JP2001078795A - 非晶質のキチンを基質とする酵素によるn−アセチル−d−グルコサミンの製造方法 - Google Patents

非晶質のキチンを基質とする酵素によるn−アセチル−d−グルコサミンの製造方法

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JP2001078795A JP25317999A JP25317999A JP2001078795A JP 2001078795 A JP2001078795 A JP 2001078795A JP 25317999 A JP25317999 A JP 25317999A JP 25317999 A JP25317999 A JP 25317999A JP 2001078795 A JP2001078795 A JP 2001078795A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 人体に対して安全なN−アセチル−D−グル
コサミンを効率良く製造できる、非晶質のキチンを基質
とする酵素によるN−アセチル−D−グルコサミンの製
造方法を提供する。 【解決手段】 脱アセチル化されていない非晶質のキチ
ン2又は均一に部分脱アセチル化された脱アセチル化率
1乃至20%の非晶質のキチンを基質とし、卵白由来
のリゾチームと、トリコデルマ(Trichoderma)属に属
する不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵素3を
使用することによって、前記リゾチームで前記キチン2
等を低分子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低
分子からN−アセチル−D−グルコサミン1を遊離させ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は、例えば甘味料等
として使用可能なN−アセチル−D−グルコサミンの製
造方法、より詳しくは、非晶質キチン類を基質とする酵
素によるN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法に
関する。
【0002】
【従来の技術】従来から、D−グルコサミンは、軟骨組
織の誘導効果を有することが知られており、欧米では変
形性関節症の治療薬として認可を受けている。一方、わ
が国では食品添加物として認可を受けており、主に甘味
料として使用されている。しかしながら、このD−グル
コサミンは、甘さを呈するものの、若干の渋みを伴うの
で、食品添加物として使用するには味覚の点から問題が
ある。
【0003】これに対し、D−グルコサミンがN−アセ
チル化された単糖であるN−アセチル−D−グルコサミ
ンは、さわやかな甘さを呈するので、D−グルコサミン
に代わり得る化合物として注目を集めており、これを大
量に製造する方法の開発が望まれている。
【0004】N−アセチル−D−グルコサミンは、例え
ばカニ、エビ、イカ等の細胞壁等を構成するキチンの構
成単位であるので、このキチンを何らかの方法で分解で
きればN−アセチル−D−グルコサミンの製造が可能で
あるが、このために大きく分けて、強酸による分解とキ
チン分解酵素による分解の2つの方法が知られている。
【0005】強酸を用いる方法としては、例えば、 (1) 図1(c) 及び図1(d) に示すように、キチン4を強
酸で完全に加水分解して得られるD−グルコサミン10
を、ナトリウムメトキシドと無水酢酸で化学的に変換
(N−アセチル化)することによって製造する方法(In
oue, Y.; Onodera, K.; Kitaoka, S.; Hirano, S.; J.
Am. Chem. Soc., 78, 4722-4724, 1956)等が知られて
いる。
【0006】また、キチン分解酵素を用いる方法として
は、図1(e) に示すように、キチン分解酵素11をキチ
ン4に作用させる方法が考えられるが、キチン4の高い
結晶性のためにほとんど分解せず、未分解物12が多く
残ると考えられるので、 (2) 図1(f) 及び図1(g) に示すように、キチン4を酸
で部分加水分解して得られるN−アセチルキトオリゴ糖
13に、加水分解能を有する酵素14を作用させること
によって製造する方法(特公昭63−273493号公
報参照)等に知られるような工夫がなされている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
(1) の方法においては、得られるN−アセチル−D−グ
ルコサミン1が化学合成品であり、天然物としてはみな
されないので、食品添加物として使用できないという問
題点がある。
【0008】また、上記(2) の方法においては、キチン
4を酸で部分加水分解する段階での収量低下が著しいの
で、最終的に得られるN−アセチル−D−グルコサミン
1の収量も低いという問題点がある。
【0009】この発明は、以上のような問題点に鑑みて
なされたものであり、人体に対して安全なN−アセチル
−D−グルコサミンを効率良く製造できる、非晶質キチ
ン類を基質とする酵素によるN−アセチル−D−グルコ
サミンの製造方法を提供することを目的とする。
【0010】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の手段とするところは、非晶質キチン又は均一系部分脱
アセチル化キチンを基質とし、低分子化酵素でこの非晶
質キチン又は均一系部分脱アセチル化キチンを低分子に
加水分解すると共に、単糖化酵素で前記低分子からN−
アセチル−D−グルコサミンを遊離させることにある。
