KR101035043B1 - 글루코사민 및 ｎ-아세틸글루코사민의 제조를 위한 물질및 공정 - Google Patents

글루코사민 및 ｎ-아세틸글루코사민의 제조를 위한 물질및 공정 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는 생합성 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하도록 유전적으로 변형된 미생물의 발효를 포함한다. 또한, 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는데 유용한 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다. 추가로 고순도의 N-아세틸글루코사민을 초래하는 방법을 포함한 발효 공정에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민을 회수하는 단계를 개시한다. 또한, N-아세틸글루코사민으로부터 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다.
글루코사민, N-아세틸글루코사민, 발효, 유전적으로 변형된 미생물

Description

글루코사민 및 Ｎ-아세틸글루코사민의 제조를 위한 물질 및 공정{Process and Materials for Production of Glucosamine and N-acetylglucosamine}
본 발명은 발효에 의해 글루코사민과 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글루코사민과 N-아세틸글루코사민을 제조하는데 유용한 유전적으로 변형된 미생물 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 발효 공정으로부터 N-아세틸글루코사민 또는 글루코사민을 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 N-아세틸글루코사민 원료로부터 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다.
아미노당은 일반적으로 복합 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드에서 모노머 잔기로서 발견된다. 글루코사민은 단당류인 글루코오스의 아미노 유도체이다. N-아세틸글루코사민은 글루코사민의 아세틸화된 유도체이다. 글루코사민, N-아세틸글루코사민 및 다른 아미노당은 많은 천연 폴리사카라이드의 중요한 구성성분이다. 예를 들어 아미노당을 포함하는 폴리사카라이드는 구조 단백질과 유사하게 세포의 구조 물질을 형성할 수 있다.
글루코사민은 동물과 사람의 여러 질환 중에서도 골관절염 질병의 치료에 적용하는 기능성 식품으로 제조되고 있다. 글루코사민 시장은 엄청난 성장을 경험하 고 있다. 또한 글루코사민의 세계 시장 가격의 급격한 하락이 예상되지 않는다. N-아세틸글루코사민은 또한 광범위한 질환을 치료할 수 있는 가치 있는 약리학적 성분이다. N-아세틸글루코사민은 어떠한 부작용도 알려져 있지 않다. N-아세틸글루코사민은 조직 재생에 긍정적 효과를 미치는 생체의 단백질 합성의 가치 있고 중요한 성분이기 때문에 N-아세틸글루코사민은 위염, 음식물 알러지, 염증성 장질환(IBD), 계실염 및 골관절 조직의 대사 장애로부터 야기되는 병리학적 질환 뿐만 아니라 급성 및 만성형 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 광범위한 질병을 예방 및/또는 치료하는데 있어서 치료 잠재력을 갖고 있다.
현재 글루코사민은 N-아세틸-D-글루코사민으로부터 유도된 복합 탄수화물인 키틴의 산 가수분해를 통하여 수득하고 있다. 또한, 글루코사민은 다양하게 아세틸화된 키토산의 산 분해에 의해 제조될 수도 있다. N-아세틸글루코사민과 글루코사민의 공중합체인 키틴은 절지동물 및 곰팡이에서 발견되는 흔한 천연 물질이다. 키틴은 예를 들면 갑각 동물(바닷가재, 새우, 크릴, 게 및 참새우 외골격); 파리 유충과 같이 돼지의 설육을 생분해하는데 이용되는 곤충; 보다 최근에는 시트르산 생산에 이용되는 곰팡이 바이오매스(biomass)인 절지동물의 폐기물과 같은 저렴한 원료로부터 수득할 수 있다. 최종 산물인 글루코사민 염은 폐물 원료 중 상대적으로 적은 키틴 함량이 상대적으로 적은 양의 생산물을 수득하기 위하여 상당한 부피의 폐기물이 처리될 것을 요구하며 공정 그 자체는 상대적으로 낮은 수율을 나타내면서 에너지 및 화학적으로 집약적이기 때문에 상대적으로 비싸다.
통상적인 산업적 실시는 미네랄, 단백질 및 설육 출발 물질을 동반한 다른 불순물을 제거하기 위하여 산과 염기의 조합으로 처리하여 키틴을 정제하고, 높은 온도에서 장시간 동안 저수율로 고농도의 염산을 통해서 한 단계로 키틴을 글루코사민으로 분해하고 탈아세틸화하는 것이다. 글루코사민은 유리 염기로서 매우 불안정하고 분해되기 쉽다. 결과적으로 염화염과 같은 안정한 염이 생산된다. Viartril 및 DONA 200-S와 같은 임상적 세트에서 효능에 대해 테스트될 수 있는 형태를 모방하기 위하여 일반적으로 염기로서 염화염을 이용하여 여타의 염의 혼합물이 제공된다. 이러한 조성물은 (글루코사민)2 술페이트-(NaCl)2 및 (글루코사민) 2 술페이트-(KCl)2의 분자식을 갖는 혼합된 염의 형태를 취하게 된다. 보다 최근에는 (글루코사민)2 소듐 비술페이트-(HCl)2, (글루코사민)2포타슘 비술페이트-(HCl) 2 구조물의 염이 적은 나트륨 및 칼륨 용량으로 안정한 글루코사민 염을 제공할 수 있는 수단으로 연구되고 있다.
N-아세틸글루코사민은 시장에서 널리 입수 가능하지 않다. 이들은 현재 고가이며 까다로운 단계인 아세트산 무수물과 같은 유기 아세틸화 시약을 이용하여 글루코사민의 아세틸화에 의해 제조되고 있다. 이러한 공정은 낮은 생산 수율로 인하여 바람직하지 않다(기질에서 글루코사민으로 50% 전환율).
갑각 동물에서 유래된 글루코사민의 통상적인 형태는 갑각 동물에 민감한 사람에게 알러지 반응을 일으킬 가능성이 있다고 소비자에게 경고하는 라벨을 부착하고 있다. 점진적으로 소비자들은 어떤 동물의 부산물도 포함하지 않는 물질을 찾고 있다. 또한, 원료 물질(예, 게 껍데기와 같은 키틴의 원료)의 이용 가능성이 점진적으로 제한되고 있다. 따라서 상업적인 판매와 이용을 위하여 고수율로 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조할 수 있는 비용 효율적인 방법에 대한 필요가 산업상 있어 왔다.
국제특허공개 WO 02/66667호는 글루코사민 및 미생물 바이오매스로부터 글루코사민을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 상기 제조방법은 갑각 동물 알러지와 관련된 문제들을 해결하였으나 낮은 수율이라는 중대한 문제점을 갖고 있다. 보다 자세하게 상기 방법은 시트르산과 같은 다른 생산물의 생산을 위한 발효에서 생성된 바이오매스 폐기물에 의존하기 때문에 그 생산물에 대하여 증가하는 시장의 요구를 만족시킬 수 있는 양의 글루코사민을 제조하기에는 충분하지 않다. 미국특허 6,372,457호는 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용되는데 미생물의 발효에 의해 글루코사민을 제조하는 방법과 물질을 개시하고 있다. 그러나 미국특허 6,372,457호는 N-아세틸글루코사민을 제조할 수 있는 방법에 대하여 개시된 바가 없다.
본 발명의 한 양태는 발효에 의해 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계; (b) 상기 배양 단계로부터 생산된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 글루코사민 -6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트렌스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산물의 감소된 억제; 및 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결과를 제공한다. 다른 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 서열을 분자로 형질전환된다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 효소 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 다른 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 또는 적어도 약 50% 이상 또는 적어도 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖되, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 효소 활성을 보유한다. 다른 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 상기 양태의 다른 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시킨 적어도 하나 이상의 유전자 변형을 추가로 포함한다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 양태의 한 관점에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 또는 적어도 약 50% 이상 또는 적어도 약 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 포함하되, 상기 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 효소 활성을 보유한다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 야생형 글루코사민-6-포스페이트 신타제와 비교했을 때 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 생산물의 억제를 감소시키는 변형을 포함한다. 그러한 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백 질을 포함할 수 있다. 추가의 측면에서, 이러한 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함한다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 상기 유전적 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 발효에 의해 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것으로 (a) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계 및 (b) 상기 배양 단계로부터 제조된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함한다. 이러한 측면에서, 유전적 변형은 바람직하게는 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 과잉 발현, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 효소 활성, 증가된 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 역반응, 감소된 프룩토오스-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감소된 정반응, 프룩토오스-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 친화력, 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감소된 친화력 및 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제에 대한 글루코사민-6-포 스페이트 생산물의 감소된 억제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결과를 제공한다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 핵산 서열은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 효소 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 서열번호 42의 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 또는 적어도 약 50% 이상 또는 적어도 약 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖되 상기 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 효소 활성을 보유한다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 양태의 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있다.
상기 양태의 또 다른 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 유전적 변형은 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산물 의 감소된 억제; 및 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 제공할 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 이전 양태에서 기술된 바와 같이 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 다양한 측면이 이전 양태에서 기술되었으며 여기에 포함된다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 그러한 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있다.
상기 양태의 또 다른 측면에서, 미생물은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 유전적 변형은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 감소된 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소의 과잉 발현; 글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력; N-아세틸글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 친화력; 및 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 생산물의 감소된 억제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결과를 제공할 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 이기능성의(biofunctional) 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 포함하되, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성이 증가된다. 다른 측면에서, 미생물은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 한 측면에서, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 각각 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 다른 측면에서, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 서열번호 56의 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖되, 상기 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 효소 활성을 보유한다. 다른 측면에서, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 서열번호 56의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 측면에서, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖으며 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스 퍼라제 활성이 감소되거나 없어진 절단된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 서열번호 58의 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 절단된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 포함한다. 한 측면에서, 절단된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 서열번호 58의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 양태에서, 미생물은 상술한 바와 같이 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형 및 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양 단계로부터 생산된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함하는 발효에 의해 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함한다. 다른 측면에서, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 감소된 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소의 과잉 발현; 글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력; N-아세틸글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 친화력; 및 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 생산물의 감소된 억제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결과를 제공한다. 이기능성의 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 다양한 측면은 이전 양태에서 기술되었으며 여기에 또한 포함된다.
상기 양태의 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함한다. 그러한 변형의 다양한 측면은 이전 양태에서 기술되었으며 여기에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 내인성 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양 단계로부터 생산된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함하는 발효에 의해 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 이러한 변형의 다양한 측면이 전술되었으며 여기에 포함된다. 한 측면에서, 미생물은 전술된 바와 같이 글루코사민-6-포스페이트 데아미나아제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 발효에 의해 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법이며, 수집 단계는 상기 배양 단계로부터 생산된 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 것을 포함한다.
전술한 양태들 중 어느 한 양태의 한 측면에서, 전술한 재조합 핵산 분자 중 어느 하나의 발현은 이에 제한되는 것은 아니지만, 락토오스와 같은 것에 의해 유도될 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 락토오스에 의한 전사 유도의 억제를 감소시키는 유전적 변형을 포함한다. 그러한 유전적 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, LacI 리프레서(repressor) 단백질을 암호화하는 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함할 수 있다.
발효에 의한 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민의 제조방법과 관련된 본 발명의 전술한 양태들 중 어느 한 양태에서, 하기 사항들이 적용될 수 있다. 한 측면에서, 배양 단계는 발효 배지 중 탄소원을 약 0.5% 내지 약 5%의 농도로 유지 하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 배양 단계는 효모 추출물을 포함한 발효 배지에서 수행한다. 또 다른 측면에서, 배양 단계는 글루코오스, 프룩토오스, 오탄당, 락토오스 및 글루콘산으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄소원을 포함하는 발효 배지에서 수행한다. 오탄당은 이에 제한되는 것은 아니지만, 리보오스, 크실로오스 및 아라비노오스를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 배양 단계는 글루코오스 및 리보오스를 포함하는 발효 배지에서 수행하고 다른 측면에서, 배양 단계는 글루코오스 및 글루콘산을 포함하는 발효 배지에서 수행한다. 한 측면으로 배양 단계는 약 25℃ 내지 약 45℃, 다른 측면으로 약 37℃의 온도에서 수행한다. 한 측면으로 배양 단계는 약 pH 4 내지 약 pH 7.5의 pH에서, 다른 측면으로 약 pH 6.7 내지 약 pH 7.5의 pH에서, 그리고 또 다른 측면으로 약 pH 4.5 내지 약 pH 5의 pH에서 수행한다.
발효 공정에 의해서 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 대한 전술한 양태들 중 어느 한 양태에서, 미생물은 하기 변형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 미생물의 포스포글루코이소머라제 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어 미생물은 포스포글루코이소머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 서열 분자로 형질전환될 수 있으며 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 포스포글루코이소머라제를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미생물은 미생물의 포스포프룩토키나제의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 추가로 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미생물은 글루타민 신테타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 예 를 들어, 미생물은 글루타민 신테타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환될 수 있으며 서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 글루타민 신테타제를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미생물은 추가로 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환될 수 있으며, 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만, ADP-글루코오스 피로포스포릴라제, 글리코겐 신타제 및 분지화 효소를 포함한 미생물의 글리코겐 합성에 관여하는 효소 암호화하는 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 추가로 포함한다. 바람직하게는 전술한 변형은 갈락토오스를 대사하는 미생물의 능력을 억제시키지 않는다.
발효 공정에 의해서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 대한 전술한 양태들 중 어느 한 양태에서, 수집 단계는 미생물로부터 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및 글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포내의 생산물을 회수하거나 발효 배지로부터 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세포외의 생산물을 회수하는 것을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 단계는 (a) 발효 배지로부터 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로 선택된 생산물을 정제하는 단계; (b) 미생물로부터 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 회수하는 단계; (c) 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 탈인산화하여 글루코사민을 제조하는 단계; 및 (d) N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 탈인산화하여 N-아세틸글루코사민을 제조하는 단계; (e) N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 처리하여 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글루코사민 생산물을 제조하는 단계로부터 선택된 단계를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 단계 (e)는 N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 산과 가열 조건 또는 효소에 의한 탈아세틸화에 의해 가수분해하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 발효 방법에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민은 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 침전하여 회수한다. 다른 측면에서, 발효 방법에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민은 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 결정화하여 회수한다.
본 발명의 다른 양태는 전술한 유전적으로 변형된 미생물들 중 어느 하나에 관한 것이다.
상술한 양태들 중 어느 하나에서 유전적으로 변형된 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만, 박테리아 및 곰팡이를 포함한다. 한 측면에서, 미생물은 박테리아 및 효모로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 적합한 박테리아는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속(genus)의 박테리아를 포함한다. 보다 적합한 박테리아는 이에 제한되는 것은 아니지만, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종(species)의 박테리아를 포함한다. 적합한 효모는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 파피아(Phaffia)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속의 효모를 포함한다. 보다 적합한 효모는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 카나덴시스(P. canadensis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 파피라 로도지마(Phaffia rhodozyma)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종의 효모를 포함한다. 적합한 곰팡이는 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼 질러스(Aspergillus), 압시디아(Absidia), 리조푸스(Rhizopus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 뉴로스포라(Neurospora) 및 트리코더마(Trichoderma)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속의 곰팡이를 포함한다. 보다 적합한 곰팡이는 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘안스(A. nidulans), 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 크리소스포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인터메디아(N. intermedia) 및 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종의 곰팡이를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 발효 공정의 산물인 용해된 N-아세틸글루코사민을 포함하는 발효액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 포함하는 고형물을 회수하는 단계를 포함하는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 방법은 발효액으로부터 세포 물질을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 상기 방법은 발효액을 탈색하는 것을 추가로 포함한다. 그러한 탈색 단계는 이에 제한되는 것은 아니지만, 다수의 N-아세틸글루코사민 결정화, 활성 탄소 처리 및 크로마토그래피에 의한 탈색을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 방법은 발효액을 이온 교환 수지와 접촉하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어 발효액을 이온 교환 수지와 접촉하는 단계는 이에 제한되는 것은 아니지만, 발효액을 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지와 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 발효액을 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지와 접촉하는 단계는 음이온 및 양이온 교환 수지의 혼합된 베드와 발효액을 접촉하는 것을 포함할 수 있다.
상기 양태의 한 측면에서, 회수 단계는 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 침전하는 것을 포함한다.
상기 양태의 한 측면에서, 회수 단계는 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 결정화하는 것을 포함한다.
상기 양태의 한 측면에서, 회수 단계를 용해된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 발효액을 농축하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 농축 단계는 대기압 이하의 압력에서 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 막 분리에 의해 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 약 40℃ 내지 약 75℃의 온도에서 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 발효액 중 고형물이 약 적어도 30% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 발효액 중 고형물이 적어도 약 40% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행한다. 다른 측면에서, 농축 단계는 발효액 중 고형물이 적어도 약 45% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 농축 단계 후에 발효액을 냉각하는 것을 추가로 포함한다. 예를 들어, 발효액은 약 -5℃ 내지 약 45℃까지, 또는 다른 측면으로 -5℃ 내지 실온까지, 또는 다른 측면으로 약 실온까지 냉각할 수 있다.
농축 단계의 다른 측면은 냉각 단계 후에 N-아세틸글루코사민 결정으로 발효액을 접종하는 것을 추가로 포함한다. 한 측면에서, N-아세틸글루코사민 접종용 결정은 발효액에서 핵형성에 의해 형성된 N-아세틸글루코사민 결정 및 외부에서 제공된 N-아세틸글루코사민 결정으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 양태의 다양한 측면들 중 한 측면에서, 회수 단계는 N-아세틸글루코사민을 수혼용성 용매와 접촉하는 단계를 포함할 수 있다. 수혼용성 용매는 이에 제한되는 것은 아니지만, 이소프로필 알코올(IPA), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드, 디옥산 및 아세토니트릴을 포함할 수 있다.
상기 양태의 다양한 측면들 중 어느 한 측면에서, 상기 방법은 회수된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 단계는 건조된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 수혼용성 용매로 세정하는 것을 포함할 수 있다.
상기 양태의 다양한 측면들 중 어느 한 측면에서, 상기 방법은 회수된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 용해하여 N-아세틸글루코사민 용액을 형성하고 그 용액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 것을 포함할 수 있다.
상기 양태의 다양한 측면들 중 어느 한 측면에서, 상기 방법은 박테리아의 내독소를 제거하기 위하여 발효액을 여과하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 N-아세틸글루코사민 원료를 수득하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 N-아세틸글루코사민 원료를 처리하여 N-아세틸글루코사민 원료로부터 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 글루코사민 생산물을 제조하는 단계를 포함하는 N-아세틸글루코사민 원료로부터 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 이 원료 중 건조 고형물의 백분율로서 적어도 약 40% N-아세틸글루코사민이다. 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 발효 공정에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민이다. 또 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 발효 공정에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 발효액이며, 상기 발효액은 실질적으로 세포 물질을 제거하기 위하여 처리된 것이다. 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 고형물 또는 용액으로 제공된다. 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 수용성이면서 저비등점의 일차 또는 이차 알코올에 현탁한다.
상기 양태의 한 측면에서, 처리 단계 (b)는 산과 가열 조건에서 N-아세틸글루코사민 원료를 가수분해하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 가수분해 단계는 약 60℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행한다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 약 70℃ 내지 90℃의 온도에서 수행한다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 전체 용액 중 약 10 중량% 내지 약 40 중량% 농도의 염산 용액을 이용하여 수행한다. 다른 측면에서, 염산 용액 대 순수 건조 중량으로 N-아세틸글루코사민 원료의 중량 비율은 약 1:1 내지 5:1이다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 약 10분 내지 약 24시간 동안 수행한다.
한 측면에서, 가수분해 단계는 (a) 가열 조건에서 N-아세틸글루코사민 원료 와 염산용액 또는 순환된 가수분해 모액을 조합하여 글루코사민 염화염을 함유하는 용액을 제조하는 단계; (b) (a)의 용액을 냉각해서 글루코사민 염화염을 침전하는 단계; 및 (c) (b)로부터 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 회수하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 가수분해 단계 (a)는 N-아세틸글루코사민 원료와 염산 용액 또는 순환된 가수분해 모액을 지속적으로 혼합하여 N-아세틸글루코사민 원료를 용해된 용액으로 유지하고, 가열 조건에서 상기 (a)의 용액에 무수 염산을 첨가하여 가수분해를 개시하고 N-아세틸글루코사민을 글루코사민 염화염으로 전환함으로써 수행한다. 다른 측면에서, 가수분해 모액은 단계 (c)에서 침전된 글루코사민 염화염을 회수한 후에 잔류하는 가수분해 용액이며, 여기서 일차 또는 이차 알코올이 가수분해 단계가 수행되기 전, 중 또는 후에 가수분해 용액에 첨가된다. 그러한 일차 또는 이차 알코올은 이에 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 이소프로판올, 에탄올, n-프로판올, n-부탄올 및 sec-부탄올을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 냉각 단계는 용액이 약 -5℃ 내지 40℃에 이를 때까지 수행한다.
다른 측면에서, 회수 단계는 (i) 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 수집하는 단계; (ii) 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 수혼용성 용매로 세정하는 단계; (iii) 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 건조하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 회수 단계는 (i) 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 수집하는 단계; (ii) 상기 (i)의 고형물을 물에 용해하여 용액을 제조하는 단계; (iii) 상기 (ii)의 용액의 pH를 2.5 내지 4로 조정하는 단계; (iv) 상기 (iii)의 용액을 활성 탄소와 접촉하여 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 탈색하는 단계; (v) 상기 (iv)의 용액으로부터 활성 탄소를 제거하는 단계; (vi) 상기 (v)의 용액으로부터 글루코사민 염화염을 결정화하는 단계를 포함한다. 이러한 측면에서, 결정화 단계는 글루코사민 염화염을 70℃ 이하의 온도에서 농축하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 결정화 단계는 글루코사민 염화염을 50℃ 이하의 온도에서 농축하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 결정화 단계는 대기압 이하의 압력에서 글루코사민 염화염을 농축하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 결정화 단계 (vi) 이후에 잔류하는 용액을 추후 회수 공정의 단계 (i)로 재순환하는 것을 추가로 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 재결정화 단계 (vi) 후에 잔류하는 용액을 결정화의 추후 단계로 재순환하는 것을 추가로 포함한다. 이러한 측면에서, 상기 방법은 단계 (vi)로부터 수득한 결정화된 글루코사민 염화염을 이에 제한되는 것은 아니지만 메탄올, 이소프로판올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드 및 디옥산을 포함한 수혼용성 용매로 세정하는 것을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 상기 방법은 결정화된 글루코사민 염화염을 세정한 이후에 약 70℃보다 낮은 온도에서 약 6시간 이하 동안 건조하는 것을 추가로 포함한다. 건조 단계는 대기압 이하의 압력에서 수행할 수 있다. 한 측면에서, 건조 단계는 공기를 일소(air sweep)하면서 수행한다.
이러한 양태의 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 수용성이면서 저비등점의 일차 또는 이차 알코올에 현탁하되, 이 방법은 가수분해 후 또는 재사용을 위하여 가수분해 용액을 재순환하기 이전에 알코올로 인해 형성된 아세트산 에 스테르를 제거하는 (a)와 (b) 단계 사이에 추가적인 단계로 포함한다. 한 측면에서, 아세트산 에스테르는 증류, 플래싱(flashing) 및 대기압 이하의 압력에서 농축하는 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공정에 의해 제거한다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 약 60℃ 내지 약 100℃의 온도에서 수행한다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 1 대기압에서 용액의 끓는점에서 수행한다. 다른 측면에서, 가수분해 단계는 염산 용액 대 건조 중량으로 N-아세틸글루코사민 원료를 3:1 내지 5:1의 중량 비율로 약 80℃이하의 온도에서 수행한다. 한 측면에서, 상기 방법은 단계 (c)에서 회수한 글루코사민 염화염은 앞서 기술된 바와 같이 수혼용성 용매로 세정하는 단계 및/또는 결정화된 글루코사민 염화염을 건조하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 이러한 양태의 또 다른 측면에서, 처리 단계 (b)는 N-아세틸글루코사민 원료와 탈아세틸화 효소를 접촉하여 글루코사민 생산물을 제조하는 것을 포함한다. 그러한 탈아세틸화 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, N-아세틸글루코사민-6-P 데아세틸라제, N-아세틸글루코사민 데아세틸라제 및/또는 N-아세틸글루코사민 모노머를 탈아세틸화하여 글루코사민을 제조할 수 있는 능력을 보유하는 것을 선별하거나 변형된 키틴 데아세틸라제를 포함할 수 있다. 한 측면에서, 글루코사민은 결정화에 의해 회수한다. 한 측면에서, 상기 방법은 침전에 의해 글루코사민 생산물을 회수하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 탈아세틸화 효소를 기판(substrate) 상에 고정화시킨다. 한 측면에서, 접촉 단계는 수용성 염화나트륨 또는 염화칼슘 용액의 존재하에서 N-아세틸글루코사민 원료를 탈아세틸화 효소와 접촉하는 것을 포함한다. 이러한 측면에서, 상기 방법은 결정화 또는 침전에 의해 글루코사민 생산물을 회수하는 것을 추가로 포함한다. 한 측면에서, 접촉 단계는 알코올을 에스테르화하기 위하여 알코올의 존재하에서 N-아세틸글루코사민 원료와 탈아세틸화 효소를 접촉하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 방법은 염(salt)과 글루코사민 생산물을 혼합하고 이 혼합물을 이에 제한되는 것은 아니지만, 클로라이드 염, 포스페이트, 술페이트, 이오다이드 및 비설페이트를 포함하는 이온 교환 매체와 접촉하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 (a) 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환한 미생물을 발효 배지에서 배양하되, 상기 재조합 핵산 서열의 발현은 락토오스 유도에 의해 조절되며, 상기 배양 단계는 (i) 약 pH 4.5 내지 약 pH 7의 pH와 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도에서 탄소원으로 글루코오스를 포함하는 발효 배지에서 미생물을 성장시키는 단계; (ii) 상기 배지에 추가로 글루코오스를 첨가하지 않고 발효 배지에 락토오스를 첨가함으로써 핵산 서열의 전사를 유도하는 단계; (iii) 단계 (ii) 후에 약 pH 4.5 내지 약 pH 6.7의 pH와 약 25℃ 내지 약 37℃의 온도에서 글루코오스의 존재하에서 미생물을 발효하는 단계를 포함하고, (b) 상기 배양 단계로부터 생산된 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함하는 발효에 의해 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 발효 단계 (iii)에 이에 제한되는 것은 아니지만 철을 포함한 미량 원소원을 첨가한다. 한 측면에서, 단계 (ii)는 약 pH 6.9의 pH에서 탄소원으로 글루코오스 를 함유하는 발효 배지에서 미생물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 측면에서, 단계 (iii)은 단계 (ii) 후에 약 pH 4.5 내지 약 pH 5.5의 pH에서 글루코오스의 존재하에서 미생물을 발효하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 단계 (iii)은 단계 (ii) 후에 약 pH 6.7의 pH에서 글루코오스의 존재하에서 미생물을 발효하는 것을 포함한다.
본 발명은 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는 생합성 방법에 관한 것이다. 그러한 방법은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하도록 유전적으로 변형된 미생물의 발효를 포함한다. 본 발명은 또한 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는데 유용한 유전적으로 변형된 미생물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고순도의 N-아세틸글루코사민으로 이어질 수 있는 방법을 포함하여 발효 공정에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민을 회수하는 방법에 관한 것이다. 아울러, N-아세틸글루코사민으로부터 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명 이전에 N-아세틸글루코사민은 글루코사민의 아세틸화에 의해 제조되었으므로 N-아세틸글루코사민으로부터 상업적으로 유용한 글루코사민을 제조하는 방법이 개시되거나 심지어 상업적으로 실행할 수 있는 것으로 여겨지지 않는다. 본 발명은 완전한 천연의 생물 공정을 통한 직접적인 N-아세틸글루코사민의 제조를 처음으로 개시한 것이다.
보다 자세하게 본 발명은 미생물의 발효에 의해 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 다른 화합물로 전환하는 경로; 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 합성하는 경로; 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 미생물 외부로 운반하는 경로; 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 미생물 내부로 운반하는 경로; 및 미생물로부터 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민 및/또는 세포외의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 포함한 생산물을 제조하기 위한 글루코사민-6-포스페이트의 제조에 관여하는 기질에 대하여 경쟁적인 경로를 포함한 아미노당 대사 경로에서의 유전적 변형을 갖는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 제 1 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 미생물로부터 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민을 회수 및/또는 발효 배지로부터 세포외의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 수집 및/또는 회수함에 의해 생산물을 수집하는 제 2 단계를 포함하며, 이는 (하기에서 정의 및 기술되는) 회수 및 정제 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 발효 공정에 의해 회수된 N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 본 발명에 기술된 방법을 이용하여 탈아세틸화되어 글루코 사민, 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트로 제조될 수 있다.
