JPH06261754A - Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ - Google Patents
Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼInfo
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- JPH06261754A JPH06261754A JP5078653A JP7865393A JPH06261754A JP H06261754 A JPH06261754 A JP H06261754A JP 5078653 A JP5078653 A JP 5078653A JP 7865393 A JP7865393 A JP 7865393A JP H06261754 A JPH06261754 A JP H06261754A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属に属する菌株を誘
導用培地で培養して得られる菌体から抽出・精製して得
られる、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセトアミ
ド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸へ加水分解する
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ。 【効果】 温和な条件でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンを脱アセチル化してＤ−グルコサミンを得ることがで
きるようになった。またその基質特異性によって、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーが混在する純度
の低い原料から、ｄ−グルコサミンのみを生成すること
ができる。
導用培地で培養して得られる菌体から抽出・精製して得
られる、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセトアミ
ド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸へ加水分解する
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ。 【効果】 温和な条件でＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンを脱アセチル化してＤ−グルコサミンを得ることがで
きるようになった。またその基質特異性によって、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーが混在する純度
の低い原料から、ｄ−グルコサミンのみを生成すること
ができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサミ
ンと酢酸へ加水分解するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼに関する。
ルコサミンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサミ
ンと酢酸へ加水分解するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
の脱アセチル化物であるＤ−グルコサミンを構成単位と
するオリゴ糖は、抗菌性、抗腫瘍性などの生理活性をも
つものとして注目されている。またＤ−グルコサミンは
医薬品として、および医薬品の製造中間体としても重要
である。Ｄ−グルコサミンは、従来キチンを出発物質と
して最終的にはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱ア
セチル化して調製されており、この脱アセチル化工程に
は濃アルカリ或いは鉱酸が用いられている。
の脱アセチル化物であるＤ−グルコサミンを構成単位と
するオリゴ糖は、抗菌性、抗腫瘍性などの生理活性をも
つものとして注目されている。またＤ−グルコサミンは
医薬品として、および医薬品の製造中間体としても重要
である。Ｄ−グルコサミンは、従来キチンを出発物質と
して最終的にはＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱ア
セチル化して調製されており、この脱アセチル化工程に
は濃アルカリ或いは鉱酸が用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンのアセチル基は加水分解しにくいの
で、該脱アセチル化を完結するためには、高い濃度の酸
またはアルカリ水溶液中長時間加熱するなどの強い条件
が必要であるため、副生成物も多く生成し、目的とする
Ｄ−グルコサミンの収率の低下を来していた。また、使
用した酸、アルカリの処理に費用を要するという欠点を
有する。
−Ｄ−グルコサミンのアセチル基は加水分解しにくいの
で、該脱アセチル化を完結するためには、高い濃度の酸
またはアルカリ水溶液中長時間加熱するなどの強い条件
が必要であるため、副生成物も多く生成し、目的とする
Ｄ−グルコサミンの収率の低下を来していた。また、使
用した酸、アルカリの処理に費用を要するという欠点を
有する。
【０００４】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱アセ
チルする別法としては、デアセチラーゼを用いる方法が
考えられる。しかし、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を特異的に脱アセチル化するデアセチラーゼの単離につ
いては、全く報告されていない。
チルする別法としては、デアセチラーゼを用いる方法が
考えられる。しかし、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
を特異的に脱アセチル化するデアセチラーゼの単離につ
