JP4402878B2 - 新規モノアセチルキトオリゴ糖及びその製造方法、並びにキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規モノアセチルキトオリゴ糖及びその製造方法、並びにキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、キチンやキトサンを分解することにより得られるオリゴ糖の各種生理活性効果が報告されており、健康食品素材として利用されつつある。
【０００３】
例えば、特開平８−１６５２４３号公報には、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤が開示されている。
【０００４】
また、特開平１０−２８７５７２号公報には、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする肝機能障害予防改善剤が開示されている。
【０００５】
更に、特開平１１−２９４８４号公報には、キトサンオリゴ糖及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする抗糖尿病剤が開示されている。
【０００６】
ところで、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖は、キチンやキトサンを塩酸等で酸分解するか、あるいはキチナーゼ、キトサナーゼ等で酵素分解することによって製造されている。
【０００７】
酸分解方法として、例えば特公平５−８６３９９号公報には、キチンを酸により部分加水分解し、アルカリにより中和してＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成せしめ、該中和溶液からイオン交換膜電気透析法によって副生塩を分離除去するＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法が開示されている。
【０００８】
また、特開平５−７４９６号公報には、均一に部分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分解して高重合度のグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得るオリゴ糖類の製造方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】
特開平８−１６５２４３号公報
【特許文献２】
特開平１０−２８７５７２号公報
【特許文献３】
特開平１１−２９４８４号公報
【特許文献４】
特公平５−８６３９９号公報
【特許文献５】
特開平５−７４９６号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特公平５−８６３９９号公報に記載されたような酸分解によるキチンオリゴ糖の製造方法では、酸分解しすぎると収量は増大するが、重合度の比較的低いオリゴ糖になってしまい、重合度の高いオリゴ糖を得るために酸分解を抑制すると、収量が低減してしまうという問題があった。
【００１１】
また、特開平５−７４９６号公報に記載された酵素分解によるオリゴ糖の製造方法では、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得ることができるが、特定構造のオリゴ糖を高純度で生産性よく得ることが困難であった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミン及び／又はグルコサミンを構成糖とする比較的重合度の高いオリゴ糖類、及びそれらの効率的な製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究した結果、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、特定のキチナーゼを作用させ、更にＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させることにより、これまでに知られていなかった構造のキトオリゴ糖が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の１つは、下記一般式（１）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された三糖以上の新規モノアセチルキトオリゴ糖を提供するものである。
【００１５】
【化３】
【００１６】
上記新規モノアセチルキトオリゴ糖は、還元末端がアセチル化されていることにより、カラムクロマトグラフィーにおけるオリゴ糖のテーリングが抑えられ、オリゴ糖の分離及び回収効率が向上するため、高純度のオリゴ糖を製造することが可能となる。
【００１７】
本発明の新規モノアセチルキトオリゴ糖においては、前記一般式（１）におけるｎが５〜１０であることが好ましい。このような重合度のオリゴ糖は、後述する本発明の製造方法によって特に効率よく製造でき、高い生理活性効果が期待できる。
【００１８】
本発明のもう１つは、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを作用させ、更にＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて、下記一般式（２）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された二糖以上のモノアセチルキトオリゴ糖を生成することを特徴とするモノアセチルキトオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【化４】
【００１９】
上記製造方法によれば、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、キチナーゼを作用させることによって、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとが重合した各種のオリゴ糖が生成される。生成したオリゴ糖は、その多くが非還元末端側にグルコサミンを有するオリゴ糖であるが、１分子のＮ−アセチルグルコサミンが非還元末端側に結合するオリゴ糖も僅かに混在する。これに対して、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンを離脱させることができる。その結果、非還元末端側は必ずグルコサミン残基で、かつ、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された、上記一般式（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を生成することができる。
【００２０】
上記製造方法においては、前記キチナーゼとして、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（Aeromonas ｓｐ.No.10S-24、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを使用する。上記酵素を用いることにより、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された比較的高重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【００２１】