발효에 의해 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 제조하는 본 발명의 신규한 방법은 저렴하고 현재 이용되는 방법에 의해 제조되는 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 수율을 초과하는 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 수율로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에서 기술된 유전적으로 변형된 미생물을 사용함에 의해 본 발명의 방법은 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 제조와 관련된 특별한 문제점과 변화하는 요구에 적용되도록 용이하게 변형될 수 있다. 추가로, 본 발명에서 개시된 공정과 물질들은 당업자에 의해서 폴리-N-아세틸글루코사민, 폴리-글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸만노사민 및 이들의 유도체와 같은 다른 아미노당을 제조하는데 이용 및/또는 변형될 수 있다.
N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 글루코사민 (GlcN)과 같은 아미노당은 미생물에서 근본적으로 중요한 분자이다. 왜냐하면 이들은 주요 고분자 특히 당접합체(즉, 공유결합으로 연결된 올리고사카라이드 사슬을 포함하는 고분자)의 생합성에 중요한 선구물질이기 때문이다. 예를 들어 대장균에서 N-아세틸글루코사민 및 글루코사민은 세포 외피의 두 고분자인 펩티도글리칸 및 리포폴리사카라이드의 선구 물질이다. 펩티도글리칸 또는 리포폴리사카라이드의 생합성을 차단하는 돌연변이는 치명적이이서, 세포 외피의 보전의 상실과 결국에는 세포의 용균(lysis)으로 이어진다.
본 발명에서 용어 글루코사민, D-글루코사민 및 N-글루코사민은 상호 교환적으로 이용될 수 있다. 유사하게 용어 글루코사민-6-포스페이트와 N-글루코사민-6- 포스페이트는 상호 교환적으로 이용될 수 있으며, 용어 글루코사민-1-포스페이트와 N-글루코사민-1-포스페이트도 상호 교환적으로 이용될 수 있다. 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트는 각각 GlcN, GlcN-6-P 및 GlcN-1-P로 약칭될 수 있다. N-아세틸글루코사민은 또한 2-아세트아미도-2-데옥시-D-글루코오스로 명명될 수 있다. N-아세틸글루코사민은 또한 N-아세틸글루코사민으로 표기될 수도 있다. 글루코사민과 이의 유도체와 유사하게, 용어 N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 각각 GlcNAc(또는 D-GlcNAc), GlcNAc-6-P 및 GlcNAc-1-P로 약칭될 수 있다. N-아세틸글루코사민은 또한 NAG로 약칭될 수 있다.
본 발명에서는 전술한 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민 생산물의 생산에 관여하는 아미노당 대사 경로에 관여하는 효소에 대하여 기술한다. 아미노당은 사카라이드의 아미노 유도체(예를 들어, 히드록시기 대신에 아미노기를 갖는 사카라이드)이다. 본 발명에서, 아미노당 대사 경로는 아미노당의 생합성, 동화 또는 이화에 관여하거나 영향을 미치는 임의의 생화학적 경로이다. 본 발명에서, 아미노당 대사 경로는 아미노당 및 이들 선구물질의 세포내 · 외 운반에 관여하는 경로를 포함하며 또한 아미노당의 생합성 또는 이화에 관여하는 기질에 대하여 경쟁적인 생화학적 경로를 포함할 수 있다. 예를 들어 최초로 형성되는 아미노당의 초기 선구물질은 프룩토오스-6-포스페이트(F-6-P)인데, 이는 (글루코사민 신타제에 의해 촉매되는) 생화학적 반응으로 또는 (글루코사민 데아미나제에 의해 촉매되는) 암모늄과의 생화학적 반응으로 글루코사민-6-포스페이트를 형성한다. 프룩토오스-6-포 스페이트는 또한 해당 경로에서의 중간물질이다. 따라서 해당 경로는 기질 프룩토오스-6-포스페이트에 대하여 경쟁함으로써 글루코사민-6-포스페이트 생합성 경로와 경쟁한다. 또한, 글루코사민-6-포스페이트는 다른 아미노당으로 전환되고 연속적인 생화학적 반응에 의해 다양한 고분자의 구성요소를 형성할 수 있다. 이와 같이 프룩토오스-6-포스페이트/글루코사민-6-포스페이트 경로, 글루코사민-6-포스페이트의 생합성에 영향을 미치는 정도까지 해당 경로, 글루코사민-6-포스페이트/고분자 생합성 경로는 모두 본 발명에서 아미노당 대사 경로로 고려될 수 있다.
글루타민 합성 및 대사 경로가 글루타민(글루코사민-6-포스페이트 합성에서 아미노 공여자)의 이용 가능성을 결정하므로 글루코사민-6-포스페이트의 생합성에 영향을 미친다. 따라서 이러한 모든 경로가 본 발명에서 아미노당 대사 경로로 고려될 수 있다. 글루코사민-6-포스페이트로부터 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 합성과 글루코사민-1-포스페이트로부터 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트의 합성은 아세틸-CoA의 공급을 요구하는데, 이는 또한 크레브스 회로(Krebs Cycle)의 기질이다. 따라서 크레브스 회로는 기질 아세틸-CoA에 대하여 N-아세틸글루코사민 합성 경로와 경쟁한다. 이와 같이 아세틸-CoA 합성 및 대사 경로가 N-아세틸글루코사민 생합성에 영향을 미치므로 본 발명에서 이들은 아미노당 대사 경로로 고려될 것이다.
다양한 미생물로부터 다수의 아미노당 대사 경로가 밝혀져 왔다. 특히, 대장균에서의 글루코사민과 N-아세틸글루코사민 및 이들의 인산화된 유도체의 생합성 및 이화 경로가 밝혀져 왔다. 이러한 경로는 탄소원으로 이러한 아미노당을 이용 할 수 있는 복합적 운반 시스템을 포함한다. 대장균에서 아미노당 운반, 이화 및 생합성에 직접적으로 관여하는 효소 및 단백질을 암호화하는 유전자가 클로닝되고 서열 분석되어졌다. 또한, 실질적으로 아미노당 대사의 각 단계마다 차단된 대장균 돌연변이 균주가 분리되어져 왔다.
대장균에서의 공지된 아미노당 대사 경로를 도 1에 나타내었다. 미국특허 US 6,372,457호는 공지된 야생형 또는 돌연변이 미생물의 글루코사민 제조 능력을 훨씬 초과하는 글루코사민 생산 능력을 갖는 글루코사민을 생산하는 미생물을 처음으로 개시하였다. 미국특허 US 6,372,457호에 개시된 재조합 숙주 세포에서는 이화 경로의 몇 단계가 유전자 불활성화에 의해 차단되고(X로 표기), GlcN-6-P의 합성을 촉매하는 GlcN-6-P 신타제가 과잉 발현된다(굵은 선으로 표기). 본 발명은 글루코사민의 제조를 위하여 미국특허 US 6,372,457에 개시되지 않은 유전적 변형의 조합 뿐만 아니라 미생물의 유전적 변형을 포함하여 미국특허 US 6,372,457에 개시되지 않은 글루코사민의 제조를 위한 신규한 발효 공정을 제공한다. 본 발명은 또한 N-아세틸글루코사민의 제조를 위한 미생물의 유전적 변형 및 발효 공정을 처음으로 기술하는 것으로 여겨진다.
이하에서 자세히 설명할 것이지만, 본 발명에 이를 때까지 아미노당 대사 경로에 관여하는 많은 경로와 유전자가 밝혀져 왔지만, 많은 가능한 유전적 변형 중 어떤 변형이 상업적으로 충분한 양의 N-아세틸글루코사민을 제조할 수 있는 미생물을 생성하는데 필수적인지에 대하여 알려진 바가 없었다. 또한, 본 발명에서 기술된 글루코사민의 제조를 위한 신규한 유전적 변형과 이들의 조합은 이전에 고려된 바도 없다. 실제로 본 발명에서 기술된 글루코사민의 제조를 위한 유전적 변형의 일부는 글루코사민 제조를 위한 발효 방법에 대하여 위에서 인용된 선행 문헌 미국특허 US 6,372,457호에 기술된 것과 상반되는 것이다.
대장균 미생물의 아미노당 대사 경로는 본 발명의 특정 실시예로 포함될 것이다. 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 과잉 생산을 위하여 본 발명에 개시된 아미노당 대사 경로에서의 유전적 변형의 주요 측면들을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 굵은 화살표는 본 발명에서 고려된 유전 공학에 의한 대사 유입의 생성 및/또는 증가를 나타낸다. N-아세틸글루코사민의 합성을 위하여 몇몇 상이한 접근법은 이에 제한되는 것은 아니지만 GNA1 및/또는 NagB에 대한 변형을 포함하며, 추가로 GlmS와 GNA1, GlmS와 GlmU, NagB와 GNA1, NagB와 GlmU에 대한 변형의 조합을 단독 또는 다른 유전적 변형과의 추가 조합으로 포함하는 것으로 개시된다. 예를 들어 본 발명은 글루코사민/N-아세틸글루코사민 생산을 최적화하기 위하여 추가 유전자의 과잉 발현 또는 결실을 고려한다. 도 3 및 하기 표에 있어서, 이 도면은 글루코오스 대사와 N-글루코사민 형성에 다양한 효소가 관여함을 나타낸 것이고 하기 표는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산을 최적화하기 위하여 본 발명의 미생물 숙주에 추가로 가할 수 있는 변형을 나타낸 것이다. 이러한 모든 양태는 이하에서 자세히 설명된다. 다른 미생물들이 아미노당 대사 경로 내에서 유사한 구조와 기능을 갖는 단백질 및 유전자 뿐만 아니라 유사한 아미노당 대사 경로를 갖고 있을 것으로 예상될 것이다. 이와 같이 대장균과 관련하여 이하에서 기술되는 원리는 다른 미생물에도 적용할 수 있으며 본 발명에 모두 포함된다.
대상 변형 목표
글루타민 신타제(glnA) 과잉 발현 글루타민 풀(pool)의 증가
포스포글루코이소머라제(pgi) 과잉 발현 프룩토오스-6-P 풀의 증가
락토오스 트랜스포터(lacY) 과잉 발현 락토오스 섭취 효율 증가 및 락토오스 유도에 대한 글루코오스의 억제 감소
글루코오스-6-P 탈수소효소(zwf) 과잉 발현 오탄당 포스페이트 경로에 대한 인산화된 아미노당의 억제 효과 완화
lac 오페론 리프레서(lacI) 결실 락토오스 유도에 대한 글루코오스의 억제를 감소시키기 위한 두 개의lacI 유전자 중 하나의 결실
lac프로모터 대체 락토오스 유도에 대한 글루코오스의 억제를 경감시키기 위하여lac 프로모터를lacUV5로 대체
글리코겐 신테타제(glg 오페론) 결실/삽입 글리코겐 합성의 차단
갈락토오스 오페론(gal) 결실/삽입 갈락토오스 유도에 의한 제조
포스포프룩토키나제 A(pfk A) 결실 세포 에너지 대사 및 아세테이트 형성으로부터 글루코사민/N-아세틸글루코사민의 짝풀림
동일한 생물학적 활성을 갖는 효소가 그 효소가 어떤 유기체에서 유래되었는지에 따라 상이한 이름을 가질 수 있다 것이 알려져 있다. 다음은 본 발명에서 기술된 다수의 효소들의 선택적 이름과 몇몇 유기체로부터 유래된 그 효소들을 암호화하는 유전자의 특정한 이름의 일반적인 리스트이다. 본 발명은 임의의 유기체로부터 유래된 주어진 기능의 효소를 모두 포함하지만, 효소명은 상호 교환적으로 또는 주어진 서열 또는 유기체에 적합하도록 이용될 수 있다.
예를 들어 본 발명에서 "글루코사민-6-포스페이트 신타제"로 일반적으로 언급되는 효소는 프룩토오스-6-포스페이트 및 글루타민으로부터 글루코사민-6-포스페이트 및 글루타메이트의 형성을 촉매한다. 상기 효소는 또한 글루코사민-프룩토오스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(이성질화); 육탄당포스페이트 아미노트랜스퍼라제; D-프룩토오스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼라제; 글루코사민-6-포스페이트 이소머라제(글루타민 형성); L-글루타민-프룩토오스-6-포스페이트 아미도트랜스퍼 라제; 및 GlcN6P 신타제로 알려져 있다. 대장균 및 다른 박테리아로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 일반적으로 GlmS로 기술된다. 효모 및 다른 원료로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 GFA 또는 GFAT로 기술된다.
다양한 유기체로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학적 전략에 이용하는 것을 고려할 수 있다. 본 발명에서는 일예로서 대장균에서 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제가 기술된다. 대장균에서 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 서열번호 1에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 서열번호 15에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 16에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 바실러스 섭틸리스에서 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 기술한다. 또한, 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 그 유기체에서는 글루코사민-프룩토오스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(GFA1)로서 알려진 서열번호 17에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 기술한다. 또한, 칸디다 알비칸스로부터 유래된 그 유기체에서는 글루코사민-프룩토오스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제(GFA1)로서 알려진 서열번호 19에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 20에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 기술한다. 또한, 본 발명은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 증가된 효소 활성; 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 생산물의 감소된 억제; 및 기질에 대한 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 초래하는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 포함한다. 일반적으로 본 발명에 있어서, 돌연변이 또는 변형된 효소의 주어진 특성에서의 증가 또는 감소는 (이하에서 설명되는) 동일하거나 동등한 조건에서 측정되거나 동일한 유기체에서 유래된 야생형 효소(즉, 정상적인, 변형되지 않은)의 동일한 특성을 참조하여 판단된다.
또한, 본 발명에서는 효소 활성에 대한 생산물의 감소된 억제로 이어질 수 있는 유전적 변형을 갖는 몇몇 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 기술한다. 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 그러한 변형은 미국특허 US 6,372,457호에 또한 자세히 개시되어 있지만, 생산물에 의한 감소된 억제를 갖는 적어도 하나 이상의 추가적이고 구별되는 GlmS 돌연변이가 본 발명에서 기술된다(서열번호 14). 대장균에서 유래된 생산물에 의한 감소된 억제를 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 이에 제한되는 것은 아니지만 (각각 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9, 서열번호 11 및 서열번호 13에 의해 암호화된) 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 포함한 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 야생형 서열(서열번호 2)와 비교하여 생산물에 의한 감소된 억제를 갖는 효소로 이어지는 서열번호 14에서의 아미노산 위치를 나타내는 표가 표 7로서 제공된다. 서열번호 4는 서열번호 2에 대하여 4번째 위치에서 Ile로부터 Thr으로, 272번째 위치에서 Ile으로부터 Thr으로, 및 450번째 위치에서 Ser으로부터 Pro으로의 돌연변이를 갖는다. 서열번호 6은 서열번호 2에 대하여 39번째 위치에서 Ala으로부터 Thr으로, 250번째 위치에서 Arg으로부터 Cys 으로 및 472번째 위치에서 Gly으로부터 Ser으로의 돌연변이를 갖는다. 서열번호 8은 서열번호 2에 대하여 469번째 위치에서 Leu으로부터 Pro으로의 돌연변이를 갖는다. 서열번호 10 및 12는 서열번호 2에 대하여 472번째 위치에서 Gly으로부터 Ser으로의 돌연변이를 갖는다. 여기서 나타낸 돌연변이의 어떠한 조합을 포함하여 표 7에 나열된 임의의 하나 이상의 위치에서의 돌연변이를 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제 또는 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 중 어느 하나에 나타낸 추가 돌연변이 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제가 본 발명에 고려된다. 또한, 상동의 변형이 다른 미생물에서 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대해서도 가해질 수 있다. 최종적으로 일부 천연적으로 발생되는 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 다른 미생물로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 신타제 보다 낮은 생산물에 의한 억제를 갖는다. 예를 들어 본 발명자들은 바실러스 섭틸리스로부터 유래된 야생형 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 대장균의 돌연변이 GlmA 효소에 필적할 만큼의 생산물에 대한 저항성을 나타냄을 입증하였다(실시예 부문 참조).
본 발명에서 일반적으로 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제로 기술되는 효소는 글루코사민-6-포스페이트 및 아세틸-CoA를 CoA를 방출하면서 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로 전환한다. 상기 효소는 또한 글루코사민-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제, 포스포글루코사민 트랜스아세틸라제 및 포스포글루코사민 아세틸라제로 알려져 있다. 효모의 효소는 일반적으로 GNA1으로 기술된다. 다양한 유기체에서 유래된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 당업계에 알 려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용하는 것을 고려할 수 있다. 예를 들어 사카로마이세스 세리비시아에로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 본 발명에서 기술된다. 사카로마이세스 세레비시애로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 29에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 30에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 서열번호 31에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 32에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 칸디다 알비칸스로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 기술한다. 또한, 서열번호 33에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 아라비도프시스 탈리아나로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 기술한다. 또한, 본 발명은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼제의 증가된 효소 활성: 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산물에 의한 감소된 억제; 및 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 초래하는 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제로 언급되는 효소는 글루코사민-6-포스페이트와 물로부터 프룩토오스-6-포스페이트와 암모늄을 형성하는 가역 반응을 촉매한다. 상기 효소는 또한 글루코사민-6-포스페이트 이소머라제; GlcN6P 데아미나제; 포스포글루코사민이소머라제; 포스포글루코사민 이소머 라제; 글루코사민 포스페이트 데아미나제; 2-아미노-2-데옥시-D-글루코오스-6-포스페이트 케톨 이소머라제(탈아민화)로서 알려져 있다. 대장균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 일반적으로 NagB로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어, 대장균으로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 서열번호 41에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 42에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 효소 활성, 증가된(더 많은) 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 역반응, 감소된(더 적은) 프룩토오스-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감소된 정반응, 프룩토오스-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6포스페이트 데아미나제의 증가된 친화력, 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감소된 친화력 및 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제에 대한 글루코사민-6-포스페이트 생산물에 의한 감소된 억제로부터 선택된 결과를 초래하는 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제로 언급되는 효소는 글루코사민-1-포스페이트와 아세틸-CoA를 CoA를 방출하면서 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 전환한다. 대장균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 GlmU로 알려져 있다. 박테리아의 GlmU 효소는 이기능성 효소(즉, 이 효소는 두 가지 효소 기능을 갖고 있다 - 이 효소는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 기능을 또한 갖고 있어서 이 효소는 UDP-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제, UDP-N-아세틸글루코사민 디포스포릴라제로 또한 알려져 있다)이다. 다양한 유기체로부터 유래된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어, 실질적으로 이기능성 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제인 대장균에서 유래된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 서열번호 55에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 56에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 대장균 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 절단된 돌연변이가 기술되는데, 여기서 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성만을 갖는 효소를 효과적으로 남기면서 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 암호화하는 부분은 결실시킨다. 이러한 절단된 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 서열번호 57에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 58에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성;(효소가 이기능성의 효소라면) N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 효소 활성; 글루코사민 -1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력; (효소가 이기능성의 효소라면) N-아세틸글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 친화력; 및 글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 생산물의 감소된 억제로부터 선택된 결과를 초래하는 유전적 변형을 갖는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제로 언급되는 효소는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 글루코사민-6-포스페이트와 아세테이트로 가수분해한다. 대장균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 일반적으로 NagA로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 대장균으로부터 유래된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제는 서열번호 85에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 84에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명은 글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 증가된 효소 활성; 증가된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 증가된 역반응; 감소된 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 감소된 정반응; 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스 페이트 데아세틸라제의 증가된 친화력; N-아세틸글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 감소된 친화력; 글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제에 대한 글루코사민-6-포스페이트 생산물의 감소된 억제로부터 선택된 결과를 초래하는 유전적 변형을 갖는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제를 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 포스포글루코사민 뮤타제로 언급되는 효소는 글루코사민-6-포스페이트와 글루코사민-1-포스페이트 간의 전환을 촉매한다. 대장균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 일반적으로 GlmM으로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 포스포글루코사민 뮤타제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 대장균으로부터 유래된 포스포글루코사민 뮤타제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 포스포글루코사민 뮤타제는 서열번호 53에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 54에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다. 또한, 본 발명은 포스포글루코사민 뮤타제의 증가된 활성; 증가된 글루코사민-1-포스페이트를 형성하는 포스포글루코사민 뮤타제의 증가된 정반응; 감소된 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 포스포글루코사민 뮤타제의 감소된 역반응; 글루코사민-6-포스페이트에 대한 포스포글루코사민 뮤타제의 증가된 친화력; 글루코사민-1-포스페이트에 대한 포스포글루코사민 뮤타제의 감소된 친화력; 포스포글루코사민 뮤타제에 대한 글루코사민-1-포스페이트 생산물의 감소된 억제로부터 선택된 결과를 초래하는 유전적 변형을 갖는 포스포글루코사민 뮤타제를 포함한다.
본 발명에서 일반적으로 포스포글루코이소머라제로 언급되는 효소는 글루코소오스-6-포스페이트의 프룩토오스-6-포스페이트로 상호전환을 촉매한다. 대장균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 일반적으로 포스포글루코이소머라제 또는 Pgi으로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 포스포글루코이소머라제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 대장균으로부터 유래된 포스포글루코이소머라제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 포스포글루코이소머라제는 서열번호 104에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 105에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에서 일반적으로 포스포프룩토키나제로 언급되는 효소는 프룩토오스-6-포스페이트(F-6-P)로부터 프룩토오스1,6,-비포스페이트의 형성을 촉매한다. 대장균에서 pfkA에 의해 암호화된 다수의 포스포프룩토키나제가 포스포프룩토키나제 활성의 90%를 제공한다. 남은 10%의 활성은 pfkB에 의해 암호화된 소수의 포스포프룩토키나제에 의해 제공된다. 대장균 및 다른 박테리아에서 포스포프룩토키나제 효소는 일반적으로 포스포프룩토키나제 또는 PfkA로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 포스포프룩토키나제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 본 발명에서는 대장균에서 유래된 PfkA가 기술된다.
본 발명에서 일반적으로 글루타민 신테타제로 언급되는 효소는 NH3 및 ATP를 필요로 하는 반응으로 L-글루타메이트의 L-글루타민으로의 전환을 촉매한다. 대장 균 및 다른 박테리아에서 상기 효소는 일반적으로 글루타민 신테타제 또는 GlnA로 알려져 있다. 다양한 유기체로부터 유래된 글루타민 신테타제가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 대장균으로부터 유래된 글루타민 신테타제가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 글루타민 신테타제는 서열번호 88에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 89에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명에서 일반적으로 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 언급되는 효소는 글루코오스-6-포스페이트를 글루코노-1,5-락톤으로 전환하는 오탄당 포스페이트 경로의 첫 번째 단계를 촉매한다. 상기 효소는 대장균 및 다른 박테리아에서 zwf에 의해 암호화된 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소로 알려져 있다. 다양한 미생물에서 유래된 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소가 당업계에 알려져 있으며 본 발명에 따른 유전 공학 전략에 이용할 것을 고려한다. 예를 들어 대장균으로부터 유래된 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소가 본 발명에서 기술된다. 대장균으로부터 유래된 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소는 서열번호 94에 나타낸 핵산 서열에 의해 암호화된 서열번호 95에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
다양한 효소가 미생물에서 글리코겐 합성에 관여한다. 그러한 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, ADP-글루코오스 피로포스포릴라제, 글리코겐 신타제 및 분지화 효소를 포함한다.
본 발명에서 언급되는 다른 유전자는 이에 제한되는 것은 아니지만, N-아세 틸글루코사민 트랜스포터 (IINag), 만노스 트랜스포터 (EIIM,P/IIIman), 글루코오스 트랜스포터 (IIGlc) 및/또는 포스파타제를 포함한다. 대장균에 이러한 유전자는 각각 nagC, nagD, nagE(N-아세틸글루코사민 트랜스포터(IINag)); manXYZ(만노스 트랜스포터(EIIM,P/IIIman)); ptsG(글루코오스 트랜스포터(IIGlc)) 또는 포스파타제 유전자에 상응한다. nagC 유전자는 glmU 오페론의 활성인자와 리프레서 둘 모두 뿐만 아니라 nag 레귤론의 리프레서로서 작용한다. nagD 유전자의 기능은 알려지지 않았으나 nag 레귤론 내에 위치함에 따라 아미노당 대사에 관여할 것으로 여겨진다. 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 분해에 관여하는 nag 유전자들(nagA, nagB, nagC, nagD, nagE)은 대장균의 염색체상 15 min에 위치하는 레귤론(즉, nag 레귤론)으로서 존재한다. 만노스 트랜스포터(EIIM,P/IIIman)(manXYZ)는 세포내로 글루코사민의 운반에 관여한다. 글루코오스 트랜스포터(IIGlc)(ptsG)는 세포내로 글루코오스를 운반하지만 글루코사민의 이차 트랜스포터로서 작용할 수 있다. 포스파타제는 당 포스페이트 및 단백질의 탈인산화를 촉매하는 것으로 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 한 양태는 발효에 의해 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 미생물에서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 증가시키는데 유용한 것으로 본 발명에서 개시된 적 어도 하나 이상의 특정한 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양 단계로부터 제조된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집되는 단계를 포함한다. 더욱 자세하게 상기 생산물은 미생물로부터 수집하는 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민 및/또는 발효 배지로부터 수집되는 세포외의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 포함한다. 한 측면에서, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 가수분해 생산물(글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트)이 안정한 산/가열 조건에서 가수분해한다. 다른 측면에서, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 탈아세틸화 효소를 사용하여 탈아세틸화한다. 회수 및 정제 방법은 이하에서 자세히 설명한다.
일반적으로 본 발명의 제조방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 (a) 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 다른 화합물로 전환하는 감소된 능력(즉, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트의 이화 또는 동화 경로의 억제), (b) 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사 민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 제조하는(즉, 합성하는) 개선된 능력, (c) 세포내로 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 운반하는 감소된 능력, (d) 세포외로 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 운반하는 개선된 능력, 및/또는 (e) 경쟁적 생화학 반응에서 글루코사민-6-P의 제조에 관여하는 기질들을 사용하는 감소된 능력; 및/또는 (f) (N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 등의 제조에 관여하는) 경쟁적 생화학 반응에서 아세틸-CoA를 사용하는 감소된 능력으로 이어지는 적어도 하나 이상의 아미노당 대사 경로에 관여하는 적어도 하나 이상의 유전적으로 변형된 유전자를 갖는다.
일반적으로 유전적으로 변형된 아미노당 대사 경로를 갖는 미생물은 동일한 조건에서 배양된 야생형 미생물과 비교했을 때 상기된 바와 같은 적어도 하나 이상의 아미노당 대사 경로에서의 변화로 이어질 수 있는 이하에서 설명되는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 아미노당 대사 경로에서의 그러한 변형은 아미노당을 제조하는 미생물의 능력을 변화시킨다. 본 발명에 있어서, 이하에서 자세히 설명되는 유전적으로 변형된 미생물은 바람직하게는 동일하거나 동등한 조건에서 배양된 동일 종(바람직하게는 동일한 균주)의 야생형 미생물과 비교했을 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 개선된 능력을 갖는 미생물을 갖는다. 동등한 조건은 유사하지만 반드시 동일하지 않지만(예, 배지 조성, 온도, pH 및 다른 조건들에서의 약간의 변화는 허용될 수 있다), 미생물 성장 또는 미생물에 의한 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민의 생산에 실질적으로 변화를 일으키지 않는 배양 조건을 의미한다.
글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조에 영향을 미치는 아미노당 대사 경로는 일반적으로 다음 종류의 경로 중 적어도 어느 하나 이상으로 분류될 수 있다:(a) 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 다른 화합물로 전환하는 경로, (b) 글루코사민-6-포스페이트를 합성하는 경로, (c) 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 세포내로 운반하는 경로, (d) 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민을 세포외로 운반하는 경로 및 (e) 글루코사민-6-포스페이트의 제조에 관여하는 기질에 대하여 경쟁적인 경로.
유전적 변형에 의해 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 개선된 능력을 갖는 미생물의 개발은 전통적 균주 개발과 분자 유전학 기술 모두를 사용함으로써 달성될 수 있다. 일반적으로 개선된 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산을 갖는 미생물을 생성하는 전략은 (1) 글루코사민-6-포스페이트의 생산에 부정적인 영향을 미치는(예, 억제하는) 아미노당 대사 경로의 적어도 하나, 바람직하게는 하나 이상을 불활성화거나 결실하는 것, 및 (2) 글루코사민-6-포스페이트 생산이 개선되도록 아미노당 대사 경로 중 적어도 하나, 바람직하게는 하나 이상을 증폭시키는 것이다.
