WO2007010855A1

WO2007010855A1 - 微生物によるｎ－アセチル－ｄ－グルコサミンの醗酵生産方法

Info

Publication number: WO2007010855A1
Application number: PCT/JP2006/314063
Authority: WO
Inventors: Tetsuya Mori; Wakako Ichikawa; Yuichi Kita; Yasuyuki Tetsuka
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-14
Publication date: 2007-01-25
Also published as: CA2615511A1; US20110059489A1; EP1908847B1; JP4889641B2; US7998723B2; EP1908847A4; CN101223282B; KR101348124B1; JPWO2007010855A1; EP1908847A1; KR20080036612A; CA2615511C; US8383368B2; US20100055746A1; CN101223282A

Abstract

Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの生産能を有する糸状菌、例えば、トリコデルマ　ハマタム　ＡＢ１０２８２株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６２３）あるいはトリコデルマ　ハルジアナム　ＡＢ１０２８３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６２４）をキチン及びキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を含む培地で培養し、培地中にＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを生産、蓄積させ、これを採取することにより、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを製造する。

Description

明細書

微生物による N _ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法

技術分野

[0001] 本発明は、 N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産能を有する新規微生物および該微生物を用、る N -ァセチル -D-ダルコサミンの製造方法に関する。 N—ァセチル— D—ダルコサミンは、医薬品、健康食品、食品などの分野で有用である。背景技術

[0002] N—ァセチル— D—ダルコサミンは、力-やェビなどの甲殻類の外殻に含まれるキチンを構成する単糖であり、食品の中にごく少量含まれている栄養素で、体内でも軟骨細胞力作り出される。ダルコサミンと同様の効果があるとされ、摂取することにより、新しい軟骨の生成を促進し、変形関節症の進行を食い止め、場合によって治癒に向力う効果力 Sあるとヽわれてヽる（新薬と臨牀 Vol. 52, No. 3, p. 301 - 312, 20 03年)。ダルコサミンは苦味を呈するのに対し、 N—ァセチルー D—ダルコサミンは蔗糖 (シユークロース）の約 50%の甘味を有するので、摂取しやすいという利点があるため、ダルコサミンに代替する物質として N—ァセチルー D—ダルコサミンが注目されている。

[0003] 従来の N—ァセチルー D—ダルコサミンの製造方法は、力-やェビなどの甲殻類の殻を原料として製造されている。その製造法を概略すると、甲殻類の殻を破砕し、これを稀酸で脱灰し、アルカリで除タンパクを行い、精製されたキチンを得たのち、このキチンを酸で加水分解してダルコサミンを生成させ、次に生成したダルコサミンを無水酢酸でァセチル化するとヽぅ工程により N—ァセチル— D—ダルコサミンを得る方法である。

[0004] また、精製されたキチンを酸で部分加水分解する方法 (例えば、特許文献 1参照）、あるいはキチンを原料とし、微生物の生産する酵素により分解し、 N—ァセチル— D —ダルコサミンを製造する方法がある (例えば、特許文献 2、特許文献 3参照)。さらに、キチンを酸による部分加水分解後、酵素を作用させる方法がある（例えば、特許文献 4参照)。 [0005] また一方、その他の製造方法として、クロロウィルスに感染したクロレラ細胞またはクロロウィルス由来の遺伝子を導入した組換え大腸菌の、ずれかを培養して N ァセチルー D ダルコサミンを生産する方法 (例えば、特許文献 5参照）、遺伝子組換え微生物、具体的には遺伝子組み換え大腸菌を用いて N ァセチルー D ダルコサミンを醜酵生産する方法がある (例えば、特許文献 6参照)。

特許文献 1 :特開 2000— 281696号公報

特許文献 2 :特表 2000— 513925号公報

特許文献 3 :特開 2004— 41035号公報

特許文献 4：特開昭 63 - 273493号公報

特許文献 5：特開 2004 - 283144号公報

特許文献 6 :国際公開第 2004Z003175号パンフレット

発明の開示

[0006] 以上のような力-やェビの甲羅や殻を原料とし、化学的に加水分解して N ァセチルー D ダルコサミンを製造する方法では高濃度の酸溶液ある!/ヽはアルカリ溶液を使用するため多量の廃液が出るという問題がある。また、力二やェビの甲羅や殻由来のキチンを微生物で、ある!、は微生物の生産する酵素で分解して N ァセチル D —ダルコサミンを作る方法では収率が悪ぐコスト高になるという問題がある。