また、前記方法によって得られたモノアセチルキトオリゴ糖の混合液から、クロマトグラフィー分画によって、各種重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を分離することが好ましい。前述したように、モノアセチルキトオリゴ糖は、還元末端がアセチル化されていることにより、カラムクロマトグラフィーにおけるオリゴ糖のテーリングが抑えられるため、特定重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を高純度で効率よく製造することができる。
【００２２】
本発明の更にもう1つは、上記一般式（１）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖をＮ−アセチル化することを特徴とするキチンオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００２３】
上記製造方法によれば、モノアセチルキトオリゴ糖は、前述したような製造方法によって、比較的重合度の高いものを高純度で効率よく製造できるため、これをＮ−アセチル化することにより、比較的重合度の高いキチンオリゴ糖を高純度で効率よく製造することが可能となる。
【００２４】
本発明の更にもう1つは、上記一般式（１）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を脱アセチル化することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００２５】
上記製造方法によれば、モノアセチルキトオリゴ糖は、前述したような製造方法によって、比較的重合度の高いものを高純度で効率よく製造できるため、これを脱アセチル化することにより、比較的重合度の高いキトサンオリゴ糖を高純度で効率よく製造することが可能となる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明において、原料とする部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンは、キチンを部分的に脱アセチル化するか、あるいはキトサンを部分的にＮ−アセチル化することによって得ることができる。
【００２７】
キチンを部分的に脱アセチル化する方法としては、例えば、キチンをアルカリ水溶液に分散させて処理する方法が挙げられる。このとき、アルカリ水溶液の温度が高く、かつ、処理時間が長いほどアセチル化度が高くなる。アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等を用いることができ、アルカリ剤の濃度は５〜５０重量％が好ましい。また、アルカリ水溶液の温度は、２５〜５０℃程度が好ましい。
【００２８】
また、キトサンを部分的にＮ−アセチル化する方法としては、例えば酢酸水溶液あるいは酢酸水溶液−メタノール混液にキトサンを溶解し、それに無水酢酸を添加して室温で反応させる方法等を採用することができる。
【００２９】
本発明において使用する部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンは、脱アセチル化度が３０〜９９％であることが好ましく、４５〜９５％であることがより好ましく、６５〜８５％であることが最も好ましい。
【００３０】
本発明において使用するキチナーゼとしては、脱アセチル化度が比較的高いキチンを分解できるものが好ましい。このようなキチナーゼとしては、例えばアエロモナス属（Aeromonas）由来のものが挙げられ、特にはアエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）が産生するキチナーゼを使用する。
【００３１】
上記アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４は、本発明者らによって分離、同定された微生物であり、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３として寄託されている。
【００３２】
次に、本発明で用いるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、例えば、ピクノポラス属（Pycnoporus）、クロストリジウム属（Clostridium）属由来のものが好ましく、特にはピクノポラス・シナバリヌス ＩＦＯ ６１３９（Pycnoporus cinnabarinus IFO 6139）由来のものが好ましく用いられる。なお、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、市販されており、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）等を用いることもできる。
【００３３】
なお、上記アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４は、キチナーゼのみでなく、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼも生産するので、その培養液をそのまま反応に用いることもできる。
【００３４】
キチナーゼによる反応と、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる反応は、前者による反応を先に行った後、後者による反応を行うことが好ましいが、両者を同時に添加して反応させることもできる。反応条件は、使用する酵素に応じた最適な条件を設定すればよく、特に限定されないが、通常はｐＨ３．５〜７．０、３０〜５０℃で、１〜４８時間反応させることが好ましい。
【００３５】
こうして両酵素による反応終了後、熱処理して酵素を失活させ、遠心分離して未分解物を除去する。得られたオリゴ糖混合溶液を、公知の各種の手段によって分離、精製することにより、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を得ることができる。分離、精製手段としては、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーや、ゲル濾過などが好ましく採用される。
【００３６】
なお、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、末端にＮ−アセチルオリゴ糖がつくため、クロマトグラフィーによる分離時のテーリングを防ぐことができ、一回のクロマトグラフィー操作で高重合度のオリゴ糖であっても高純度に単離することができる。
【００３７】
こうして得られた前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、その還元末端糖以外の部分もＮ−アセチル化することによって、キチンオリゴ糖に変換することができる。このＮ−アセチル化は、例えば、無水酢酸やハロゲン化酢酸などのＮ−アセチル化試薬を用いて行うことができる。例えば、モノアセチルキトオリゴ糖を、水、メタノール、ピリジン、もしくは非溶媒系にて溶解又は分散させ、上記Ｎ−アセチル化試薬を加えることでＮ−アセチル化を行う。中和脱塩後、凍結乾燥、又は遠心分離などの操作により、簡単にキチンオリゴ糖を得ることができる。
【００３８】