본 발명의 한 양태에서, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이 트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 합성하는 미생물 능력의 개선은 글루코사민-6-포스페이트 신타제 유전자(glmS)의 발현의 증폭(예, 과잉 발현) 및/또는 대장균의 경우 nagB 유전자이고 이의 생산물이 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제인 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 유전자의 발현을 증폭함으로써 달성될 수 있다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 글루코사민-6-포스페이트를 탈아민화하여 프룩토오스-6-포스페이트 및 암모늄을 형성하는 정반응을 촉매한다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 또한 프룩토오스-6-포스페이트 및 암모늄으로부터 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 역반응을 촉매한다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 역반응은 신타제 반응에서는 프룩토오스-6-포스페이트 및 글루타민으로부터 글루코사민-6-포스페이트 및 글루탐산을 형성한다는 점에서 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 작용과는 상이하다. 글루타민의 충분한 세포내 공급은 글루코사민-6-포스페이트 신타제 반응에 중요하다. 글루코사민-6-포스페이트의 합성 및 분해 경로는 잠재적 무용 경로를 나타내며 이로 인한 프룩토오스-6-포스페이트와 글루코사민-6-포스페이트의 연속적 상호전환은 글루타민의 소모적 고갈을 초래한다. 따라서 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 역 작용의 이용은 데아미나제가 아미노 공여자로서 아미노산(글루타민) 보다는 암모늄을 이용하기 때문에 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 이로운 영향을 미친다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 글루코사민-6-포스페이트의 프룩토오스-6-포스페이트 및 암모늄으로의 분해를 선호하는 키네틱(kinetic) 평형으로 가역 반응을 촉매한다. 따라서 본 발명의 다른 양태로서, 증가된 역반응 활성과 감소된 정반응 활성을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 돌연변이된 형태 또는 과잉 발현된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산에 유용하다. 본 발명의 다른 양태로 증가된 Vmax, 증가된 비 활성, 증가된 안정성, 프룩토오스-6-포스페이트 및 암모늄 기질에 대한 증가된 친화력 및 글루코사민-6-포스페이트 생산물에 의한 감소된 억제를 갖는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 갖는 미생물을 제공한다. 그러한 증진을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 자연으로부터 분리하거나 유전적 변형 또는 단백질 공학의 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터를 기반으로 하는 단백질 공학이 이러한 목적에 맞게 이용될 수 있다. 예시로 Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc., 등이 있으며 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 발현의 증폭은 예를 들어 대장균에 nagB 유전자를 암호화하는 재조합 핵산 분자의 도입함에 의해 달성될 수 있다. 그러한 숙주 균주에서 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 글루코사민-6-포스페이트의 합성을 촉진할 수 있기 때문에 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 발현의 증폭은 불활성화된 glmS 유전자를 갖는 대장균 균주 돌연변이체에서 분석되어야 한다. 이러한 유기체에서 글루코사민-6-포스페이트 신타제 활성의 제거는 필수적이지 않으며, 본 발명의 한 양태이다.
본 발명에서 기술된 다른 효소 및 다른 단백질에 대한 예로서 변형된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제는 예를 들어 돌연변이된(즉, 유전적으로 변형된) 글 루코사민-6-포스페이트 데아미나제 유전자일 수 있으며 유전적 변형을 위한 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 재조합 핵산 분자는 착오하기 쉬운 PCR과 같은 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 및/또는 치환을 위한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방법에서 유전자는 증폭에 이용되는 DNA 폴리머라제에 의해 고빈도의 부적합(misincorporation) 착오가 일어날 수 있는 조건에서 증폭된다. 결과적으로 이 PCR 산물에서 고빈도의 돌연변이가 수득된다. 이렇게 형성된 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 유전자 돌연변이체는 테스트용 미생물에 증가된 글루코사민 생산능을 부여하는지 여부에 대하여 돌연변이되지 않은 재조합 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 핵산 분자를 포함하는 미생물과 비교하여 상기 돌연변이 유전자를 테스트함으로써 스크리닝될 수 있다. 따라서 본 발명의 한 양태는 돌연변이 또는 상동성 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전적으로 변형된 재조합 핵산 분자로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다. 그러한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 단백질은 본 발명에서 (이하에서 자세히 설명하는) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 상동체로서 언급될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, glmS 또는 nagB의 과잉 발현은 글루코사민-6-포스페이트의 세포내 축적 및 궁극적으로는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산에 중요하다. 왜냐하면 세포내에서 글루코사민-6-포스페이트 신타제/또는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 양은 해당과정으로부터 글루코사민-6-포스페이 트 합성으로 탄소의 유입의 선회를 조절하기 때문이다.
N-아세틸글루코사민 제조를 위해서는 글루코사민-6-포스페이트가 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 전환되어야 하고, 그 다음 탈인산화 및/또는 배양액으로 분비된다. 본 발명의 한 양태에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민을 합성하는 미생물 능력의 개선은 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애의 경우에는 GNA1 유전자이고 이의 산물이 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제인 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 유전자의 발현을 증폭함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민을 합성하는 미생물의 능력의 개선은 대장균의 경우 nagA 유전자이고 이의 산물이 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제인 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제 유전자의 발현의 증폭에 의해 달성된다. 데아세틸라제는 정반응으로 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 글루코사민-6-포스페이트로의 전환을 촉매한다. 또한, 글루코사민-6-포스페이트를 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트로 전환하는 역반응을 촉매한다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 글루코사민-6-포스페이트로의 탈아세틸화를 선호하는 키네틱 평형으로 가역 반응을 촉매한다. 따라서 본 발명의 다른 양태로서 증가된 역반응 활성 및 감소된 정반응 활성을 갖는 돌연변이된 형태의 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조에 유용하다.
글루코사민-6-포스페이트 신타제(GlmS)는 생산물 글루코사민-6-포스페이트에 의해 강하게 억제되기 때문에 글루코사민-6-포스페이트 아세틸라제 유전자(GNA1) 및/또는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제 유전자(nagA) 발현의 증폭은 세포내의 글루코사민-6-포스페이트의 양을 감소시키고, GlmS 효소에 대한 생산물의 억제를 감소시켜서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 합성하는 미생물의 능력의 개선은 대장균에서 glmA 유전자이고 이의 산물이 포스포글루코사민 뮤타제인 포스포글루코사민 뮤타제 유전자의 발현의 증폭에 의해 달성된다. 포스포글루코사민 뮤타제는 글루코사민-6-포스페이트의 글루코사민-1-포스페이트로의 전환을 촉매한다. 글루코사민-6-포스페이트 신타제는(GlmS)는 생산물 글루코사민-6-포스페이트에 의해 강하게 억제되기 때문에 포스포글루코사민 뮤타제 유전자 발현의 증폭은 세포내의 글루코사민-6-포스페이트의 양을 감소키시고 GlmS 효소에 대한 생산물의 억제를 감소시켜서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 합성하는 미생물의 능력의 개선은 대장균에서 glmU 유전자이고 이의 산물이 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제인 이기능성의 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 유전자의 발현의 증폭에 의해 달성될 수 있다. 본 발명은 또한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 단백질의 발현의 증폭 또는 증가된 활성을 포함한다. 상기 이기능성의 효소는 (글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제로서) 글루코사민-1-포스페이트의 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로의 전환을 촉매하고, 그 생산물을 추가로 (N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제로서) UDP-N-아세틸글루코사민으로 전환한다. 따라서 본 발명의 한 양태로서, 아세틸트랜스퍼라제 작용의 증가된 활성과 우리딜트랜스퍼라제 작용의 감소된 활성을 갖는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 돌연변이된 형태가 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하기 위해 이용된다. 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제는 글루코사민-6-포스페이트가 연속적 생화학 반응을 거쳐서 고분자에 통합되는 아미노당 대사 경로 내에서 작용하기 때문에 glmU 유전자는 대장균 성장에 필수적인 유전자이다. 아세틸트랜스퍼라제 작용의 증가된 활성과 우리딜트랜스퍼라제 작용의 감소된 활성을 갖는 GlmU 효소 돌연변이된 형태는 글루코사민으로부터 유래된 고분자가 합성되어 세포 성장을 지지할 수 있도록 야생형 GlmU 유전자를 갖는 숙주 균주에서 이용되어야 할 것이다.
글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 합성은 도 3에 나타낸 바와 같이 많은 다른 글루코오스 대사 경로와 밀접하게 연관되어 있다. 글루코오스가 세포에 의해 섭취되면 바로 글루코오스-6-P로 전환된다. 글루코오스는 도면에 나타낸 경로를 포함하여 다수의 경로에 의해 대사된다. 글루코사민 합성 경로에서 글루코오스-6-P는 프룩토오스-6-P로 이성질화되고 이어서 GlmS에 의해 프룩토오스-6-포스페 이트로부터 글루코오스-6-포스페이트로 전환된다. 최종적으로 글루코사민-6-포스페이트는 탈인산화되어 분비된다. 글루코오스-6-포스페이트에 대한 주요 경쟁적 선택 루트는 포스포프룩토키나제를 통한 해당과정으로의 유입이다. 글루코오스-6-포스페이트에 대한 다른 중요한 선택 루트는 글루코노락톤-6-포스페이트로의 산화(오탄당 포스페이트 경로로의 유입)이다. 추가로, 글루코오스-6-포스페이트는 글루코오스-1-포스페이트로 전환될 수 있고 이로부터 글리코겐이 형성어고 세포에 저장된다. 이하에서 자세히 설명되는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산을 최대화하기 위해서 다른 경쟁 경로를 조정하는 것이 본 발명의 범주에 속한다.
박테리아 세포는 주요 탄소 저장 형태로서 글리코겐을 축적한다. 글리코겐 합성에는 (또한 글루코오스-1-포스페이트 아데닐트랜스퍼라제로 알려진) ADP-글루코오스 피로포스포릴라제 , 글리코겐 신타제 및 분지화 효소를 포함한 세 가지 효소가 관여한다. 이러한 효소는 각각 글루코오스-1-포스페이트로부터 모노사카라이드 공여자(ADP-글루코오스)의 합성, 이러한 모노사카라이드 단위체가 글루코오스의 (1,4) 폴리머를 형성하도록 중합 및 상기 사슬에 (1-6)분지가 형성되도록 상기 폴리머의 재배열을 촉매한다. ADP-글루코오스 피로포스포릴라제는 글리코겐 합성에서 중추적인 효소이며 다른자리입체성 효과인자에 의해 강하게 조정된다. 예를 들어, 3-포스포글리세레이트는 효소 활성을 촉진하는 반면에 오르소포스페이트는 활성을 감소시킨다. 이러한 효과인자들이 싱체내에서(in vivo) 글리코겐 합성을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 세포내의 글리코겐 양은 성장 조건에 따라 건조 중량으로 약 10 내지 60%에 달한다. 일반적으로 글리코겐은 탄소 및 에너지 공급이 충분하고 질소가 제한적 영양소일 때 축적된다. 성장 배지에서 포스페이트의 결핍은 세포내 글리코겐 양을 더욱 증가시킨다. 박테리아에서 ADP-글루코오스의 유일한 기능은 글리코겐 합성의 선구물질로서 작용한다는 것이다. 글리코겐 합성이 차단된 대장균 돌연변이체의 세포 성장은 해로운 영향을 받지 않는다. 글리코겐 합성을 차단하는 것은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조에 더 많은 탄소원이 이용되게 할 것이다.
글루코사민/N-아세틸글루코사민의 제조를 최대화하기 위하여 (pgi 유전자에 의해 암호화된) 포스포글루코이소머라제가 조종될 수 있다. pgi 유전자의 과잉 발현은 글루코오스-6-P가 글루코사민-6-P 합성의 직접적인 기질인 프룩토오스-6-P로 전환하는 것을 증가시킬 수 있다.
글루코오스는 세포 성장 및 글루코사민 합성을 지지하기 위해 필요한다. 포스포프룩토키나제(PfkA 및 PfkB, 전자가 주요 동위효소임)는 프룩토오스-6-P의 프룩토오스-1,6-비포스페이트로의 전환을 촉매한다. 이 반응은 글루코사민-6-포스페이트 합성과 경쟁적으로 작용한다. 탄소 유입을 조절함에 있어서 더 많은 글루코오스-6-P가 글루코사민 경로로 진입하도록 PfkA 및/또는 PfkB의 발현을 조정하는 것이 바람직하다. 글루코사민 합성을 최대화하기 위하여 글루코오스 공급은 특별히 제한적이지 않지만 과량의 글루코오스는 일반적으로 아세테이트의 형성으로 이어진다. 아세테이트의 축적은 세포 성장을 억제하고 일반적 세포 대사에 하강 신호로 보내기 때문에 이러한 상황은 피해야 한다. 탄소 공급을 조절하는 한 방식은 세포 성장 및 아세테이트 형성으로의 탄소 유입과 글루코사민 합성으로의 탄소 유 입을 짝풀림하는 것이다. 이는 pfkA 유전자를 결실하고 성장을 위하여 세포에 프룩토오스를 공급함으로써 달성될 수 있다. pfkA 녹아웃된 돌연변이에서 프룩토오스-6-포스페이트의 해당과정으로의 유입은 효과적으로 제한될 수 있다. 따라서 실질적으로 모든 글루코오스가 글루코사민 합성에 이용되는 동시에 세포 성장 및 에너지 생산은 프룩토오스를 투입함으로써 공급된 것이며, 프룩토오스는 세포내로 운반되어져 프룩토오스-1-포스페이트로 인산화된다. 후자는 프룩토오스-1, 6-디포스페이트로 추가로 인산화될 것이다.
인산화된 아미노당은 오탄당 포스페이트 경로의 효소들을 억제하는 것으로 알려져 있다. 실제로 N-아세틸글루코사민은 글루코네이트 및 리보오스와 같은 경로의 중간 물질을 투입함으로써 완화될 수 있는 세포 성장 억제를 유발하였다. 글루코네이트 및 오탄당 화합물의 보충은 또한 N-아세틸글루코사민의 제조를 증가시키는 것으로 또한 밝혀져 있다. 아미노당에 의한 억제를 극복하기 위해서 (zwf 유전자에 의해 암호화된)글루코오스-6-P 탈수소효소와 같은 오탄당 포스페이트 경로의 효소를 과잉 발현할 수 있다.
글루코사민/N-아세틸글루코사민 합성은 아미노 공여자인 글루타민을 소비한다. 글루타민의 합성에는 glnA 유전자에 의해 암호화된 글루타민 신테타제가 관여한다. glnA 유전자의 과잉 발현은 글루타민 풀을 증가시켜서 글루코사민/N-아세틸글루코사민을 증가시킬 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 바람직한 변형의 일부를 갖는 미생물은 한 양태에서 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 적어 도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산물의 감소된 억제; 및/또는 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 제공한다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
다른 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 증가된 효소 활성; 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 생산물의 감소된 억제; 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 기질에 대한 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 초래한다. 한 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 효소 활성을 증가시키거나, 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 생산물의 억제를 감소시키거나 전술한 결과 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
다른 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화이다.
또 다른 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 과잉 발현, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 효소 활성, 증가된(더 많은) 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 역반응, 감소된(더 적은)프룩토오스-6-포스페이트를 형성하는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감소된 역반응, 프룩토오스-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 증가된 친화력, 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 감 소된 친화력, 및 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제에 대한 글루코사민-6-포스페이트 생산물의 감소된 억제로부터 선택된 결과를 초래한다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
다른 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 한 측면에서, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화이다.
또 다른 양태에서, 미생물은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는 상기 유전적 변형은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; N-아세틸 글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소의 과잉 발현: 글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력; N-아세틸글루코사민-1-포스페이트에 대한 글루코사민 -1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸 글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 감소된 친화력; 및/또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제에 대한 N-아세틸 글루코사민-1-포스페이트 생산물의 감소된 억제로부터 선택된 결과를 제공한다. 한 측면에서, 미생물은 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 포함하는 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
다른 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 증가된 활성; N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 과잉 발현; N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 증가된 역반응; 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 감소되거나 바람직하게는 결실된 정반응으로부터 선택된 결과를 초래한다. 한 측면에서, 미생물은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸 라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
다른 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 포스포글루코사민 뮤타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 포함한다. 바람직하게는 포스포글루코사민 뮤타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 포스포글루코사민 뮤타제의 증가된 활성; 포스포글루코사민 뮤타제의 과잉 발현; 글루코사민-1-포스페이트를 형성하는 포스포글루코사민 뮤타제의 증가된 작용 및/또는 글루코사민-6-포스페이트를 형성하는 포스포글루코사민 뮤타제의 감소되거나 보다 바람직하게는 결실된 작용으로부터 선택된 결과를 초래한다. 한 측면에서, 미생물은 포스포글루코사민 뮤타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 서열은 포스포글루코사민 뮤타제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 포스포글루코사민 뮤타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 포스포글루코사민 뮤타제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 미생물의 포스포글루코이소머라제 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 추가 적 유전적 변형을 가질 수 있다. 바람직하게는 유전적으로 변형된 미생물은 포스포글루코이소머라제의 증가된 활성, 포스포글루코이소머라제의 과잉 발현, 포스포글루코이소머라제의 기질에 대한 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 초래하는 포스포글루코이소머라제를 증가시키기 위한 적어도 어느 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 포스포글루코이소머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 포스포글루코이소머라제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 어느 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 포스포글루코이소머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 포스포글루코이소머라제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 미생물의 포스포프룩토키나제의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 한 측면에서, 포스포프룩토키나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 포스포프룩토키나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화이다. 포스포프룩토키나제의 기능과 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 미생물의 글루타민 신테타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 바람직하게는 유전적으로 변형된 미생물은 글루타민 신테타제의 증가된 활성, 글루타민 신테타제의 과잉 발현, 기질에 대한 글루타민 신테타제의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과를 초래하는 글루타민 신테타제를 증가시키기 위한 적어도 어느 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 글루타민 신테타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루타민 신테타제의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루타민 신테타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 글루타민 신테타제의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 미생물의 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 바람직하게는 유전적으로 변형된 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 증가된 활성, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 과잉 발현, 기질에 대한 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 증가된 친화력으로부터 선택된 결과는 초래하는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 증가시키기 위한 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 한 측면에서, 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 그러한 핵산 분자는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 효소 활성을 증가시키거나 전술한 결과들 중 어느 하나를 초래하는 적어도 어느 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있 다. 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 기능 및 대표적인 서열은 앞서 기술되어져 왔다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 미생물의 글리코겐 합성에 관여하는 하나 이상의 효소의 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 글리코겐 합성에 관여하는 효소는 이에 제한되는 것은 아니지만, ADP-글루코오스 피로포스포릴라제, 글리코겐 신타제 및 분지화 효소를 포함한다. 한 측면에서, 글리코겐 합성에 관여하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글리코겐 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 하나 이상의 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화이다.
본 발명에서 기술된 양태들 중 어느 한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 포스파타제의 활성을 증가시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 앞서 기술된 유전적으로 변형된 미생물의 초기 세포내 생산물은 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민이다. 대장균을 포함한 많은 미생물에서 충분한 세포내 암모늄의 공급은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 반응에 중요하다. 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 세포외로 운반되기 이전에 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민으로 탈인산화된다. 따라서 본 발명의 또 다른 양태는 글루코사민-6-포스페이트, 글루 코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트의 탈인산화에 적합한 포스파타제 활성을 갖도록 유전적으로 변형된 미생물을 제공하는 것이다. 그러한 포스파타제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 알칼라인 포스파타제, 산 포스파타제, 포스포-당 포스파타제, 포스포-아미노당 포스파타제를 포함한다. 바람직한 양태에서 그러한 대장균은 개선된(증가된) 포스파타제 활성(즉, 포스파타제 작용)을 갖는다.
상기된 양태들 중 어느 한 양태에서, 미생물은 N-아세틸글루코사민 데아세틸라제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸글루코사민 트랜스포터(IINag), 글루코사민 신타제, 포스포글루코사민 뮤타제, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 만노스 트랜스포터(EIIM,P/IIIman), 포스포프룩토키나제, 글루코오스 트랜스포터(IIGlc), 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및/또는 포스파타제의 그룹으로부터 선택된 효소의 활성을 증가시키거나 감소시키는 적어도 하나 이상의 추가적 유전적 변형을 가질 수 있다. 대장균에서 상기 유전자는 각각 NagA, nagB, nagC, nagD, nagE, glmS, glmM, glmU, manXYZ, pfkA, pfkB, ptsG, GNA1 또는 포스파타제 유전자에 상응한다.
다양한 전술한 유전적 변형은 미생물에 의한 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 향상시킬 목적에 따라 하나 이상의 변형을 갖는 미생물을 생산하기 위하여 조합될 수 있다. 예를 들어 한 양태에서 그러한 미생물은 하기 유전 적 변형을 갖는다: (1) 글루코사민-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형; 및 (2) 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형. 보다 바람직한 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 또한 갖는다.
다른 양태에서, 미생물은 하기 유전적 변형을 갖는다: (1) 글루코사민-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형; 및 (2) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형. 보다 바람직한 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 또한 갖는다.
다른 양태에서, 미생물은 하기 유전적 변형을 갖는다: (1) 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 증가시키는 유전적 변형; 및 (2) 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 활성을 증가, 바람직하게는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 증가 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 유전적 변형. 보다 바람직한 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 또한 갖는다.
다른 양태에서, 미생물은 하기 유전적 변형을 갖는다: (1) 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형; 및 (2) 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 활성을 증가, 바람직하게는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제 활성을 증가 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제 활성을 감소시키는 유전적 변형. 보다 바람직한 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 또한 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명의 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 내인성 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(예를 들어, 효모는 내인성 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 갖는다) 및 또한 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키기 위한 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 바람직한 양태에서 미생물은 또한 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 갖는다.
다른 양태에서, 본 발명의 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 글루코사민-6-포스페이트 신타제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, 포스포글루코사민 뮤타제 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 암호화하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된다. 재조합 핵산 분자는 효소 작용에 영향을 미치는 유전적 변형을 가질 수 있다. 재조합 핵산 분자의 발현은 이 재조합 핵산 분자가 배제된 상태에서 단백질의 발현양 또는 생물학적 활성과 비교했을 때 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 신타제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, 포스포글루코사민 뮤타제 또는 글루코 사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제의 발현 및/또는 생물학적 활성을 증가시킨다. 바람직한 양태에서, 재조합 핵산 분자는 미생물의 게놈내로 통합된다. 추가의 양태에서, 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, N-아세틸-글루코사민-특이적인 효소 IINag, 포스포글루코사민 뮤타제, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 포스포프룩토키나제, PEP의 Enzyme IIGlc: 글루코오스 PTS, EIIM, PEP의 P/IIIMan: 만노스 PTS, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸 트랜스퍼라제 및/또는 포스파타제의 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자에서 적어도 하나 이상의 추가적인 유전적 변형을 갖는다. 유전적 변형은 바람직하게는 증가되어야 하는 포스파타제의 경우를 제외하고는 단백질의 작용을 증가시키거나 감소시킨다. 다른 바람직한 양태에서, 미생물은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제 및 N-아세틸-글루코사민-특이적 효소 IINag를 암호화하는 유전자에서의 변형을 갖되, 여기서 상기 유전적 변형은 단백질의 작용을 증가시키거나 감소시킨다. 한 양태에서, 유전적 변형은 유전자의 일부분의 결실이다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물은 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된 글루코사민-6-포스페이트 신타제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민 -6-포스페이트 데아세틸라제, 포스포글루코사민 뮤타제 또는 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 암호화하는 재조합 핵산 분자; 및 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제, 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제, N-아세틸-글루코사민-특이적 효소 IINag, 포스포글루코사민 뮤타제, 글루코사민-1-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제/N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제, 포스포프룩토키나제, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, PEP의 Enzyme IIGlc: 글루코오스 PTS 및/또는 EIIM, PEP의 P/IIIMan: 만노스 PTS의 그룹으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 유전자에서 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 유전적 변형은 단백질의 작용을 증가시키거나 감소시키고 재조합 핵산 분자의 발현은 미생물에 의한 효소의 발현을 증가시킨다. 다른 양태에서, 미생물은 포스파타제 유전자에 의해 암호화된 포스파타제가 증가된 작용을 갖도록 그 유전자의 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 갖는다. 바람직한 양태에서, 재조합 핵산 분자는 미생물의 게놈내로 통합된다.
본 발명에서 기술된 돌연변이의 다양한 다른 조합이 본 발명에 통합되며 다수는 실시예 부문에서 기술다.
추가로 본 발명에서 개시된 공정 및 물질은 당업자에 의해서 폴리-N-아세틸글루코사민, 폴리-글루코사민, 갈락토사민, 만노사민, N-아세틸 갈락토사민, N-아세틸만노사민 및 이들의 유도체와 같은 다른 아미노당을 제조하기 위하여 이용 및/또는 변형될 수 있다.
상기된 바와 같이 본 발명의 발효 방법에 의해 상당한 고수율의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 제조하기 위해서 미생물은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 개선시키도록 유전적으로 변형된다. 본 발명에서 이용된 유전적으로 변형된 미생물은 정상(즉, 야생형 또는 천연적으로 발생하는) 형태로부터 변형된(즉, 돌연변이된 또는 변화된) 게놈을 갖는다. 한 측면에서, 그러한 유기체는 대상 단백질을 암호화하는 유전자를 내인적으로 포함하여 발현할 수 있고, 유전적 변형은 그 유전자의 유전적 변형일 수 있으며, 그로 인하여 상기 변형은 유전자의 발현 및/또는 활성에 약간의 영향(예, 증가, 감소, 결실)을 미친다. 다른 측면에서, 그러한 유기체는 대상 단백질을 암호화하는 유전자를 내인적으로 포함하고 발현할 수 있고, 유전적 변형은 적어도 하나 이상의 외인성 핵산 서열(즉, 재조합 핵산 분자)의 도입일 수 있으며, 여기서 외인성 핵산 서열은 대상 단백질 및/또는 단백질 또는 단백질의 활성 또는 단백질을 암호화하는 유전자에 영향을 미치는 임의의 단백질을 암호화한다. 미생물로 도입될 수 있는 외인성 핵산 분자는 야생형 단백질을 암호화하거나 야생형 또는 정상 단백질과 비교했을 때 암호화된 단백질의 발현 및/또는 활성에 영향을 미치는 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 또 다른 측면에서, 유기체가 내인적으로(천연적으로) 대상 단백질을 암호화하는 유전자를 필수적으로 포함하고 있지 않지만, 대상 단백질의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자를 도입하도록 유전적으로 변형된다. 여기서도, 재조합 핵산 분자는 야생형 단백질을 암호화하거나 재조합 핵산 분자는 야생형 단백질과 비교했을 때 암호화된 단백질의 발현 및/또는 활성에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 다른 양태에서, 다양한 발현 조절 서열(예, 프로모터)이 미생물의 내인성 유전자의 발현에 영향을 미치기 위하여 미생물로 도입될 수 있다. 이러한 측면 각각과 관련된 다양한 양태가 이하에서 자세하게 설명될 것이다.