[0007] また、力二やェビの甲羅や殻が原料の場合、甲殻類アレルギーを持っている人が摂取したときにアレルギーを起こすという懸念がある。さらに原料であるキチンを水産資源に頼っているため、漁獲量によって供給量が変動するという問題があり、近年では乱獲による環境破壊が懸念されて、る。

[0008] 一方、クロロウィルスに感染したクロレラ細胞を用いる培養生産方法では、細胞を破砕して N ァセチル一 D—ダルコサミンを得るため、操作が煩雑になる問題があり、また遺伝子組換え微生物を用 V、て N ァセチル D ダルコサミンを作る方法では、設備上拡散防止処置をとらねばならず、操作が煩雑になることや食品の安全性に関する社会通念上問題がある。

[0009] したがって、本発明の目的は、菌体外に N ァセチルー D ダルコサミンを生産する能力を有する新規微生物、および N ァセチル D ダルコサミン生産能を有する微生物を用、る N ァセチル -D-ダルコサミンの安定かつ安価でさらに安全な製造方法を提供することにある。

[0010] 本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者らにより、天然より単離されたある種の糸状菌またはその変異株が、 N—ァセチルー D ダルコサミンのポリマーであるキチンやそのオリゴマーであるキチンオリゴ糖以外の炭素源を含む培地中で、 N ァセチル -D-ダルコサミンを生産することを初めて見出した。またこの糸状菌を液体培地で培養することにより、 N ァセチルー D グルコサミンを培地中に高濃度に生産させ、かつ効率よく分離することに成功し、本発明を完成した。

[0011] すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。

(1) N ァセチル -D-ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株を、キチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を含む培地に培養し、培地中に N ァセチルー D ダルコサミンを生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、 N ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

(2) 前記炭素源および窒素源を追加しながら培養を行うことを特徴とする、（1)の N ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

(3) N ァセチルー D ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株力トリコデルマ属 (Trichoderma)に属する糸状菌の非遺伝子組換え株であることを特徴とする、（1)または（2)の N ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

(4) N ァセチルー D ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株力 ^s、トリコテノレマノヽマタム (Trichoderma hamatum)、トリコテノレマノヽノレジアナム、丄、 richoderma harzianum)、トリコアノレマリ ~~セィ (Trichoderma reeseiノめるいはトリコデルマビリデ（Trichoderma viride)のいずれかの非遺伝子組換え株であることを特徴とする、 (3)の N ァセチルー D—ダルコサミンの醱酵生産方法。

(5) N ァセチルー D ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が、トリコデルマハマタム AB10282株（Trichoderma hamatum AB1028 2 FERM BP— 10623)あるいはトリコデルマハルジァナム AB10283株（Trie hoderma harzianum AB10283 FERM BP— 10624)のいずれかであることを特徴とする、（4)の N—ァセチルー D—ダルコサミンの醱酵生産方法。

(6) N—ァセチル— D—ダルコサミンの生産能を有する、トリコデルマハマタム（Tr ichoderma hamatum) FERM BP— 10623株あるいはトリコデルマハルジアナム（Trichoderma harzianum) FERM BP— 10624株。

(7) トリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum) FERM BP— 10623株あるいはトリコデルマノヽルジァナム（Trichoderma harzianum) FERM BP— 106 24株に変異を導入することにより得られる、 N -ァセチル -D-ダルコサミンの生産能を有する変異株。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 次に、本発明を詳細に説明する。

本発明の N—ァセチル -D-ダルコサミンの製造法は、 N—ァセチル -D-ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株をキチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源と窒素源を含む培地で培養し、培地中に N—ァセチル -D-ダルコサミンを生成、蓄積させ、培地から分離'精製し、 N—ァセチルー D—ダルコサミンを得ることよりなる。