いては、全く報告されていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海洋微生
物であるビブリオ（Vibrio）属に着目し、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンがβ−（１、４）−結合したポリマ
ーであるキチンの変換酵素について鋭意研究を重ねた結
果、該微生物がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱ア
セチル化する酵素を生産することを見出した。
物であるビブリオ（Vibrio）属に着目し、Ｎ−アセチル
−Ｄ−グルコサミンがβ−（１、４）−結合したポリマ
ーであるキチンの変換酵素について鋭意研究を重ねた結
果、該微生物がＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱ア
セチル化する酵素を生産することを見出した。
【０００６】すなわち、本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサ
ミンと酢酸へ加水分解するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンデアセチラーゼを提供するものである。
グルコサミンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサ
ミンと酢酸へ加水分解するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンデアセチラーゼを提供するものである。
【０００７】また、本発明は、ビブリオ属に属するＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ生産能を有
する菌株をＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラ
ーゼ誘導用培地中で培養し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素
を単離することを特徴とするＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼの製造法を提供するものである。
アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ生産能を有
する菌株をＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラ
ーゼ誘導用培地中で培養し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素
を単離することを特徴とするＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼの製造法を提供するものである。
【０００８】本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸
へ加水分解するものであれば、いかなる性質のＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼをも包含する。
ンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸
へ加水分解するものであれば、いかなる性質のＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼをも包含する。
【０００９】本発明酵素の理化学的性質を以下に示す。 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセトアミド基に作
用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸へ加水分解する。Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンの２量体以上のオリゴマーに
は、実質的に反応しない。 （２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、その由来生物により大きく異なるが、約
４．０〜９．０の範囲内にある。例えば、ｐＨ５．６〜
１０．８の範囲で、ビブリオ由来の酵素について活性測
定法に従って酵素反応を行ったところ、ビブリオ由来の
酵素の至適ｐＨは７．８〜８．２である。但し、使用し
た緩衝液は、ｐＨ５．６〜６．０の範囲では１００ｍＭ
ＣＨ3 ＣＯＯＨ−ＣＨ3 ＣＯＯＮａ緩衝液、ｐＨ６．
０〜９．０の範囲では１００ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ
2 ＨＰＯ4 緩衝液、ｐＨ９．６〜１０．８の範囲では２
００ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＮａＯＨ緩衝液である。
用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸へ加水分解する。Ｎ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンの２量体以上のオリゴマーに
は、実質的に反応しない。 （２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、その由来生物により大きく異なるが、約
４．０〜９．０の範囲内にある。例えば、ｐＨ５．６〜
１０．８の範囲で、ビブリオ由来の酵素について活性測
定法に従って酵素反応を行ったところ、ビブリオ由来の
酵素の至適ｐＨは７．８〜８．２である。但し、使用し
た緩衝液は、ｐＨ５．６〜６．０の範囲では１００ｍＭ
ＣＨ3 ＣＯＯＨ−ＣＨ3 ＣＯＯＮａ緩衝液、ｐＨ６．
０〜９．０の範囲では１００ｍＭ ＫＨ2 ＰＯ4 −Ｎａ
2 ＨＰＯ4 緩衝液、ｐＨ９．６〜１０．８の範囲では２
００ｍＭ Ｎａ2 ＨＰＯ4 −ＮａＯＨ緩衝液である。