본 발명에서 유전적으로 변형된 미생물은 박테리아, 원생생물, 조류, 곰팡이류 또는 다른 미생물을 포함한 임의의 유전적으로 변형된 미생물을 포함할 수 있다. 그러한 유전적으로 변형된 미생물은 목적한 결과(예, 증가된, 감소된 또는 변형의 결과로서 변형된 효소 발현 및/또는 활성 및/또는 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민의 변형된 제조)를 달성하기 위해서 정상(즉, 야생형 또는 천연적으로 발생하는) 형태로부터 변형된(즉, 돌연변이된 또는 변환된)형태 및/또는 염색체 유전 물질(예, 재조합 핵산 분자)을 발현하도록 변형된 게놈을 갖는다. 보다 자세하게는 미생물에 대한 변형은 미생물 게놈의 변형(예, 외인성 유전자) 및/또는 미생물로 염색체외에 잔류하거나 숙주 미생물 게놈으로 통합될 수 있는 유전 물질(예, 재조합 핵산 분자)을 도입함으로써 달성될 수 있다. 이와 같이 유전적 변형은 미생물의 외인성 또는 재조합으로 도입된 핵산 서열의 발현을 조절하는 조절 서열의 도입 또는 변형, (예, 야생형 또는 변형된 단백질을 암호화하는)야생형 또는 변형된 재조합 핵산 분자의 도입, 미생물의 내인성 유전자의 변형 또는 효소 발현 및/또는 생물학적 활성과 관련된 특정 특성을 갖는 미생물로 이어질 수 있는 임의의 다른 변형을 포함할 수 있다. 미생물의 유전적 변형은 전통적인 균주 개발 및/또는 분자 유전학 기술을 사용해서 달성될 수 있다. 그러한 기술은 당업계에 공지되 어 있으며 예를 들어, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press에 미생물과 관련되어 공개되어 있다. 상기 문헌 Sambrook et al.의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다. 유전적으로 변형된 미생물은 핵산분자가 삽입. 결실 및/또는 변형(즉, 돌연변이된; 예를 들면 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위)되고 그러한 변형은 미생물 내에서 목적한 효과를 제공하는 방식으로 포함할 수 있다. 본 발명에서, 유전적으로 변형된 미생물은 재조합 기술을 사용하여 변형된 미생물을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 미생물의 유전적 변형은 본 발명에 따른 아미노당 대사 경로에 관여하는 단백질의 활성을 증가시키거나 감소시킨다. 그러한 유전적 변형은 임의의 변형 유형을 포함하며 특히 재조합 기술 및/또는 전통적 돌연변이 유발 의해 이루어진 변형을 포함한다. 본 발명에서 유전자 발현, 유전자의 기능 또는 유전자 생산물(즉, 유전자에 의해 암호화된 단백질)의 기능의 감소로 이어지는 유전적 변형은 유전자의 (완전한 또는 부분적인) 불활성화, 결실, 파괴(interruption), 차단, 억제(silencing) 또는 하향 조절로 기재될 수 있다. 예를 들어, 임의의 유전자에 의해 암호화된 단백질의 기능의 감소로 이어지는 유전자의 유전적 변형은 그 유전자의 완전한 결실(즉, 그 유전자가 존재하지 않아 그 단백질이 존재하지 않는다), 단백질로 불완전하거나 전혀 해독되지 않도록 하는 유전자에서의 돌연변이(예, 단백질이 발현되지 않는다) 또는 단백질의 본래의 기능을 감소시키거나 제거한 유전자에서의 돌연변이(예, 효소 활성 또는 작용이 감소되거나 제거된 단백질이 발현된다)의 결과일 수 있다. 보다 자세하게는 본 발명에서 효소의 작용 또는 활성을 감소시킨다는 것은 효소의 감소된 발현 및/또는 기능성(생물학적 활성)으로 이어질 수 있는 미생물에서의 임의의 유전적 변형을 의미하고 효소 발현의 감소 또는 제거 뿐만 아니라 효소의 감소된 활성(예, 비 활성), 효소의 증가된 억제 또는 분해를 포함한다. 예를 들어 본 발명에 따른 효소의 작용 또는 활성은 효소의 생산을 차단하거나 감소시킴으로써 감소될 수 있고, 효소 활성의 감소 또는 효소의 활성을 억제함으로써 감소시킬 수 있다. 이러한 변형의 몇몇 조합이 또한 가능하다. 효소 생산의 차단 또는 감소는 효소를 암호화하는 유전자를 성장 배지 중 유도 화합물의 존재를 필요로 하는 프로모터의 조절하에 위치시키는 것을 포함한다. 유도인자가 배지로부터 고갈되도록 조건을 설정함으로써 효소(및 효소 합성)를 암호화하는 유전자의 발현이 턴오프(turn off)될 것이다. 효소의 활성을 차단하거나 감소시키는 것은 미국특허 US 4,743,546호에 개시된 바와 유사한 절제(excision) 기술 방식을 사용하는 것을 또한 포함한다. 이러한 방식을 이용하기 위하여 대상 효소를 암호화하는 유전자는 게놈으로부터 그 유전자의 특이적이고 조절된 절제를 가능하게 하는 특정 유전자 서열 사이에 클로닝한다. 절제는 예를 들어 미국특허 US 4,743,546호에서 처럼 배양시에 배양 온도의 전환 또는 몇 가지 다른 물리적 또는 영양소의 신호에 의해 촉진될 수 있다.
유전자 발현 또는 기능에서의 증가로 이어질 수 있는 유전적 변형은 유전자의 증폭, 과잉 생산, 과잉 발현, 활성화, 개선, 첨가 또는 상향 조절로서 기재될 수 있다. 보다 자세하게는 본 발명에서 효소 또는 다른 단백질의 작용 (또는 활성)을 증가시킨다는 것은 효소 또는 단백질의 증가된 발현 및/또는 기능성(생물학 적 활성)으로 이어지는 미생물에서의 임의의 유전적 변형을 의미하며, 효소의 높아진 활성(예, 비 활성 또는 생체내 효소의 활성), 효소의 감소된 억제 또는 분해 및 효소의 과잉 발현을 포함한다. 예를 들어 유전자의 카피(copy)가 증가될 수 있거나, 발현율이 천연 프로모터 보다 높은 발현율을 제공하는 프로모터의 사용에 의해 증가될 수 있거나 유전자가 효소의 생물학적 활성을 증가시키는 유전 공학 또는 전통적 돌연변이 유발에 의해 변이될 수 있다. 이러한 변형의 조합이 또한 가능하다.
일반적으로 본 발명에 있어서, 돌연변이 또는 변형된 효소의 주어진 특성(예, 효소 활성)에서의 증가 또는 감소는 동일한 또는 동등한 조건에서 측정된 또는 알려진 동일한 유기체로부터 유래된(동일한 기원 또는 부모 서열로부터 유래된) 야생형(예, 정상, 변형되지 않은) 효소의 동일한 특성을 참조하여 판단될 수 있다. 유사하게, 유전적으로 변형된 미생물의 특성(예, 단백질의 발현 및/또는 생물학적 활성, 또는 생산물의 생산)에서의 증가 또는 감소는 동일하거나 동등한 조건에서 동일한 종, 바람직하게는 동일한 균주의 야생형 미생물의 동일 특성을 참조하여 판단될 수 있다. 그러한 조건은 미생물의 단백질 활성(예, 발현 또는 생물학적 활성) 또는 다른 특성이 측정된 분석 또는 배양 조건(예, 배지 성분, 온도, pH 등) 뿐만 아니라 이용된 분석 유형, 평가된 숙주 미생물 등을 포함한다. 전술된 바와 같이 동등한 조건(예, 배양 조건)은 유사하지만 필수적으로 동일하지 않으며(예, 조건에서의 몇몇 보존적 변화는 허용될 수 있다) 동일한 조건에서의 비교 대상과 비교했을 때 미생물의 성장 또는 효소의 발현 또는 생물학적 활성에 실질적으로 변 화를 일으키지 않는 조건이다.
바람직하게는 특정 단백질(예, 효소)의 활성을 증가시키거나 감소시키는 유전적 변형을 갖는 유전적으로 변형된 미생물은 단백질의 활성(예, 발현, 생산 및/또는 생물학적 활성)에 있어서, 야생형 미생물 유래 야생형 단백질의 활성과 비교했을 때 적어도 약 5% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 10% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 15% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 25% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 35% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 45% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 55% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 60% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 또는 5% 내지 100%에 속하는 모든 정수(예, 6%, 7%, 8% 등)의 백분율의 증가 또는 감소를 갖는다. 동일한 차이가 분리된 변형된 핵산 분자 또는 단백질을 분리된 야생형 핵산 분자 또는 단백질과 직접적으로 비교할 때 바람직하다(예, 비교가 생체내와 생체를 비교한 경우).
본 발명의 다른 측면에서, 주어진 단백질(예, 효소)의 활성을 증가시키거나 감소시키는 유전적 변형을 갖는 유전적으로 변형된 미생물은 단백질의 활성(예, 발현, 생산 및/또는 생물학적 활성)에 있어서, 야생형 미생물 유래 야생형 단백질의 활성과 비교했을 때 적어도 약 2배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 5배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 20배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 30배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 40배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 50배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 75배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 100배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 125배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 150배 이상 또는 약 2배 이상으로부터 시작하는 모든 정수 증가분(예, 3배, 4배, 5배, 6배 등)의 증가 또는 감소를 갖는다.
증가된 또는 감소된 (발현, 비 활성, 생체내 활성 등을 포함한)활성을 제공하기 위한 미생물의 유전적 변형은 바람직하게는 미생물에서의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생합성 경로 또는 아미노당 대사 경로에 그 경로가 내인성이면서 유전적으로 변형되거나 유기체로 하나 이상의 재조합 핵산 분자가 유전적으로 도입된 내인성이거나 재조합 기술에 의해 완전히 제공된 것이든지 간에 영향을 미친다. 본 발명에 있어서, "글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생합성 경로의 활성에 영향을 미친다"는 것은 유전적 변형이 배제된 유기체와 비교했을 때 유기체에 의해 발현되는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생합성 경로에서 임의의 감지할 수 있거나 측정될 수 있는 변화 또는 변형을 일으키는 임의의 유전적 변형을 포함한다. 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생합성 경로에서의 감지할 수 있는 변화 또는 변형은 이에 제한되는 것은 아니지만, 미생물의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생합성 경로에서의 적어도 어느 하나 이상의 생산물의 생산에서의 감지할 수 있는 변화 또는 세포내 및/또는 세포외의 글루코사민 또는 N- 아세틸글루코사민의 생산에서의 감지할 수 있는 변화를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 유전적 변형은 본 발명에서 기술된 특정 효소 또는 다른 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 변형을 포함한다. 그러한 변형은 내인성의 효소 또는 단백질에 가해질 수 있으며, 그에 의하여 그러한 단백질을 천연적으로 포함하는 미생물은 예를 들어 전통적인 돌연변이 방법, 선별 기술 및/또는 유전 공학 기술을 포함하는 분자 유전학 기술에 의해 유전적으로 변형된다. 유전 공학 기술은 예를 들어 내인성 유전자의 일부분을 결실하거나 개선된 효소 또는 다른 단백질을 암호화하는 서열 또는 내인성 효소 또는 다른 단백질의 발현을 증가시키는 다른 프로모터와 같은 이형성 서열로 내인성 유전자의 일부분을 대체하기 위하여 표적화 재조합 벡터를 이용하는 것을 포함한다. 유전 공학 기술은 재조합 기술을 사용하는 유전자의 과잉 발현을 포함한다.
예를 들어, 외래의 프로모터가 본 발명에서 기술된 아미노당 대사와 관련된 대상 효소 또는 다른 단백질을 암호화하는 적어도 하나 이상의 유전자의 업스트림에 도입될 수 있다. 바람직하게는 내인성 유전자의 5' 업스트림 서열은 구성적 프로모터, 유도적 프로모터 또는 이용된 성장 조건에서 최적의 발현을 달성하는 프로모터로 대체될 수 있다. 이러한 방법은 이용된 성장 조건에서 내인성 유전자가 활성화되지 않거나 충분히 활성화되지 않을 때 특히 유용하다.
본 발명의 이러한 양태의 다른 측면에서, 유전적 변형은 숙주로 대상 효소 또는 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자의 도입을 포함할 수 있다. 숙주는 (1) 특정 효소 또는 단백질을 발현하지 않는 숙주세포 또는 (2) 특정 효소 또는 단 백질을 발현하되, 도입된 재조합 핵산 분자가 미생물에서의 효소 또는 다른 단백질의 활성을 변화 또는 개선시키는 숙주세포를 포함할 수 있다. 본 발명은 임의의 유전적으로 변형된 미생물을 포함하되, 그 미생물은 본 발명에 따른 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 제조하는 발효 공정에 적합한 적어도 하나 이상의 변형을 포함한다.
유전적으로 변형된 미생물은 분리된 핵산 분자를 미생물로 도입하는 것과 같은 재조합 기술에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 미생물은 증가된 발현이 바람직한 단백질과 같은 대상 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자로 형질감염될 수 있다. 형질감염된 핵산 분자는 발현될 수 있는 능력이 유지되는 방식으로 염색체외에 잔류하거나 형질감염된(즉, 재조합) 숙주 세포의 염색체 내에 하나 이상의 위치로 통합될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 숙주 세포는 핵산 분자로 형질감염되자마자 그 핵산 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합된다. 통합의 중요 장점은 핵산 분자가 세포내에서 안정적으로 유지된다는 것이다. 바람직한 양태에서, 통합된 핵산 분자는 핵산 분자의 발현을 조절하도록 유도될 수 있는 (이하에서 기술되는) 전사 조절 서열에 작동가능하게 연결된다.
핵산 분자는 불규칙 또는 표적 통합 중 어느 하나에 의해 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 그러한 통합 방식은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 대장균 균주 ATCC47002는 ColE1 복제 개시점을 보유한 플라스미드를 유지할 수 없는 돌연변이를 포함한다. 그러한 플라스미드가 이러한 균주에 전달되어졌을 때, 그 플라스미드 상에 포함된 유전자 마커에 대한 선별은 플라스미드의 염색체로의 통합 으로 이어질 것이다. 이러한 균주는 예를 들어 대장균 lacZ 유전자의 5'- 및 3'- 말단이 측면에 위치하도록 대상 유전자 및 선별 마커를 포함하는 플라스미드로 형질전환될 수 있다. lacZ 서열은 염색체에 포함된 lacZ 유전자로 도입되는 DNA를 표적으로 한다. lacZ 위치에서의 통합은 효소 β-갈락토시다제를 암호화하는 온전한 lacZ 유전자를 대상 유전자가 파괴된 부분적 lacZ 유전자로 대체한다. 성공적인 통합체는 β-갈락토시다제 음성을 통하여 선별될 수 있다. 유전적으로 변형된 미생물은 형질도입하는 박테리오파지를 사용하는 것과 같은 방법에 의해 수여 세포 게놈으로 핵산 분자를 도입함으로써 또한 제조될 수 있다. 본 발명의 몇 가지 서로 다른 유전적으로 변형된 미생물을 제조하기 위한 재조합 기술 및 박테리오파지로 형질도입하는 기술은 당업계에 알려져 있으며 실시예 부문에서 자세히 설명된다.
온도 전환에 의해 대장균 염색체에서 표적 유전자 결실 및 유전자의 도입을 위한 벡터 및 방법은 Hamilton et al.(1998, J.Bateriol. 171:4617-4622)에 개시되어 있다. 이 방법은 서로 다른 글루코사민 생산 대장균 균주를 개발하는데 적용되었다. 유전자 통합을 위한 프로토콜은 다음 주요 단계들을 포함한다. 첫 번째 단계는 표적 위치의 서열을 클로닝하고 내부 결실을 만들고/거나 그 결실 위치에 통합될 외래 유전자를 삽입하는 것이다. 두 번째 단계는 이러한 서열을 포함하는 단편을 온도 민감성인 복제 개시점과 항생제 선별 마커를 포함하는 온도 민감성인 통합 벡터에 서브클로닝하는 것이다. 세 번째 단계는 상기 통합 벡터를 대장균 숙주 균주에 형질전환하고 비허용 온도(42℃)에서 단일 교차(single crossover) 재조합 과정을 통하여 전체 플라스미드가 염색체로 통합된 클론을 선별하는 것이다. 네 번째 단계는 허용 온도(30℃)에서 액체 배양으로 선별된 클론의 세포를 배양하는 것이다. 통합된 플라스미드를 갖는 세포는 플라스미드를 상실하는 경향이 있다. 복제 개시점 및 항생제 저항 유전자의 일부 또는 전체 플라스미드를 상실하게 된 세포들은 이러한 배양에서 보다 빨리 성장할 것이다. 일반적으로 이 단계는 2개 내지 10개 클론의 풀에서 유래된 세포를 50-ml LB배지에 접종하고 그 배양액을 24시간 동안 배양함으로써 달성된다. 이렇게 형성된 배양액은 1000배 희석하여 신선한 배지로 계대하였고 추가로 24시간동안 배양하였다. 다섯번째로 세포를 도말하고 항생제 내성을 상실한 클론들은 선별하였다. 통합된 유전자 또는 결실된 유전자의 특성에 따른 유전자 특이적 선별 과정이 이용될 수 있었다. 전형적으로 클론을 스크리닝하기 위해서 PCR 산물의 크기를 통하여 염색체에서 목적한 변형을 구비한 클론을 그것의 천연 형태와 구별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하는 PCR을 수행하였다. 클론은 통합되거나 결실된 DNA 서열에 특이적인 프로브를 사용하는 서던 블롯 분석에 의해 재확인되었다.
본 발명은 발효 공정으로 상업적으로 이용할 수 있는 양의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산할 수 있는 능력을 갖는 미생물의 사용을 포함한 방법을 개시한 것이다(즉, 바람직하게는 동일한 조건에서 배양된 야생형 미생물과 비교했을 때 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산함에 있어 개선된 능력). 본 발명에서 발효 공정은 세포로부터 생산물을 제조하기 위하여(즉, 세포는 배양 공정 중에 생산물을 생산한다) 용기, 생물반응기, 발효조 또는 다른 적당한 배양 챔버에서 미생물과 같은 세포를 배양하는 공정이다. 생산물은 전형적으로 실험 또는 상업적 목적에 유용한 생산물이다. 본 발명에 따른 발효 방법은 야생형 단백질과 비교했을 때 변이된(예, 증가되거나 감소된) 기능을 갖는 단백질의 생산(발현)의 증가로 이어지는 아미노당 대사 경로에 관여하는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 유전자의 유전적 변형에 의해 달성된다. 그러한 변이된 기능은 유전적으로 설계된 미생물의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산하는 능력을 개선시킨다. 당업자에 의해 실시예에 기술된 특정 선별 기술과 같은 것에 의해 본 발명에서 기술된 특정하게 변이된 기능(예, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 생산하는 개선된 능력)을 갖는 유전적으로 변형된 미생물의 생산은 다양한 서로 다른 유전적 변형을 통하여 주어진 기능적 조건을 만족시키는 많은 유기체를 생산할 수 있다. 예를 들어, 주어진 핵산 서열에서 서로 다른 불규칙적 뉴클레오타이드 결실 및/또는 치환은 동일한 표현형 결과(예, 그 서열에 의해 암호화된 단백질의 감소된 작용)로 이어질 수도 있다. 본 발명은 본 발명에서 기술된 특성을 갖는 미생물의 생산으로 이어질 수 있는 임의의 그러한 유전적 변형을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서 유전적으로 변형된 미생물은 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트를 합성하는 개선된 능력을 갖는 미생물을 포함한다. 본 발명에 있어서, "합성하는 개선된 능력"은 미생물이 동일한 조건에서 배양된 야생 형 미생물과 비교했을 때 생산물의 증가된 양을 생산할 수 있도록 상기 생산물의 합성과 관련된 아미노당 대사 경로에서의 임의의 개선 또는 상향 조절을 의미한다.
본 발명의 한 측면에서, 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 적합한 배양 조건 특히 본 발명에서 기술된 임의의 배양 조건에서 배양되었을 때 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트의 적어도 약 1g/L 이상, 바람직하게는 적어도 약 5g/L 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 10g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 20g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 30g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 40g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 50g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 60g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 70g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 100g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 110g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 120g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 150g/L 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 180g/L 이상, 또는 더 높은 양 또는 적어도 약 1g/L 내지 적어도 약 500g/L 사이에 속하는 모든 정수의 양(예, 2g/L, 3g/L 등)을 생산한다. 다른 측면에서, 본 발명의 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 유전적으로 변형된 미생물로서 동일한 조건 또는 동등한 조건에서 배양된 동일한 종(바람직하게는 균주)의 야생형(즉, 변형되지 않은, 자연적으로 발생하는) 보다 적어도 약 2배 이상의 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, 바람직하게는 적어도 약 5배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 25배 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 50배 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 100배 이상, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 200배 이상, 적어도 약 2배 내지 적어도 약 200배 사이에 속하는 모든 정수 증가분의 배(즉, 적어도 3배, 적어도 4배)로의 증가를 포함한 더 많은 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트을 생산한다. 그러한 특성을 갖는 다양한 특정한 미생물들이 실시예 부문에서 동정된다.
다른 측면에서, 본 발명의 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 14g/L K2HPO4, 16g/L KH2PO4, 1g/L Na3Citrate · 2H2O, 5g/L (NH4)2SO4, 20g/L 글루코오스, 10mM MgSO4, 1mM CaCl2 및 1mM IPTG를 포함하는 발효 배지로 pH7.0에서, 건조 세포 중량으로 적어도 약 8/L 이상의 세포 밀도까지 37℃에서 24시간 동안 배양되었을 때 적어도 약 1g/L 이상의 글루코사민을 생산한다. 한 측면에서, 본 발명의 발효 방법에서 유용한 유전적으로 변형된 미생물은 14g/L K2HPO4, 16g/L KH2PO4, 1g/L Na3Citrate · 2H2O, 5g/L (NH4) 2SO4, 20g/L 글루코오스, 10mM MgSO4, 1mM CaCl2 및 약 0.2mM 내지 약 1mM의 IPTG를 포함하는 발효 배지로 pH7.0에서, 건 조 세포 중량으로 적어도 약 8/L의 세포 밀도까지 약 28℃ 내지 약 37℃에서 약 10시간 내지 약 60시간 동안 배양되었을 때 적어도 약 1g/L 이상의 글루코사민을 생산한다. 바람직한 양태에서 IPTG의 양은 약 0.2mM이다.
본 발명의 발효 방법에서 이용될 수 있는 미생물(예, 숙주 세포 또는 생산 유기체)은 임의의 미생물(예, 박테리아, 원생생물, 조류, 곰팡이 또는 다른 미생물)이고 가장 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 곰팡이이다. 적합한 박테리아 속(genera)에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)이다. 적합한 박테리아 종(species)은 이에 제한되는 것은 아니지만, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 포함하다. 적합한 효모 속은 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 파피아(Phaffia)를 포함한다. 적합한 효모 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 카나덴시스(P. canadensis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 파피라 로도지마(Phaffia rhodozyma)를 포함한다. 적합한 곰팡이 속은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼질러스(Aspergillus), 압시디아(Absidia), 리조푸스(Rhizopus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 뉴로스포라(Neurospora) 및 트리코더마(Trichoderma)을 포함한다. 적합한 곰팡이 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘안스(A. nidulans), 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 크리소스포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인터메디아(N. intermedia) 및 트리코덤 레세이(Trichoderm reesei)를 포함한다. 특히 바람직한 대장균 균주는 K-12, B 및 W를 포함하며 K-12가 가장 바람직하다. 대장균이 바람직한 박테리아이고 본 발명에 따른 다양한 양태를 예시하는데 이용되었지만 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산하고, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산을 개선시키기 위해 유전적으로 변형될 수 있는 임의의 미생물은 본 발명에 따른 방법에 이용될 수 있다는 것이 자명할 것이다. 본 발명의 발효 방법에서 이용되는 미생물은 생산 유기체로서 또한 언급될 수 있다.
바람직한 양태에서, 유전적으로 변형된 미생물은 박테리아 또는 효모이고 보다 바람직하게는 에스케리키아 종이고 보다 더 바람직하게는 대장균이다. 유전적으로 변형된 대장균은 이에 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 nagA, nagB, nagC, nagD, nagE, manXYZ, glmM, pfkB, pfkA, glmU, glmS, GNA1, ptsG 또는 포스 파타제 유전자를 포함하는 유전자에서 변형을 갖는다. 다른 양태에서, 그러한 유전적으로 변형된 대장균은 nag 레귤론 유전자의 결실을 갖으며, 또 다른 양태에서, nag 레귤론 유전자에서의 결실 및 manXYZ에 의해 암호화된 단백질이 감소된 작용을 갖도록 하는 manXYZ에서의 유전적 변형을 갖는다.
본 발명에 있어서 특정 효소 또는 다른 단백질은 전장 단백질, 융합 단백질 또는 (천연 대립형질 변이체, 단편, 다른 유기체로부터 유래된 관련 단백질 및 합성하거나 인공적으로 유래된 변이체(상동체)를 포함한) 자연적으로 발생하는 단백질의 임의의 상동체를 포함하여 야생형 대조 단백질의 적어도 하나 이상의 생물학적 활성 갖는 임의의 단백질을 의미한다. 대조 단백질의 상동체(돌연변이체, 변이체, 변형된 형태)는 이에 제한되는 것은 아니지만, 적어도 하나 이상의 아미노산이 결실(예, 펩타이드 또는 단편과 같이 단백질의 절단된 형), 삽입, 역위, 치환 및/또는 (예, 당쇄화, 인산화, 아세틸화, 미리스토일화, 프레닐화, 팔미트화, 아미드화 및/또는 글리코실포스파티딜 이노시톨의 첨가에 의해) 유도되어 자연적으로 발생하는 대조 단백질과 상이한 단백질을 포함한다. 한 바람직한 상동체는 자연적으로 발생한 단백질의 생물학적으로 활성인 단편이다. 본 발명에서 유용한 자연적으로 발생한 단백질의 다른 바람직한 상동체는 이하에서 기술된다. 따라서 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 그러한 특정한 단백질의 오픈 리딩 프레임, 도메인, 이들의 생물학적으로 활성인 단편, 생물학적 활성을 갖는 자연적으로 발생하는 단백질 또는 도메인의 임의의 상동체인 해독 생산물을 암호화할 수 있다.
본 발명에서 분리된 단백질은 그것의 자연 환경으로부터 분리된(즉, 사람의 조작을 받은) 단백질이며, 예를 들어 정제된 단백질, 부분적으로 정제된 단백질, 재조합 방법으로 생산된 단백질 및 합성 방법으로 생산된 단백질을 포함할 수 있다. 몇 가지 재조합 방법으로 생산된 단백질이 실시예 부문에 기술되어 있다. 이와 같이 "분리된"은 단백질이 정제된 정도까지 나타내지는 않는다. 추가로 가상의 단백질을 "단백질 X"(즉, 본 발명에서 이용된 임의의 효소 또는 단백질은 이 용어로 치환될 수 있다)라고 명명하는 경우에, "대장균 단백질 X"는 대장균에서 유래된 단백질 X(자연적으로 발생한 단백질 X의 상동체를 포함함) 또는 대장균의 자연적으로 발생한 단백질 X의 기능 및 구조(예, 서열)에 대한 지식으로부터 생산된 단백질을 의미한다. 즉, 대장균 단백질 X는 대장균으로부터 자연적으로 발생한 단백질 X와 실질적으로 유사한 구조 및 기능을 보유하거나 이하에서 기술되는 대장균으로부터 천연적으로 발생한 단백질 X의 생물학적 활성(즉, 생물학적 활성을 갖는) 상동체인 임의의 단백질 X를 포함한다. 이와 같이 대장균 단백질 X는 정제된, 부분적으로 정제된, 재조합의, 돌연변이/변형된 및 합성된 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같은 용어 정의는 본 발명에서 기술되는 다른 미생물에서 유래된 단백질 X에 대해서도 유사하게 적용된다.
상동체는 천연 대립형질 변이 또는 천연적 돌연변이의 결과물일 수 있다. 단백질을 암호화하는 핵산의 천연적으로 발생하는 대립형질 변이체는 게놈 상에서 상기 단백질을 암호화하는 유전자와 필수적으로 동일한 위치에 발생하지만, 예를 들면 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발되는 천연적 변이로 인하여 유사하지만 동일한 서열을 갖지는 않는 유전자이다. 전형적으로 대립형질 변이체는 비교되는 유 전자에 의해 암호화된 단백질과 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. 한 부류의 대립형질 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서로 다른 핵산 서열을 갖지만 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 대립형질 변이체는 또한 유전자(예, 조절 영역)의 5' 또는 3'의 비해독 영역에서의 변이를 포함할 수 있다. 대립형질 변이체는 당업계에 잘 알려져 있다.