[0013] 本発明の方法で用いられる N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株としては、 N—ァセチルー D—ダルコサミンを生産する能力を有する非遺伝子組み換え糸状菌であればいかなるものでもよいが、天然より N— ァセチルー D—ダルコサミン生産能を指標に単離された糸状菌またはその変異株などが挙げられる。ここで、「N—ァセチル— D—ダルコサミンを生産する能力」とは、糸状菌をキチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源と窒素源を含む培地で培養したときに培地中に十分な量、好ましくは 0. OlmgZmL以上 (振とう培養時）、より好ましくは 0. lmgZmL以上（振とう後、静置培養時）の N—ァセチルー D—ダルコサミンを蓄積することができる能力をいう。このような糸状菌としては、例えば、具体的には、 N -ァセチル -D-ダルコサミンの生産能を有するトリコデルマ（Trichoderma)属に属する糸状菌が挙げられる。

[0014] N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌は、好適な培地、好ましくは液体培地で培養し、該培地中に蓄積された N—ァセチル -D-ダルコサミンの有無を調べることによって、探索することができる。培地中の N—ァセチルー D—ダルコサミンの検出は、例えば、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)を用いた分析により、標準品の N -ァセチル -D-ダルコサミンと比較して行なうことができる。

[0015] 本発明に用いる糸状菌の具体的な例としては、標準菌株であるトリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum NBRC31291)、トリコデルマハルジァナム（Trie hoderma harzianum NBRC31292)、トリコテノレマリーセィ (Trichoderma re esei ATCC24449)、トリコデルマビリデ (Trichoderma viride NBRC31137 )や本発明者らが神奈川県厚木市より採取した土壌試料力新たに分離した AB102 82株および AB10283株がある。この新たに分離した AB10282株および AB1028 3株は、不完全糸状菌綱（Hyphomycetes)、トリコデルマ属（Trichoderma属）に属する菌株であり、本発明の方法に好適に用いられる N—ァセチルー D—ダルコサミン生産菌の一例である。

[0016] この AB10282および AB10283株の菌学的性質を以下に記載する。

[0017] 1. AB10282株の菌学的性質

(1)培養的 ·形態的性質

(a) AB10282株をコーンミール寒天培地において 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 56〜58mmに達する。培養 7日目の集落は平坦で気生菌糸は少ない。集落表面および裏面は無色を呈する。

(b)麦芽エキス寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 68 〜70mmに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに羊毛状の気生菌糸を生じる。培養 7日目の集落は羊毛状を呈し、集落表面は淡白色を呈する。裏面は淡白色を呈する。

(c)ポテト'デキストロース寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2 日目で 68〜70mmに達する。集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、集落表面は淡白色〜淡黄白色で、裏面は淡白色〜淡黄白色を呈する。

(d)ッァペック寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 29〜 31mmに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに綿毛状〜羊毛状を呈する。集落表面は薄い白色で、裏面は薄い白色を呈する。 (e)コーンミール寒天培地で 25°C、 7日間培養したときの AB10282株の光学顕微鏡による観察結果を以下に記載する。

菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は幅 2. 0〜6. O /z mで、無色、平滑で隔壁を有する。分生子柄は、平滑で、隔壁を有し、先端がしばしば不稔を呈し、短く丸みをおびたフィアライドを密生する。フィアライドは、分生子柄にほぼ直角に生じ、短く丸みをおびたボーリングのピン状を呈し、無色、平滑で、長さ 4. 0〜 6. O ^ m,幅は最も広い部位において 2. 5〜3. 5 mである。分生子はフィアライド先端から多数形成され、単細胞で、無色、平滑、だ円形〜長だ円形を呈し、大きさが 3. 0〜4. 5 X 2. 4〜2. 8 mである。

(2)生理学的性質

(a)生育温度

麦芽エキス寒天培地を用いて、 5。C、 10。C、 15。C、 20。C、 25。C、 30。C、 35。C、 37 °Cおよび 40°Cの各温度で培養した結果、 AB 10282株は 10°C〜 30°Cまで何れの温度でも生育し、最適生育温度は 20〜25°C付近である。

(b)生育 pH

pHを 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10【こ調整した麦芽エキス寒天培地を用!ヽて、 25 °Cで培養した結果、 AB10282株は pH3〜10まで生育し、最適生育 pHは、 5〜6である。

2. AB10283株の菌学的性質

(1)培養的 ·形態的性質

(a) AB10283株をコーンミール寒天培地において 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 63〜65mmに達する。集落は平坦でのち綿毛状〜羊毛状を呈する。集落表面は灰緑色〜暗緑色で、裏面は薄!、灰緑色〜薄!、暗緑色を呈する。