【００１０】なお、ビブリオ属に属する菌株から得た酵
素の相対活性を図１に示す。
素の相対活性を図１に示す。
【００１１】本酵素を所定の緩衝液に溶解し、４５℃に
おいて３０分間保持した後、残存活性を測定したときの
５０％以上の活性が残存するｐＨ範囲は、由来生物によ
って大きく異なるが、約３．０〜９．０の範囲内にあ
る。例えばビブリオ由来の酵素では、約６．０〜９．０
である。ビブリオ由来の酵素の相対活性を図３に示す。 （３）作用適温の範囲 作用適温の範囲も由来生物により大きく異なるが、約１
０℃〜５０℃の範囲内にある。例えば、ビブリオ由来の
酵素を用い、２０〜４７℃の範囲において活性測定法に
従い酵素反応を行ったところ、該酵素の作用適温の範囲
は、約３３〜３９℃である。ビブリオ由来の酵素の相対
活性を図２に示す。 （４）分子量 ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ−３０００ＳＷカラムにより測定し
た分子量は７０，０００〜２００，０００である。な
お、ビブリオ由来の酵素の分子量は１６０，０００〜１
８０，０００である。
おいて３０分間保持した後、残存活性を測定したときの
５０％以上の活性が残存するｐＨ範囲は、由来生物によ
って大きく異なるが、約３．０〜９．０の範囲内にあ
る。例えばビブリオ由来の酵素では、約６．０〜９．０
である。ビブリオ由来の酵素の相対活性を図３に示す。 （３）作用適温の範囲 作用適温の範囲も由来生物により大きく異なるが、約１
０℃〜５０℃の範囲内にある。例えば、ビブリオ由来の
酵素を用い、２０〜４７℃の範囲において活性測定法に
従い酵素反応を行ったところ、該酵素の作用適温の範囲
は、約３３〜３９℃である。ビブリオ由来の酵素の相対
活性を図２に示す。 （４）分子量 ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ−３０００ＳＷカラムにより測定し
た分子量は７０，０００〜２００，０００である。な
お、ビブリオ由来の酵素の分子量は１６０，０００〜１
８０，０００である。
【００１２】本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
デアセチラーゼは、種々の微生物、例えばバクテリア、
真菌、酵母、動物細胞または植物細胞から得られる。す
なわち、これらの微生物をその種類に応じた各種培地中
で誘導物質の存在下に培養し、この誘導物質としては、
キチン、キチン分解物、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーを単独
又はこれらのうち２種以上を組み合わせたものを使用で
きる。誘導物質は、０．１ｇ／リットル以上、好ましく
は１．０〜５０ｇ／リットルの濃度で加える。
デアセチラーゼは、種々の微生物、例えばバクテリア、
真菌、酵母、動物細胞または植物細胞から得られる。す
なわち、これらの微生物をその種類に応じた各種培地中
で誘導物質の存在下に培養し、この誘導物質としては、
キチン、キチン分解物、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンオリゴマーを単独
又はこれらのうち２種以上を組み合わせたものを使用で
きる。誘導物質は、０．１ｇ／リットル以上、好ましく
は１．０〜５０ｇ／リットルの濃度で加える。
【００１３】以下に、ビブリオ属に属するビブリオ・コ
レレ非−０１（ＩＦＯ Ｎｏ．１５４２９）を使用した
場合を例にとり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデア
セチラーゼの取得法及び該酵素の特徴を詳細に説明す
る。
レレ非−０１（ＩＦＯ Ｎｏ．１５４２９）を使用した
場合を例にとり、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデア
セチラーゼの取得法及び該酵素の特徴を詳細に説明す
る。
【００１４】なお、本発明の製造法に用いられるビブリ
オ属に属する菌株は公知のものであり、例えばビブリオ
・コレレ非−０１は、発酵研究所（ＩＦＯ）より入手で
きる。 培養条件 上記菌株をまず通常の栄養培地で培養する。培地は格別
である必要はなく、通常の培地が用いられる。例えば、
炭素源としてグルコース、マルトース、キシロース、ス
クロース、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イ
ーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の
有機窒素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
等の無機窒素が例示できる。また無機塩としては、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、
リン酸カリウム、塩かカリウム、塩化ナトリウム、塩化
カルシウム等を適宜組み合わせて使用できる。上記培地
のｐＨは、適当な酸または塩基を加えることにより６．
５から８．０の範囲内に調整され、高圧殺菌により殺菌
される。培養温度は、２５〜４０℃、好ましくは３７℃
で１２〜２４時間好気的に振とうまたは攪拌しながら培
養を行う。本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデ
アセチラーゼは誘導酵素であり、上記培養液から得られ
た菌体を、炭素源、窒素源及び無機塩を含む通常の培地
に、誘導物質を添加した培地で培養する。この誘導物質
およびその濃度としては、上記と同様である。
オ属に属する菌株は公知のものであり、例えばビブリオ
・コレレ非−０１は、発酵研究所（ＩＦＯ）より入手で
きる。 培養条件 上記菌株をまず通常の栄養培地で培養する。培地は格別
である必要はなく、通常の培地が用いられる。例えば、
炭素源としてグルコース、マルトース、キシロース、ス
クロース、ペプトン等が例示でき、窒素源としては、イ
ーストエキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸溶液等の