상동체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 분리된 천연적으로 발생한 단백질에 대한 직접적인 변형, 직접적인 단백질 합성 또는 불규칙 또는 표적 돌연변이를 유발할 수 있는 예를 들어 전통적 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 대한 변형을 포함한 단백질의 생산에 대하여 공지된 당업계의 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
야생형 단백질과 비교했을 때 상동체에서의 변형은 천연적으로 발생하는 단백질과 비교했을 때 상동체의 기본적인 생물학적 활성을 실질적으로 항진, 길항 또는 실질적으로 변화시키지 않는다. 일반적으로 단백질의 생물학적 활성 또는 생물학적 작용은 단백질에 의해 나타나거나 수행되는 임의의 기능을 의미하는 것으로 상기 단백질의 천연적으로 발생하는 형태에 대하여 생체내 (즉, 단백질의 천연적 생리학적 환경) 또는 생체외 (즉, 실험실 조건에서)에서 측정되거나 관찰된 것이다. 본 발명에서 기술된 효소 및 단백질의 생물학적 활성은 상기에서 상세하게 기술되었다. 예를 들어 본 발명에서"글루코사민-6-포스페이트 신타제"로 언급된 효소는 프룩토오스-6-포스페이트와 글루타민으로부터 글루코사민-6-포스페이트와 글루타메이트의 형성을 촉매한다. 상동체와 같은 단백질에서의 변형은 천연적으로 발생한 단백질과 동일한 정도의 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 천연적으로 발생한 단백질과 비교했을 때 감소되거나 증가된 생물학적 활성을 갖는 단백질을 유발할 수 있다. 단백질 발현의 감소 또는 활성의 감소로 이어지는 변형은 단백질의 (완전하거나 부분적인) 불활성화, 하향 조절 또는 감소된 작용을 의미할 수 있다. 유사하게 단백질 발현의 증가 또는 활성의 증가로 이어지는 변형은 단백질의 증폭, 과잉생산, 활성화, 개선, 상향 조절 또는 증가된 작용을 의미할 수 있다. 주어진 단백질의 기능적 서브 유니트, 상동체 또는 단편은 바람직하게는 실질적으로 동일한(예, 적어도 정성적으로 동일한) 천연 단백질의 생물학적 기능을 수행할 수 있다(즉, 생물학적 활성을 갖는다). 단백질의 기능적 서브 유니트, 단편 또는 다른 상동체는 대조군 또는 야생형 단백질의 생물학적 활성을 갖는 것으로 인식되기 위하여, 대조군 또는 야생형 단백질과 동일한 정도의 생물학적 활성을 갖도록 반드시 요구되지 않는다는 것을 주지해야 한다(즉, 정성적 유사성이면 충분하다). 한 양태에서, 야생형 단백질과 비교했을 때 상동체에서의 변형은 천연적으로 발생하는 단백질의 비교했을 때 단백질의 기본적인 활성을 실질적으로 감소시키지 않는 것이 바람직하다. 증가된 생물학적 활성(예, 증가된 효소 활성)이 상동체에서 바람직할 것이다. 상동체는 또한 천연적으로 발생하는 형태와 비교했을 때 단백질의 기능적 또는 효소적 활성 보다는 천연적으로 발생하는 단백질과 비교했을 때 특정 화합물에 의한 억제에 대한 감소된 민감성과 같이 특징에서의 차이를 가질 수도 있다.
본 발명에 있어서, 생물학적 활성인 상동체 또는 이들의 단편을 포함한 분리된 단백질은 야생형 또는 천연적으로 발생하는 단백질의 생물학적 활성의 적어도 하나 이상의 특징을 갖는다. 단백질 발현 및 생물학적 활성을 검출하고 측정하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질 전사의 측정, 단백질 해독의 측정, 단백질의 세포내 위치의 측정, 이 단백질과 다른 단백질의 결합 또는 연관성의 측정, 단백질 또는 다른 핵산에 이 단백질을 암호화하는 유전자 조절 서열의 결합 또는 연관성의 측정, 단백질을 발현하는 세포에서 그 단백질의 생물학적 활성의 증가, 감소 또는 유도의 측정을 포함한다.
본 발명에 따른 단백질의 단백질 발현양을 측정하는 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만, 웨스턴 블로팅, 면역세포화학, 유동세포 계수 또는 이에 제한되는 것은 아니지만, 리간드 결합, 효소 활성 또는 다른 단백질 파트너와의 결합을 포함한 단백질의 특성을 기반으로 하는 분석법인 다른 면역기반 분석법을 포함한다. 결합 분석법 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, BIA core 기계는 두 단백질로 이루어진 복합체의 결합 상수를 측정하는데 이용될 수 있다. 이러한 복합체에 대한 해리 상수는 완충용액이 칩 위에서 통과하는 시간에 따른 굴절율에서의 변화를 모니터링함으로써 확인될 수 있다(O'Shannessy et al. Anal. Biochem. 212:457-468 (1993); Schuster et al., Nature, 365:343-347(1993)). 한 단백질과 다른 단백질의 결합을 측정하는 다른 적합한 분석법은 예를 들어 효소 면역학적 분석(ELISA)과 방사 면역학적 분석(RIA)과 같은 면역학적 분석 또는 형광, UV 흡수, 원평광 2색성 편광 분석 또는 핵자기 공명(NMR)을 통한 단백질의 분광학적 또는 광학적 특성에서의 변화를 모니터링함에 의한 결합의 측정을 포함한다. 본 발명에서 이용된 단백질의 효소 활성을 측정하는 분석법은 당업계에 알려져 있으며 다수의 분석법이 실시예 부문에서 기술된다.
본 발명에 발효 공정에서의 변형 및 이용을 위한 바람직한 표적을 대표하며 아미노당 대사 경로에 관여하는 많은 효소와 단백질은 대표적인 야생형 또는 돌연변이 단백질의 기능과 아미노산 서열(및 이를 암호화하는 핵산 서열)과 관련하여 앞서 기술되었다. 본 발명의 한 양태에서, (다른 유기체에서 유래된 관련 단백질 또는 주어진 단백질의 변형된 형태를 포함한)주어진 단백질의 상동체는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 유기체에서의 이용을 위해 포함된다. 본 발명에 포함되는 단백질 상동체는 본 발명에 따라 변형되거나 과잉 발현될 수 있는 효소 또는 단백질의 아미노산 서열을 대표하는 발명에서 기술된 아미노산 서열과 적어도 약 35% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 45% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 55% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 65% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 96% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 97% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 98% 이상 동일한, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 이상 동일하거나, 35% 내지 99%에 속하는 모든 정수의 백분율(즉, 36%, 37% 등) 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상동체의 아미노산 서열은 야생형 또는 대조 단백질의 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시하지 않는 한 동일성%에 대한 언급은 (1) 아미노산 조사용 blastp 및 핵산 조사용 blastn과 표준 디폴트 파라미터를 사용한 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 조사; 여기서, 의문(query) 서열은 디폴트에 의해 복잡성이 낮은 영역에 대해 필터링된다 (참조: Altschul, S. F. , Madden, T. L., Schaffer, A. A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다); (2) BLAST 2 정렬(하기 기재한 파라미터를 사용함); (3) 및/또는 표준 디폴트 파라미터를 사용한 PSI-BLAST(Position Specific Iterated BLAST)를 사용하여 수행하는 상동성 평가를 의미한다. BLAST 2.0 Basic BLAST와 BLAST 2 간에 표준 파라미터의 몇 가지 차이가 있기 때문에, BLAST 2 프로그램을 사용하는 경우에 2개의 특이적 서열이 유의적 상동성을 갖는 것으로 인정될 수 있는 반면에, 의문 서열로서 서열들 중 하나를 사용하여 BLAST 2.0 Basic BLAST으로 수행한 조사는 제 2 서열을 최상의 매치로서 식별하지 않을 수 있음이 주지된다. 또한, PSI-BLAST는 서열 상동체를 고찰하기 위한 민감한 방법으로서, 사용이 용이한 자동화 형태의 "프로필" 조사를 제공한다. 상기 프로그램은 먼저, 갭이 있는(gapped) BLAST 데이터베이스 조사를 수행한다. PSI-BLAST 프로그램은 다음 라운드의 데이터베이스 조사를 위해 의문 서열을 대신하게 되는 위치-특이적 스코어 행렬을 구축 하기 위해 복귀된 임의의 유의적 정렬로부터의 정보를 사용한다. 따라서, 동일성%는 이들 프로그램 중 어느 하나를 사용함으로써 측정할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
2개의 특이적 서열을 문헌[참조: Tatusova and Madden, (1999), "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250; 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다]에 기재된 바와 같이 BLAST2 서열을 사용하여 서로 정렬할 수 있다. 생성된 정렬에 갭(결실 및 삽입)의 도입을 허용하면서 상기 두 서열 간에 갭이 있는 BLAST 조사(BLAST 2.0)를 수행하기 위해 BLAST 2 서열 정렬은 BLAST 2.0 알고리듬을 사용하여 blastp 또는 blastn으로 수행한다. 본 발명에서 명료성의 목적상, BLAST 2 서열 정렬은 다음과 같은 표준 디폴트 파라미터를 사용하여 수행한다.
blastn의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:
매치에 대한 보상값=1
미스매치에 대한 패널티= -2
오픈 갭(5) 및 신장 갭(2) 페널티
갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(11) 필터(적용)
blastp의 경우, 다음의 0 BLOSUM62 행렬을 사용한다:
오픈 갭(11) 및 신장 갭(1) 페널티
갭 x_탈락값(50) 기대값(10) 단어 길이(3) 필터(적용).
본 발명에서 기술 및/또는 이용된 단백질은 대조 단백질의 아미노산 서열의 적어도 약 30개 이상의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 또한 포함할 수 있다(즉, 상기된 아미노산 서열들 중 임의의 서열의 30개의 인접한 아미노산 서열과 100% 동일성을 갖는 30개의 인접한 아미노산 잔기). 바람직한 양태에서, 본 발명에서 기술 및/또는 이용된 단백질은 대조 단백질의 아미노산 서열의 적어도 약 50개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 75개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 100개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 115개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 130개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 150개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 200개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 250개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 300개 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 350개 이상의 인접한 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 갖는 단백질을 포함한다. 한 양태에서, 그러한 단백질은 대조군 단백질의 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명에 있어서, 핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 이용된 용어 "인접한"또는 "연속적인"은 중단되지 않은 서열에서 연결된 것을 의미한다. 예를 들어 제 1 서열이 제 2서열의 30개의 인접한(또는 연속적인) 아미노산을 포함한다는 것은 상기 제 1 서열이 제 2서열의 중단되지 않는 30개 아미노산 잔기의 서열과 100% 동일한 중단되지 않은 30개 아미노산 잔기의 서열을 포함하는 것을 의미한다. 유사하게 제 1 서열이 제 2 서열과 100% 동일성은 갖는다는 것은 상기 제 1 서열과 제 2서열이 뉴클레오타이드 또는 아미노산 간의 갭(gap)없이 정확하게 일치한다는 것을 의미한다.
다른 양태에서, 상동체를 포함하여 본 발명에서 기술 또는 사용된 단백질은 천연적으로 발생한 단백질 아미노산 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는 것으로 상기 상동체를 암호화하는 핵산 서열이 (이하에서 언급되는) 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서 천연적으로 발생하는 단백질을 암호화는 핵산 분자(즉, 천연적으로 발생한 단백질을 암호화하는 핵산 가닥의 상보체)에(즉, ~와) 혼성화될 수 있다. 바람직하게는 주어진 상동체는 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서 야생형 또는 대조 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 상보체에 혼성화하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
대조 핵산 서열의 핵산 서열 상보체는 단백질을 암호화하는 가닥에 상보적인 핵산 가닥의 핵산 서열을 의미한다. 주어진 아미노산 서열을 암호화하는 이중 가닥 DNA는 단일 가닥 DNA와 상기 단일 가닥 DNA의 상보체인 서열을 갖는 상보적인 가닥을 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같이 본 발명의 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일가닥일 수 있으며 엄격한 조건에서 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 그 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 상보체와 안정한 혼성체를 형성하는 이러한 핵산 분자를 포함한다. 상보적 서열을 유추하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 아미노산 서열 분석 및 핵산 서열 분석 기술은 오류로부터 완전히 자유롭지 않기 때문에 본 발명에 나타낸 서열은 본 발명의 대조 단백질의 명백한 서열을 최대한 나타낸 것이다.
본 발명에서 혼성화 조건은 임의의 핵산 분자가 동일한 핵산 분자를 동정하기 위하여 이용될 수 있는 표준 혼성화 조건을 의미한다. 그러한 표준 조건은 예 를 들어, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Labs Press, 1989에 개시되어 있다. 상기 문헌 Sambrook et al.은 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다(특히 페이지 9.31-9.62 참조). 또한, 뉴클레오타이드의 부정합(mismatch) 정도를 다양화하는 혼성화를 달성하기에 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는 공식은 예를 들어 Meinkoth et al. 1984, Anal. Biochem. 138, 267-284에 개시되어 있다. 상기 문헌 Meinkoth et al.은 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다
보다 자세하게는 본 발명에서 기술된 온화한 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 70% 이상의 핵산 서열 동일성 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 의미한다(즉, 약 30% 이하의 뉴클레오타이드의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 20% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 본 발명에서 매우 높은 엄격한 혼성화 및 세정 조건은 혼성화 반응에서 프로브로 사용될 핵산 분자와 적어도 약 90% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 분자의 분리를 가능하게 하는 조건을 말한다(즉, 뉴클레오타이드의 약 10% 이하의 부정합을 가능하게 하는 조건). 앞서 기재된 바와 같이 당업자는 이러한 특정한 뉴클레오타이드 부정합 정도를 달성할 수 있는 적합한 혼성화 및 세정 조건을 계산하는데 Meinkoth et al.에 기술된 공식을 사용할 수 있다. 그러한 조건은 DNA:RNA 또는 DNA:DNA 혼 성체가 형성되는지에 따라 달라질 것이다. DNA:DNA 혼성체에 대하여 계산된 용융 온도는 DNA:RNA 혼성체 보다 10℃이하이다. 특정한 양태에서, DNA:DNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 적합한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na+)의 이온 강도로 약 20℃ 내지 약 35℃(낮은 엄격성), 보다 바람직하게는 약 28℃ 내지 약 40℃(높은 엄격성), 보다 더 바람직하게는 약 35℃ 내지 45℃의 온도(보다 높은 엄격성)에서의 혼성화를 포함한다. 특정 양태에서, DNA:RNA 혼성체에 대한 엄격한 혼성화 조건은 유사하게 엄격한 세정 조건을 포함하여 6X SSC(0.9M Na+)의 이온 강도로 약 30℃ 내지 약 45℃, 보다 바람직하게는 약 38℃ 내지 약 50℃, 보다 더 바람직하게는 약 45℃ 내지 55℃의 온도에서의 혼성화를 포함한다. 이러한 수치는 약 100개 이상의 뉴클레오타이드, 0% 포름아미드 및 약 40%의 G+C 함량의 분자에 대한 용융 온도의 계산에 기반을 둔다. 선택적으로 Tm은 위에서 인용된 Sambrook et al. 페이지 9.31 내지 9.62에 기술된 바에 따라 실험적으로 계산될 수도 있다. 일반적으로 세정 조건은 가능한 엄격해야 하고 선택된 혼성화 조건에 적합해야 할 것이다. 예를 들어, 혼성화 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 Tm 보다 약 20-25℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함할 수 있으며, 세정 조건은 염과 특정한 혼성체에 대하여 계산된 Tm 보다 약 12-20℃ 낮은 온도 조건의 조합을 포함한다. DNA:DNA 혼성체에 이용하기에 적합한 혼성화 조건의 한 예는 약 42℃에서의 6X SSC(50% 포름아미드)에서 2-24시간 혼성화하고 실온에서 약 2X SSC로 한 차례 이상 세정하고 이어서 더 높은 온도와 더 낮은 이온 강도에서 추가로 세정(예, 약 37℃에서 약 0.1X-0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정한 후 68℃에서 약 0.1X 내지 0.5X SSC로 적어도 한 차례 이상 세정)하는 세정 단계를 포함한다.
한 양태에서, 상동체는 천연 대립형질 변이 또는 천연 돌연변이의 결과물일 수 있다. 주어진 단백질의 상동체는 또한 본 발명에서 기술된 핵산 또는 아미노산 양으로 적어도 약간의 구조적 유사성(예, 적어도 약 35% 이상의 동일성)을 가지면서 다른 유기체로부터 유래된 실질적으로 동일한 기능을 갖는 자연적으로 발생한 단백질일 수 있다. 본 발명에 따른 상동체는 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질에 대한 직접적인 변형 또는 예를 들어 불규칙 또는 표적 돌연변이를 일으킬 수 있는 전통적 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 단백질을 암호화하는 유전자에 대한 변형을 포함하여 당업계에 알려진 기술을 사용해서 제조할 수 있다. 주어진 단백질을 암호화하는 핵산의 천연적으로 발생하는 대립형질 변이체는 주어진 단백질을 암호화하는 유전자와 게놈 상의 동일한 위치에 발생하지만, 예를 들어 돌연변이 또는 재조합에 의해 유발되는 천연적 변이로 인하여 유사하지만 동일하지 않은 서열을 갖는 유전자이다. 전형적으로 천연 대립형질 변이체는 비교되는 유전자에 의해 암호화된 단백질과 유사한 활성을 갖는 단백질을 암호화한다. 한 부류의 대립형질 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여 서로 다른 핵산 서열을 갖지만 동일한 단백질을 암호화할 수 있다. 대립형질 변이체는 유전자의 5' 및 3' 비해독 영역(예, 조절 제어 영역)에서의 변이를 또한 포함할 수 있다. 대립형질 변이체는 당업계에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 단백질 및/또는 상동체의 최소 크기는 한 측면에서 단백질의 목적한 생물학적 활성을 보유하기에 충분한 크기이다. 다른 양태에서, 본 발명에 따른 단백질은 적어도 약 30개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 50개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 75개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 100개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 115개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 130개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 150개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 200개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 250개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 300개 아미노산 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 350개 아미노산 이상이다. 그러한 단백질의 최대 크기에 있어서는 통상적인 제한 이외의 제한은 없어서, 단백질은 주어진 단백질의 일부분 또는 전장 단백질, 필요하다면, 여분의 추가 서열을 함유하는 단백질(예, 융합 단백질 서열)을 포함할 수 있다. 본 발명에서 이용하기 적합한 융합 절편은 이에 제한되는 것은 아니지만, 단백질의 안정성을 개선; 다른 바람직한 생물학적 활성(예, 제 2 효소 기능)을 제공 및/또는 (예, 친화 크로마토그래피에 의해) 단백질의 정제를 용이하게 할 수 있는 절편을 포함한다.
본 발명의 한 양태에서, 본 발명에서 기술된 임의의 아미노산 서열은 특정된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단 각각의 측면에 적어도 하나 내지 적어도 약 20개까지 추가 이형성 아미노산 서열이 위치하도록 제조될 수 있다. 이렇게 형성된 단백질 또는 폴리펩타이드는 특정한 아미노산 서열으로 "반드시 이루어진"이라고 기술될 수 있다. 본 발명에서 상기 이형성 아미노산 서열은 특정한 아미노산 서열 의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는), 특정한 아미노산 서열의 기능과 관련이 없거나, 천연적으로 발생하는 서열에서 그러한 뉴클레오타이드가 주어진 아미노산 서열이 유래되는 유기체의 표준 코돈 이용(usage)을 사용하여 해독되었다면 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 천연적으로 발생하는 핵산 서열 측면에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 암호화되지 않는 아미노산 서열이다. 유사하게, "반드시 이루어진"이라는 문구가 본 발명에서 핵산 서열과 관련되어서 사용되면 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'- 말단 각각에 적어도 하나 내지 약 60개까지 추가 이형성 뉴클레오타이드가 측면에 위치하는 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 의미한다. 이형성 뉴클레오타이드는 천연 유전자에서 발생함에 따라 특정한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 측면에 천연적으로 위치하지 않거나(즉, 천연 생체내에서 발견되지 않는) 단백질에 어떠한 추가 기능을 부여하거나 특정한 아미노산 서열을 갖는 단백질의 기능을 변화시키는 단백질을 암호화하지 않는다.
본 발명의 한 양태는 본 발명에서 기술된 아미노당 대사 경로에 관여하는 효소 또는 다른 단백질들을 암호화하는 핵산 분자의 이용 및/또는 조작을 포함한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 기술된 효소 또는 다른 단백질들 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함하거나, 핵산 서열로 반드시 이루어지거나 이루어진 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에서 분리된 핵산 분자는 그것의 천연 환경, 상기 핵산 분자가 천연 에서 위치하는 게놈 또는 염색체인 그것의 천연 환경(즉, 사람에 의해 조작된)으로부터 제거된 핵산 분자이다. "분리된"이란 핵산 분자가 정제된 정도까지를 나타내지 않지만, 상기 분자는 그 분자가 천연에서 위치한 전체 게놈 또는 전체 염색체를 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 분리된 핵산 분자는 본 발명에서 기술된 글루코사민-6-포스페이트 신타제 유전자와 같은 유전자를 포함할 수 있다. 유전자를 포함하는 분리된 핵산 분자는 상기 유전자를 포함하는 염색체의 단편이 아니라 상기 유전자와 관련된 코딩 영역과 조절 영역을 동일한 염색체 상에 천연적으로 위치하는 추가 유전자 없이 포함한다. 분리된 핵산 분자는 천연에서 특정된 핵산 서열의 측면에 정상적으로 위치하는 않는(즉, 이형성의 서열) 추가 핵산이 측면(즉, 서열의 5'및/또는 3'의 말단)에 위치하는 특정한 핵산 서열을 또한 포함할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 DNA, RNA(예, mRNA), 또는 DNA 또는 RNA 중 어느 하나의 유도체(예, cDNA)를 포함할 수 있다. "핵산 분자"는 일차적으로 물리적인 핵산 분자를 의미하는 것이고 "핵산 서열은"은 일차적으로 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것이지만, 상기 두 용어는 특히 단백질을 암호화할 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 서열이라는 관점에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 분리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술(예, 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭, 클로닝) 또는 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 분리된 핵산 분자는 천연의 핵산 분자 및 이에 제한되는 것은 아니지만 천연 대립형질 변이체 및 단백질의 생물학적 활성에 목적한 영향을 제공할 수 있는 방식으로 뉴클레오타이드가 삽입, 결실, 치환 및/또는 역위된 변형된 핵산 분자를 포함한다. 대립형질 변이체 및 단백질 상동체(예, 핵산 분자 상동체에 의해 암호화된 단백질)는 앞에서 기술되었다.
핵산 분자 상동체는 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 제조될 수 있다(예를 들어 상기 문헌 Sambrook et al. 참조). 예를 들어 핵산 분자는 이에 제한되는 것은 아니지만, 위치 지정 돌연변이, 핵산 분자에 돌연변이를 유발할 수 있는 화합물을 처리, 핵산 단편의 효소 처리에 의한 절단, 핵산 단편의 라이게이션, PCR 증폭 및/또는 핵산 서열의 선별된 영역의 돌연변이 유발, 올리고뉴클레오타이드 혼합물의 합성과 핵산 분자의 혼합체를 "세우기"위한 혼합군의 라이게이션 및 이들의 조합과 같은 전통적인 돌연변이 유발 기술 및 재조합 DNA 기술을 포함한 다양한 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 핵산 분자 상동체는 그 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질의 기능에 대하여 스크리닝 및/또는 야생형 유전자와의 혼성화에 의해 변형된 핵산의 혼합물로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 분자의 최소의 크기는 목적한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 암호화하기에 충분하거나 천연 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 상보적인 서열과 (예, 온화한, 높은 또는 매우 높은 엄격한 조건에서, 바람직하게는 매우 높은 엄격한 조건에서) 안정적 혼성체를 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브를 형성하기에 충분한 크기이다. 이와 같이 본 발명의 핵산 분자의 크기는 혼성화 조건 그 자체(예, 온도, 염농도 및 포름아미드 농도) 뿐만 아니라 핵산 분의 조성 및 핵산 분자와 상보적 서열간의 백분율 상동성 또는 동일성에 따라 달라질 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머 또는 프로브로서 이용되는 핵산 분자의 최소 크기는 일반적으로 GC가 풍부하다면 적어도 약 12 내지 약 15 뉴클레오타이드 이상이며 AT가 풍부하다면 적어도 약 15 지 약 18 염기이다. 본 발명에 따른 핵산 분자의 최대 크기에 대하여 통상적인 제한 이외의 제한은 없지만, 핵산 분자는 단백질을 암호화하는 서열의 일부분, 전장 단백질을 암호화하는 핵산 서열(완전한 유전자를 포함함)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 임의의 핵산 분자 특히 본 발명에서 기술된 핵산 분자들 중 어느 하나의 핵산 서열을 아는 것은 당업자에게 예를 들어 (a) 이러한 핵산 분자의 카피를 제조 및/또는 (b) 그러한 핵산 분자의 적어도 일부분을 포함하는 핵산 분자(예, 전장 유전자, 전장 코딩 영역, 조절 영역, 절단된 코딩 영역을 포함하는 핵산 분자)를 수득하게 해준다. 이러한 핵산 분자는 적합한 라이브러리 또는 DNA를 스크리닝하기 위하여 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하는 전통적인 클로닝 기술과 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 적합한 라이브러리 또는 DNA를 PCR 증폭하는 것을 포함한 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 스크리닝 또는 핵산 분자를 증폭하기에 적합한 라이브러리는 박테리아 및 효모 게놈 DNA 라이브러리, 특히 대장균의 게놈 DNA 라이브러리를 포함한다. 유전자를 클로닝하고 증폭하는 기술은 예를 들면 상기 문헌 Sambrook et al.에 개시되어 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명에서 기술한 아미노당 대사 경로에 관여하는 효소 또는 다른 단백질의 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자와 재조합 벡터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에 있어서, 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 조작하고 그러한 핵산 서열을 숙주 세포로 도입하는 도구로서 이용되도록 설계된(즉, 인위적으로 생산된) 핵산 분자이다. 따라서 재조합 벡터는 선택된 핵산 서열을 클로닝, 서열분석 및/또는 선택된 핵산 서열의 발현 및/또는 그러한 핵산 서열의 숙주 세포로 전달하여 재조합 세포를 형성하는 것과 같이 다른 조작에 이용하는데 적합하다. 그러한 벡터는 일반적으로 클로닝되고 전달되는 핵산 서열에 천연적으로 근접하여 위치하지 않는 핵산 서열인 이형성의 핵산 서열을 포함하지만, 상기 벡터는 또한 본 발명의 핵산 분자에 천연적으로 근접하여 위치하거나 (이하에서 자세히 기술되는) 본 발명의 핵산 분자의 발현에 유용한 조절 핵산 서열(예, 프로모터, 비해독 영역)을 포함할 수 있다. 벡터는 RNA 또는 DNA일 수 있으며 원핵생물 또는 진핵생물 유래일 수 있으며 일반적으로는 플라스미드이다. 벡터는 염색체외 성분(예, 플라스미드)으로서 유지되거나 재조합 유기체(예, 미생물 또는 식물)의 염색체로 통합될 수 있다. 전체 벡터는 숙주 세포내에 위치하거나 특정 조건에서는 본 발명의 핵산 분자를 남겨두면서 플라스미드 DNA가 결실될 수 있다. 통합된 핵산 분자는 염색체 프로모터의 조절하에 천연 또는 플라스미드 프로모터 조절하에 또는 몇몇 프로모터 조합의 조절하에 위치시킬 수 있다. 핵산 분자의 단일 또는 다수의 카피가 염색체내로 통합될 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 적어도 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자로 이용되는 재조합 벡터는 발현 벡터이다. 본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 암호화된 생산물(예, 대상 단백질)의 생산에 적합한 벡터를 의미한다. 이러한 양태에서, 생산될 생산물을 암호화 하는 핵산 서열은 재조합 벡터에 삽입되어 재조합 핵산 분자로 제조된다. 생산될 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 재조합 숙주 세포내에서 상기 핵산 서열의 전사 및 해독을 가능하게 하는 벡터의 조절 서열에 상기 핵산 서열을 작동가능하게 연결시키는 방식으로 벡터에 삽입할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명에 따른 재조합 핵산 분자로 이용되는 재조합 벡터는 표적화 벡터이다. 본 발명에서 용어 "표적화 벡터"는 재조합 숙주 세포 내로 특정 핵산 분자를 전달하는데 이용되는 벡터를 의미하는 것으로 상기 핵산 분자는 숙주 세포 또는 미생물 내에서 내인성 유전자를 결실 또는 불활성화시키는데 이용된다(즉, 표적 유전자의 파괴 또는 녹아웃 기술에서 이용되는). 이러한 벡터는 당업계에 또한 "녹-아웃"벡터로서 알려져 있다. 이러한 양태의 한 측면에서, 벡터의 일부분, 보다 일반적으로는 벡터에 삽입된 핵산 분자(즉, 삽입물)는 숙주 세포내 표적 유전자(즉, 결실 또는 불활성화되도록 표적화된 유전자)의 핵산 서열과 상동성인 핵산서열을 갖는다. 벡터 삽입물의 핵산 서열은 표적 유전자와 결합하도록 설계되어 표적 유전자와 삽입물간의 상동성 재조합이 일어나서 그에 의하여 (즉, 돌연변이 또는 결실된 내인성 표적 유전자의 적어도 일부분에 의해) 내인성 표적 유전자가 결실, 불활성 또는 약화된다.