また、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、その還元末端糖から脱アセチル化することにより、キトサンオリゴ糖に変換することができる。この脱アセチル化は、化学的方法又は酵素法で行うことができる。化学的方法としては、ナトリウムメトキシドやアンモニアなどの塩基が用いられる。例えば、モノアセチルキトオリゴ糖をメタノールなどの溶媒に溶解又は分散させ、ナトリウムメトキシドなどの塩基を加えることで脱アセチル化を行う。そして、中和脱塩後、凍結乾燥、又は遠心分離などの操作により簡単にキトサンオリゴ糖を得ることができる。また、酵素法としては、デアセチラーゼを用いて脱アセチル化する方法が採用できる。デアセチラーゼとしては、例えば、コレトトリクム・リンデムチアヌム（Colletotrichum lindemuthianum）や、リゾプス・ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のものを使用することができる。
【００３９】
こうして得られたキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖は、前記方法で得られたモノアセチルキトオリゴ糖から作られるので、６糖以上のオリゴ糖を高純度で調製することが可能であり、従来では単離が難しく、研究されていない高重合度キチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の純品を得ることができる。
【００４０】
【実施例】
実施例１
（１）実験材料
キチナーゼとしては、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（Aeromonas ｓｐ.No.10S-24、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを用いた。
【００４１】
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、ピクノポラス・シナバリヌス ＩＦＯ ６１３９（Pycnoporus cinnabarinus IFO 6139）由来のエキソ-β-Ｎ-アセチルヘキソサミニダーゼ(以下「β-GlcNAcase」とする)を用いた。
【００４２】
分離したキトオリゴ糖の糖配列決定には、ペニシリウム ＳＰ．ＡＦ９−Ｐ−１２８（Penicillium ｓｐ. AF9-P-128、佐賀大学農学部 応用生物科学科 生物資源利用化学講座 生物資源化学研究室保存菌株）由来の エキソ-β-グルコサミニダ−ゼ(以下「β-GlcNase」とする)を用いた。なお、β-GlcNaseは、当業者が容易に入手できる公知の微生物、例えばアミコラトプシス・オリエンテイルＩＦＯ １２８０６（Amycolatopsis orientalis IFO 12806）や、アスペルギルス・オリゼイ ＩＡＭ２６６０(Aspergillus oryzae IAM2660）などによって製造することもできる。
【００４３】
基質には、キトサンを無水酢酸でＮ-アセチル化して調製した25％ N-アセチル化キトサンを用いた。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーには、Pharmacia製のCM-Sephadex C-25を使用し、ゲル濾過にはBio-Rad製のBio-Gel P-6を使用した。その他の試薬は、市販特級を使用した。
【００４４】
（２）酵素活性測定法
▲１▼キチナーゼ活性測定法
0.5% コロイダルキチン0.5mlにMcIlvaine緩衝液（pH4.0）1.0mlを混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、酵素溶液0.5ml を加えて37℃で10分間振盪反応を行った。5分間の煮沸により反応を停止し、ろ過を行い、得られたろ液中の生成還元糖量を、Schales変法を用いて求めた。標準物質としてGlcNAcを用い、1分間に１μmolのGlcNAcに相当する還元糖量を遊離する酵素量を１unitとした。
【００４５】
▲２▼β−GlcNAcase活性測定法
β-GlcNAcase活性測定にはp-ニトロフェニル-β-D-N-アセチルグルコサミニドを基質として用いた。４mM 基質 0.2ml に0.1M クエン酸ナトリウム-塩酸緩衝液（pH2.2）0.2mlを加えて37℃で５分間プレインキュベートした後、酵素を0.1ml添加し10分間反応を行った。その後、0.2M炭酸ナトリウム溶液を2.0ml加えて反応を停止し、420nmにおける吸光度を測定することにより遊離したp-ニトロフェノール量を定量した。標準物質としてp-ニトロフェノールを用い、1分間に１μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量を１unitとした。
【００４６】
▲３▼β−GlcNase活性測定法
β-GlcNase活性測定は、0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.7)に溶解した脱アセチル化度96%キトサンを基質として用いた。0.55% 基質1.4mlを37℃で５分間インキュベートした後、酵素を0.1ml添加し、37℃で１０分間反応した。その後、 Schales試薬を2ml加え反応を停止し、蒸留水を0.5ml加え、15分間煮沸した。冷却後、ろ過し、420nmにおける吸光度を測定した。標準物質として塩酸-D-グルコサミンを用い、１分間に１μmolのグルコサミンを生成する酵素量を１unitとした。
【００４７】
（３）実験工程
実験工程の概要を図１に示す。以下、各工程について詳細に説明する。
▲１▼キチナーゼ及びβ-GlcNAcaseによる酵素分解
まず、25％ N-アセチル化キトサン２gに0.1M酢酸溶液200mlを加えて一晩撹拌した後、同じく0.1M酢酸溶液でpH4.0に調整した。これに0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)を加え400mlに調整した。
【００４８】
この0.5％ N-アセチル化キトサン溶液400mlに２％アジ化ナトリウム４mlを加えた後、キチナーゼ（2.0 units/ml）を１mlずつ2回にわけて添加し、それぞれ37℃で48時間ずつ反応を行った。更にβ-GlcNAcase（6.2 units/ml）を0.8 ml添加し、24時間反応を行った。5分間の煮沸により反応を停止させた後、遠心分離（13,000rpm×15分）により得た上清を電気透析により脱塩した。
【００４９】
（４）CM-Sephadex C-25による陽イオン交換クロマトグラフィー
キチナーゼ及びβ-GlcNAcaseによる分解生成物を分離するために、脱塩後の酵素反応液を0.1N酢酸ナトリウム溶液でpH5.0に調整し、CM-Sephadex C-25カラムに供した。まず、0.02M 酢酸緩衝液（pH5.0）で未吸着画分を溶出後、0〜2.0M 塩化ナトリウム直線濃度勾配（酢酸緩衝液1.2リットル＋2.0M NaCl 1.2リットル）により吸着画分を溶出させた。
【００５０】
この結果を図２に示す。図２に示されるように、未吸着画分F-1と、0〜2M NaCl直線濃度勾配により溶出された吸着画分F-2〜F-13に分離できた。また、後述する質量分析結果から、F-8〜F-11の画分は2種類のオリゴ糖を含むことがわかった。
【００５１】
（５）Bio-Gel P-6によるゲルろ過
CM-Sephadex C-25による分離後、ジアセチルキトオリゴ糖を含む画分であるF-8〜F-11をBio-Gel P-6によるゲルろ過に供した。