【0011】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施形態を図面
に基づいて説明する。なお、図1(a) に示すように、こ
の実施形態に係るN−アセチル−D−グルコサミン1の
製造方法は、例えば、非晶質キチン2を基質とし、低分
子化酵素と単糖化酵素とからなる酵素3によって、非晶
質キチン2を低分子に加水分解すると共に、これら低分
子からN−アセチル−D−グルコサミン1を遊離させる
ものである。
【0012】非晶質キチン2は、N−アセチル−D−グ
ルコサミン単位1aの含量が100%の非晶質物質であ
る。そのため、この非晶質キチン2は、水等に膨潤し易
い。
【0013】非晶質キチン2を調製するには、例えば図
1(b) に示すように、キチン4をアルカリ処理等すれば
よい。即ち、まず、キチン4の粉末を所定濃度のアルカ
リ水溶液に浸漬し、室温で数時間〜十数時間程度放置し
た後、塩酸等の酸で中和するか、又は、アルコール類や
イオン交換樹脂等で脱アルカリする。その後、アセトン
やメタノール等の有機溶媒中に滴下すれば非晶質キチン
2が沈殿してくるので、これを濾別し、蒸留水等で充分
に洗浄して脱塩等を行えば、精製品を得ることができ
る。なお、アルカリ水溶液としては、アルカリ金属水酸
化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸アルカリ金属塩
等の水溶液を使用すればよいが、特にNaOH、KOH
の水溶液が望ましい。
【0014】酵素3は、低分子化酵素と単糖化酵素とか
ら構成されている。低分子化酵素は、高分子である非晶
質キチン2の分子鎖にランダムに作用して低分子に加水
分解することができる。単糖化酵素は、β−N−アセチ
ルヘキソサミニダーゼ活性を有するものであり、前記低
分子の非還元末端からN−アセチル−D−グルコサミン
1を1分子ずつ遊離させることができる。
【0015】このような低分子化酵素としては、特に限
定されるものではないが、ニワトリ等の卵白由来のリゾ
チームが好適である。即ち、この卵白由来のリゾチーム
は安価であるので、コスト高にならないという利点があ
る。
【0016】単糖化酵素も、特に限定されるものではな
いが、例えばTrichoderma harzianum等の不完全菌トリ
コデルマ類の生産する粗酵素が好適である。この粗酵素
は、例えば、上記の菌体を培養した後の培養液からその
菌体を除去して調製した粗酵素液等として使用すればよ
い。ここで、不完全菌トリコデルマ類の菌体の大きさは
他の微生物に比べて大きく、粗酵素液等の調製時におけ
る除去操作が簡単であるので、このような粗酵素を使用
すれば、製造効率が良いという利点がある。
【0017】N−アセチル−D−グルコサミン1を製造
するには、非晶質キチン2に上記のような低分子化酵素
や、単糖化酵素を含む粗酵素液等を加え、酸性条件下、
36〜37℃程度で数時間〜数十時間撹拌等して反応さ
せればよい。この場合、低分子化酵素と単糖化酵素の共
存下ではなく、低分子化酵素により適当な条件でまず低
分子に加水分解した後、前記粗酵素液等を加えて単糖化
酵素により反応させてもよい。反応を停止するには、例
えば数分間、沸騰水中で加熱等して単糖化酵素等を失活
させればよい。その後は、従来公知の方法でN−アセチ
ル−D−グルコサミン1を単離、精製すればよい。
【0018】このように、水等に膨潤し易い非晶質キチ
ン2を基質とするので、低分子化酵素等との親和性が高
く、そのためN−アセチル−D−グルコサミン1を効率
良く製造できるという利点がある。また、キチン4から
非晶質キチン2を調製する際には収量の低下がほとんど
ないので、最終的に得られるN−アセチル−D−グルコ
サミン1の収率も高いという利点がある。更に、化学的
な変換を伴わないので、人体に対して安全であるという
利点もある。
【0019】なお、この実施形態においては、非晶質キ
チン2を基質とする場合について説明したが、非晶質キ
チン類としてはこれに限定されるものではなく、均一系
部分脱アセチル化キチンを基質としてもよい。
【0020】均一系部分脱アセチル化キチンは、所定含
量のN−アセチル−D−グルコサミン単位1aとD−グ
ルコサミン単位とからなる、ランダムに脱アセチル化さ
れた非晶質物質である。そのため、この均一系部分脱ア
セチル化キチンは、冷水、氷水、水、及び希酸に膨潤し
易い。
【0021】均一系部分脱アセチル化キチンを調製する
には、例えば、まず既述と同様にしてキチン4をアルカ
リ処理した後、これに氷を加えて撹拌するか、又は、分
散液を直接凍結し、次に解凍する操作を繰り返して、非
晶質キチン2のドープ(アルカリキチンドープ)を調製
する。なお、このドープには、生成する均一系部分脱ア
セチル化キチンの分子量低下を抑えるために、必要に応
じてチオフェノールやNaBH4 等をあらかじめ添加し
ておいてもよい。次いで、ドープを50℃以下で所定時
間熟成させて脱アセチル化した後、既述と同様の操作を
行えば、精製品を得ることができる。
【0022】N−アセチル−D−グルコサミン1の製造
の際には、均一系部分脱アセチル化キチンは、既述の非
晶質キチン2の場合と同様、低分子化酵素で低分子に加
水分解される。低分子がD−グルコサミン単位を含んで
いる場合には、単糖化酵素による反応は、N−アセチル
−D−グルコサミン単位1aである非還元末端のみで起
こる。そのため、N−アセチル−D−グルコサミン1の
収率が低下しないようにするには、均一系部分脱アセチ
ル化キチンの脱アセチル化率を1〜50%程度としてお
くのが望ましい。
【0023】このように、均一系部分脱アセチル化キチ
ンを基質とする場合には、非晶質キチン2に比べ、水等