(b)麦芽エキス寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 76 〜78mmに達する。集落ははじめ、気生菌糸は少なく白色を呈するが、しだいに綿毛状〜羊毛状の気生菌糸を生じる。培養 7日目の集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、分生子形成に伴い集落表面は黄緑色〜暗緑色を呈する。分生子形成は中心部を除いて集落全体で認められるが、分生子形成体が周辺部および中間部で輪状を呈する。裏面は黄緑色〜暗緑色を呈する。

(c)ポテト'デキストロース寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2 日目で 63〜65mmに達する。培養 7日目の集落は綿毛状〜羊毛状を呈し、気生菌糸は豊富で中心部がやや隆起し、分生子形成に伴い中心部は黄緑色〜薄い緑色を呈する。集落表面は中心部が黄緑色〜薄い緑色で、裏面は淡白色〜淡黄白色を呈する。

(d)ッァペック寒天培地を用いて 25°Cで培養したとき、集落の直径は 2日目で 35〜 37mmに達する。集落は中心部が平坦で、周辺部は綿毛状を呈する。分生子形成は周辺部で輪状を呈し、分生子形成に伴！、集落表面は灰緑色〜暗緑色を呈する。集落表面は灰緑色〜暗緑色で、裏面は薄!、灰緑色〜薄!、緑色を呈する。

(e)コーンミール寒天培地で 25°C、 7日間培養したときの AB10283株の光学顕微鏡による観察結果を以下に記載する。

菌糸は隔壁を有し、培地中および培地上に伸長する。菌糸は幅 2. 0〜8. O /z mで、無色、平滑で隔壁を有する。分生子形成に伴い集落表面は無色からのち灰緑色〜暗緑色を呈する。分生子形成は集落全体で認められるが、分生子形成体が輪状を呈する。分生子柄は、平滑で、隔壁を有し、フィアライドを分生子柄にほぼ直角に生じ、あまり密に形成されない。フィアライドは短く丸みをおびたボーリングのピン状を呈し、無色、平滑で、長さ 5. 0〜8. O ^ m,幅は最も広い部位において 2. 5〜3. 5 /z mである。分生子はフィアライド先端から多数形成され、単細胞で、無色、平滑、球形〜亜球形を呈する。大きさは 2. 4〜3. 0 X 2. 4〜2. 8 mで、長さと幅の比は 1. 00〜： L 15である。

(2)生理学的性質

(a)生育温度

麦芽エキス寒天培地を用いて、 5。C、 10。C、 15。C、 20。C、 25。C、 30。C、 35。C、 37 °Cおよび 40°Cの各温度で培養した結果、 AB 10283株は 10°C〜 35°Cまで何れの温度でも生育し、最適生育温度は 25〜30°C付近である。

(b)生育 pH

pHを 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9および 10【こ調整した麦芽エキス寒天培地を用!ヽて、 25 °Cで培養した結果、 AB10283株は pH3〜10まで生育し、最適生育 pHは、 5〜7と思われる。

[0019] 以上の菌学的性質力も AB10282株および AB10283株の分類学上の位置をジェィ.エイ.フォン.アークス著、ザ .ジェネラ .ォブ .ファンジャィ ·スポルレイティング ·イン

'ピュア'カルチャー、第 3版、ジエイ'クレイマー社、バダッッ、 1981年 (J. A. von Arx, The Genera oi Fungi Sporulaung m Pure Culture, drd ed. , J. Cramer, Vaduz, 1981)に従って検索した。その結果、 AB10282株および AB10 283株はトリコデルマ属に属することが認められた。さらに、種の同定を奥田徹、防菌防黴、 Vol. 20、 p. 157—166、 1992年に従って検索した結果、 AB10282株はトリコデルマノ、マタム、 AB10283株はトリコデルマハルジァナムに属することが認められた。本発明者らは、 AB10282株をトリコデルマハマタム AB10282 (Trichod erma hamatum AB10282)、 AB10283株をトリコデルマハルジァナム AB1 0283 (Trichoderma harzianum AB10283)と命名した。