【００５２】
すなわち、CM-Sephadex C-25による分離後、濃縮、電気透析、凍結乾燥した上記各画分を0.15M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0) 5mlに溶解し、DISMIC-25csフィルターを通した後、Bio-Gel P-6カラムに供し、0.15M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)で溶出させた。
【００５３】
結果を図３及び図４に示す。CM-Sephadex C-25だけでは分離できなかったものが、Bio-Gel P-6と組み合わせると良好に分離できていることがわかる。それぞれ小さいピークが不純物、大きいピークが目的のモノアセチルキトオリゴ糖であることが後述する質量分析の結果から確認された。
【００５４】
（６）質量分析
CM-Sephadex C-25及びBio-Gel P-6による分離後、各画分を濃縮、電気透析、凍結乾燥し、質量分析を行った。すなわち、各画分の凍結乾燥品0.5 mg を蒸留水50μlに溶解したものを試料液とした。試料液１μlをサンプルプレート上で、2,5-ジヒドロキシ安息香酸1μlと混合し、乾燥後、MOLDI-TOF MSにより分子量の測定を行った。分析にはVoyagerTM Elite(PerSeptive Biosystems)を用いた。
【００５５】
この結果を表１に示す。F-2〜F-7, F-12及び F-13はCM-Sephadex C-25だけで単一に分離できた。F-8〜F-11はCM-Sephadex C-25だけでは不純物を含み、Bio-Gel P-6によってオリゴ糖を単一に分離できた。最終的に得られた各画分のオリゴ糖は、F-2, F-4がGlcNAcを２残基含むヘテロキトオリゴ糖、F-3，F-5〜F-9がGlcNAcを１残基含むヘテロキトオリゴ糖だとわかる。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（７）β-GlcNaseによる酵素分解
各画分のキトオリゴ糖の糖配列を決定するために、2〜11糖のモノアセチルキトオリゴ糖にβ-GlcNaseを作用させた。オリゴ糖溶液（2mg/ml）50μlに0.04M リン酸緩衝液(pH5.5)を25μl加え、β-GlcNase（0.5units/ml）25μlを添加し、37℃で20時間反応を行った。その後3分間の煮沸で反応を停止した。
【００５８】
（８）薄層クロマトグラフィー（TLC）による糖配列の決定
β-GlcNaseによる分解後、その分解生成物を薄層クロマトグラフィーにより分析し、糖配列の決定を行った。TLCプレートはMERCK製 TLC aluminium sheets silica gel 60を用いた。0.05Ｍ NaH2PO4を噴霧して105℃１時間加熱したのち、n-プロパノ-ル、水、30％アンモニア水を70：15：15の割合で混合した溶媒で、上昇法により３回展開した。各スポットはジフェニルアミン-アニリン試薬を噴霧し105℃、15分加熱し発色させた。標準物質にはGlcN１〜６糖、GlcNAc１〜６糖を使用した。
【００５９】
この結果から、すべての画分で分解生成物はGlcN １残基及びGlcNAc １残基の発色のみが見られることから、還元末端にGlcNAc１残基を持ち非還元末端側にGlcNの連続した糖配列を持つモノアセチルキトオリゴ糖であることがわかった。
【００６０】
最終的な各画分の収量と、ヘテロキトオリゴ糖の重合度を図５に示す。この結果から、得られたオリゴ糖はGlcNAc１残基を含むモノアセチルキトオリゴ糖が大部分で、F-1〜F-13のトータルな収量は1348ｍｇだった。
【００６１】
実施例２
実施例１により得られた様々な長さのモノアセチルキトオリゴ糖を0.04M炭酸ナトリウム溶液に糖濃度0.5%となるように溶解し、メタノール及び無水酢酸をそれぞれ45%および1.1%となるように加えた。この溶液を25℃で24時間放置した後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に糖濃度0.5%となるように0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加え、30分間室温で放置した。0.1Ｎ塩酸を用いてpH6.0に調整後、電気透析で脱塩、凍結乾燥によりN-アセチル化されたキチンオリゴ糖を得た。
【００６２】
実施例３
実施例１により得られた様々な長さのモノアセチルキトオリゴ糖を、０．５％の濃度となるように、２０ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した。次いで、コレトトリクム・リンデムチアヌム ＡＴＣＣ１２６１１（Colletotrichum lindemuthianum ATCC 12611）から、文献（Tokuyasu. K, et al.: Biosci. Biotech. Biochem., 60, 1598-1603, 1996)に記載の方法で精製したキチンデアセチラーゼを、０．７４ units/mlとなるように添加し、４０℃で２４時間インキュベートした。反応液１ｍｌに対して、３３％（ｖ／ｖ）酢酸を０．５ｍｌ加えて、３分間煮沸して反応を停止した。この反応液から電気透析により脱塩し、凍結乾燥して脱アセチル化されたキトサンオリゴ糖を得た。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された二糖以上のモノアセチルキトオリゴ糖を提供することができ、このオリゴ糖は、還元末端の糖のみがＮアセチル化されていて水溶性を示し、これまでに調製困難であった比較的高重合度のオリゴ糖でも高純度で単離することが可能となる。また、このオリゴ糖をＮ−アセチル化又は脱アセチル化することにより、比較的高重合度のキチンオリゴ糖又はキトサンオリゴ糖を高純度で製造することが可能となる。このような高重合度のモノアセチルキトオリゴ糖、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖についての知見はまだ少ないが、これまでの報告から各種の生理活性が期待できるものと推測される。また、酵素の反応基質として用いることで、反応機構の解析や阻害などへの知見を得ることができ、タンパク工学的な観点、強力な阻害剤構築という点からも、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例における実験工程を示す説明図である。
【図２】 CM-Sephadex C-25による陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図表である。
【図３】 実施例で得られたフラクションＦ８、Ｆ９のBio-Gel P-6によるゲルろ過の結果を示す図表である。
【図４】 実施例で得られたフラクションＦ１０、Ｆ１１のBio-Gel P-6によるゲルろ過の結果を示す図表である。
【図５】 オリゴ糖の収量を各フラクション毎に示す図表である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規モノアセチルキトオリゴ糖及びその製造方法、並びにキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、キチンやキトサンを分解することにより得られるオリゴ糖の各種生理活性効果が報告されており、健康食品素材として利用されつつある。
