻胶裂解酶粗酶液
按2%（体积分数）的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中，30℃、220r/min摇瓶培养24h，得到褐藻胶裂解酶粗酶液。
5、获取初解溶液
将10mL褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到1000mL海藻悬液中，40℃水浴中酶解至少24h（可适当延长酶解时间至48h），然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液。
海藻悬液：由铜藻粉末和水混合而成，其中，铜藻粉末过40目筛，铜藻粉末和水的混合比例为1g:20ml。
铜藻粉末的获得方法：冲洗铜藻原料，去除泥沙、贝壳等杂质，晾干（或烘干）后，用粉碎机研磨成粉末，过40目筛。
我们用TLC法对初解溶液进行了检测，检测过程如下：取2mL初解溶液，12000r/min离心5min，取4μL上清于TLC板上点样，取2μL标准品（该标准品中含有聚合度分别为2、3、4、5和6的五种褐藻寡糖）也于TLC板上点样，点样吹干后以正丁醇:甲酸:水=5:4:1为展开剂，展开2h，结束后吹干，喷上显色剂（无水乙醇:硫酸=9:1）后再次吹干，于110 ℃烘箱中放置30min，最后取出TLC板。
检测结果：如图2所示，第1竖栏是标准品，第2竖栏是初解溶液样品，可见初解溶液中含有褐藻三糖和褐藻四糖两种褐藻寡糖。
我们用TLC法对制得的褐藻寡糖也进行了TLC板检测（检测过程同上），检测结果如图3所示。检测结果显示：主要产物为褐藻三糖和褐藻四糖，与初解溶解的检测结果一致。
综上，由于芽孢杆菌Alg可产高活力褐藻胶裂解酶，所以利用芽孢杆菌Alg来制备褐藻寡糖时，不仅有效降低了褐藻寡糖的制备成本，而且还提高了褐藻寡糖的生产效率。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一株可产高活力褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于，该芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2018年07月17日，保藏编号为CGMCC No.16120。
2.利用权利要求1所述的芽孢杆菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将权利要求1所述的芽孢杆菌先在分离纯化培养基上进行活化，然后在液体发酵培养基中进行驯化培养；
步骤2：在对数生长期时对菌株进行稀释分离，然后涂布到分离纯化培养基的表面，之后挑取种子菌株；
步骤3：将挑取出来的种子菌株接数环于液体发酵培养基中，培养得到种子液；
步骤4：按2%的接种量将上述种子液接入到液体发酵培养基中，震荡培养，得到褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤5：将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:100的体积比加入到海藻悬液中，40℃水浴中酶解至少24h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
步骤6：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述分离纯化培养基的配方为：
蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L，调pH 值至7.3±0.1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠2-10g/L、硫酸铵2-6g/L、硫酸镁 0.5-2g/L、磷酸氢二钾1-4g/L、硫酸亚铁0.01-0.05g/L，调pH 值至7.3±0.1。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述液体发酵培养基的配方为：
海藻酸钠10g/L、硫酸铵5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸亚铁0.03g/L，调pH值至7.3±0.1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3中，培养温度为30℃，培养时间为24h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤4中，培养温度为30℃，摇床的转速为220r/min，培养时间为24h。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤5中，海藻悬液是由40目大小的铜藻粉末和水以1g:20ml的比例混合而成的。
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