[0020] なお、 AB10282株は、平成 17年 5月 20日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（干 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM P— 20543として寄託され、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP— 10623の受託番号で寄託されている。また、 AB10283株は、平成 17年 5月 20日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM P— 20544として寄託され、その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP— 10624の受託番号で寄託されている。

[0021] 本発明に使用されるトリコデルマハマタム、トリコデルマハルジァナム、トリコデルマリーセィ、トリコデノレマビリデ、トリコデノレマハマタム AB10282 (Trichoderm a hamatum AB10282)およびトリコデルマハノレジァナム AB10283 (Trichod erma harzianum AB10283)株は、例えば、ポテト'デキストロース寒天培地のスラント上で保存することができる。しかし、スラント上では継代することで自然変異する可能性があるため、凍結乾燥保存を行うことにより、安定に保存することができる。

[0022] 以上、 N—ァセチル— D—ダルコサミン生産菌の一例であるトリコデルマハマタム、トリコデルマハルジァナム、トリコデルマリーセィ、トリコデルマピリデ、 AB1028 2株および AB10283株について説明した力一般的には糸状菌類はその菌学的性状が極めて変化しやすぐ安定したものではない。糸状菌類は、自然的あるいは通常行われている紫外線照射、 X線照射、変異誘発剤（例えば、 N—メチルー N—-トロ N 二トロソグァ二ジンなど）を用いた人為的変異手段により変異誘発することは周知の事実である。このような自然変異株ならびに人工変異株も含め、糸状菌に属し N ァセチル D ダルコサミンを生産する能力を有する菌株はすべて本発明に使用することができる。

なお、人為的に変異を導入する場合、変異導入前の親株に対し、それ以上、好ましくは 1.5倍以上の N ァセチル D ダルコサミン生産能を有する変異株を選択することが好ましい。

[0023] その他、トリコデルマに属する糸状菌としては、トリコデルマァウレオビリデ (T. aur eoviride)、トリコデルマコ -ンギ（T. koningi)、トリコデルマピルリフエラム（T. pil uliferum)などが挙げられる力すべて N ァセチルー D ダルコサミンの生産に使用できる。

[0024] 本発明の方法を実施するに当っては、糸状菌に属する N—ァセチルー D—ダルコサミン生産能を有する菌を、用いる糸状菌に好適な培地、例えば、通常の微生物が利用しうる栄養物を含有する培地、好ましくは液体培地中におヽて培養するのが好ましい。該生産菌の培養には、微生物の培養に用いられる通常の培養方法が適用される。栄養源としては、使用された糸状菌が資化しうる炭素源、窒素源および無機塩などを程よく含有する培地であれば天然培地、合成培地の!/、ずれでも利用できる。

[0025] 本発明の N ァセチルー D ダルコサミンの醱酵生産方法では、 N ァセチルー D ダルコサミンのポリマーであるキチンやそのオリゴマーであるキチンオリゴ糖を原料として培地に含み、それを分解して N ァセチル D ダルコサミンを生成するという分解反応ではなぐ糸状菌の細胞壁成分であるキチンの生合成反応を利用し、その中間体である N ァセチルー D—ダルコサミンを生産する。したがって、炭素源および窒素源としては、キチンゃキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を用いる。原料として用いる炭素源としては、グルコース、フルクトース、シユークロース、ガラクトース、デキストリン、グリセロール、澱粉、水飴、糖蜜、動 ·植物油などが利用できる。また、窒素源としては、魚粉、大豆粉、小麦胚芽、コーンスティープリカ一、綿実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、塩ィ匕アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモユウム、酢酸アンモ-ゥム、硝酸ナトリウム、尿素などを使用できる。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、塩素、燐酸、硫酸あるいはその他のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することもできる。また、使用する N—ァセチルー D—ダルコサミン生産菌の生育を助け、 N—ァセチル -D-ダルコサミンの生産を促進するような無機物質および (または）有機物質を添加することもできる。

[0026] なお、炭素源および窒素源は培養開始時の培地に加えるだけでなぐ培養中に追加することが好ましい。具体的には、炭素源、窒素源はその培養液中の濃度を測定し、完全に消費される前に添加することが望ましい。