【０００３】
例えば、特開平８−１６５２４３号公報には、硫酸化キチンオリゴ糖及び／又はその塩を有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤が開示されている。
【０００４】
また、特開平１０−２８７５７２号公報には、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖及びその塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする肝機能障害予防改善剤が開示されている。
【０００５】
更に、特開平１１−２９４８４号公報には、キトサンオリゴ糖及びそれらの塩から選ばれた少なくとも１種を有効成分として含有することを特徴とする抗糖尿病剤が開示されている。
【０００６】
ところで、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖は、キチンやキトサンを塩酸等で酸分解するか、あるいはキチナーゼ、キトサナーゼ等で酵素分解することによって製造されている。
【０００７】
酸分解方法として、例えば特公平５−８６３９９号公報には、キチンを酸により部分加水分解し、アルカリにより中和してＮ−アセチルキトオリゴ糖を生成せしめ、該中和溶液からイオン交換膜電気透析法によって副生塩を分離除去するＮ−アセチルキトオリゴ糖の製造方法が開示されている。
【０００８】
また、特開平５−７４９６号公報には、均一に部分脱アセチル化されたキチンをキチナーゼにより加水分解して高重合度のグルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得るオリゴ糖類の製造方法が開示されている。
【０００９】
【特許文献１】
特開平８−１６５２４３号公報
【特許文献２】
特開平１０−２８７５７２号公報
【特許文献３】
特開平１１−２９４８４号公報
【特許文献４】
特公平５−８６３９９号公報
【特許文献５】
特開平５−７４９６号公報
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、特公平５−８６３９９号公報に記載されたような酸分解によるキチンオリゴ糖の製造方法では、酸分解しすぎると収量は増大するが、重合度の比較的低いオリゴ糖になってしまい、重合度の高いオリゴ糖を得るために酸分解を抑制すると、収量が低減してしまうという問題があった。
【００１１】
また、特開平５−７４９６号公報に記載された酵素分解によるオリゴ糖の製造方法では、グルコサミン及びＮ−アセチルグルコサミンからなるヘテロオリゴ糖、及びグルコサミンのホモオリゴ糖を得ることができるが、特定構造のオリゴ糖を高純度で生産性よく得ることが困難であった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、Ｎ−アセチルグルコサミン及び／又はグルコサミンを構成糖とする比較的重合度の高いオリゴ糖類、及びそれらの効率的な製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究した結果、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、特定のキチナーゼを作用させ、更にＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させることにより、これまでに知られていなかった構造のキトオリゴ糖が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１４】
すなわち、本発明の１つは、下記一般式（１）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された三糖以上の新規モノアセチルキトオリゴ糖を提供するものである。
【００１５】
【化３】
【００１６】
上記新規モノアセチルキトオリゴ糖は、還元末端がアセチル化されていることにより、カラムクロマトグラフィーにおけるオリゴ糖のテーリングが抑えられ、オリゴ糖の分離及び回収効率が向上するため、高純度のオリゴ糖を製造することが可能となる。
【００１７】
本発明の新規モノアセチルキトオリゴ糖においては、前記一般式（１）におけるｎが５〜１０であることが好ましい。このような重合度のオリゴ糖は、後述する本発明の製造方法によって特に効率よく製造でき、高い生理活性効果が期待できる。
【００１８】
本発明のもう１つは、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを作用させ、更にＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて、下記一般式（２）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された二糖以上のモノアセチルキトオリゴ糖を生成することを特徴とするモノアセチルキトオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【化４】
【００１９】
上記製造方法によれば、部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、キチナーゼを作用させることによって、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルコサミンとが重合した各種のオリゴ糖が生成される。生成したオリゴ糖は、その多くが非還元末端側にグルコサミンを有するオリゴ糖であるが、１分子のＮ−アセチルグルコサミンが非還元末端側に結合するオリゴ糖も僅かに混在する。これに対して、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させることにより、Ｎ−アセチルグルコサミンを離脱させることができる。その結果、非還元末端側は必ずグルコサミン残基で、かつ、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された、上記一般式（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を生成することができる。
【００２０】
上記製造方法においては、前記キチナーゼとして、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（Aeromonas ｓｐ.No.10S-24、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを使用する。上記酵素を用いることにより、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された比較的高重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【００２１】
また、前記方法によって得られたモノアセチルキトオリゴ糖の混合液から、クロマトグラフィー分画によって、各種重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を分離することが好ましい。前述したように、モノアセチルキトオリゴ糖は、還元末端がアセチル化されていることにより、カラムクロマトグラフィーにおけるオリゴ糖のテーリングが抑えられるため、特定重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を高純度で効率よく製造することができる。