有機窒素、または硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
等の無機窒素が例示できる。また無機塩としては、硫酸
マグネシウム、塩化マグネシウム、リン酸ナトリウム、
リン酸カリウム、塩かカリウム、塩化ナトリウム、塩化
カルシウム等を適宜組み合わせて使用できる。上記培地
のｐＨは、適当な酸または塩基を加えることにより６．
５から８．０の範囲内に調整され、高圧殺菌により殺菌
される。培養温度は、２５〜４０℃、好ましくは３７℃
で１２〜２４時間好気的に振とうまたは攪拌しながら培
養を行う。本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデ
アセチラーゼは誘導酵素であり、上記培養液から得られ
た菌体を、炭素源、窒素源及び無機塩を含む通常の培地
に、誘導物質を添加した培地で培養する。この誘導物質
およびその濃度としては、上記と同様である。
【００１５】培地の具体例としては、培地１リットル当
り３ｇの硝酸アンモニウム、１ｇのリン酸水素二カリウ
ム、２０ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇの硫酸マグネシ
ウム、０．０８ｇの塩化カルシウム、５０ｇのＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンをそれぞれ含有したｐＨ７．４
の液体培地を例示できる。
り３ｇの硝酸アンモニウム、１ｇのリン酸水素二カリウ
ム、２０ｇの塩化ナトリウム、０．５ｇの硫酸マグネシ
ウム、０．０８ｇの塩化カルシウム、５０ｇのＮ−アセ
チル−Ｄ−グルコサミンをそれぞれ含有したｐＨ７．４
の液体培地を例示できる。
【００１６】ビブリオ・ココレ非−０１は、２５〜４０
℃、好ましくは３７℃で１〜３日間好気的に振とうまた
は攪拌しながら培養される。 酵素の採取法 上記培養液から本発明酵素を採取、精製するには既知の
精製法が単独、もしくは併用して利用されうる。例え
ば、培養液を遠心分離にかけ菌体を集めた後、超音波処
理等によって菌体抽出液を得た後、イオン交換クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィー、などで精製を行う。精製法の１例を次に
示す。 （１）菌体の超音波破砕物より遠心分離により無細胞抽
出液を得る。 （２）ＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌクロマトグラフィーに
かけ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液で溶出を行う。 （３）更にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
にかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出する。 （４）次にＨＰＬＣを用いたＴＳＫ−Ｇ ３０００ＳＷ
のゲルろ過を行う。
℃、好ましくは３７℃で１〜３日間好気的に振とうまた
は攪拌しながら培養される。 酵素の採取法 上記培養液から本発明酵素を採取、精製するには既知の
精製法が単独、もしくは併用して利用されうる。例え
ば、培養液を遠心分離にかけ菌体を集めた後、超音波処
理等によって菌体抽出液を得た後、イオン交換クロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマ
トグラフィー、などで精製を行う。精製法の１例を次に
示す。 （１）菌体の超音波破砕物より遠心分離により無細胞抽
出液を得る。 （２）ＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌクロマトグラフィーに
かけ、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液で溶出を行う。 （３）更にハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
にかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液で溶出する。 （４）次にＨＰＬＣを用いたＴＳＫ−Ｇ ３０００ＳＷ
のゲルろ過を行う。
【００１７】このような方法で精製した時の各ステップ
における酵素の純化の度合いを表１に示す。表１におけ
る活性は後述の活性測定法により測定した値である。こ
のようにして、ステップ４で１．２２単位／ｍｇタンパ
ク質の（当初の酵素液に比較して３４６倍に純化され
た）精製酵素が得られる。以下、後述の酵素の性質は、
この精製酵素を用いて調べられた。
における酵素の純化の度合いを表１に示す。表１におけ
る活性は後述の活性測定法により測定した値である。こ
のようにして、ステップ４で１．２２単位／ｍｇタンパ
ク質の（当初の酵素液に比較して３４６倍に純化され
た）精製酵素が得られる。以下、後述の酵素の性質は、
この精製酵素を用いて調べられた。
【００１８】 第 １ 表 ステップ 総蛋白量 総活性 比 活 性 純化倍率 活性回収率 ｍｇ 単 位 単位/mg 蛋白質 倍 ％ １ 1730 6.20 0.00358 1 100 ２ 68.6 6.00 0.0875 24.4 96.7 ３ 6.57 2.45 0.373 104 39.5 ４ 0.72 0.88 1.22 346 14.2 活性測定法 １００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）０．３ｍｌに基
質として１％Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液０．
１ｍｌを加え、さらに酵素溶液０．１ｍｌを加え、３７
℃で３０分インキュベートする。その後、生成したＤ−
グルコサミンをインドール・塩酸法で比色定量する。酵
素の１単位は、１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコサミン
を生成する酵素量とする。