일반적으로 재조합 핵산 분자는 전사 조절 서열 및 해독 조절 서열을 포함한 하나 이상의 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 적어도 하나 이상의 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함한다. 본 발명에서 용어 "재조합 분자"또는 "재조합 핵산 분자"는 일차적으로 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산 분자 또는 핵산 서열을 의미하는 것이지만, 그러한 핵산 분자가 본 발명에서 기술된 바와 같이 재조합 분자일 때에는 용어 "핵산 분자"와 상호교환적으로 이용될 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 분자가 숙주 세포로 형질감염(즉, 형질전환, 형질도입, 형질감염, 접합 또는 전도)되었을 때 발현될 수 있는 방식으로 발현 조절 서열(예, 전사 조절 서열 및/또는 해독 조절 서열)에 연결된 것을 의미한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 또는 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 것이다. 적합한 전사 조절 서열은 재조합 핵산 분자가 도입된 숙주 세포 또는 유기체에서 기능을 발휘할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 핵산 분자는 재조합 세포에 적합한 해독 조절 서열, 복제 개시점 및 다른 조절 서열과 같은 추가의 조절 서열을 또한 포함할 수 있다. 한 양태에서, 숙주 세포 염색체로 통합된 재조합 분자를 포함하여 본 발명에 따른 재조합 분자는 발현된 단백질을 생산한 세포로부터 분리되도록 하는 분비 신호(즉, 신호 단편 핵산 서열)를 또한 포함한다. 적합한 신호 절편은 발현될 단백질과 천연적으로 연관된 신호 절편 또는 본 발명에 따른 단백질의 분비를 유도할 수 있는 임의의 이형성 신호 절편을 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명의 재조합 분자는 발현된 단백질이 숙주 세포막에 전달 및 삽입되도록 하는 리더 서열을 포함한다. 적합한 리더 서열은 단백질과 천연적으로 연관된 리더 서열 또는 세포막으로 단백질의 전달 및 삽입을 유도할 수 있는 임의의 이형성 리더 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 "형질감염"은 외인성 핵산 분자(즉, 재조합 핵산 분자)를 세포내로 삽입할 수 있는 임의의 방법을 의미한다. 용어 "형질전환"은 이 용어가 핵산 분자를 조류, 박테리아 및 효소와 같은 미생물 또는 식물 세포로 도입하는데 이용할 경우 용어 "형질감염"과 상호교환적으로 이용될 수 있다. 미생물 시스템 및 식물 시스템에서 용어 "형질전환"은 미생물 또는 식물에 의한 외인성 유전자의 습득으로 인한 유전되는 변화를 설명하는데 이용되며 "형질감염"과 본질적으로 같은 의미이다. 따라서 형질감염 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 형질전환, 세포의 화학적 처리, 입자 사격(particle bombardment), 전기천공, 미세주입, 리포펙션(lipofection), 흡수, 감염 및 원형질체 융합을 포함한다.
재조합 세포는 박테리아 또는 효모 세포(즉, 숙주 세포)를 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함하는 발현 벡터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 재조합 분자로 형질전환하여 제조된다. 용어 작동가능하게 연결된 이란 핵산 분자가 숙주 세포로 형질전환되었을 때 발현될 수 있는 방식으로 발현 벡터로 삽입되는 것을 의미한다. 본 발명에서 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환할 수 있고 특정한 핵산 분자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 바람직하게는 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 또한 복제할 수 있는 것이다. 본 발명에서 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드이다. 본 발명의 발현 벡터는 효모 숙주 세포 또는 박테리아 숙주 세포, 바람직하게는 대장균 숙주 세포 내에서 기능(즉, 직접적인 유전자 발현)을 발휘하는 임의의 벡터를 포함한다. 본 발명의 바람직한 재조합 세포는 실시예 부문에서 기술된다.
본 발명의 핵산 분자는 전사 조절 서열, 해독 조절 서열, 복제 개시점과 같은 조절 서열 및 재조합 세포에 적합하고 본 발명에 따른 핵산 분자의 발현을 조절하는 다른 조절 서열을 포함하는 발현 벡터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특히, 본 발명의 재조합 분자는 전사 조절 서열을 포함한다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터 및 리프레서 서열과 같은 전사 개시를 조절하는 서열이다. 적합한 전사 조절 서열은 효모 또는 박테리아 바람직하게는 대장균에서 기능을 발휘할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 다양한 그러한 전사 조절 서열이 당업계에 알려져 있다.
본 발명에 기술된 다양한 효소 및 단백질(이들의 상동체를 포함하여)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자는 인위적 프로모터에 의해 조절되도록 클로닝할 수 있다. 프로모터는 생산 유기체에서 충분한 양의 암호화된 단백질을 유지하는데 요구되는 유전자의 발현 정도를 제공할 임의의 적합한 프로모터일 수 있다. 적합한 프로모터는 (락토오스, 갈락토오스, 말토오스 및 염과 같은) 다른 화합물에 의해 또는 (온도와 같은) 성장 조건의 변화에 의해 유도될 수 있다. 유도적 프로모터의 이용은 유전자 발현 및 발효 공정의 최적의 수행으로 이어질 수 있다. 바람직한 프로모터는 값비싼 유도 인자를 첨가할 필요가 없는 구성적 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터는 약하고 돌연변이된 리프레서 유전자의 이용과 같은 유전적 변형에 의해 기능적으로 구성적 또는 "누출되는" 정상적으로 유도되는 프로모터를 포함할 수 있다. 사용하기에 특히 바람직한 프로모터는 lac, P L 및 T7이다. 유전자 양(카피 수)은 최대의 생산물 형성을 위해 요구되는 것들에 따라 달라질 수 있다. 한 양태에서, 재조합 유전자는 숙주 게놈내로 통합된다.
재조합 DNA 기술의 이용은 예를 들어 숙주 세포내에서 핵산 분자의 카피 개수, 이 핵산 분자가 전사될 효율, 이렇게 형성된 전사체가 해독될 효율 및 해독 후 수식 효율을 조작함으로써 형질전환된 핵산 분자의 발현을 증진시킬 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 서열의 발현을 증가시키는데 유용한 재조합 기술은 이에 제한되는 것은 아니지만, 높은 카피 수를 갖는 플라스미드에 핵산 분자를 작동가능하게 연결, 핵산 분자를 숙주 세포 염색체에 통합, 플라스미드에 벡터 안정성 서열의 추가, 전사 조절 신호(예, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변형, 전사 조절 신호의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 이용에 상응하도록 본 발명에 따른 핵산 분자의 변형, 전사체를 불안정하게 하는 서열의 결실 및 발효 중에 재조합 효소의 생산으로부터 재조합 세포 성장을 일시적으로 분리하는 조절 신호의 이용을 포함한다. 본 발명의 발현된 재조합 단백질의 활성은 그러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 단편화, 변형 또는 유도함으로써 증진될 수 있다. 그러한 변형은 실시예 부문에서 상세히 설명된다.
본 발명에 따른 하나 이상의 재조합 분자는 본 발명의 암호화된 생산물을 생산하기 위하여 이용될 수 있다. 한 양태에서, 암호화된 생산물은 단백질을 생산하기에 효율적인 조건에서 본 발명에서 기술된 바와 같이 핵산 분자를 발현함으로써 제조할 수 있다. 암호화된 단백질을 생산하기 위한 바람직한 방법은 숙주 세포를 하나 이상의 재조합 분자로 형질감염시켜서 재조합 세포를 형성하는 것이다. 적합한 세포는 임의의 미생물(예, 숙주 세포 또는 생산 유기체)이고 미생물(예, 박테리아, 원생생물, 조류, 곰팡이 또는 다른 미생물)이며 가장 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 곰팡이이다. 적합한 박테리아 속(genera)에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)이다. 적합한 박테리아 종(species)은 이에 제한되는 것은 아니지만, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)를 포함하다. 적합한 효모 속은 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 파피아(Phaffia)를 포함한다. 적합한 효모 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로마이세스 세레비시애(Sacchromyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosacchromyces pombe), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 카나덴시스(P. canadensis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 파피라 로도지마(Phaffia rhodozyma)를 포함한다. 적합한 곰팡이 속은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼질러스(Aspergillus), 압시디아(Absidia), 리조푸스(Rhizopus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 뉴로스포라(Neurospora) 및 트리코더마(Trichoderma)를 포함한다. 적합한 곰팡이 종은 이에 제한되는 것은 아니지만, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘란스(A. nidulans), 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 크리소스포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인터메디아(N. intermedia) 및 트리코덤 레세이(Trichoderm reesei)를 포함한다. 숙주세포는 형질전환되지 않은 세포 또는 적어도 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 이미 형질전환된 세포일 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 본 발명에서 기술된 유전적으로 변형된 미생물 및 실시예에서 특정하게 동정된 미생물을 동정하는 특성을 갖는 미생물을 포함한다. 상기 특성을 동정하는 것은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산하는 능력을 포함하여 실시예에서 미생물의 임의의 또는 모든 유전형 및/또는 표현형 특성을 포함할 수 있다.
상기된 바와 같이 본 발명에 따른 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조방법은 유전적으로 변형된 아미노당 대사 경로를 갖는 미생물을 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 제조를 위한 발효 배지에서 배양한다. 적합하거나 효율적인 발효 배지는 본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물이 배양되었을 때 글루코사민 및/또는 N-아세틸글코사민을 제조할 수 있는 임의의 배지를 의미한다. 그러한 배지는 일반적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 포스페이트 원을 포함하는 수용성 배지이다. 그러한 배지는 또한 적합한 염, 미네랄, 금속 및 다른 영양소를 포함할 수 있다. 본 발명에서 기술된 미생물에 대한 유전적 변형의 한 장점은 유전적 변형은 아미노당 대사를 상당히 변이시킴에도 불구하고 생산 유기체에 어떠한 영양소 요구조건을 생성하지 않는다는 것이다. 따라서 단일 탄소원으로 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 글리세롤 또는 둘 이상의 상이한 화합물의 혼합물을 포함하는 최소-염 함유 배지가 발효 배지로서 바람직하게 이용된다. 최소-염-글루코오스 함유 배지의 이용은 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 발효를 위한 가장 바람직한 배지이고 또한 생산물의 회수 및 정제를 용이하게 할 것이다. 한 측면에서, 효모 추출물이 이 배지의 성분이다.
본 발명의 미생물은 통상적인 발효 생물반응기에서 배양될 수도 있다. 미생물은 이에 제한되는 것은 아니지만 회분식, 유가식, 세포 재순환 및 연속식 발효를 포함한 임의의 발효 공정에 의해 배양될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 회분식 또는 유가식 발효 공정에 의해 성장시킨다.
본 발명의 한 양태에서는 접종 전에 발효 배지를 적합한 온도, 일반적으로 약 20℃ 내지 약 45℃, 바람직하게는 약 25℃ 내지 약 45℃, 또는 약 25℃ 내지 약 40℃, 또는 약 25℃ 내지 약 37℃ 목적한 온도까지 데운다. 몇몇 양태에서 약 30℃ 내지 37℃가 더 바람직하다. 발효 조건은 본 발명의 미생물을 약 20℃ 내지 약 40℃에 속하는 모든 증가분(즉, 21℃, 22℃ 등)의 온도에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 미생물의 성장 및 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사 민 생산에 최적인 온도는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어 미생물의 재조합 핵산 분자의 발현을 위한 특정 프로모터의 선별은 최적의 배양 온도에 영향을 미칠 수 있다. 당업자는 본 발명에 따른 임의의 미생물의 최적의 성장 및 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산 온도는 본 발명에 따른 미생물에 대하여 실시예에서 기술된 바와 같은 표준 기술을 사용함으로써 용이하게 결정될 수 있다.
배지는 적절한 성장 기간 후 높은 세포 밀도를 생산하기에 충분한 양의 활발하게 성장하는 유전적으로 변형된 미생물의 배양액으로 접종한다. 상기 세포는 적어도 약 10g/l, 바람직하게는 약 10g/l 내지 약 40g/l, 보다 바람직하게는 적어도 약 40g/l의 세포 밀도로 성장시킨다. 이러한 공정은 일반적으로 약 10-60시간을 요구한다.
충분한 산소가 초기 세포 성장 동안 세포 성장을 유지하고 대사 및 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산을 유지할 수 있도록 발효 과정 중에 배지에 첨가되어야 한다. 산소는 배지의 교반 및 통기에 의해 용이하게 제공된다. 교반 및 쉐이킹과 같은 전통적 방법이 배지를 교반하고 통기하는데 이용될 수 있다. 배지에서의 바람직한 산소 농도는 포화 값(즉, 약 30-40℃ 및 대기압에서 배지 중 산소의 용해도)의 15% 이상, 보다 바람직하게는 포화 값의 20% 이상이지만, 발효에 역으로 작용하지 않는다면, 더 낮은 농도로의 이탈이 일어날 수 있다. 또한 생산 공정 중 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 안정성 및 형성을 개선하려면 산소 양은 발효 공정 중에 임의의 적절한 시간 동안에는 매우 낮은 양에 도달할 수 있어야 한다. 배지의 산소 농도는 산소 전극과 같은 전통적 방법에 의해 모니터링될 수 있다. 희석되지 않은 산소 기체 및 질소 이외의 불활성화 기체로 희석된 산소 기체와 같은 다른 산소원들이 이용될 수 있다.
바람직한 양태로 대장균에서 발효에 의한 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산은 단일 탄소원으로 글루코오스를 사용하는 것에 기반을 두기 때문에 PEP:글루코오스 PTS가 유도될 것이다. 따라서 PEP:만노스 PTS의 기능성 EIM,P/IIIMan이 배제된 상태에서도 (예, manXYZ 돌연변이를 갖는 대장균에서) 생산물인 글루코사민은 유도된 글루코오스 운반 시스템을 통하여 세포에 의해 섭취될 것이다. 그러나 과량의 글루코오스 존재하에서 글루코사민의 섭취가 상당히 억제된다. 따라서 본 발명의 한 양태는 발효 생물반응기에서 과량의 글루코오스를 유지함으로써 글루코사민 생산물의 섭취를 방지하는 것이다. 본 발명에서 "과량의" 글루코오스는 앞서 기술된 배양 조건과 같은 정상적 조건에서 미생물의 성장을 유지하는데 요구되는 글루코오스 양 이상을 의미한다.
바람직하게는 글루코오스의 농도는 발효 배지의 약 0.05% 내지 약 15% 중량/부피의 농도로 유지한다. 다른 양태에서, 글루코오스 농도는 발효 배지의 약 0.5g/L 내지 약 150g/L, 보다 더 바람직하게는 발효 배지의 약 5g/L 내지 약 100g/L, 보다 더 바람직하게는 5g/L 내지 약 20g/L의 농도로 유지한다. 한 양태에서, 발효 배지의 글루코오스 농도는 임의의 적합한 방법(예, 글루코오스 테스트 스트립을 이용함)에 의해 모니터링하고 글루코오스가 고갈되거나 거의 고갈되었을 때 추가의 글루코오스를 배지에 첨가할 수 있다. 다른 양태에서, 글루코오스 농도는 발효 배지의 반연속적(semi-continuous) 또는 연속적 투입에 의해 유지된다. 글루코오스에 대하여 기술된 파라미터는 본 발명의 발효 배지에서 이용된 임의의 탄소원에도 적용될 수 있다. 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산 공정을 개선시키려면 탄소원은 발효 중 적절한 시간 동안 검출할 수 없는 정도의 양에 도달할 수 있어야 한다. 본 발명의 발효 방법에서 이용될 수 있는 다른 탄소원은 이에 제한되는 것은 아니지만 프룩토오스, 오탄당, 락토오스 및 글루콘산을 포함한다. 오탄당은 이에 제한되는 것은 아니지만, 리보오스, 크실로오스 및 아라비노스를 포함한다. 한 측면에서, 배양 단계는 글루코오스 및 리보오스를 포함하는 발효 배지에서 수행한다.
본 발명의 추가 양태는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산 및 안정성을 유지 및/또는 개선시키는데 필수적인 발효 배지의 기타 성분 및 파라미터를 보충 및/또는 조절하는 것이다. 예를 들어 한 양태에서, 발효 배지는 암모늄 술페이트를 포함하며, 배양 배지 중 암모늄 술페이트의 농도는 과량의 암모늄 술페이트 첨가에 의해 보충된다. 바람직하게는 암모늄 술페이트의 농도는 발효 배지 중 적어도 약 0.1% 내지 약 1%(중량/부피) 및 바람직하게는 약 0.5%의 정도로 유지한다. 또 다른 양태에서, 발효 배지의 pH는 pH변동 여부에 대해 모니터링한다. 본 발명의 발효 방법에서, pH는 약 pH 4.0 내지 pH 8.0의 pH, 한 측면에서 약 pH 4.0 내지 pH 7.5의 pH, 다른 측면에서 약 pH 6.7 내지 pH 7.5의 pH를 유지하는 것이 바람직하고 다른 양태에서 약 pH 4.5 내지 pH 5의 pH를 유지하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태는 앞서 기술되었지만, 발효 공정은 pH 4 내지 pH 8 이내에 속 하는 0.1 씩의 증가분(즉, pH 4.1, pH 4.2, pH 4.3 등)의 pH에서 수행될 수 있다. 본 발명의 한 방법에서, 발효 배지의 개시 pH가 pH 7.0이라면 예를 들어 발효 배지의 pH가 pH 7.0으로부터 상당한 차이를 나타내는지 모니터링하고 그에 따라 예를 들어 수산화나트륨의 첨가에 의해 조정한다. 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 안정성 및 형성 효율을 위한 최적의 pH는 세포 성장을 위한 최적의 pH와 상이할 수 있기 때문에 두 단계(또는 그 이상의)의 프로토콜이 이용될 수 있다. 그러한 프로토콜에서 세포는 먼저 균체의 빠른 생산을 위한 최적의 pH에서 먼저 성장시키고 그 다음 상이한 pH를 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 분해를 최소화하면서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 합성을 최대화하는데 이용한다.
본 발명의 추가 양태는 아세테이트 생산으로부터 독성이 적은 부산물의 생산으로 탄소 유입을 전환하는 것이다. 이러한 방법에 의하여 발효 배지 중 과량의 글루코오스와 관련하여 일어날 수 있는 독성 문제는 피할 수 있다. 아세테이트 생산으로부터 탄소 유입을 전환하는 방법은 당업계에 알려져 있다.
본 발명의 회분식, 유가식 및/또는 연속식 발효 공정에서 발효는 세포외의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 축적에 의해 확인될 수 있는 바에 따라 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 형성이 본질적으로 중단될 때까지 지속한다. 총 발효 시간은 일반적으로 약 40 내지 약 60시간이고 바람직하게는 약 48시간이다. 연속식 발효 공정에서, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민은 배지에서 축적되는 대로 생물반응기로부터 제거될 수 있다. 본 발명의 이러한 방법은 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민; 또는 세포외의 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민을 포함하는 생산물의 생산으로 이어진다.
글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 합성을 위하여 상이한 유전자들이 대장균 pET 발현 시스템을 사용하여 과잉 발현되었다. 유전자 발현은 IPTG 및 락토오스에 의해 유도될 수 있다. IPTG의 가격이 글루코사민 제조를 상당히 비싸게 만들 수 있다. 따라서 IPTG의 이용은 이상적으로 발효공정으로부터 제거되어야 할 것이다. 락토오스는 상대적으로 저렴하고 방대한 규모의 생산 공정에서 이용될 수 있다. 락토오스에 의한 유도를 위해서 락토오스는 먼저 세포의 β-갈락토시다제에 의해 실질적 유도 인자인 알로락토오스로 전환될 필요가 있다. 2123-54와 같은 글루코사민 생산 균주에 있어서, 이 균주는 β-갈락토시다제 음성이므로 유도 인자로서 락토오스가 이용될 수 없다. 이는 lacZ 유전자 위치에 T7-glmS*54 발현 카세트를 삽입함으로 인하여 상기 유전자의 결실 및 파괴 때문이다.
원칙적으로 몇몇 서로 다른 방법들이 IPTG에 대한 의존성을 제거하기 위해서 사용될 수 있다. 본 발명에서 예시된 한 방식은 lacZ 유전자를 복원하는 것이다. 이는 염색체 상에서 lacZ 이외의 다른 위치에 T7-glmS*54 발현 카세트를 통합함으로써 달성된다.
galK 위치로의 통합은 lacZ 유전자를 온전하게 남겨둘 것이다. Lac+ 균주는 IPTG 보다 훨씬 저렴한 락토오스에 의해 잠재적으로 유도될 수 있다. 통합 균주가 또한 Gal-일 수 있기 때문에 galK 위치가 T7-glmS*54 발현 카세트의 통합을 위하여 선택되었다. 그러한 균주에서 갈락토오스가 lac 프로모터에 대한 유도 인자로서 이용될 수 있음이 보고되었다. 따라서 알로락토오스에 의한 유도에 추가하여 락토오스 가수분해에 의해 생성되는 갈락토오스가 추가로 유도를 개선시킬 수 있다. 이는 최적 미달 (sub-optimal) 양의 락토오스가 글루코사민 생산 공정에서 이용될 때 이로울 것이다. 통합은 삽입이 세포 성장 및 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민 생산에 어떤 부정적 영향을 유발하지 않는 임의의 다른 위치에서 또한 일어날 수 있다.
락토오스 유도는 글루코오스 억제의 적용을 받는다. 글루코사민 생산은 배지에 많은 양의 글루코오스가 존재할 때에는 일어나지 않았다. 그러나 일단 글루코오스가 소비되면 락토오스가 이용되고 글루코사민 생산이 유도되었다. 글루코오스 대 락토오스의 비율은 효소 발현 및 글루코사민 /N-아세틸글루코사민 생산에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 글루코오스의 억제는 천연 lac 오페론을 억제하여 일어난다. 글루코오스가 존재하면 락토오스 트랜스포터(LacY) 및 β-갈락토시다제(LacZ)의 합성은 억제되어서 T7 RNA 폴리머라제의 유도를 위한 유도 인자 분자(알로락토오스 및 갈락토오스)가 거의 생산되지 않았다. 글루코오스 억제에 대한 자세한 메커니즘은 여전히 연구중이다. 글루코오스의 억제는 두 가지 레벨에서 작용하는 것으로 나타난다. 억제의 한 레벨은 lac 프로모터 서열에 대한 cAMP에 의해 매개되는 작용을 통해서이다. 다른 레벨은 글루코오스 트랜스포터 단백질 즉, (crr 유전자에 의해 암호화된) 효소 IIAGlc 및 (ptsG 유전자에 의해 암호화된) IICBGlc에 의해 유발되는 락토오스 섭취의 억제를 통해서이다. lacUV5 프로모터는 글루코오스 억제에 민감하지 않지만 락토오스(유도 인자)의 세포내 유입의 배제는 유도를 억제한다.
글루코오스 억제는 최적화된 성장 및 유도 프로토콜을 사용함으로써 최소화될 수 있다. 서로 다른 유전적 변형이 또한 글루코오스 억제를 최소화하기 위하여 또한 도입될 수 있다. 한 방식은 lac 오페론에 있는 천연의 lac 프로모터를 글루코오스에 의해 억제되지 않을 것으로 여겨진 lacUV5 프로모터로 대체하는 것이었다. 글루코오스 억제는 crr 유전자의 유전적 변형에 의해 또한 최소화될 수 있었다. 다른 방식은 lacI 리프레서 유전자들 중 어느 하나를 결실하는 것이었다. 몇몇 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민 생산 대장균 균주에서, 천연의 lac 오페론 및 DE3 요소(element)에 각각 두 개 카피의 lacI 리프레서 유전자가 있다. 상기 lacI 유전자들 중 어느 하나의 결실은 글루코오스 억제 대한 내성과 글루코사민/N-아세틸글루코사민 생산을 증가시킨다. 락토오스는 lacY에 의해 암호화된 락토오스 퍼미아제를 통하여 세포내로 운반되기 때문에 락토오스 유도는 lacY 과잉 발현에 의해 영향을 받을 수 있다.
글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 양은 합성 속도 뿐만 아니라 세포의 대사 및 생산물이 발효 조건에서 안정적이지 않다면 분해에 의해서도 결정된다. 본 발명에서 기술된 바와 같이 글루코사민은 대장균 성장에 이용되는 통상적인 pH 범위에 매우 불안정한 것으로 확인되었다. 글루코사민 및/또는 이들의 분해 산물은 또한 균주 7107-18에 독성을 일으킨다. 독성은 20gl-의 낮은 글루코사민 농도가 세포 접종 이전에 3.5시간 동안 배지(pH 7.0)로 전 배양되었을 때 조차도 관찰되었다. 독성은 pH 7.0으로 개시하는 배지에서 적어도 부분적으로는 GlcN 분해 산물 때문이었다. GlcN은 낮은 pH에서 더욱 안정하며, 글루코사민은 pH 4.7이하에서는 분해되지 않는다.
경제적인 공정을 개발하기 위하여 글루코사민 합성은 생산물의 분해가 최소화됨과 동시에 최대화되어야 한다. 또한, 상대적으로 낮은 pH에서 작동하는 발효기에서 GlcN 생산 프로토콜은 합성된 GlcN을 보존할 수 있을 뿐만 아니라 이러한 공정은 또한 독성 분해 산물의 농도를 감소시킴으로써 세포를 보호할 수 있다. 이러한 장점은 이러한 방식으로 성장하는 세포의 감소된 성장 속도 및 대사 활성을 보충할 것이다. 계속된 GlcN 합성은 세포에서의 지속적인 에너지 생성을 요구하며, 이러한 낮은 pH에서 느리게 성장하는 세포는 요구되는 충분한 에너지를 생성하지 못할 수 있다.
일반적으로 대장균은 6-7 보다 낮은 pH에서 느리게 성장한다. 낮은 pH에서 증진된 성장 특성을 나타내는 대장균 돌연변이체를 분리하는 것이 유용할 수 있다. 선택적으로 개선된 글루코사민 합성 경로는 낮은 pH 조건에서 정상적으로 성장할 수 있는 다른 박테리아 및 효모 종에서 설계될 수 있다. 예를 들어 사카로마이세스 세레비시애는 pH 4 내지 5에서 최적으로 성장한다.
신규한 전략이 생산물 분해 문제를 극복하기 위하여 개발되었다. 대장균에서의 글루코사민 합성 경로를 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트의 합성으로 이어지는 글루코사민-6-P N-아세틸트랜스퍼라제(GNA1)의 과잉 발현에 의해 확장하였다. 이러한 균주로 N-아세틸글루코사민-6-P가 생산되었고 N-아세틸글루코사민으로서 배지에 효과적으로 분비되는 것이 증명되었다. N-아세틸글루코사민은 다양한 범위의 pH 및 온도에서 매우 안정적이다. 이러한 생산물은 약산 조건을 이용하여 용이하게 글루코사민으로 다시 전환할 수 있다. 이러한 전략을 이용함으로써 N-아세틸글루코사민의 역가는 글루코사민 생산 균주보다 몇 배 높게 증가하였다. N-아세틸글루코사민이 또한 최종 생산물로서 회수되었다.
몇몇 인자들이 간단한 미네랄 배지에서 높은 역가의 N-아세틸글루코사민 생산에 영향을 미칠 수 있다. 첫 번째 인자는 N-아세틸글루코사민의 안정성이다. 이는 생산물을 저장하는 것 뿐만 아니라 글루코사민 분해 산물의 독성 효과를 피하는 것이다. 두 번째로 N-아세틸화 단계는 경로를 이러한 목적으로 유도하는 강력한 힘으로써 작용한다. NagB 효소는 GlmS 및 GNA1 효소의 부재에서 과잉 발현되면 세포 생존 및 성장에 충분한 정도의 아미노당을 제공하는 기능만을 수행한다. GLNA1 효소가 NagB와 함께 동시 발현되면 이 경로에서 아세틸화 반응의 추진력을 보여주면서 다양한 그램 양의 N-아세틸글루코사민의 생산으로 이어진다. 세 번째로 N-아세틸글루코사민의 합성은 아세틸기의 공여자로서 아세틸-CoA를 이용한다. 이는 세포에 대한 일종의 대사적 부담으로 여겨짐에도 불구하고 이는 아세테이트 형성을 억제하는 작용을 하고 결국 세포 배양물에 아세테이트 축적에 의해 유발되 는 부정적인 효과를 방지한다. 아세테이트 형성은 아세테이트 합성에 관여하는 효소의 유전적 변형에 의해 또한 최소화될 수 있다.