【００２２】
本発明の更にもう1つは、上記一般式（１）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖をＮ−アセチル化することを特徴とするキチンオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００２３】
上記製造方法によれば、モノアセチルキトオリゴ糖は、前述したような製造方法によって、比較的重合度の高いものを高純度で効率よく製造できるため、これをＮ−アセチル化することにより、比較的重合度の高いキチンオリゴ糖を高純度で効率よく製造することが可能となる。
【００２４】
本発明の更にもう1つは、上記一般式（１）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を脱アセチル化することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【００２５】
上記製造方法によれば、モノアセチルキトオリゴ糖は、前述したような製造方法によって、比較的重合度の高いものを高純度で効率よく製造できるため、これを脱アセチル化することにより、比較的重合度の高いキトサンオリゴ糖を高純度で効率よく製造することが可能となる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明において、原料とする部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンは、キチンを部分的に脱アセチル化するか、あるいはキトサンを部分的にＮ−アセチル化することによって得ることができる。
【００２７】
キチンを部分的に脱アセチル化する方法としては、例えば、キチンをアルカリ水溶液に分散させて処理する方法が挙げられる。このとき、アルカリ水溶液の温度が高く、かつ、処理時間が長いほどアセチル化度が高くなる。アルカリ剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等を用いることができ、アルカリ剤の濃度は５〜５０重量％が好ましい。また、アルカリ水溶液の温度は、２５〜５０℃程度が好ましい。
【００２８】
また、キトサンを部分的にＮ−アセチル化する方法としては、例えば酢酸水溶液あるいは酢酸水溶液−メタノール混液にキトサンを溶解し、それに無水酢酸を添加して室温で反応させる方法等を採用することができる。
【００２９】
本発明において使用する部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンは、脱アセチル化度が３０〜９９％であることが好ましく、４５〜９５％であることがより好ましく、６５〜８５％であることが最も好ましい。
【００３０】
本発明において使用するキチナーゼとしては、脱アセチル化度が比較的高いキチンを分解できるものが好ましい。このようなキチナーゼとしては、例えばアエロモナス属（Aeromonas）由来のものが挙げられ、特にはアエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）が産生するキチナーゼを使用する。
【００３１】
上記アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４は、本発明者らによって分離、同定された微生物であり、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３として寄託されている。
【００３２】
次に、本発明で用いるＮ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、例えば、ピクノポラス属（Pycnoporus）、クロストリジウム属（Clostridium）属由来のものが好ましく、特にはピクノポラス・シナバリヌス ＩＦＯ ６１３９（Pycnoporus cinnabarinus IFO 6139）由来のものが好ましく用いられる。なお、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、市販されており、例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）等を用いることもできる。
【００３３】
なお、上記アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４は、キチナーゼのみでなく、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼも生産するので、その培養液をそのまま反応に用いることもできる。
【００３４】
キチナーゼによる反応と、Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼによる反応は、前者による反応を先に行った後、後者による反応を行うことが好ましいが、両者を同時に添加して反応させることもできる。反応条件は、使用する酵素に応じた最適な条件を設定すればよく、特に限定されないが、通常はｐＨ３．５〜７．０、３０〜５０℃で、１〜４８時間反応させることが好ましい。
【００３５】
こうして両酵素による反応終了後、熱処理して酵素を失活させ、遠心分離して未分解物を除去する。得られたオリゴ糖混合溶液を、公知の各種の手段によって分離、精製することにより、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖を得ることができる。分離、精製手段としては、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーや、ゲル濾過などが好ましく採用される。
【００３６】
なお、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、末端にＮ−アセチルオリゴ糖がつくため、クロマトグラフィーによる分離時のテーリングを防ぐことができ、一回のクロマトグラフィー操作で高重合度のオリゴ糖であっても高純度に単離することができる。
【００３７】
こうして得られた前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、その還元末端糖以外の部分もＮ−アセチル化することによって、キチンオリゴ糖に変換することができる。このＮ−アセチル化は、例えば、無水酢酸やハロゲン化酢酸などのＮ−アセチル化試薬を用いて行うことができる。例えば、モノアセチルキトオリゴ糖を、水、メタノール、ピリジン、もしくは非溶媒系にて溶解又は分散させ、上記Ｎ−アセチル化試薬を加えることでＮ−アセチル化を行う。中和脱塩後、凍結乾燥、又は遠心分離などの操作により、簡単にキチンオリゴ糖を得ることができる。
【００３８】
また、前記一般式（１）又は（２）で示されるモノアセチルキトオリゴ糖は、その還元末端糖から脱アセチル化することにより、キトサンオリゴ糖に変換することができる。この脱アセチル化は、化学的方法又は酵素法で行うことができる。化学的方法としては、ナトリウムメトキシドやアンモニアなどの塩基が用いられる。例えば、モノアセチルキトオリゴ糖をメタノールなどの溶媒に溶解又は分散させ、ナトリウムメトキシドなどの塩基を加えることで脱アセチル化を行う。そして、中和脱塩後、凍結乾燥、又は遠心分離などの操作により簡単にキトサンオリゴ糖を得ることができる。また、酵素法としては、デアセチラーゼを用いて脱アセチル化する方法が採用できる。デアセチラーゼとしては、例えば、コレトトリクム・リンデムチアヌム（Colletotrichum lindemuthianum）や、リゾプス・ジャポニクス（Rhizopus japonicus）由来のものを使用することができる。