質として１％Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン溶液０．
１ｍｌを加え、さらに酵素溶液０．１ｍｌを加え、３７
℃で３０分インキュベートする。その後、生成したＤ−
グルコサミンをインドール・塩酸法で比色定量する。酵
素の１単位は、１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコサミン
を生成する酵素量とする。
【００１９】
【発明の効果】本発明のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼは、これまでに全く知られていない酵
素であり、該酵素を使用することにより、温和な条件で
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱アセチル化してＤ
−グルコサミンを得ることができるようになった。また
その基質特異性によって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンオリゴマーが混在する純度の低い原料から、Ｎ−グ
ルコサミンのみを生成することができた、。Ｄ−グルコ
サミンは機能性オリゴ糖合成の出発物質として、近年注
目されており、本発明の酵素は広い分野での応用が期待
される。
ンデアセチラーゼは、これまでに全く知られていない酵
素であり、該酵素を使用することにより、温和な条件で
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを脱アセチル化してＤ
−グルコサミンを得ることができるようになった。また
その基質特異性によって、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンオリゴマーが混在する純度の低い原料から、Ｎ−グ
ルコサミンのみを生成することができた、。Ｄ−グルコ
サミンは機能性オリゴ糖合成の出発物質として、近年注
目されており、本発明の酵素は広い分野での応用が期待
される。
【００２０】
（１）Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｏｎ−０１
ＩＦＯ１５４２９株の培養 培地２００ｍｌ当たり、０．６ｇの硝酸アンモニウム、
０．２ｇのリン酸水素二カリウム、２ｇの塩化ナトリウ
ム、０．１２ｇの硫酸マグネシウム、０．０２ｇの塩化
カルシウム、１０ｇのグルコース、３ｇのアガーをそれ
ぞれ含有したｐＨ７．４の平板培地上で、Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｏｎ−０１ ＩＦＯ１５４２９
株を、３７℃で２４時間培養した。その後、へらを用い
て集めた菌を、以下の誘導培地中で２４時間好気的に振
とう培養した。
ＩＦＯ１５４２９株の培養 培地２００ｍｌ当たり、０．６ｇの硝酸アンモニウム、
０．２ｇのリン酸水素二カリウム、２ｇの塩化ナトリウ
ム、０．１２ｇの硫酸マグネシウム、０．０２ｇの塩化
カルシウム、１０ｇのグルコース、３ｇのアガーをそれ
ぞれ含有したｐＨ７．４の平板培地上で、Ｖｉｂｒｉｏ
ｃｈｏｌｅｒａｅ ｎｏｎ−０１ ＩＦＯ１５４２９
株を、３７℃で２４時間培養した。その後、へらを用い
て集めた菌を、以下の誘導培地中で２４時間好気的に振
とう培養した。
【００２１】誘導培地：５００ｍｌ当たり、１．５ｇの
硝酸アンモニウム、０．５のリン酸水素二カリウム、１
０ｇの塩化ナトリウム、０．３ｇの硫酸マグネシウム、
０．０４の塩化カルシウム、２５ｇのＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンをそれぞれ含有したｐＨ７．４の液体培
地。 （２）酵素の採取および精製 その後、培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離にか
け湿重量１１ｇの菌体を得た。４０ｍｌの生理食塩水に
懸濁し、０℃で１０分間超音波処理（２０秒間作動、２
０秒間休止）を行った後、遠心分離によって、０．００
３５８単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つタンパク質
１．７３ｇを含む無細胞抽出液を得た。
硝酸アンモニウム、０．５のリン酸水素二カリウム、１
０ｇの塩化ナトリウム、０．３ｇの硫酸マグネシウム、
０．０４の塩化カルシウム、２５ｇのＮ−アセチル−Ｄ
−グルコサミンをそれぞれ含有したｐＨ７．４の液体培
地。 （２）酵素の採取および精製 その後、培養液を８０００×ｇで２０分間遠心分離にか
け湿重量１１ｇの菌体を得た。４０ｍｌの生理食塩水に
懸濁し、０℃で１０分間超音波処理（２０秒間作動、２
０秒間休止）を行った後、遠心分離によって、０．００
３５８単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つタンパク質
１．７３ｇを含む無細胞抽出液を得た。
【００２２】次いで、抽出液を０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａを充填したカラムに流した後、段階的にＮａＣｌの
濃度を上昇させた。１５０ｍＭ ＮａＣｌによって０．
０８７５単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つタンパク
質６８．６ｍｇを溶出した。さらに該溶出液を、ハイド
ロキシアパタイトカラムに流し、リン酸緩衝液の濃度を
段階的に上昇させて該酵素を溶出した。５０ｍＭの濃度
のリン酸緩衝液によって、０．３７３単位／ｍｇタンパ
ク質の比活性を持つタンパク質２．４５ｍｇを含有する
溶出液１０ｍｌを得た。
（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａを充填したカラムに流した後、段階的にＮａＣｌの
濃度を上昇させた。１５０ｍＭ ＮａＣｌによって０．
０８７５単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つタンパク
質６８．６ｍｇを溶出した。さらに該溶出液を、ハイド