に対してより膨潤し易いので、N−アセチル−D−グル
コサミン1をより効率良く製造できるという利点があ
る。その他の利点は非晶質キチン2と同様である。
【0024】
【実施例】次に、この発明を実施例により更に詳細に説
明するが、この発明は係る実施例に限定されるものでは
ない。
【0025】〔実施例1〕 〔非晶質キチンの調製〕粉末状のキチンTC−L(商品
名,三栄工業社製)5.0g(絶乾重量)をアルカリ水
溶液(NaOH50g/蒸留水75g)に浸漬し、室温
で12時間放置した。その後、強酸でpHを8.4に調
整し、これを有機溶媒中に滴下した。生成した沈殿を濾
別し、蒸留水で塩類がなくなるまで洗浄することによっ
て、非晶質キチンを得た。
【0026】〔菌体の前培養〕不完全菌トリコデルマ類
としては、Trichoderma harzianum(TMIC 60622,財団
法人日本きのこセンター菌蕈研究所より分譲)を使用し
た。この不完全菌を2%グルコース、0.5%ポリペプ
トン、0.2%酵母エキス、0.1%KH2PO4、0.05
%MgSO4・7H2O、及び2%寒天を含む平面シャーレ上の
平面寒天培地に接種し、30℃で3日間、静置培養し
た。
【0027】〔酵素生産〕上記の寒天培地上に広がった
不完全菌の菌糸をコルクボーラー(内径1cm)で寒天
ごと打ち抜き、0.5%非晶質キチン、0.2%ポリペ
プトン、0.01%酵母エキス、0.07%K2HPO4
0.03%KH2PO4、及び0.05%MgSO4・7H2Oを含む
培養液100mLに接種し、30℃、120rpmで回
転培養した。経時的に培養液の一部を取り、キチナーゼ
活性及びβ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそ
れぞれ測定した。その結果を図2に示す。
【0028】〔酵素活性の測定〕キチナーゼ活性は、グ
リコールキチンを基質とし、酵素反応で遊離した還元糖
を定量することによって算出した。即ち、0.1%グリ
コールキチンの0.1M酢酸ナトリウム溶液(pH6.
0)1.0mLに酵素液0.2mLを加え、37℃で1
0分間反応させた。反応終了後、直ちにSchalesの試薬
2.0mLを加えて15分間煮沸した。室温まで放冷
後、420nmの吸光度を測定した。N−アセチル−D
−グルコサミンを標準物質としてあらかじめ検量線を作
成しておき、遊離した還元糖量を算出した。コントロー
ル実験は、グリコールキチン溶液にSchalesの試薬を加
え、次いで酵素液を加えた後、煮沸することによって行
った。なお、酵素活性の1単位(U)は、この反応条件
下で1分間当たりに1μmol のN−アセチル−D−グル
コサミンを遊離するのに必要な酵素量と定義した。
【0029】β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性
は、p−ニトロフェニル−β−N−アセチル−D−グル
コサミニドを基質とし、酵素反応で遊離したp−ニトロ
フェノールを定量することによって算出した。即ち、
0.1mM p−ニトロフェニル−β−N−アセチル−
D−グルコサミニドの0.1M酢酸ナトリウム溶液(p
H6.0)2.0mLに酵素液0.2mLを加え、反応
生成物の最大吸収波長337nmにおける吸光度の増加
を経時的に追跡した。遊離したp−ニトロフェノール量
は、その分子吸光係数(3500M-1・cm-1)及びこ
の吸光度における1分間当たりの増加量から算出した。
なお、酵素活性の1単位(U)は、この反応条件下で1
分間当たりに1μmol のp−ニトロフェノールを遊離す
るのに必要な酵素量と定義した。
【0030】〔実施例2〕 〔粗酵素液の調製〕実施例1とほぼ同様にして不完全菌
の培養を開始した後、第5日目の培養液を0.45μm
のメンブランフィルターにより軽くアスピレーターで吸
引しながらろ過し、浮遊している菌体等を除去した。得
られたろ液をそのまま粗酵素液として以下の操作に使用
した。
【0031】〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グ
ルコサミンの製造〕非晶質キチン0.1gに粗酵素液及
び卵白由来のリゾチーム(和光純薬社製)を加え、更に
HClで反応液のpHを4.5に調整した後、蒸留水で
全量を25mLとした。次いで、37℃で撹拌し、生成
したN−アセチル−D−グルコサミンの量を経時的に測
定した。その結果を図3に示す。
【0032】〔N−アセチル−D−グルコサミンの定
量〕反応液の一部を取り、0.45μmのメンブランフ
ィルターでろ過したろ液をHPLC(高速液体クロマト
グラフィー)〔カラム:Shodex NH2P-504E(4.6mm×250
mm),溶出液:アセトニトリル/水=70/30,流
速:1mL/min,カラム温度:40℃,検出:DI〕によ
り分析した。市販のN−アセチル−D−グルコサミンを
標準物質として検量線を作成し、ピーク面積から、生成
したN−アセチル−D−グルコサミン量を定量した。
【0033】〔実施例3〕 〔均一系部分脱アセチル化キチン(均一系DAC)の調
製〕実施例1と同様にしてキチンTC−Lをアルカリ処
理した後、その溶液に砕氷375gを入れ、室温で氷が
完全に溶けるまで放置することによって、非晶質キチン
のドープ(アルカリキチンドープ)を調製した。次い
で、このドープを30℃で10時間静置、熟成させて部
分脱アセチル化(均一系反応)した。その後、強酸でp
Hを8.4に調整し、これを有機溶媒中に滴下した。生
成した沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がなくなるまで洗浄
することによって、脱アセチル化率が約20%の均一系