【００３９】
こうして得られたキチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖は、前記方法で得られたモノアセチルキトオリゴ糖から作られるので、６糖以上のオリゴ糖を高純度で調製することが可能であり、従来では単離が難しく、研究されていない高重合度キチンオリゴ糖及びキトサンオリゴ糖の純品を得ることができる。
【００４０】
【実施例】
実施例１
（１）実験材料
キチナーゼとしては、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（Aeromonas ｓｐ.No.10S-24、ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを用いた。
【００４１】
Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとしては、ピクノポラス・シナバリヌス ＩＦＯ ６１３９（Pycnoporus cinnabarinus IFO 6139）由来のエキソ-β-Ｎ-アセチルヘキソサミニダーゼ(以下「β-GlcNAcase」とする)を用いた。
【００４２】
分離したキトオリゴ糖の糖配列決定には、ペニシリウム ＳＰ．ＡＦ９−Ｐ−１２８（Penicillium ｓｐ. AF9-P-128、佐賀大学農学部 応用生物科学科 生物資源利用化学講座 生物資源化学研究室保存菌株）由来の エキソ-β-グルコサミニダ−ゼ(以下「β-GlcNase」とする)を用いた。なお、β-GlcNaseは、当業者が容易に入手できる公知の微生物、例えばアミコラトプシス・オリエンテイルＩＦＯ １２８０６（Amycolatopsis orientalis IFO 12806）や、アスペルギルス・オリゼイ ＩＡＭ２６６０(Aspergillus oryzae IAM2660）などによって製造することもできる。
【００４３】
基質には、キトサンを無水酢酸でＮ-アセチル化して調製した25％ N-アセチル化キトサンを用いた。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーには、Pharmacia製のCM-Sephadex C-25を使用し、ゲル濾過にはBio-Rad製のBio-Gel P-6を使用した。その他の試薬は、市販特級を使用した。
【００４４】
（２）酵素活性測定法
▲１▼キチナーゼ活性測定法
0.5% コロイダルキチン0.5mlにMcIlvaine緩衝液（pH4.0）1.0mlを混合し、37℃で5分間プレインキュベートした後、酵素溶液0.5ml を加えて37℃で10分間振盪反応を行った。5分間の煮沸により反応を停止し、ろ過を行い、得られたろ液中の生成還元糖量を、Schales変法を用いて求めた。標準物質としてGlcNAcを用い、1分間に１μmolのGlcNAcに相当する還元糖量を遊離する酵素量を１unitとした。
【００４５】
▲２▼β−GlcNAcase活性測定法
β-GlcNAcase活性測定にはp-ニトロフェニル-β-D-N-アセチルグルコサミニドを基質として用いた。４mM 基質 0.2ml に0.1M クエン酸ナトリウム-塩酸緩衝液（pH2.2）0.2mlを加えて37℃で５分間プレインキュベートした後、酵素を0.1ml添加し10分間反応を行った。その後、0.2M炭酸ナトリウム溶液を2.0ml加えて反応を停止し、420nmにおける吸光度を測定することにより遊離したp-ニトロフェノール量を定量した。標準物質としてp-ニトロフェノールを用い、1分間に１μmolのp-ニトロフェノールを生成する酵素量を１unitとした。
【００４６】
▲３▼β−GlcNase活性測定法
β-GlcNase活性測定は、0.1M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.7)に溶解した脱アセチル化度96%キトサンを基質として用いた。0.55% 基質1.4mlを37℃で５分間インキュベートした後、酵素を0.1ml添加し、37℃で１０分間反応した。その後、 Schales試薬を2ml加え反応を停止し、蒸留水を0.5ml加え、15分間煮沸した。冷却後、ろ過し、420nmにおける吸光度を測定した。標準物質として塩酸-D-グルコサミンを用い、１分間に１μmolのグルコサミンを生成する酵素量を１unitとした。
【００４７】
（３）実験工程
実験工程の概要を図１に示す。以下、各工程について詳細に説明する。
▲１▼キチナーゼ及びβ-GlcNAcaseによる酵素分解
まず、25％ N-アセチル化キトサン２gに0.1M酢酸溶液200mlを加えて一晩撹拌した後、同じく0.1M酢酸溶液でpH4.0に調整した。これに0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)を加え400mlに調整した。
【００４８】
この0.5％ N-アセチル化キトサン溶液400mlに２％アジ化ナトリウム４mlを加えた後、キチナーゼ（2.0 units/ml）を１mlずつ2回にわけて添加し、それぞれ37℃で48時間ずつ反応を行った。更にβ-GlcNAcase（6.2 units/ml）を0.8 ml添加し、24時間反応を行った。5分間の煮沸により反応を停止させた後、遠心分離（13,000rpm×15分）により得た上清を電気透析により脱塩した。
【００４９】
（４）CM-Sephadex C-25による陽イオン交換クロマトグラフィー
キチナーゼ及びβ-GlcNAcaseによる分解生成物を分離するために、脱塩後の酵素反応液を0.1N酢酸ナトリウム溶液でpH5.0に調整し、CM-Sephadex C-25カラムに供した。まず、0.02M 酢酸緩衝液（pH5.0）で未吸着画分を溶出後、0〜2.0M 塩化ナトリウム直線濃度勾配（酢酸緩衝液1.2リットル＋2.0M NaCl 1.2リットル）により吸着画分を溶出させた。
【００５０】
この結果を図２に示す。図２に示されるように、未吸着画分F-1と、0〜2M NaCl直線濃度勾配により溶出された吸着画分F-2〜F-13に分離できた。また、後述する質量分析結果から、F-8〜F-11の画分は2種類のオリゴ糖を含むことがわかった。
【００５１】
（５）Bio-Gel P-6によるゲルろ過
CM-Sephadex C-25による分離後、ジアセチルキトオリゴ糖を含む画分であるF-8〜F-11をBio-Gel P-6によるゲルろ過に供した。
【００５２】
すなわち、CM-Sephadex C-25による分離後、濃縮、電気透析、凍結乾燥した上記各画分を0.15M 酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0) 5mlに溶解し、DISMIC-25csフィルターを通した後、Bio-Gel P-6カラムに供し、0.15M酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.0)で溶出させた。
【００５３】
結果を図３及び図４に示す。CM-Sephadex C-25だけでは分離できなかったものが、Bio-Gel P-6と組み合わせると良好に分離できていることがわかる。それぞれ小さいピークが不純物、大きいピークが目的のモノアセチルキトオリゴ糖であることが後述する質量分析の結果から確認された。