[0027] トリコデルマ属糸状菌、トリコデルマハマタム AB10282 (Trichoderma hamat urn AB10282)および、トリコデルマハノレジァナム AB10283 (Trichoderma harzianum AB10283)株の生育に好適な培地としては、ポテト'デキストロース寒天培地、麦芽エキス寒天培地、あるいは V— 8ジュース寒天培地が挙げられる。 N— ァセチルー D—ダルコサミンの生産に好適な培地としては、実施例に示した培地のほか、ッァペック（改変）培地などが挙げられる。

[0028] N—ァセチルー D—ダルコサミン生産菌の培養方法は、好気的条件下での培養法が適しており、通気下の深部液体培養法も適している。培養温度は、 15〜30°Cが好適であり、 25〜30°Cがより好適である。 N—ァセチルー D—ダルコサミンの蓄積量は、用いた培地の種類や培養条件によって異なるが、通常、振とう培養、静置培養、タンク培養とも 3〜20日間の培養で最高に達する。

[0029] N—ァセチルー D—ダルコサミンを効率よく生産させる培養条件は、前記培地成分の組成、培養温度、撹拌速度、 pH、通気量、種母の培養時間、種母の接種量などを、使用する生産菌株の種類および外部条件などに応じて、適宜に調節あるいは選択して設定する。液体培養において発泡がある場合は、シリコーン油、植物油あるいは界面活性剤などの消泡剤を単独または混合して適宜に培地に配合することができる

[0030] 培養の終了するためには、培養物中に生産された N—ァセチルー D—ダルコサミンの蓄積量が最高に達した時点で培養を停止することが好まし、。 N ァセチル D ダルコサミンの単離はその培養物から、醱酵生産物を得る一般的な方法に準じて

N ァセチルー D ダルコサミンの単離を行うのがよい。具体的には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化あるいは膜分離などにより、 N ァセチルー D ダルコサミンを培地から単離することができる。

[0031] 本発明を実施例により更に具体的に説明する。ただし、本発明は以下の態様に限定されない。

実施例 1

[0032] グルコース 4. 0%、硫酸アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシゥム。. 01%、リン酸二水素カリウム。. 02%、リン酸水素二カリウム。. 18%、 pH無調整の培地 100mlをバッフル付き 500ml容三角フラスコに入れ、トリコデルマ属糸状菌をスラントから一白金耳接種し、 5日間、 27°Cで回転数 180rpmのロータリーシェ一力一で好気培養した後、 2日間 27°Cで静置培養した。培養上清を HPLCで分析し、標準品の N ァセチル -D-ダルコサミンと比較した結果、生産物質はすべての菌株において N ァセチル -D-ダルコサミンと同定された。

HPLC条件

カラム； Wakosil 5NH2カラム（φ 4. 6mm X 250mm)、

移動相；ァセトニトリル：水 = 80： 20、

流速； 2mlZ分、

カラム温度； 20°C、

検出; RI

[0033] 培養を行ったトリコデルマ属糸状菌の菌株ごとの N ァセチルー D—ダルコサミンの生産量を表 1に示す。

[0034] [表 1] 培養上清中の N -ァセチル- D -グルコサミン量

実施例 2

[0035] 紫外線照射による変異導入

トリコデルマノヽマタム AB10282 (Trichoderma hamatum AB10282)の分生胞子を 10mlのリン酸緩衝液 (pH6. 0)に懸濁した。この胞子液をシャーレに移し、回転子を入れ、スターラーで回転させながら、 20W紫外線ランプを使用し、距離 20c m、 3分間照射させた。紫外線照射後、胞子液を稀釈し、コーンスターチ 4.0%、塩ィ匕アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシウム 0. 1%、リン酸二水素カリゥム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム. 12水和物 0. 08%、寒天 1. 5%、 pH7. 0の平板培地に広げ、生育したコロニーを分離した。分離したコロニーはコーンスターチ 4.0 %、塩化アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシウム 0. 1%、リン酸二水素カリウム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム · 12水和物 0. 08%、pH7. 0の培地 5mlを入れた試験管に接種し、 27°Cで 7日間振盪培養し、 AB10282株と比較して N -ァセチル -D-ダルコサミンの生産量が増加した変異株を選抜した。