部分脱アセチル化キチン(DAC20)を得た。
【0034】〔酵素活性の測定〕非晶質キチンの代わり
に均一系部分脱アセチル化キチンを使用した他は、実施
例1と同様にしてキチナーゼ活性及びβ−N−アセチル
ヘキソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その結果
を図2に示す。
【0035】〔実施例4〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕非晶質キチンの代わりに均一系部分脱アセチル化
キチンを使用した他は、実施例2と同様にして、生成し
たN−アセチル−D−グルコサミンの量を経時的に測定
した。その結果を図3に示す。
【0036】〔比較例1〕 〔酵素活性の測定〕非晶質キチンの代わりにキチンTC
−Lを使用した他は、実施例1と同様にしてキチナーゼ
活性及びβ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそ
れぞれ測定した。その結果を図2に示す。
【0037】〔比較例2〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕非晶質キチンの代わりにキチンTC−Lを使用し
た他は、実施例2と同様にして、生成したN−アセチル
−D−グルコサミンの量を経時的に測定した。その結果
を図3に示す。
【0038】〔比較例3〕 〔酵素活性の測定〕非晶質キチンの代わりにグルコース
を使用した他は、実施例1と同様にしてキチナーゼ活性
及びβ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそれぞ
れ測定した。その結果を図2に示す。
【0039】〔比較例4〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕非晶質キチンの代わりにグルコースを使用した他
は、実施例2と同様にして、生成したN−アセチル−D
−グルコサミンの量を経時的に測定した。その結果を図
3に示す。
【0040】
【発明の効果】以上のように、この発明によれば、水等
に膨潤し易い非晶質キチン又は均一系部分脱アセチル化
キチンを基質とするので、低分子化酵素等との親和性が
高く、そのためN−アセチル−D−グルコサミンを効率
良く製造できるという利点がある。また、キチンから非
晶質キチン等を調製する際には収量の低下がほとんどな
いので、最終的に得られるN−アセチル−D−グルコサ
ミンの収率も高いという利点がある。更に、化学的な変
換を伴わないので、人体に対して安全であるという利点
もある。
【図面の簡単な説明】
【図1】(a) は実施形態に係るN−アセチル−D−グル
コサミンの製造方法を示す模式図、(b) は非晶質キチン
の調製方法を示す模式図。(c) 及び(d) は従来例(1) を
示す模式図、(e) はキチンにキチン分解酵素を作用させ
る方法を示す模式図、(f) 及び(g) は従来例(2) を示す
模式図。
【図2】実施例1、実施例2、比較例1、比較例2にお
けるキチナーゼ活性及びβ−N−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ活性を示すグラフ。
【図3】実施例3、実施例4、比較例3、比較例4にお
けるN−アセチル−D−グルコサミンの収量を示すグラ
フ。
【符号の説明】
1 N−アセチル−D−グルコサミン 2 非晶質キチン 3 酵素(低分子化酵素及び単糖化酵素)
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成12年7月4日(2000.7.4)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 非晶質のキチンを基質とする酵素によ
るN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は、例えば甘味料等
として使用可能なN−アセチル−D−グルコサミンの製
造方法、より詳しくは、非晶質のキチンを基質とする酵
素によるN−アセチル−D−グルコサミンの製造方法に
関する。
【0002】
【従来の技術】従来から、D−グルコサミンは、軟骨組
織の誘導効果を有することが知られており、欧米では変
形性関節症の治療薬として認可を受けている。一方、わ
が国では食品添加物として認可を受けており、主に甘味
料として使用されている。しかしながら、このD−グル
コサミンは、甘さを呈するものの、若干の渋みを伴うの
で、食品添加物として使用するには味覚の点から問題が
ある。
【0003】これに対し、D−グルコサミンがN−アセ
チル化された単糖であるN−アセチル−D−グルコサミ
ンは、さわやかな甘さを呈するので、D−グルコサミン
に代わり得る化合物として注目を集めており、これを大
量に製造する方法の開発が望まれている。
【0004】N−アセチル−D−グルコサミンは、例え
ばカニ、エビ、イカ等の細胞壁等を構成するキチンの構
成単位であるので、このキチンを何らかの方法で分解で
きればN−アセチル−D−グルコサミンの製造が可能で
あるが、このために大きく分けて、強酸による分解とキ
チン分解酵素による分解の2つの方法が知られている。
【0005】強酸を用いる方法としては、例えば、 (1) 図1(c) 及び図1(d) に示すように、キチン4を強
酸で完全に加水分解して得られるD−グルコサミン10
を、ナトリウムメトキシドと無水酢酸で化学的に変換
(N−アセチル化)することによって製造する方法(In
oue, Y.; Onodera, K.; Kitaoka, S.; Hirano, S.; J.