【００５４】
（６）質量分析
CM-Sephadex C-25及びBio-Gel P-6による分離後、各画分を濃縮、電気透析、凍結乾燥し、質量分析を行った。すなわち、各画分の凍結乾燥品0.5 mg を蒸留水50μlに溶解したものを試料液とした。試料液１μlをサンプルプレート上で、2,5-ジヒドロキシ安息香酸1μlと混合し、乾燥後、MOLDI-TOF MSにより分子量の測定を行った。分析にはVoyagerTM Elite(PerSeptive Biosystems)を用いた。
【００５５】
この結果を表１に示す。F-2〜F-7, F-12及び F-13はCM-Sephadex C-25だけで単一に分離できた。F-8〜F-11はCM-Sephadex C-25だけでは不純物を含み、Bio-Gel P-6によってオリゴ糖を単一に分離できた。最終的に得られた各画分のオリゴ糖は、F-2, F-4がGlcNAcを２残基含むヘテロキトオリゴ糖、F-3，F-5〜F-9がGlcNAcを１残基含むヘテロキトオリゴ糖だとわかる。
【００５６】
【表１】
【００５７】
（７）β-GlcNaseによる酵素分解
各画分のキトオリゴ糖の糖配列を決定するために、2〜11糖のモノアセチルキトオリゴ糖にβ-GlcNaseを作用させた。オリゴ糖溶液（2mg/ml）50μlに0.04M リン酸緩衝液(pH5.5)を25μl加え、β-GlcNase（0.5units/ml）25μlを添加し、37℃で20時間反応を行った。その後3分間の煮沸で反応を停止した。
【００５８】
（８）薄層クロマトグラフィー（TLC）による糖配列の決定
β-GlcNaseによる分解後、その分解生成物を薄層クロマトグラフィーにより分析し、糖配列の決定を行った。TLCプレートはMERCK製 TLC aluminium sheets silica gel 60を用いた。0.05Ｍ NaH2PO4を噴霧して105℃１時間加熱したのち、n-プロパノ-ル、水、30％アンモニア水を70：15：15の割合で混合した溶媒で、上昇法により３回展開した。各スポットはジフェニルアミン-アニリン試薬を噴霧し105℃、15分加熱し発色させた。標準物質にはGlcN１〜６糖、GlcNAc１〜６糖を使用した。
【００５９】
この結果から、すべての画分で分解生成物はGlcN １残基及びGlcNAc １残基の発色のみが見られることから、還元末端にGlcNAc１残基を持ち非還元末端側にGlcNの連続した糖配列を持つモノアセチルキトオリゴ糖であることがわかった。
【００６０】
最終的な各画分の収量と、ヘテロキトオリゴ糖の重合度を図５に示す。この結果から、得られたオリゴ糖はGlcNAc１残基を含むモノアセチルキトオリゴ糖が大部分で、F-1〜F-13のトータルな収量は1348ｍｇだった。
【００６１】
実施例２
実施例１により得られた様々な長さのモノアセチルキトオリゴ糖を0.04M炭酸ナトリウム溶液に糖濃度0.5%となるように溶解し、メタノール及び無水酢酸をそれぞれ45%および1.1%となるように加えた。この溶液を25℃で24時間放置した後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。乾固物に糖濃度0.5%となるように0.1Ｎ水酸化ナトリウムを加え、30分間室温で放置した。0.1Ｎ塩酸を用いてpH6.0に調整後、電気透析で脱塩、凍結乾燥によりN-アセチル化されたキチンオリゴ糖を得た。
【００６２】
実施例３
実施例１により得られた様々な長さのモノアセチルキトオリゴ糖を、０．５％の濃度となるように、２０ｍＭ 四ホウ酸ナトリウム−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した。次いで、コレトトリクム・リンデムチアヌム ＡＴＣＣ１２６１１（Colletotrichum lindemuthianum ATCC 12611）から、文献（Tokuyasu. K, et al.: Biosci. Biotech. Biochem., 60, 1598-1603, 1996)に記載の方法で精製したキチンデアセチラーゼを、０．７４ units/mlとなるように添加し、４０℃で２４時間インキュベートした。反応液１ｍｌに対して、３３％（ｖ／ｖ）酢酸を０．５ｍｌ加えて、３分間煮沸して反応を停止した。この反応液から電気透析により脱塩し、凍結乾燥して脱アセチル化されたキトサンオリゴ糖を得た。
【００６３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された二糖以上のモノアセチルキトオリゴ糖を提供することができ、このオリゴ糖は、還元末端の糖のみがＮアセチル化されていて水溶性を示し、これまでに調製困難であった比較的高重合度のオリゴ糖でも高純度で単離することが可能となる。また、このオリゴ糖をＮ−アセチル化又は脱アセチル化することにより、比較的高重合度のキチンオリゴ糖又はキトサンオリゴ糖を高純度で製造することが可能となる。このような高重合度のモノアセチルキトオリゴ糖、キチンオリゴ糖、キトサンオリゴ糖についての知見はまだ少ないが、これまでの報告から各種の生理活性が期待できるものと推測される。また、酵素の反応基質として用いることで、反応機構の解析や阻害などへの知見を得ることができ、タンパク工学的な観点、強力な阻害剤構築という点からも、非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例における実験工程を示す説明図である。
【図２】 CM-Sephadex C-25による陽イオン交換クロマトグラフィーの結果を示す図表である。
【図３】 実施例で得られたフラクションＦ８、Ｆ９のBio-Gel P-6によるゲルろ過の結果を示す図表である。
【図４】 実施例で得られたフラクションＦ１０、Ｆ１１のBio-Gel P-6によるゲルろ過の結果を示す図表である。
【図５】 オリゴ糖の収量を各フラクション毎に示す図表である。
Claims (6)
- 下記一般式（１）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された三糖以上の新規モノアセチルキトオリゴ糖。
- 前記一般式（１）におけるｎが５〜１０である請求項１記載の新規モノアセチルキトオリゴ糖。
- 部分脱アセチル化キチン又は部分Ｎ−アセチル化キトサンに、アエロモナス sp．Ｎｏ．１０Ｓ−２４（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１７３）由来のキチナーゼを作用させ、更にＮ−アセチルヘキソサミニダーゼを作用させて、下記一般式（２）で示される、還元末端糖のみがＮ−アセチル化された二糖以上のモノアセチルキトオリゴ糖を生成することを特徴とするモノアセチルキトオリゴ糖の製造方法。
- 前記方法によって得られたモノアセチルキトオリゴ糖の混合液から、クロマトグラフィー分画によって、各種重合度のモノアセチルキトオリゴ糖を分離する請求項３記載の新規モノアセチルキトオリゴ糖の製造方法。
- 請求項１又は２記載のモノアセチルキトオリゴ糖をＮ−アセチル化することを特徴とするキチンオリゴ糖の製造方法。
- 請求項１又は２記載のモノアセチルキトオリゴ糖を脱アセチル化することを特徴とするキトサンオリゴ糖の製造方法。
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