[0036] N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産

コーンスターチ 4. 0%、塩化アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシゥム 0. 1%、リン酸二水素カリウム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム · 12水和物 0. 0 8%、 pH7. 0の培地 200mlをバッフル付き 500ml容三角フラスコに入れ、紫外線照射の変異処理により N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産量が増加した上記トリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum)変異株をスラントから一白金耳接種し、 27°Cで回転数 180rpmのロータリーシェーカーで好気培養し、 6、 7、 8、 10および 12日目のそれぞれに 50%グルコース Z5%酢酸アンモ-ゥム溶液を 2mlずつ添カロし、 15日間培養した。培養上清を HPLCで分析し、標準品の N ァセチルー D グルコサミンと比較した結果、生産物質は N ァセチル -D-ダルコサミンと同定された。前記培養により 5mgZmlの N -ァセチル D ダルコサミンを含む培養液が得られた。

実施例 3

[0037] 変異誘発剤による変異導入

トリコデルマハマタム AB10283 (Trichoderma hamatum AB10283)の分生胞子を 4mlのクェン酸緩衝液（pH6. 0)〖こ懸濁した。この胞子液に N—メチルー N —ニトロ— N—二トロソグァ二ジンを加え（最終濃度 50 lZml)、 37°Cで 30分間保温した。その後、遠心分離 (3500 X g)を行い、上澄み液を捨て、再度クェン酸緩衝液 (pH6. 0)に懸濁、遠心操作により、胞子を洗浄した。 N—メチル N 二トロ— N -トロソグァ-ジン処理した胞子液を稀釈し、コーンスターチ 4.0%、塩化アンモ- ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシウム 0. 1%、リン酸二水素カリウム 0. 0 2%、リン酸水素ニナトリウム · 12水和物 0. 08%、寒天 1. 5%、 pH7. 0の平板培地に広げ、生育したコロニーを分離した。分離したコロニーはコーンスターチ 4.0%、塩ィ匕アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、硫酸マグネシウム 0. 1%、リン酸二水素カリウム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム. 12水和物 0. 08%、pH7. 0の培地 5mlを入れた試験管に接種し、 27°Cで 7日間振盪培養し、 AB10283株と比較して N ァセチル D ダルコサミンの生産量が増加した変異株を選抜した。

[0038] N ァセチルー D—ダルコサミンの生産

コーンスターチ 4. 0%、塩化アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 4%、リン酸二水素カリウム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム. 12水和物 0. 08%、pH7. 0の培地 200 mlをバッフル付き 500ml容三角フラスコに入れ、 N -メチル N 二トロ一 N—二トロソグァ-ジンの変異処理により、 N ァセチル -D-ダルコサミンの生産量が増加した上記トリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum)変異株をスラントから一白金耳接種し、 27°Cで回転数 180rpmのロータリーシェーカーで好気培養し、 6、 7、 8 、 10および 12日目のそれぞれに 50%グルコース Z5%塩化アンモ-ゥム溶液を 2ml ずつ添加し、 15日間培養した。培養上清を HPLCで分析し、標準品の N ァセチル — D—ダルコサミンと比較した結果、生産物質は N -ァセチル -D-ダルコサミンと同定された。前記培養により 3mgZmlの N -ァセチル— D—ダルコサミンを含む培養液が得られた。

実施例 4

[0039] グルコース 6.0%、塩化アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 6%、リン酸二水素カリゥム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム. 12水和物 0. 08%、pH7. 0の培地 75mlをバッフル付き 500ml容三角フラスコに入れ、実施例 2で得られた紫外線照射の変異処理により N—ァセチル -D-ダルコサミンの生産量が増加したトリコデルマハマタム (Trichoderma hamatum)変異株をスラントから一白金耳接種し、 27°Cで回転数 1 80rpmのロータリーシェーカーで好気培養し、 4、 7、 9、 11、 13曰目に 50%グルコース Z5%酢酸アンモ-ゥム溶液を 3mlずつ添加した後、 15日間培養した。培養上清を HPLCで分析し、標準品の N—ァセチルー D—ダルコサミンと比較した結果、生産物質は N -ァセチル -D-ダルコサミンと同定された。前記培養により 13mgZml の N -ァセチル -D-ダルコサミンを含む培養液が得られた。