Am. Chem. Soc., 78, 4722-4724, 1956)等が知られて
いる。
【0006】また、キチン分解酵素を用いる方法として
は、図1(e) に示すように、キチン分解酵素11をキチ
ン4に作用させる方法が考えられるが、キチン4の高い
結晶性のためにほとんど分解せず、未分解物12が多く
残ると考えられるので、 (2) 図1(f) 及び図1(g) に示すように、キチン4を酸
で部分加水分解して得られるN−アセチルキトオリゴ糖
13に、加水分解能を有する酵素14を作用させること
によって製造する方法(特公昭63−273493号公
報参照)等に知られるような工夫がなされている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記
(1) の方法においては、得られるN−アセチル−D−グ
ルコサミン1が化学合成品であり、天然物としてはみな
されないので、食品添加物として使用できないという問
題点がある。
【0008】また、上記(2) の方法においては、キチン
4を酸で部分加水分解する段階での収量低下が著しいの
で、最終的に得られるN−アセチル−D−グルコサミン
1の収量も低いという問題点がある。
【0009】この発明は、以上のような問題点に鑑みて
なされたものであり、人体に対して安全なN−アセチル
−D−グルコサミンを効率良く製造できる、非晶質のキ
チンを基質とする酵素によるN−アセチル−D−グルコ
サミンの製造方法を提供することを目的とする。
【0010】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の手段とするところは、脱アセチル化されていない非晶
キチン又は均一部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が39%以下の非晶質のキチンを基質とし、卵白
由来のリゾチームと、トリコデルマ(Trichoderma)属
に属する不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵素
を使用することによって、前記リゾチーム前記キチン
を低分子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低分
子からN−アセチル−D−グルコサミンを遊離させるこ
とにある。
【0011】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施形態を図面
に基づいて説明する図1(a) に示すように、この実施
形態に係るN−アセチル−D−グルコサミン1の製造方
法は、例えば、脱アセチル化されていない非晶質キチ
ン2を基質とし、卵白由来のリゾチーム、トリコデル
マ(Trichoderma)属に属する不完全菌が生産する粗酵
とからなる混合酵素3によって、非晶質キチン2を
低分子に加水分解すると共に、これら低分子からN−ア
セチル−D−グルコサミン1を遊離させるものである。
【0012】非晶質キチン2は、脱アセチル化されて
いない、即ち、N−アセチル−D−グルコサミン単位1
aの含量が100%の非晶質物質である。そのため、こ
の非晶質キチン2は、水等に膨潤し易い。
【0013】非晶質キチン2を調製するには、例えば
図1(b) に示すように、キチン4をアルカリ処理等すれ
ばよい。即ち、まず、キチン4の粉末を所定濃度のアル
カリ水溶液に浸漬し、室温で数時間〜十数時間程度放置
した後、塩酸等の酸で中和するか、又は、アルコール類
やイオン交換樹脂等で脱アルカリする。その後、アセト
ンやメタノール等の有機溶媒中に滴下すれば非晶質
チン2が沈殿してくるので、これを濾別し、蒸留水等で
充分に洗浄して脱塩等を行えば、精製品を得ることがで
きる。なお、アルカリ水溶液としては、アルカリ金属水
酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸アルカリ金属
塩等の水溶液を使用すればよいが、特にNaOH、KO
Hの水溶液が望ましい。
【0014】混合酵素3は、卵白由来のリゾチーム
トリコデルマ(Trichoderma)属に属する不完全菌が生
産する粗酵素とから構成されている。前記リゾチーム
は、高分子である非晶質キチン2の分子鎖にランダム
に作用して低分子に加水分解することができる。前記粗
酵素は、β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性を有
するものであり、前記低分子の非還元末端からN−アセ
チル−D−グルコサミン1を1分子ずつ遊離させること
ができる。
【0015】前記リゾチームは、ニワトリ等の卵白由来
ものであり、安価であるので、コスト高にならないと
いう利点がある。
【0016】前記粗酵素は、トリコデルマ(Trichoderm
a)属に属する例えばTrichoderma harzianum等の不完全
生産するものである。この粗酵素は、例えば、上記
の菌体を培養した後の培養液からその菌体を除去して調
製した粗酵素液等として使用すればよい。ここで、この
ような不完全菌の菌体の大きさは他の微生物に比べて大
きく、粗酵素液等の調製時における除去操作が簡単であ
るので、このような粗酵素を使用すれば、コスト高にな
らないという利点がある。