NagB 및 GNA1의 조합은 프룩토오스-6-P로부터 N-아세틸글루코사민-6-P로의 경로를 제공한다. 기질로서 글루타민과 프룩토오스-6-P를 사용하는 GlmS와 달리 NagB 효소는 암모늄의 N-아세틸글루코사민-6-P로의 직접적인 암모늄 동화를 촉매한다. 또한, NagB 단백질은 약 30kDa으로 Glms 단백질(약 70kDa)보다 훨씬 작다. 대장균에서 과잉 발현되었을 때 GlmS 단백질과 비교하여 NagB 단백질의 더 많은 부분이 수용성 단백질 분획에 속하는 것을 확인하였다.
GlmS 효소는 일반적으로 생산물에 의한 강력한 억제 작용을 받는다. 생산물에 대한 저항성 GlmS 효소의 이용은 글루코사민의 역가를 높이고 또한 N-아세틸글루코사민의 역가를 높이는데 중요한 역할을 담당한다. 생산물에 대한 저항성 GlmS 돌연변이체는 생체외 돌연변이 유발에 의해 생산될 수 있다. 그러한 돌연변이체는 천연으로부터 또한 분리될 수 있다. 이는 천연 바실러스 섭틸리스 GlmS의 생산물에 대한 저항성을 보여줌으로써 예시되었다.
다음은 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 최적의 생산을 위한 예시적 프로토콜이다. 이는 본 발명의 몇몇 작동가능하고 바람직한 양태의 일부 예시이며 본 발명의 유일한 양태로서 해석되지 않아야 한다. 플라스크 배양 및 발효조 배양 모두를 위한 몇몇 바람직한 발효 프로토콜 및 발효 공정의 파라미터가 실시예 부문에서 상세히 기술된다.
다음은 본 발명에 따른 락토오스에 의해 유도되는 글루코사민 발효 공정에 대한 통상적인 프로토콜을 설명한다.
균주: 재조합 대장균
유도: 세포 밀도가 10g/L에 도달한 후에 30g/L 락토오스를 첨가한다(약 35% 의 투입량은 10시간에 걸쳐서 점차적으로 줄여서 첨가한다). 글루코 오스 투입은 글루코오스 억제를 방지하기 위하여 이 과정 중에서는 보 류한다. 락토오스를 모두 첨가한 이후에 글루코오스 투입을 다시 개 시한다.
투입: 5㎍ FeSO4-7H2O/글루코오스 및 0.33㎍ MnSO4-H2O/g 글루코오스를 함유하 는 50% 글루코오스로, 이 글루코오스는 제한 농도로 투입한다.
발효 시간 : 72시간
발효 모드: 요구된 바대로 첨가된 50% 글루코오스로 유가식 배양하며 글루코 오스의 제한 농도를 유지한다
접종물 : 부피로 5%
pH : 성장 중에는 6.9, 그 다음 유도 후에는 6.7이며 10N NH4OH에 의해 조절 함
온도 : 30℃에서 유도 후에 25℃로 전환함
산소 : 20% 이상의 O2를 용해하고 교반에 의해 제어함
통기 : 0.5 내지 1vvm
배지
배지 성분 및 이들의 농도
성분 농도
KH2PO4 14gl-
K2HPO4 16gl-
Na3-시트레이트 1gl-
(NH4)2SO4 5gl-
CaCl2-H2O 0.05gl-
MgSO4-7H2O 0.6gl-
FeSO4-7H2O 3mgl-
ZnSO4-7H2O 3.8mgl-
MnSO4-H2O 0.33mgl-
CuSO4-5H2O 0.1mgl-
NaMoO4-2H2O 0.1mgl-
H3BO3 01.mgl-
CoCl2-6H2O 0.1mgl-
글루코오스 필요한 바에 따라 >200gl-
Mazu 204 defoamer 0.25gl-
상기 배지에서 (점진적으로 추가되는) 글루코오스 및 (멸균 후에 첨가되는) Fe, Zn, Mn, Cu, B, Mo, Co 미량 원소를 제외한 모든 성분들은 멸균 전에 첨가한다.
다음은 본 발명에 따른 N-아세틸글루코사민 발효 공정에 대한 통상적인 프로토콜을 설명한다.
균주: 재조합 대장균
유도: 세포 밀도가 15 내지 20gl-에 도달한 후에 5 내지 10gl- 락토오스를 한 차례 첨가한다. 글루코오스 투입은 상기 과정 중에 보류되지 않으며, (초기 부피를 기초로) 6.5gl-1hr-1로 일정하게 유지되도록 한다.
투입: 어떤 변형도 포함하지 않는 65% 글루코오스로, 이 글루코오스는 제한 농도로 투입한다.
발효 시간 : 60 내지 72시간
발효 모드: 요구된 바에 따라 첨가된 65% 글루코오스로 유가식 배양하고 글 루코오스의 제한된 농도를 유지한다
접종물 : 부피로 2.5 내지 5%
pH : 전반적으로 6.9, 12N NH4OH에 의해 제어함
온도 : 전반적으로 37℃
산소 : 20% 이상의 O2를 용해하고 교반에 의해 제어함
통기 : 0.5 내지 1vvm
배지
배지 성분 및 이들의 농도
성분 농도(1리터 당)
KH2PO4 6.67g
시트르산 3.25g
CaCl2-H2O 0.05g
MgSO4-7H2O 2.5g
FeSO4-7H2O 5mg
ZnSO4-7H2O 3.8mg
MnSO4-H2O 0.33mg
CuSO4-5H2O 0.1mg
CoCl2-6H2O 0.1mg
글루코오스 필요에 따라 >200g
Mazu 204 defoamer 0.25g
상기 배지에서 모든 성분은 (점진적으로 추가하는) 글루코오스를 제외하고 멸균 전에 첨가한다. 초기 pH는 멸균 후에 3.0에 가까우며 접종 전에 NH4OH로 6.9로 조정한다.
본 발명의 방법은 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민, 및/또는 세포외의 글루코사민 및/또는 세포외의 N-아세틸글루코사민인 생산물을 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 일반적인 수집 단계는 (하기에서 기술되는) 생산물을 회수하고 또한 생산물을 목적한 만큼 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 회수 및 정제를 위한 상세한 방법의 설명은 이하에서 제공된다. 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민과 같은 생산물을 "수집한다"는 것은 발효 생물반응기로부터 생산물을 수집하는 것을 의미하며 분리, 회수 또는 정제의 추가적 단계를 내포하지 않는다. 예를 들어 수집 단계는 생물반응기로부터 전체 배양물(즉, 미생물 및 배양 배지)을 제거하고, 생물반응기로부터 세포외의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 포함하는 발효 배지를 제거 및/또는 생물반응기로부터 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민을 포함하는 미생물을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명에서 용어 "회수하기" 또는 "회수하다"는 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민의 용해도 조건을 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민 각각이 불용성이 되어 용액으로부터 침전되거나 결정화되는 정도까지 감소시키는 것을 의미한다. 이러한 단 계 후에 추가 정제 단계를 진행할 수 있다. 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민은 바람직하게는 실질적으로 순수한 형태로 회수한다. 본 발명에서 "실질적으로 순수한"은 상업적 판매용 영양학적 화합물로서 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 효율적인 이용이 가능하도록 하는 순도를 의미한다. 한 양태에서, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 생산물은 바람직하게는 생산 유기체 또는 기타 발효 배지 성분으로부터 분리한다. 이러한 분리를 달성할 수 있는 방법은 하기에서 기술된다.
바람직하게는 본 발명의 방법에 의해서 미생물 및/또는 발효 배지로부터 적어도 약 1g/L 이상의 생산물(즉, 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트)을 수집 또는 회수한다. 보다 바람직하게는 본 발명의 방법에 의해서 적어도 약 5g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 10g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 20g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 50g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 75g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 100g/L 이상의 생산물, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 120g/L 이상의 생산물 및 적어도 약 1g/L 내지 적어도 약 120g/L에 속하는 임의의 전체 증가분(즉, 2g/L, 3g/L 등)의 생산물을 회수한다. 한 양태에서, 상기 생산물은 약 1g/L 내지 적어도 약 120g/L의 양으로 회수한다.
전형적으로 본 발명의 공정에서 생산된 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코 사민의 대부분은 세포외의 것이다. 미생물은 여과 또는 원심 분리와 같은 전통적인 방법에 의해 발효 배지로부터 제거될 수 있다. 한 양태에서, 생산물을 수집 또는 회수하는 단계는 발효 배지로부터 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 정제하는 것을 포함한다. 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민은 크로마토그래피, 추출, 결정화(예, 증발 결정화), 막 분리, 역 삼투압 및 증류와 같은 전통적 방법에 의해 세포가 배제된 발효 배지로부터 회수할 수 있다. 바람직한 양태에서, 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민은 결정화에 의해 세포가 배제된 발효 배지로부터 회수한다. 다른 양태에서, 생산물을 회수하는 단계는 세포외의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 농축하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민이 세포내에 축적되므로 생산물을 회수하는 단계는 미생물로부터 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민을 분리하는 것을 포함한다. 예를 들어 상기 생산물은 생산물(글루코사민, N-아세틸글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트)을 분해하지 않는 방법에 의해 미생물 세포를 용균하고 여액을 원심 분리하여 불용성 세포 잔해물을 제거하고 그 다음 글루코사민, N-아세틸글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸 글루코사민-1-포스페이트 생산물을 상기된 바와 같은 전통적 방법에 의해 회수함으로써 수집할 수 있다.
본 발명에 따른 유전적으로 변형된 미생물에서의 초기 세포내의 생산물은 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민이다. 인산화 중간 물질들은 미생물의 외부로 운반되는 중에 미생물의 원형질 공간에 있는 알칼라인 포스파타제, 산 포스파타제, 당 포스파타제 또는 아미노당 포스파타제의 존재로 인하여 탈인산화된다. 본 발명의 한 양태에서, 목적한 생산물인 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산을 용이하게 하기 위하여 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트는 세포 외부로 운반되기 전 또는 중에 천연적으로 발생하는 포스파타제에 의해 탈인산화시킨다. 이러한 양태에서, 세포내 재조합으로 제공된 포스파타제 활성의 증폭 또는 발효 배지를 포스파타제로 처리할 필요성은 제거된다. 다른 양태에서, 생산 유기체에서의 포스파타제 양은 이에 제한되는 것은 아니지만, 내인성 포스파타제 유전자의 유전적 변형을 포함한 방법 또는 포스파타제 유전자를 발현시키기 위한 미생물의 재조합 변형에 의해 증가된다. 또 다른 양태에서, 수집된 발효 배지는 상기된 바와 같이 세포를 용균하였을 때와 같이 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및/또는 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트가 배지로 방출된 후에 포스파타제로 처리한다.
상기된 바와 같이 본 발명의 공정은 상당한 양의 세포외 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산한다. 특히, 공정은 전체 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 50% 이상이 세포외의 것인 보다 바람직하게는 전체 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 75%의 이상이 세포외의 것인 가장 바람직하게는 전체 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민 90% 이상이 세포외의 것이 되도록 세포외의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민을 생산한다. 본 발명의 방법에 의해 세포외 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 생산 농도는 약 1g/l 이상, 보다 바람직하게는 약 5g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약10g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약 20g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약 50g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약 75g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약 100g/l 이상, 보다 더 바람직하게는 약 120g/l 이상까지 달성될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 N-아세틸글루코사민을 생산하는 신규한 수단에 관한 것이다. 이 방법은 상기된 바와 같은 발효 공정에 의해 생산된 용해된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 발효액을 수득하고 이 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 것을 포함한다. 본 발명에서 발효 공정에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민은 발효 공정의 생산물인 N-아세틸글루코사민이다. 즉, 세포를 배양하는 발효 공정은 세포에 의한 N-아세틸글루코사민의 생산으로 이어진다. 용어 회수하기 또는 회수한다는 N-아세틸글루코사민 용액의 용해도 조건이 N-아세틸글루코사민이 불용성이 되어 용액으로부터 침전되거나 결정화될 수 있는 정도까지 감소시키는 것을 의미한다. N-아세틸글루코사민, 남은 배지 및 세포 물질을 함 유하는 발효액은 먼저 세포 물질 및 박테리아의 내독소를 제거하기 위하여 처리될 수 있다. 세포 물질을 제거하기 이전에 발효액의 세포는 이에 제한되는 것은 아니지만, 초음파, 삼투압에 의한 파괴, 그라인딩/비딩(grinding/beading), 프렌치 프레스(French press), 균질화(homogenization), 폭발적 감압(explosive decompression), 용매 처리, 임계점 추출(critical point extraction) 및 냉동/해동을 포함하는 상이한 방법을 사용하여 용균될 수 있다. 세포 물질 및 내독소의 제거는 마이크로 또는 한외여과 또는 이들의 조합에 의해 달성될 수 있다. 당업계에 알려진 다른 기술은 원심분리와 정용여과(diafiltration)를 포함한다. 세포 물질의 제거 이후 용액은 내독소의 충분한 제거를 확인하기 위하여 테스트될 수 있다.
발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 단계 이전에 발효액을 탈색 및/또는 탈회분할 수 있다. 이러한 공정 둘 모두를 수행한다면 어떠한 것이 먼저 실시될 수 있다. 그러나 먼저 탈회분 공정을 수행함에 의해서 탈색의 요구조건은 이온 교환 수지의 이용과 같은 탈회분 공정에 의해 색상이 제거되기 때문에 감소하게 된다. 탈색 단계는 다수의 N-아세틸글루코사민 결정화, 활성화 탄소 처리 및 크로마토그래피에 의한 탈색에 의해 수행할 수 있다. 크로마토그래피에 의한 탈색은 (이온 교환이 아니라 색상 흡착에 의한) 이온 교환 수지, Dow Optics SD-2 수지 및 통상적인 실리카를 기반으로 하는 크로마토그래피 매체의 이용을 포함한다.
탈회분 단계는 발효액을 이온 교환 수지와 접촉함으로써 수행될 수 있는데 이는 발효액을 음이온 교환 수지 및/또는 양이온 교환 수지와 접촉하는 것을 포함한다. 한 양태에서, 음이온과 양이온 교환 수지 모두의 혼합 베드가 사용된다. 양이온 제거는 강산 또는 약산 이온 교환 수지 중 어느 하나에 수행될 수 있는데 반하여 약염기 수지가 발효에서 생산된 유기산을 제거하는 개선된 능력으로 인하여 바람직하다. 양이온 제거는 음이온 교환기로부터 나온 유출액은 높은 pH를 갖는데 반하여 양이온 교환기로부터 나온 유출액은 낮은 pH를 갖고 있기 때문에 음이온 제거를 선행하도록 일반적으로 선택된다. N-아세틸글루코사민은 높은 pH에서 에피머화(epimerize)하는 경향이 있어 측정할 수 있는 양의 N-아세틸만노사민을 생산한다. 음이온 제거는 강염기 또는 약염기 수지 중 어느 하나로 수행할 수 있다. 이렇게 정제된 용액은 이온성 물질을 거의 함유지 않으며 주로 물, N-아세틸글루코사민 및 발효 중에 소비되지 않은 발효 투입물로부터 유래된 탄수화물로 이루어진다. 이러한 중간 생산물의 N-아세틸글루코사민 순도는 일반적으로 스트림(stream)의 전체 건조 고형물 함량의 약 90% 이상이다. 탈회분를 완성하기 위하여 추가의 마무리가 바람직하다면 그 다음 혼합 베드 이온 교환 단계가 적용될 수 있다. 이러한 경우에, 양이온 및 음이온 수지가 동일한 이온 교환기를 점유하고 상당히 탈회분된 발효액이 이러한 베드를 통과하게 된다. 혼합 베드 이온 교환은 분리된 양이온 및 음이온 교환기에서 일어날 수 있고 이는 발효액 pH의 변화 정도를 최소화하는 추가의 장점을 제공함에도 불구하고 수지 손실이라는 상당한 위험을 수반하는 재생 이전에 이온 교환 수지를 분리할 필요가 있기 때문에 분리된 베드를 이용하는 것이 보다 용이하다.
발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 단계는 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 침전 및/또는 결정화하는 것을 포함한다. 일반적으로 회수 단계 이전에 발효액은 침전 또는 결정화할 수 있도록 더 높은 농도의 용해된 N-아세틸글루코사민을 제공하기 위하여 농축된다. 농축 단계는 진공(즉, 대기압 이하의 압력에서)에서 또는 막 분리에 의하여 수행될 수 있다. 바람직한 양태에서, 농축 단계는 약 40℃ 내지 약 75℃의 온도, 보다 바람직하게는 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도에서 수행한다. 농축 단계는 일반적으로 발효액 중 고형물의 함량이 적어도 약 30% 고형물, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 고형물, 보다 바람직하게는 적어도 약 45% 고형물에 도달할 때까지 수행된다.
농축 후에 발효액은 일반적으로 냉각한다. 이 냉각은 수동적인, 즉, 단순히 발효액을 실온에 이르도록 하는 것 또는 냉동 건조기, 분무 냉각기, 프릴러(priller), 플레이커(flaker) 및 블렌더(blender) 또는 냉각 재킷(cooling jacket)을 구비한 압출기의 이용과 같은 것에 의해 달성될 수 있다. 농축된 발효액을 냉각하는 단계 단독으로 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는데 충분할 수 있다. 예를 들어 발효액은 약 -5℃ 내지 약 40℃, 약 -5℃ 내지 실온 또는 실온까지 냉각될 수 있다.
발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물은 회수하는 것은 또한 존재하는 결정의 성장에 의한 회수를 촉진하기 위하여 발효액을 N-아세틸글루코사민 결정으로 접종하는 단계를 또한 포함한다. 결정은 발효액 중 핵형성 또는 외부에서 제공되는 N-아세틸글루코사민 결정으로 제공될 수 있다. 한 예에서, 초포 화된 용액을 불안정한 상태로 만든 다음 추가 핵형성을 방지하고 존재하는 결정의 성장을 촉진하기 위하여 서서히 냉각함에 의해 몇몇 핵형성이 일어날 때까지 발효액을 농축 및/또는 냉각한다. 선택적으로 임의의 방법에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민 결정은 접종 결정으로서 발효액에 도입될 수 있다.
발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 것은 발효액 중 N-아세틸글루코사민과 수혼용성 용매(water miscible solvent)를 접촉함으로써 개선될 수 있다. N-아세틸글루코사민은 이소프로필 알코올(IPA), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드, 디옥산 및 아세토니트릴과 같은 수혼용성 용매에 매우 불용성임이 확인되었다. 따라서 발효액에 그러한 수혼용성 용매의 도입은 N-아세틸글루코사민을 덜 용해성으로 만들 것이며 추가로 회수될 것이다.
본 발명의 회수 공정은 발효액의 회분식 또는 연속적 결정화 중 어느 하나를 따라 수행할 수 있다. 농축 공정 중에 형성된 결정은 필터 또는 원심분리에 의해 계속적으로 수득하면서 동시에 모액은 추가의 농축을 위하여 재순환되거나 이들은 고형물을 제거할 때까지 모액과 잔류할 수 있다.
N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물의 회수 후에 고형물은 원심 분리 또는 여과와 같은 것에 의해 발효액으로부터 분리할 수 있다. 이렇게 형성된 고형물 케이크(cake)는 진공 건조와 같은 당업계에 공지된 다양한 기술에 의해 건조될 수 있는데 이러한 단계는 분해 및 색상 형성을 방지하기 위하여 낮은 온도에서 수행하는 것이 바람직하다. 최종 건조 생산물은 일반적으로 적어도 약 50% 이상의 건조 고형물, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상의 건조 고형물 및 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 이상의 건조 고형물일 것이다. 건조 이전에 회수된 고형물은 상기된 바와 같은 수혼용성 용매로 세정될 수 있다. 그러한 세정 단계는 예를 들어 색상 형성을 방지하는 등 생산물의 안정성으로 이어질 수 있다.
다른 양태에서, 회수된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물은 제 2 회수 단계로서 상기 고형물을 용해하고 고형물을 회수함으로써 추가로 정제할 수 있다. 상기 제 2 회수 단계는 전술된 회수 공정 단계 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 제 2 회수 사이클에 대한 필요성은 목적한 최종 생산물 순도 및 출발 순도에 의해 결정된다.
상기된 다양한 회수 공정을 이용하여 고순도의 N-아세틸글루코사민이 제조할 수 있다. 특히 본 발명의 공정은 적어도 약 70% 이상 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 이상 순수한 N-아세틸글루코사민을 생산할 수 있다.
다양한 회수 공정 양태가 바람직하다. 예를 들어 세포가 배제된 발효액은 추가 이온 제거 없이 활성 탄소에 의한 탈색; 에너지 효율을 위하여 다단계로 진행할 수 있는 (예, 바람직한 조건은 약 600mmHg의 진공에서 액의 온도는 45℃ 내지 55℃이다) 진공 증발기에서 약 45% 이상의 건조 고형물로 농축; 데워진 농축액을 순수한 N-아세틸글루코사민으로 접종하고 교반하면서 냉각함으로써 고형물 N-아세틸글루코사민을 제조하는데 이용될 수 있다. 냉각된 발효액은 여과되거나 원심분리되고 고형물 덩어리가 회수된다. 회수된 고형물은 진공 건조될 수 있고 순수한 N-아세틸글루코사민 또는 글루코사민 염의 제조에서 중간 물질로서 이용될 수 있고; N-아세틸글루코사민 순도가 87% 이상이면 순수한 N-아세틸글루코사민은 단일 결정화로부터 제조할 수 있다. 접종, 냉각 및 모액으로부터 고형물을 회수하는 것에 대하여 선택적으로 초포화된 스트림은 냉각에 의해 고형화될 수 있다. 적합한 냉각 장비는 냉동 건조기, 분무 냉각기, 프릴러(priller), 플레이커(flaker) 및 블렌더(blender) 또는 냉각 재킷(cooling jacket)을 구비한 압출기를 포함한다. 이렇게 형성된 고형물은 추가로 건조될 수 있다.
다른 바람직한 회수 양태에서, 회수된 N-아세틸글루코사민은 건조하지 않고 물에 재용해하고 제 2 사이클인 농축, 접종, 냉각 및 고형물 수집을 수행할 수 있다. 수집된 고형물은 수혼용성 용매로 세정하고 진공에서 건조한다. 중복 결정화에 대한 필요성은 N-아세틸글루코사민의 출발 순도에 의해 결정된다. 건조 고형물의 백분율로서 순도가 87% 이상이라면 단일 결정화가 요구된다. 순도가 70%라면 중복 결정화가 요구된다.
다른 바람직한 회수 양태는 회수된 고형물은 탈색되고 70℃에 달하는 온도에서 농축된 물질을 사용하거나 부분적으로 정제된 물질을 70℃에서 재용해하고 이들을 실온으로 냉각시킴으로써 순수한 N-아세틸글루코사민을 생성하는 단일 결정화이다. 회수된 고형물은 수혼용성 용매로 세정하고 건조한다.
다른 바람직한 회수 양태에서, 세포가 배제된 탈회분된 발효액은 양이온 교환 수지를 포함한 크로마토그래피 매체를 사용하는 시뮬레이티드 무빙 베드 크로마토그래피 시스템(simulated moving bed chromatographic system)에서의 분리에 의 해 추가로 정제한다. 일단 약 98% 순수한 스트림이 수득되면 진공 농축이 이하에 기술된 안정화 처리를 위한 물질을 준비한다.
다른 바람직한 회수 양태에서, 높은 순도는 갖고 105℃에서 건조할 때 분해로 인한 손실이 1% 중량 이하이면서 색상이 안정적인 N-아세틸글루코사민의 높은 회수율을 달성하기 위하여 수혼용성 용매가 이용된다. 예를 들어 탈색 및 탈회분에 의해 93%에 도달한 상대적으로 높은 순도의 N-아세틸글루코사민으로 시작함으로써 진공 농축에 의해 수분을 제거하고 그 다음 수용성 용매를 첨가하고 추가의 순수한 생산물을 침전하는 것이 가능하다. 침전된 생산물을 수혼용성 용매로 처리하는 공정은 추후 건조 단계를 용이하게 하는데 여기서 잔류 수분은 분해 반응이 일어나는 것을 방지할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 N-아세틸글루코사민으로부터 글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다. 최종 생산물로 글루코사민을 생산하기 위하여 N-아세틸글루코사민은 가수분해되어 최종 생산물로 글루코사민을 생산할 수 있다. 상기 가수분해는 발효액으로부터 먼저 분리하지 않고 발효에서 생산된 N-아세틸글루코사민에 직접으로 행해지거나 선택적으로 가수분해는 상기된 방법에 의해 회수된 N-아세틸글루코사민과 같이 발효액으로부터 먼저 분리된 이후의 N-아세틸글루코사민에 행해질 수 있다. 또한, 본 발명의 이 방법에서는 다른 입수 가능한 N-아세틸글루코사민 원료를 이용할 수 있다. 본 발명 이전에 N-아세틸글루코사민은 유기 아세틸화 시약을 이용하는 글루코사민의 아세틸화에 의해 또는 키틴으로부터 글루코사민을 제조하기 위하여 전통적으로 사용된 산 가수분해 공정과 유사한 키틴으로부터 직접 적으로 N-아세틸글루코사민의 효소에 의한 가수분해에 의해 생산되었다. 따라서 N-글루코사민으로부터 최종 생산물로 글루코사민을 제조하는 역반응에 대한 필요성은 없었다.
따라서 본 발명에서 기술된 N-아세틸글루코사민 원료는 순수한 N-아세틸글루코사민 원료가 아니라 글루코사민으로 전환될 양의 N-아세틸글루코사민을 함유하는 임의의 원료(고형물 또는 용액)를 의미한다. 글루코사민 염화염은 상기된 바와 같이 발효 공정에 의해 생산되고 상기된 바와 같이 발효액으로부터 회수된 N-아세틸글루코사민으로부터 생산될 수 있거나 상기 공정은 잔류 색상 또는 이온 구성성분을 제거하지 않고 세포 물질이 제거된 발효기 농축액으로서 직접적으로 발효에 의해 제조된 N-아세틸글루코사민을 사용할 수 있다. 선택적으로 키틴의 효소에 의한 가수분해와 같은 다른 방법에 의해서 제조된 N-아세틸글루코사민을 포함한 임의의 다른 적합한 N-아세틸글루코사민의 원료가 본 발명에서 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 글루코사민 염화염은 원료 중 총 고형물의 백분율로서 적어도 약 30% 이상의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 N-아세틸글루코사민 원료로부터 생산될 수 있으며 보다 바람직하게는 상기 원료는 원료 중 총 고형물의 백분율로서 적어도 약 30% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 35% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 40% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 45% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 55% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 85% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 이상을 포함한다. 일반적으로 글루코사민 염화염은 적어도 약 1% 내지 100%에 속하는 모든 정수(즉, 1%, 2%, 3%....98%, 99%, 100%)의 백분율의 N-아세틸글루코사민을 함유하는 N-아세틸글루코사민의 원료로부터 제조된다. 이 반응에서 N-아세틸글루코사민은 고형물로서 또는 물에 용해된 용액으로서 또는 이에 제한되는 것은 아니지만, 에탄올, 메탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올 또는 sec-부탄올을 포함한 수용성이면서 낮은 비등점의 일차 또는 이차 알코올 중 용액으로서 이용될 수 있다. 바람직한 양태에서, N-아세틸글루코사민 원료는 원료 중 전체 건조 고형물의 백분율로 적어도 약 40%이상의 N-아세틸글루코사민을 포함한다.