実施例 5

[0040] グルコース 6. 0%、塩化アンモ-ゥム 0. 1%、酵母エキス 0. 6%、リン酸二水素カリゥム 0. 02%、リン酸水素ニナトリウム. 12水和物 0. 08%、 pH7. 0の培地 2. 0Lを 4 L容ジャーフアーメンターに入れ滅菌後、あら力じめ前培養した、実施例 2で得られた紫外線照射の変異処理により N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産量が増加したトリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum)変異株を接種し、培養温度 27°C 、攪拌回転数 450rpm、通気量 2LZminで 3、 5、 7および 9日目のそれぞれに 50% グルコース Z5%酢酸アンモ-ゥム溶液を 20mlずつ添カ卩し、 27°Cで 10日間培養した。

[0041] 培養上清の N—ァセチルー D—ダルコサミンを HPLCで測定した結果、 N—ァセチル— D—ダルコサミン濃度は 15mgZmlであった。その培養液 2. 0Lの遠心上清を活性炭 200ml充填したカラムに通過させ、その後このカラムに 200mlのイオン交換水を通過させた。その通過液を強酸性陽イオン交換榭脂デュオライト (登録商標) C - 20 (H+型） 200mlを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに 200mlのィォン交換水を通過させた。さらにその通過液を弱塩基性陰イオン交換榭脂デュオライト

(登録商標) A378D (OH—型） 200mlを充填したカラムに通過させ、その後このカラムに 200mlのイオン交換水を通過させた。

[0042] 通過液を減圧下濃縮乾固し、 20gの固形物を得た。これを蒸留水 20mlに溶解した水溶液にアセトンを 50ml添加し、結晶化操作を行なったところ、純度 95%の N—ァセチル D—ダルコサミンの結晶様粉末として 12g得られた。このようにして得られた結晶様粉末の NMR分析を行なったところ、その¹ H— NMRケミカルシフト値及び¹³ C - NMRケミカルシフト値が、 N -ァセチル -D-ダルコサミンの文献値と一致した。産業上の利用可能性

[0043] 本発明の N ァセチルー D ダルコサミンの製造法は、安定した N ァセチルー D ダルコサミンの生産 ·供給を実現するものであり、該製造法を用、れば N ァセチルー D ダルコサミンを効率よぐ安全で安価に製造することが可能となる。また、本発明の微生物は、上記 N ァセチルー D ダルコサミンの製造法に、好適に使用することがでさる。

Claims

請求の範囲

[1] N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株を、キチンおよびキチンオリゴ糖以外の炭素源および窒素源を含む培地に培養し、培地中に N—ァセチルー D—ダルコサミンを生成、蓄積させ、これを採取することを特徴とする、 N—ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

[2] 前記炭素源および窒素源を追加しながら培養を行うことを特徴とする、請求項 1に記載の N—ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

[3] N—ァセチル— D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が

、トリコデルマ属 (Trichoderma)に属する糸状菌の非遺伝子組換え株であることを特徴とする、請求項 1または請求項 2に記載の N—ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

[4] N—ァセチル— D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が

、トリコデノレマノヽマタム (Trichoderma hamatum)、トリコデノレマノヽノレジァナム ( Trichoderma harzianum)、トリコ "ノレマリ ~~セィ (Trichoderma reeseiノあるヽはトリコデルマビリデ（Trichoderma viride)のいずれかの非遺伝子組換え株であることを特徴とする、請求項 3に記載の N—ァセチルー D—ダルコサミンの醱酵生産方法。

[5] N—ァセチル— D—ダルコサミンの生産能を有する糸状菌の非遺伝子組換え株が

、トリコデルマハマタム AB10282株（Trichoderma hamatum AB10282 F ERM BP— 10623)あるいはトリコデルマハノレジァナム AB10283株（Trichode rma harzianum AB10283 FERM BP— 10624)のいずれかであることを特徴とする、請求項 4に記載の N—ァセチル -D-ダルコサミンの醱酵生産方法。

[6] N—ァセチル— D—ダルコサミンの生産能を有する、トリコデルマハマタム（Trich oderma hamatum) FERM BP— 10623株あるいはトリコデルマハルジアナム（ Trichoderma harzianum) FERM BP— 10624株。

[7] トリコデルマハマタム（Trichoderma hamatum) FERM BP— 10623株あるいはトリコデルマノヽルジァナム（Trichoderma harzianum) FERM BP— 10624 株に変異を導入することにより得られる、 N—ァセチルー D—ダルコサミンの生産能を有する変異株。