【0017】N−アセチル−D−グルコサミン1を製造
するには、非晶質キチン2に上記のようなリゾチー
及び粗酵素を含む粗酵素液等を加え、酸性条件下、
36〜37℃程度で数時間〜数十時間攪拌等して反応さ
せればよい反応を停止するには、例えば数分間、沸騰
水中で加熱等して粗酵素等を失活させればよい。その後
は、従来公知の方法でN−アセチル−D−グルコサミン
1を単離、精製すればよい。
【0018】このように、水等に膨潤し易い非晶質
チン2を基質とするので、前記リゾチーム等との親和性
が高い。また、混合酵素を使用して非晶質のキチン2か
N−アセチル−D−グルコサミン1を直接的に製造で
きるので、製造効率が良いという利点がある。更に、キ
チン4から非晶質キチン2を調製する際には収量の低
下がほとんどないので、最終的に得られるN−アセチル
−D−グルコサミン1の収率も高いという利点がある。
加えて、化学的な変換を伴わないので、人体に対して安
全であるという利点もある。
【0019】なお、この実施形態においては、脱アセチ
ル化されていない非晶質キチン2を基質とする場合に
ついて説明したが、これに限定されるものではなく、均
部分脱アセチル化された脱アセチル化率が39%以
下の非晶質のキチンを基質としてもよい。
【0020】この均一部分脱アセチル化されたキチン
は、61%以上のN−アセチル−D−グルコサミン単位
1aと39%以下のD−グルコサミン単位とからなる、
ランダムに脱アセチル化された脱アセチル化率が39%
以下の非晶質物質である。そのため、均一部分脱アセ
チル化されたキチンは、冷水、氷水、水、及び希酸に膨
潤し易い。
【0021】均一部分脱アセチル化されたキチンを調
製するには、例えば、まず既述と同様にしてキチン4を
アルカリ処理した後、これに氷を加えて攪拌するか、又
は、分散液を直接凍結し、次に解凍する操作を繰り返し
て、非晶質キチン2のドープ(アルカリキチンドー
プ)を調製する。なお、このドープには、均一に部分脱
アセチル化されたキチンの分子量低下を抑えるために、
必要に応じてチオフェノールやNaBH4等をあらかじ
め添加しておいてもよい。次いで、ドープを50℃以下
で所定時間熟成させて脱アセチル化した後、既述と同様
の操作を行えば、精製品を得ることができる。
【0022】N−アセチル−D−グルコサミン1の製造
の際には、均一部分脱アセチル化されたキチンは、既
した非晶質キチン2の場合と同様、卵白由来のリゾ
チームで低分子に加水分解される。低分子がD−グルコ
サミン単位を含んでいる場合には、前記粗酵素による反
応は、N−アセチル−D−グルコサミン単位1aである
非還元末端のみで起こる。ここで、均一に部分脱アセチ
ル化されたキチンの脱アセチル化率は39%以下である
ので、N−アセチル−D−グルコサミン1の収率が高い
という利点がある。
【0023】このように、均一部分脱アセチル化され
た非晶質のキチンを基質とする場合には、脱アセチル化
されていない非晶質のキチン2に比べ、水等に対してよ
り膨潤し易いので、N−アセチル−D−グルコサミン1
をより効率良く製造できるという利点がある。その他の
利点は、脱アセチル化されていない非晶質キチン2と
同様である。
【0024】
【実施例】次に、この発明を実施例により更に詳細に説
明するが、この発明は係る実施例に限定されるものでは
ない。
【0025】〔実施例1〕 〔脱アセチル化されていない非晶質キチンの調製〕粉
末状のキチンTC−L(商品名,三栄工業社製)5.0
g(絶乾重量)をアルカリ水溶液(NaOH50g/蒸
留水75g)に浸漬し、室温で12時間放置した。その
後、強酸でpHを8.4に調整し、これを有機溶媒中に
滴下した。生成した沈殿を濾別し、蒸留水で塩類がなく
なるまで洗浄することによって、脱アセチル化されてい
ない非晶質キチンを得た。
【0026】〔菌体の前培養〕トリコデルマ(Trichode
rma)属に属する不完全菌としては、Trichoderma harzi
anum(TMIC 60622,財団法人日本きのこセンター菌蕈研
究所より分譲)を使用した。この不完全菌を2%グルコ
ース、0.5%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、
0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4・7H2O、及び2%寒
天を含む平面シャーレ上の平面寒天培地に接種し、30
℃で3日間、静置培養した。
【0027】〔酵素生産〕上記の寒天培地上に広がった
不完全菌の菌糸をコルクボーラー(内径1cm)で寒天
ごと打ち抜き、0.5%非晶質キチン、0.2%ポリ
ペプトン、0.01%酵母エキス、0.07%K2HPO4
0.03%KH2PO4、及び0.05%MgSO4・7H2Oを含む
培養液100mLに接種し、30℃、120rpmで回
転培養した。経時的に培養液の一部を取り、キチナーゼ
活性及びβ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性をそ
れぞれ測定した。その結果を図2に示す。
【0028】〔酵素活性の測定〕キチナーゼ活性は、グ
リコールキチンを基質とし、酵素反応で遊離した還元糖
を定量することによって算出した。即ち、0.1%グリ
コールキチンの0.1M酢酸ナトリウム溶液(pH6.