ロキシアパタイトカラムに流し、リン酸緩衝液の濃度を
段階的に上昇させて該酵素を溶出した。５０ｍＭの濃度
のリン酸緩衝液によって、０．３７３単位／ｍｇタンパ
ク質の比活性を持つタンパク質２．４５ｍｇを含有する
溶出液１０ｍｌを得た。
【００２３】溶出液１０ｍｌは限外ろ過（分画分子量１
０万）により０．４ｍｌに濃縮した後、ＴＳＫｇｅｌ３
０００ＳＷカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
にかけ、１．２２単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つ
精製酵素０．７２ｍｇを得た。該酵素の純化倍率は３４
６倍であり、活性の回収率は１４．２％であった。ま
た、分子量は、１２０，０００〜１８０，０００であっ
た。
０万）により０．４ｍｌに濃縮した後、ＴＳＫｇｅｌ３
０００ＳＷカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
にかけ、１．２２単位／ｍｇタンパク質の比活性を持つ
精製酵素０．７２ｍｇを得た。該酵素の純化倍率は３４
６倍であり、活性の回収率は１４．２％であった。ま
た、分子量は、１２０，０００〜１８０，０００であっ
た。
【図１】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラー
ゼの、３７℃における相対活性とｐＨの関係を示すグラ
フである。
ゼの、３７℃における相対活性とｐＨの関係を示すグラ
フである。
【図２】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラー
ゼの、ｐＨ７．８における相対活性と温度の関係を示す
グラフである。
ゼの、ｐＨ７．８における相対活性と温度の関係を示す
グラフである。
【図３】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラー
ゼを３７℃で３０分間インキュベートした後の、３７
℃、ｐＨ７．８における相対活性と温度の関係を示すグ
ラフである。
ゼを３７℃で３０分間インキュベートした後の、３７
℃、ｐＨ７．８における相対活性と温度の関係を示すグ
ラフである。
【図４】ｐＨ７．８かつ所定の温度条件下で３０分間イ
ンキュベートした後の、３７℃、ｐＨ７．８における相
対活性と温度の関係を示すグラフである。
ンキュベートした後の、３７℃、ｐＨ７．８における相
対活性と温度の関係を示すグラフである。
Claims (6)
- 【請求項１】Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンのアセト
アミド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと酢酸へ加水分解
するＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ。 - 【請求項２】ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ−３０００ＳＷカラム
により測定した分子量が７０，０００〜２００，０００
である請求項１に記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ンデアセチラーゼ。 - 【請求項３】 次の性質を有する請求項１または２に記
載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ。 （１）作用及び基質特異性：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンのアセトアミド基に作用し、Ｄ−グルコサミンと
酢酸へ加水分解する。Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン
の２量体以上のオリゴマーには、実質的に反応しない。 （２）至適ｐＨ：３７℃において７．８〜８．２であ
る。 （３）安定ｐＨ：４５℃において６．０〜９．０であ
る。 （４）作用適温の範囲：至適温度は３３〜３９℃であ
る。 （５）分子量：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ−３０００ＳＷカラ
ムにより測定した分子量は１２０，０００〜１８０，０
００である。 - 【請求項４】 ビブリオ属に属する菌から得られる請求
項１〜３のいずれかに記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンデアセチラーゼ。 - 【請求項５】 ビブリオ属に属するＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンデアセチラーゼ生産能を有する菌株をＮ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ誘導用培地
中で培養し、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチ
ラーゼを生成蓄積せしめ、次いで該酵素を単離すること
を特徴とするＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチ
ラーゼの製造法。 - 【請求項６】 ビブリオ属に属するＮ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンデアセチラーゼ生産能を有する菌株をあら
かじめ栄養培地中で培養することを特徴とする請求項５
に記載のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンデアセチラー
ゼの製造法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5078653A JPH0763370B2 (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ |
| US08/154,350 USH1453H (en) | 1993-03-12 | 1993-11-18 | N-acetyl-D-glucosamine deacetylase and a process for preparing the same |
| DE69433102T DE69433102T2 (de) | 1993-03-12 | 1994-03-11 | N-Acetyl-D-Glucosamin Deacetylase und Verfahren zu deren Herstellung |
| EP94301768A EP0614972B1 (en) | 1993-03-12 | 1994-03-11 | N-Acetyl-D-glucosamine deacetylase and a process for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5078653A JPH0763370B2 (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261754A true JPH06261754A (ja) | 1994-09-20 |
| JPH0763370B2 JPH0763370B2 (ja) | 1995-07-12 |
Family
ID=13667824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5078653A Expired - Lifetime JPH0763370B2 (ja) | 1993-03-12 | 1993-03-12 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | USH1453H (ja) |
| EP (1) | EP0614972B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0763370B2 (ja) |
| DE (1) | DE69433102T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08289786A (ja) * | 1995-04-25 | 1996-11-05 | Agency Of Ind Science & Technol | グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼ |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2615443B2 (ja) * | 1995-03-13 | 1997-05-28 | 工業技術院長 | Ｎ−アセチル−ｄ−グルコサミンデアセチラーゼの製造方法 |
| KR101035043B1 (ko) | 2002-07-01 | 2011-05-19 | 아르키온 라이프 사이언씨즈 엘엘씨 | 글루코사민 및 ｎ-아세틸글루코사민의 제조를 위한 물질및 공정 |
| CN104327128A (zh) * | 2014-11-19 | 2015-02-04 | 北大医药重庆大新药业股份有限公司 | 一种氨基葡萄糖盐酸盐的制备方法 |
| CN104530144B (zh) * | 2014-12-09 | 2017-05-24 | 厦门蓝湾科技有限公司 | 制备硫酸氨基葡萄糖的反应装置及其制备方法 |
| CN107022538A (zh) * | 2016-04-02 | 2017-08-08 | 华中农业大学 | 一种高产氨基葡萄糖的脱乙酰酶及其编码基因 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04349884A (ja) * | 1991-05-27 | 1992-12-04 | Agency Of Ind Science & Technol | デアセチラーゼの製造方法 |
-
1993
- 1993-03-12 JP JP5078653A patent/JPH0763370B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-11-18 US US08/154,350 patent/USH1453H/en not_active Abandoned
-
1994
- 1994-03-11 EP EP94301768A patent/EP0614972B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-03-11 DE DE69433102T patent/DE69433102T2/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04349884A (ja) * | 1991-05-27 | 1992-12-04 | Agency Of Ind Science & Technol | デアセチラーゼの製造方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH08289786A (ja) * | 1995-04-25 | 1996-11-05 | Agency Of Ind Science & Technol | グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69433102D1 (de) | 2003-10-09 |
| DE69433102T2 (de) | 2004-06-24 |
| JPH0763370B2 (ja) | 1995-07-12 |
| EP0614972A2 (en) | 1994-09-14 |
| USH1453H (en) | 1995-06-06 |
| EP0614972A3 (en) | 1996-05-29 |
| EP0614972B1 (en) | 2003-09-03 |
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| EXPY | Cancellation because of completion of term |