0)1.0mLに酵素液0.2mLを加え、37℃で1
0分間反応させた。反応終了後、直ちにSchalesの試薬
2.0mLを加えて15分間煮沸した。室温まで放冷
後、420nmの吸光度を測定した。N−アセチル−D
−グルコサミンを標準物質としてあらかじめ検量線を作
成しておき、遊離した還元糖量を算出した。コントロー
ル実験は、グリコールキチン溶液にSchalesの試薬を加
え、次いで酵素液を加えた後、煮沸することによって行
った。なお、酵素活性の1単位(U)は、この反応条件
下で1分間当たりに1μmol のN−アセチル−D−グル
コサミンを遊離するのに必要な酵素量と定義した。
【0029】β−N−アセチルヘキソサミニダーゼ活性
は、p−ニトロフェニル−β−N−アセチル−D−グル
コサミニドを基質とし、酵素反応で遊離したp−ニトロ
フェノールを定量することによって算出した。即ち、
0.1mM p−ニトロフェニル−β−N−アセチル−
D−グルコサミニドの0.1M酢酸ナトリウム溶液(p
H6.0)2.0mLに酵素液0.2mLを加え、反応
生成物の最大吸収波長337nmにおける吸光度の増加
を経時的に追跡した。遊離したp−ニトロフェノール量
は、その分子吸光係数(3500M-1・cm-1)及びこ
の吸光度における1分間当たりの増加量から算出した。
なお、酵素活性の1単位(U)は、この反応条件下で1
分間当たりに1μmol のp−ニトロフェノールを遊離す
るのに必要な酵素量と定義した。
【0030】〔実施例2〕 〔粗酵素液の調製〕実施例1とほぼ同様にして不完全菌
の培養を開始した後、第5日目の培養液を0.45μm
のメンブランフィルターにより軽くアスピレーターで吸
引しながらろ過し、浮遊している菌体等を除去した。得
られたろ液をそのまま粗酵素液として以下の操作に使用
した。
【0031】〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グ
ルコサミンの製造〕実施例1で得られた脱アセチル化さ
れていない非晶質キチン0.1gに粗酵素液及び卵白
由来のリゾチーム(和光純薬社製)を加え、更にHCl
で反応液のpHを4.5に調整した後、蒸留水で全量を
25mLとした。次いで、37℃で攪拌し、生成したN
−アセチル−D−グルコサミンの量を経時的に測定し
た。その結果を図3に示す。
【0032】〔N−アセチル−D−グルコサミンの定
量〕反応液の一部を取り、0.45μmのメンブランフ
ィルターでろ過したろ液をHPLC(高速液体クロマト
グラフィー)〔カラム:Shodex NH2P-504E(4.6mm×250
mm),溶出液:アセトニトリル/水=70/30,流
速:1mL/min,カラム温度:40℃,検出:DI〕によ
り分析した。市販のN−アセチル−D−グルコサミンを
標準物質として検量線を作成し、ピーク面積から、生成
したN−アセチル−D−グルコサミン量を定量した。
【0033】〔実施例3〕 〔均一部分脱アセチル化されたキチンの調製〕実施例
1と同様にしてキチンTC−Lをアルカリ処理した後、
その溶液に砕氷375gを入れ、室温で氷が完全に溶け
るまで放置することによって、非晶質キチンのドープ
(アルカリキチンドープ)を調製した。次いで、このド
ープを30℃で10時間静置、熟成させて部分脱アセチ
ル化(均一系反応)した。その後、強酸でpHを8.4
に調整し、これを有機溶媒中に滴下した。生成した沈殿
を濾別し、蒸留水で塩類がなくなるまで洗浄することに
よって、均一に部分脱アセチル化された脱アセチル化率
が約20%の非晶質のキチン(DAC20)を得た。
【0034】〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されてい
ない非晶質キチンの代わりに、上記で得られた脱アセ
チル化率が約20%の非晶質のキチンを使用した他は、
実施例1と同様にしてキチナーゼ活性及びβ−N−アセ
チルヘキソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その
結果を図2に示す。
【0035】〔実施例4〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない非晶質キチンの代わ
りに、実施例3で得られた脱アセチル化率が約20%の
非晶質のキチンを使用した他は、実施例2と同様にし
て、生成したN−アセチル−D−グルコサミンの量を経
時的に測定した。その結果を図3に示す。
【0036】〔比較例1〕 〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されていない非晶質
キチンの代わりにキチンTC−Lを使用した他は、実施
例1と同様にしてキチナーゼ活性及びβ−N−アセチル
ヘキソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その結果
を図2に示す。
【0037】〔比較例2〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない非晶質キチンの代わ
りにキチンTC−Lを使用した他は、実施例2と同様に
して、生成したN−アセチル−D−グルコサミンの量を
経時的に測定した。その結果を図3に示す。
【0038】〔比較例3〕 〔酵素活性の測定〕脱アセチル化されていない非晶質
キチンの代わりにグルコースを使用した他は、実施例1
と同様にしてキチナーゼ活性及びβ−N−アセチルヘキ
ソサミニダーゼ活性をそれぞれ測定した。その結果を図
2に示す。
【0039】〔比較例4〕 〔粗酵素液を用いたN−アセチル−D−グルコサミンの
製造〕脱アセチル化されていない非晶質キチンの代わ
りにグルコースを使用した他は、実施例2と同様にし
て、生成したN−アセチル−D−グルコサミンの量を経
時的に測定した。その結果を図3に示す。
【0040】
【発明の効果】以上のように、この発明には次のような
利点がある。 (1)水等に膨潤し易い非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチーム等との親和性が高いので、N−アセ
チル−D−グルコサミンを効率良く製造できる。 (2)混合酵素を使用して非晶質のキチンからN−アセ
チル−D−グルコサミンを直接的に製造できるので、製
造効率が良い。 (3)キチンから非晶質のキチンを調製する際には収量
の低下がほとんどないので、最終的に得られるN−アセ
チル−D−グルコサミンの収率も高い。 (4)化学的な変換を伴わないので、人体に対して安全
である。 (5)安価なリゾチームと、粗酵素液等の調製時におけ
る菌体の除去操作が簡単な粗酵素とからなる混合酵素を
使用するので、コスト高にならない。 (6)脱アセチル化されていないか又は脱アセチル化率
が39%以下の非晶質のキチンを基質とするので、N−
アセチル−D−グルコサミンの収率が高い。
【図面の簡単な説明】
【図1】(a) は実施形態に係るN−アセチル−D−グル
コサミンの製造方法を示す模式図、(b) は脱アセチル化
されていない非晶質キチンの調製方法を示す模式図。
(c) 及び(d) は従来例(1) を示す模式図、(e) はキチン
にキチン分解酵素を作用させる方法を示す模式図、(f)
及び(g) は従来例(2) を示す模式図。
【図2】実施例1、実施例2、比較例1、比較例2にお
けるキチナーゼ活性及びβ−N−アセチルヘキソサミニ
ダーゼ活性を示すグラフ。
【図3】実施例3、実施例4、比較例3、比較例4にお
けるN−アセチル−D−グルコサミンの収量を示すグラ
フ。
【符号の説明】 1 N−アセチル−D−グルコサミン 2 脱アセチル化されていない非晶質キチン 3 混合酵素 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成12年9月20日(2000.9.2
0)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0010
【補正方法】変更
【補正内容】
【0010】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の手段とするところは、脱アセチル化されていない非晶
質のキチン又は均一に部分脱アセチル化された脱アセチ
ル化率が1乃至20%の非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチームと、トリコデルマ(Trichoderma)
属に属する不完全菌が生産する粗酵素とからなる混合酵
素を使用することによって、前記リゾチームで前記キチ
ンを低分子に加水分解すると共に、前記粗酵素で前記低
分子からN−アセチル−D−グルコサミンを遊離させる
ことにある。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0019
【補正方法】変更
【補正内容】
【0019】なお、この実施形態においては、脱アセチ
ル化されていない非晶質のキチン2を基質とする場合に
ついて説明したが、これに限定されるものではなく、均
一に部分脱アセチル化された非晶質のキチンを基質とし
てもよい。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0020
【補正方法】変更
【補正内容】
【0020】この均一に部分脱アセチル化されたキチン
は、所定含量のN−アセチル−D−グルコサミン単位1
とD−グルコサミン単位とからなる、ランダムに脱ア
セチル化された非晶質物質である。そのため、均一に部
分脱アセチル化されたキチンは、冷水、氷水、水、及び
希酸に膨潤し易い。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0022
【補正方法】変更
【補正内容】
【0022】N−アセチル−D−グルコサミン1の製造
の際には、均一に部分脱アセチル化されたキチンは、既
述した非晶質のキチン2の場合と同様、卵白由来のリゾ
チームで低分子に加水分解される。低分子がD−グルコ
サミン単位を含んでいる場合には、前記粗酵素による反
応は、N−アセチル−D−グルコサミン単位1aである
非還元末端のみで起こる。そのため、N−アセチル−D
−グルコサミン1の収率が低下しないようにするには、
均一に部分脱アセチル化されたキチンの脱アセチル化率
を1〜50%程度としておくのが望ましい
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】0040
【補正方法】変更
【補正内容】
【0040】
【発明の効果】以上のように、この発明には次のような
利点がある。 (1)水等に膨潤し易い非晶質のキチンを基質とし、卵
白由来のリゾチーム等との親和性が高いので、N−アセ
チル−D−グルコサミンを効率良く製造できる。 (2)混合酵素を使用して非晶質のキチンからN−アセ
チル−D−グルコサミンを直接的に製造できるので、製
造効率が良い。 (3)キチンから非晶質のキチンを調製する際には収量
の低下がほとんどないので、最終的に得られるN−アセ
チル−D−グルコサミンの収率も高い。 (4)化学的な変換を伴わないので、人体に対して安全
である。 (5)安価なリゾチームと、粗酵素液等の調製時におけ
る菌体の除去操作が簡単な粗酵素とからなる混合酵素を
使用するので、コスト高にならない。 (6)脱アセチル化されていないか又は脱アセチル化率
1〜20%の非晶質のキチンを基質とするので、N−
アセチル−D−グルコサミンの収率が高い。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大槻 徹 京都市左京区岩倉北池田町19番地 Fターム(参考) 4B050 CC08 DD03 LL02 4B064 AF21 CA05 CA21 CB07 CD19 DA10

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 非晶質キチン又は均一系部分脱アセチル
    化キチンを基質とし、低分子化酵素でこの非晶質キチン
    又は均一系部分脱アセチル化キチンを低分子に加水分解
    すると共に、単糖化酵素で前記低分子からN−アセチル
    −D−グルコサミンを遊離させることを特徴とする、非
    晶質キチン類を基質とする酵素によるN−アセチル−D
    −グルコサミンの製造方法。
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