한 양태에서, 글루코사민 염화염은 산 및 가열 조건에서의 가수분해를 이용하여 N-아세틸글루코사민의 원료로부터 제조할 수 있다. 산 가수분해 기술은 당업계에 알려져 있다. 본 발명은 N-아세틸글루코사민을 글루코사민 염화염으로 전환하는데 이러한 화학 반응의 특정한 적용을 제공하는 것이다. 가수분해 반응은 글루코사민 염화염으로 전환되는 N-아세틸글루코사민의 각 몰에 대하여 1몰의 아세트산을 방출하고, 각각 1 몰의 염산과 물을 소비한다. 물, 염산 및 N-아세틸글루코사민의 많은 조합이 성공적으로 반응을 수행할 수 있으므로 반응물로서 무수 염산, 건조된 N-아세틸글루코사민 및 물을 사용하거나 N-아세틸글루코사민과 염산 둘 모두 또는 둘 중 하나와 물을 반응시키는 것이 가능하다. 반응은 과량의 물과 염산으로 수행된다. 중요한 파라미터는 잔류하는 염산 농도 뿐만 아니라 반응 시간과 온도이다. 반응은 전환이 완료된 후에 냉각하는 것이며, 최종 온도 뿐만 아니라 잔류하는 과량의 염산 농도가 글루코사민 염화염 생산물의 용해도를 결정한다. 과량의 용해도는 글루코사민 염화염의 감소된 퍼패스(per-pass) 회수를 유발하여 수율을 감소시킨다. 글루코사민은 분해될 수 있고 글루코사민을 완성하는 반응은 용액에서 일어난다. 반응 속도는 온도, 용액 중 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민의 농도 및 용액 중 염산의 농도와 관련된다. 성공적인 조건은 60℃ 내지 100℃의 온도 보다 바람직하게는 70℃ 내지 90℃의 온도를 포함한다. 염산 용액 대 N-아세틸글루코사민 고형물의 허용 가능한 비율은 1:1 내지 5:1의 중량비, 바람직하게는 3:1의 중량비, 보다 바람직하게는 2.5:1의 중량비이다. 허용 가능한 염산 용액의 농도는 10-40% w/w이고 보다 바람직하게는 약 10% 내지 37% w/w이다. 무수 염산은 희석열을 조정하게 하고 N-아세틸글루코사민을 충분히 용해하는 충분한 용액이 있는 것을 전제로 수용성 염산 대신에 이용될 수 있다. 모든 조합이 성공적임에 따라 첨가 순서 및 첨가 시에 온도는 덜 중요하다. 반응을 수행하는 시간은 반응 온도 및 산 농도에 따라 다양하며 고온에서 농축된 산의 경우 10분에서부터 저온에서 희석된 산의 경우에 3시간 이상까지(예, 24시간까지) 이다. 용액은 글루코사민 염화염을 침전시키기 위하여 4℃까지 냉각한다. 더 높고 낮은 온도(예, 약 -5℃ 내지 약 40℃의 임의의 온도)가 허용 가능하지만, 4℃가 상업적으로 통상적인 조건으로 가수분해 용액에서 잔류 글루코사민 염화염을 최소하기 위한 통상적인 온도로서 선택되었다. 글루코사민 염화염의 상대적인 건조 고형물 조성이 낮은 더 불순한 가수분해 용액의 경우에는 저속 냉각 속도와 최종 온도에서 추가 홀딩 시간 (holding time)이 가수분해 용액을 포화 상태로 되돌리는데 필요하다. 용액의 교반은 불순물에 의해 결정화 공정을 수행해야 하는 장애를 완화시키기는 하지만 해소하지는 못한다.
가수분해 반응은 과량의 염산으로 수행되어지기 때문에 냉각하고 글루코사민 염화염을 제거하는 공정 후 가수분해 용액은 가수분해에 다시 이용될 수 있는 능력을 보유하고 있다. 공생산물(coproduct)인 아세트산 농도가 증가하고 각 가수분해 사이클마다 반응물 염산이 소비되기 때문에 상기 가수분해 용액은 덜 활성화되며 반응을 완료하는데 더 많은 시간이 소요된다. 기체 형태의 염화수소를 공급하여 반응물을 재구성함으로써 염화수소를 재충전하는 것이 가능하지만 각 반응 사이클마다 아세트산 공생산물의 증가는 간단한 가수분해 산물 용액의 재순환에 점진적인 장애로 작용한다. 이는 가수분해 단계 전, 중 또는 후에 일차 또는 이차 알코올의 첨가를 통하여 아세트산을 에스테르화함으로써 극복될 수 있다. 아세트산은 알코올과 에스테르를 형성하고 이는 N-아세틸글루코사민 가수분해 전, 중 또는 후에 증류, 플래싱(flashing) 또는 진공 증발에 의해 제거할 수 있다.
N-아세틸글루코사민은 용해시키거나 용해된 상태를 유지하기 위하여 재순환된 가수분해 모액과 연속적으로 혼합될 수 있다. 이어서, 대체 무수 염산을 첨가하고 용액의 온도를 증가시켜서 가수분해 반응을 개시하고 글루코사민 염화염의 용해도를 최소화하기 위하여 충분한 잔류 산 농도를 유지한다. 압력은 대기압 이상으로 조정될 수 있고 상승된 온도가 반응기 이용 시간을 최소화하므로 선택된다. N-아세틸글루코사민을 글루코사민 염화염로 완전히 전환한 후에 반응은 냉각시키고 글루코사민 염화염은 여과 또는 원심분리에 의해 회수한다. 여과물 및 원심분리물은 목표 온도 약 4℃에 도달하고 대부분의 글루코사민 염화염이 회수될 때까지 냉각기를 통하여 재순환한다. 그 다음 원심분리물 또는 여과물은 재이용을 위하여 재순환한다. 반응시 손실을 보충하기 위하여 충분한 물이 N-아세틸글루코사민과 첨가되어야 한다. 아세트산과 같은 반응 공생산물의 축적은 연속적인 모액의 제거에 의해, 이러한 제거 스트림으로부터 잔류 염산 용액을 분리하고 추후 재이용을 위해 재투입함에 의해 또는 일차 또는 이차 알코올로 에스테르화하고 이들을 에스테르로서 건조함에 의해 제거한다.
본 발명에서 기술된 가수분해 공정으로부터 글루코사민을 회수하는 공정은 전술된 N-아세틸글루코사민의 회수와 유사하고 글루코사민의 회수에 대해 전체로 적용될 수 있다. 글루코사민 회수의 몇몇 바람직한 측면은 하기 및 실시예 부문에서 설명한다.
여과 또는 원심분리로 고형 글루코사민 염을 회수할 수 있다. 회수된 몰 수율은 N-아세틸글루코사민을 기준으로 50% 내지 90% 정도이다. 알코올에 의한 세정 및 건조 후에 글루코사민 순도는 96% 내지 100% 정도이다. 원심분리기 또는 여과지로부터 회수한 습윤 케이크는 건조 중에 덩어리를 형성하는 생산물의 성향을 최소하기 위하여 알코올로 세정한다. 생산물은 그 다음 진공 건조기 또는 Wyssmont형 건조기에서 건조시 손실이 생산물의 사양을 맞출 때까지 진공에서 건조한다.
회수된 N-아세틸글루코사민 가수분해 여과지- 또는 원심분리기- 유래의 케이크는 세정하거나 그렇지 않은 채 시작할 수 있다. 케이크는 실온에서 교반하면서 물에 약 25%(w)의 농도로 용해한다. 수산화나트륨 또는 수산화칼륨과 같은 염기가 pH를 2.5 - 4로 조정하기 위하여 첨가된다. 일단 pH가 조정되면 완전히 용해된 용매는 활성 탄소로 처리한다. 예를 들어, 배치 모드에서 글루코사민 염화염 그램당 0.02 그램의 Draco G-60 또는 동등한 활성 탄소를 첨가하고 최대 30분 동안 혼합한다. 반응물은 여과하여 탄소를 제거한다. 그 다음 탄소는 탄소 및 여과 장치에 잔류하는 글루코사민 염화염을 용출하기 위하여 재결정될 글루코사민 염화염의 양과 거의 동일한 양의 물로 세정한다. 선택적으로 용액은 과립 형태의 활성 탄소로 충진된 베드를 통과하게 하고 활성 탄소의 재생 또는 폐기 이전에 잔류하는 글루코사민 염화염을 회수하기 위한 추후 용출 단계를 수행한다.
정제된 용액은 진공 및 교반 하에서 50℃까지 가열한다. 50-60cm Hg의 진공이 이용되었다. 약 절반의 부피가 증발에 의해 제거되면 고형물은 여과, 원심분리 또는 재결정된 글루코사민 염화염을 회수하는 다른 적합한 수단에 의해 잔류 용액으로부터 회수한다. 잔류 용액은 추후 회수를 위해 재투입한다. 고형물은 수집하면 이에 제한되는 것은 아니지만 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, sec-부탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드 또는 디옥산을 포함한 수혼용성 용매로 세정하고 건조한다.
단일 사용한 가수분해 산물로부터 재결정할 때 액체는 고체가 눈에 띠이며 부피가 개시 부피의 약 20-30%에 이르는 지점까지 추가로 증발시킨다. 동일한 부피의 수혼용성 용매가 액체 침전물로서 첨가하고 이렇게 형성된 용액으로부터 고체는 여과, 원심분리 또는 재결정된 글루코사민 염화염을 회수하기에 적합한 다른 수 단에 의해 회수한다. 그 다음 잔류 용액은 예를 들어 4℃까지 냉각시키고 잔류 글루코사민 염화염을 회수하기 위하여 여과한다.
다수 이용된 가수분해 산물로부터 재결정화할 때 추후 사이클의 활성 탄소로 처리된 가수분해 산물을 증발 및 고형물 회수에 의해 제거된 부피를 보충하기 위하여 당해 사이클의 회수된 용액으로 첨가한다. 약 절반의 부피가 증발에 의해 제거되면 사이클이 반복한다.
재결정된 글루코사민 염화염의 순도는 첫 번째 결정화 단계의 가수분해 산물로부터 진척된 과량의 산의 중화 및 다른 불순물로 인한 염의 양에 따라 달라진다. 이는 회수된 글루코사민 염화염이 순도 사양을 맞추지 못할 때 여러 차례 사용된 가수분해 결정화 단계를 단일 사용된 결정화 단계로 대체함으로써 조절된다. 수혼용성 용매를 이용한 침전 중에 회수된 침전된 글루코사민 염화염은 재용해하고 연속적인 재결정화의 일부분으로 통합한다.
회수된 글루코사민 염화염의 습윤된 케이크는 건조 중에 덩어리를 형성하고 색상이 어두워지는 생산물의 성향을 최소화하기 위하여 알코올을 포함해야 한다. 그 다음 진공 건조기 또는 Wyssmont형 건조기에서 건조시의 손실이 생산물의 사양을 맞출 때까지 진공에서 건조한다.
한 양태에서, 가수분해 단계는 (a) 가열 조건에서 N-아세틸글루코사민 원료를 염산 용액 또는 재순화된 가수분해 모액과 혼합함으로써 N-아세틸글루코사민 원료를 가수분해하여 글루코사민 염화염을 함유하는 용액을 제조하는 단계; (b) 단계 (a)의 용액을 냉각하여 글루코사민 염화염을 침전하는 단계; 및 (c) 단계 (b)로부 터 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 회수하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 가수분해 단계는 N-아세틸글루코사민 원료를 염산 용액 또는 재순환된 가수분해 모액과 연속적으로 혼합함으로써 N-아세틸글루코사민 원료를 용해된 용액으로 유지하고 그 다음 가열 조건에서 무수 염산을 (a)의 용액에 첨가하여 가수분해를 개시하고 N-아세틸글루코사민을 글루코사민 염화염으로 전환함으로써 수행될 수 있다. 다른 측면에서, 재순환된 가수 분해 모액은 단계 (c)에서 침전된 글루코사민 염화염을 회수한 후에 잔류하는 가수분해 용액으로 일차 또는 이차 알코올이 가수분해 단계가 진행되기 전 중 또는 후에 가수분해 용액에 첨가된다. 이러한 측면에서, 냉각 단계는 용액이 약 -5℃내지 40℃에 이를 때까지 수행할 수 있다.
회수 단계는 (i) 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 수집하고; (ii) 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 수혼용성 용매(이에 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 이소프로판올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드 및 디옥산을 포함함)로 세정하고; (iii) 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 건조하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, 회수 단계는 (i) 침전된 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 회수하고; (ii) 단계 (i)로부터 고형물을 물에 용해하여 용액을 형성하고; (iii) 상기 단계 (ii)의 용액의 pH를 (예, 염기의 첨가, 산을 제거하기 위한 세정, 이온 교환 매체 통과 또는 다른 적합한 방법에 의해) 2.5 내지 4로 조정하고; (iv) 상기 단계 (iii)의 용액을 활성 탄소와 접촉하여 글루코사민 염화염을 함유하는 고형물을 탈색하고; (v) 상기 단계 (iv)의 용액으로부터 활성 탄소를 제거하고; (vi) 상기 단계 (v)의 용액으로부터 글루코사민 염화염을 결정화하는 것을 포함한다. 이러한 측면에서, 결정화 단계는 글루코사민 염화염을 약 70℃ 이하의 온도에서, 보다 바람직하게는 약 50℃이하의 온도에서 농축하는 것을 포함한다. 한 측면에서, 결정화 단계는 대기압 이하의 압력에서 글루코사민 염화염을 농축하는 것을 포함한다. 다른 측면에서, 이 공정은 결정화 단계 (vi) 후에 잔류하는 용액을 추후 회수 공정의 단계 (i) 또는 추후 결정화(예, 재결정화) 단계로 재순환하는 것을 포함한다.
다른 측면에서, N-아세틸글루코사민 원료는 수용성이면서 저비등점의 일차 또는 이차 알코올로 현탁하면 가수분해 방법은 용액을 냉각시키기 전에 가수 분해 후 또는 재사용을 위한 가수분해 용액을 재순환 이전에 알코올로 형성된 아세트산 에스테르를 제거하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 아세트산 에스테르는 이에 제한되는 것은 아니지만 증류, 플래싱 및 대기압 이하 압력에서의 농축을 포함하는 공정에 의해 제거된다. 이러한 양태에서, 가수분해 단계는 약 60℃ 내지 100℃, 바람직하게는 1 대기압에서 용액의 끓는점에서 수행한다.
다른 측면에서, 가수분해가 상대적으로 높은 산 대 N-아세틸글루코사민 비율(예, 약 3:1 내지 5:1) 및 상대적으로 낮은 온도(예, 80℃이하)에서 수행된다면 글루코사민 결정의 질은 글루코사민을 재결정화할 필요가 없이 충분히 높다. 이러한 양태에서, 단일 결정화 단계는 전술된 수혼용성 용매로 세정하고 전술된 바와 같이 건조한다.
실제로 본 발명에서 기술된 가수분해 및 회수의 방법은 단계 (vi)의 결정화 된 글루코사민 염화염을 수혼용성 용매로 세정하는 단계와 건조시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한 측면에서, 결정화된 글루코사민 염화염은 적어도 약 70℃이하의 온도에서 적어도 약 6시간 이하 동안, 다른 양태에서는 50℃이하의 온도에서 적어도 약 3시간 이하 동안 건조한다. 건조 단계는 진공의 존재 또는 부재 및 공기의 존재 또는 부재 또는 불활성 기체를 일소하면서 수행할 수 있다.
N-아세틸글루코사민을 글루코사민으로 전환하는 다른 방법은 효소에 의한 가수분해 과정을 이용하는 것이다. 발효액 중 또는 이의 회수 후에 N-아세틸글루코사민을 가수분해하는 효소 처리는 실시예 부문에 기술된다. 세 가지 유형의 효소가 후보 효소이다:N-아세틸글루코사민-6-P 데아세틸라제(EC 3.5.1.25, NagA), N-아세틸글루코사민 데아세틸라제(EC 3.5.1.33) 및 키틴 데아세틸라제.
Fujishima et al.에 의해 기술된 데아세틸라제가 N-아세틸글루코사민-6-P 데아세틸라제(EC 3.5.1.25, NagA)로서 동정되었다. 이들의 N-아세틸글루코사민-6-P에 대한 친화력과 효율은 N-아세틸글루코사민 보다 훨씬 높았다. 그러나 대장균으로부터 정제된 N-아세틸글루코사민-6-P 데아세틸라제는 N-아세틸글루코사민에 작용하지 않는다.
효소 N-아세틸글루코사민-6-P 데아세틸라제(EC 3.5.1.23, NagA)는 N-아세틸글루코사민, N-아세틸만노사민 및 뉴라민산의 세포내 대사에서 필수적인 단계인 N-아세틸글루코사민6-P를 글루코사민-6-P로 전환하는 능력으로 알려져 있다. 정상적으로 재조합 대장균 NagA 단백질과 같은 이러한 효소는 인산화되지 않은 N-아세틸글루코사민에는 작용하지 않는다. N-아세틸글루코사민 6-P 데아세틸라제(nagA)를 암호화하는 DNA 서열이 많은 서로 다른 유기체에서 확인되었다. (NagA와 구별되는) N-아세틸글루코사민에만 작용할 수 있는 데아세탈라제가 존재하는지 여부에 대하여 알려진 바 없다.
키틴 데아세틸라제(EC 3.5.1.41)은 키토산을 얻는 키틴의 N-아세틸글루코사민 단위체의 탈아세틸화를 촉매한다. 키틴 데아세틸라제 활성은 N-아세틸기가 방사능 표지된 글리콜 키틴(부분적으로 O-하이드록시에틸화된 키틴) 기질을 사용함으로써 보통 결정한다. 효소는 또한 미크로크리스탈린 키틴 및 카르복시메틸키틴(용해되는 유도체)에 작용한다. 그러나 Mucor rouxii로부터 유래된 키틴 데아세틸라제는 N-아세틸글루코사민 모노머 또는 2-3 올리고머를 탈아세틸화하지 않는 것으로 알려져 있다(Araki and Ito, 1975, Eur. J. Biochem. 55:71-78, 이의 전문은 본 발명에서 참조로 인용된다). 정상적 키틴 데아세틸라제가 글루코사민 모노머를 탈아세틸화한다는 암시는 없음에도 불구하고 그러한 활성을 갖는 키틴 데아세틸라제 변이체가 천연으로부터 분리되거나 생체외에서 생성될 수 있다.
많은 아실 트랜스퍼라제가 한 기질로부터 아세틸기를 떼어내어 다른 기질에 전달할 수 있다(Konecny, et al.). 그러한 효소가 N-아세틸글루코사민을 탈아세틸화할 수 있다는 암시는 없음에도 불구하고 그러한 활성을 갖는 아실 트랜스퍼라제 변이체가 천연으로부터 분리되거나 생체외에서 생성될 수 있다.
N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화는 천연의 아실 트랜스퍼라제를 갖는 유기체 또는 재조합 아실 트랜스퍼라제를 갖는 유기체로부터 분리 또는 보유된 아실 트랜스퍼라제에 의해 수행될 수 있다. 재조합 아실 트랜스퍼라제는 불규칙 또는 직접 적인 돌연변이 및/또는 단백질 공학에 의해 개선될 수 있다.
N-아세틸글루코사민을 글루코사민으로 전환하는데 아실 트랜스퍼라제 또는 데아실틸라제 기술을 적용함에 있어서 용액 중 특히 외부 질소 원자를 수소화할 수 있는 낮은 pH 환경에서 글루코사민의 공지된 불안정성으로 인하여 다양한 메커니즘을 통하여 생산물이 분해될 가능성이 있다.
산 가수분해에 적합하나 간단한 pH 감소는 효소의 촉매 작용에 문제를 일으킨다. 효소는 완충되지 않은 또는 중성이 아닌 pH 환경에 노출되었을 때 변성될 수 있다. 또한, 높은 염 함량이 효소의 변성과 관련이 있다.
결론적으로 효소의 형태를 고정하고 높은 이온 농도에 노출되었을 때의 충격을 완화하고 값비싼 효소의 소비를 방지하기 위하여 공지된 효소 고정화 기술(이하에서 기술됨)을 적용하는 것이 적합하다. 추가로 아세트산 나트륨, 아세트산 칼슘, 염화나트륨 및 염화칼슘과 같은 다른 염과 비교했을 대 상대적으로 낮은 글루코사민 염화염의 용해도를 활용하는 것이 적합하다.
수용성 나트륨 또는 염화칼슘 용액 및 N-아세틸글루코사민과 적절한 효소를 공존에 의해 평형 반응이 진행되어 효소를 위한 pH 완충제로 작용할 수 있는 매우 수용성의 나트륨 또는 아세트산 칼슘을 형성할 수 것이다. 이 반응은 또한 상대적으로 불용성이지만 안정한 글루코사민 염화염을 생산하며 이는 증발에 의한 농축 또는 액체 침전제의 이용에 의해 용액으로부터 결정화 또는 침전될 수 있다. 글루코사민이 용액으로부터 분리됨에 따라 평형 반응은 추가의 N-아세틸글루코사민을 소모하면서 정반응으로 추진된다. 잔류하는 모액은 잔류하는 용해된 글루코사민 염화염, 아세트산나트륨 또는 칼슘, 염화나트륨 또는 칼슘 및 소량의 반응하지 않은 N-아세틸글루코사민을 포함하게 될 것이다. 이러한 모액을 액체 침전제로서 알코올로 처리하여 덜 불용성의 글루코사민 염화염, 염화나트륨 또는 칼슘 및 N-아세틸글루코사민으로부터 수용성의 아세트산나트륨 또는 칼슘을 분리하고 효소에 의한 전환 공정의 시작으로 재순환할 수 있다.
효소에 의해 N-아세틸글루코사민을 글루코사민 염화염으로 전환하는 다른 방식은 N-아세틸글루코사민으로부터 아세틸기를 알코올로 전달함으로써 알코올을 에스테르화하는 촉매 효소를 이용하는 것이다. 가수분해 중에 형성된 에스테르를 제거하는 것은 글루코사민 유리 염기를 생산하면서 N-아세틸글루코사민을 소비하는 정반응을 추진한다.
효소의 가수분해로부터 형성된 글루코사민 유리 염기는 이를 예를 들면 염화나트륨과 같은 염화염 용액과 함께 혼합물로서 수소화 형태의 양이온 교환 수지를 통과시킴으로써 안정화되는데, 여기서 염의 양이온이 수소 이온과 교환되어 안정적 글루코사민이 염화염이 형성되면서 동시에 이온 교환 수지는 염의 양 이온을 보유하게 된다. 이러한 동일한 방식으로 이에 제한되는 것은 아니지만, 포스페이트, 술페이트, 이오다이드 및 비설페이트를 포함한 다양한 염 중 선택된 임의의 염이 글루코사민 유리 염기와 혼합될 수 있고 양 이온 교환 컬럼을 통과하면서 (글루코사민)2 술페이트-(NaCl)2, (글루코사민)2 술페이트-(KCl)2, (글루코사민)2 술페이트, 글루코사민 염화염, 글루코사민 하이드로이오다이드, 글루코사민 포스페이트, (글 루코사민)2 포타슘 비술페이트-(HCl)2, (글루코사민)2 소듐 비술페이트-(HCl) 2를 포함한 공지된 안정한 산 염으로 전환될 것이다.
따라서 한 측면에서, 전술한 탈아세틸화 효소는 고체 지지체 상에 부착된 즉, 고정화된 효소이다. 본 발명에서 고체 지지체 상에 부착되는 효소(예, 데아세틸라제)는 고정화된 효소, 재조합 효소와 같은 효소를 포함한 고정화된 세포(고정화된 박테리아, 곰팡이(예, 효모), 조류, 곤충, 식물 또는 포유동물 세포), 안정화된 온전한 세포 및 안정화된 세포/막 호모제네이트를 포함한다. 안정화된 온전한 세포 및 안정화된 세포/막 호모제네이트는 효소를 발현하는 천연적으로 발생하는 미생물 또는 상술한 효소를 발현하도록 (예, 재조합 기술에 의해) 유전적으로 변형된 미생물, 곤충 세포 또는 포유 동물세포의 호모제네이트를 포함한다. 효소를 부착하는 방법이 이하에서 기술되지만, 그러한 방법은 박테리아 및 다른 세포를 부착하는데에도 동등하게 적용할 수 있으며, 그러한 양태에서 세포는 용균할 수 있다.
효소를 고정화하는 다양한 방법이 Industrial Enzymology 2nd Ed., Godfrey T. and West, S. Eds., Stockton Press, New York, N.Y., 1996, pp.267-272; Immobilized Enzyme, Chibata, I. Ed. Halsted Press, New York, N.Y., 1978; Enzymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Laskin, A. Ed., Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., Menlo Park, Califonia, 1985; 및 Applied Biochemisty and Bioengineering, Vol.4, Chibata, I. and Wingard, Jr., L.Eds, Academic Press, New York, N.Y., 1983에 개시되어 있으며 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.
간단하게 고체 지지체는 임의의 고체 유기 지지체, 인공 막, 생폴리머 지지체 또는 분리된 효소의 활성에 심각하게 영향을 미치지 않고 효소와 부착할 수 있는 무기 지지체를 의미한다. 예시 유기 지지체는 폴리스티렌, 나일론, 페놀-포름알데히드 수지, 아크릴 코폴리머(예, 폴리아크릴아미드), 안정화된 온전한 전체 세포 및 안정화된 천연 그대로의 전체 세포/막 호모제네이트와 같은 폴리머를 포함한다. 예시 생폴리머 지지체는 셀룰로오스, 폴리덱스트란(예, 세파덱스), 아가로스, 콜라겐 및 키틴을 포함한다. 예시 무기 지지체는 유리 비드(다공성의 및 무공성), 스테인레스 스틸 및 산화 금속(예, ZrO2, TiO2, Al2O3 및 NiO) 및 모래를 포함한다. 바람직하게는 고체 지지체는 안정화된 온전한 세포 및/또는 천연 그대로의 세포 호모제네이트로부터 선택된다. 그러한 지지체의 준비는 최소한의 처리와 비용을 요구한다. 또한, 그러한 지지체는 효소의 최대한 안정성을 제공한다.
효소는 흡착, 교차연결(공유 결합을 포함한) 및 포착(entrapment)을 포함한 다양한 방법에 의해 고체 지지체에 부착된다. 흡착은 반데르 발스 결합, 수소 결합, 이온 결합 또는 소수성 결합을 통하여 이루어질 수 있다. 흡착에 의한 고정화의 예시 고체 지지체는 고분자 흡착제 및 이온 교환 수지를 포함한다. 비드 형태의 고체 지지체가 특히 적합하다. 흡착 고체 지지체의 입자 크기는 고정화되는 효소가 기질(예, 오일)이 목적한 속도로 반응기를 이동하는 동안에 메쉬 여과지에 의해 반응기에 보존되도록 선택될 수 있다. 다공성의 미립자 지지체로 미립자의 중 공 내부로 효소 또는 박테리아 세포가 위치하도록 흡착 공정을 조절하여 활성의 바람직하지 않은 손실로부터 보호하는 것이 가능하다.
본 발명에서 기술된 각 간행물 및 참고문헌들은 이의 전문이 본 발명에서 참조로 인용된다.
하기 실험 결과는 예시를 목적으로 제공하는 것이지 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
도 1은 재조합 대장균에서 글루코사민의 생합성과 대사 경로를 간략하게 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 대장균에서의 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민의 과잉 생산을 위하여 경로에 신규한 변형을 나타낸 것이다.
도 3은 글루코오스로부터 글루코사민으로의 경로와 다른 경쟁적인 경로의 개요를 나타낸 것이다(PGI = 포스포글루코이소머라제; PGM = 포스포글루코뮤타제; PFK = 포스포프룩토키나제; zwf = 글루코오스-6-포스페이트 디하이드로제나제; GlmS = 글루코오스-6-P 신타제; 포스파타제 = 글루코사민-6-포스페이트의 가수분해에 관여하는 포스파타제 활성).
도 4는 재조합 바실러스 섭틸리스의 GlmS 효소의 활성에 대한 글루코사민-6-포스페이트의 영향을 나타낸 선형 그래프이다.
도 5는 저농도의 글루코사민-6-포스페이트에서 다양한 GlmS 단백질들의 글루코사민 신타제 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 쉐이크 플라스크 배양 중에 시간이 경과함에 따른 효소 활성의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 쉐이크 플라스크에서 서로 다른 조건에서 락토오스에 의해 유도된 글루코사민 생산의 정도를 나타낸 막대 그래프이다(락토오스에 의해서 유도된 균주는 7107-16이며 대조군 균주는 2123-54이다).
도 8은 초기 성장 단계 이후에 락토오스에 의해 유도된 세포 배양에서의 글루코사민 생산에 미량 원소의 영향을 나타낸 선형 그래프이다.
도 9는 발효조에서의 글루코사민의 생산에 포스페이트 양과 철 투입이 미치는 영향을 나타낸 선형 그래프이다.
도 10은 20gl-1의 글루코사민으로 서로 다른 pH에서 7107-18의 성장 곡선을 나타낸 선형 그래프이다.
도 11은 1-리터 발효조에서 서로 다른 환경 조건에서 2123-54 균주의 글루코사민의 생산을 나타낸 선형 그래프이다.
도 12는 서로 다른 pH에서 글루코사민의 분해를 나타낸 선형 그래프이다(M9A-글루코오스 배지에서 60gl-1).
도 13은 M9A 배지(글루코오스 제외)에서 N-아세틸글루코사민의 안정성을 나타낸 것으로 상기 안정성은 두 농도의 N-아세틸글루코사민(40 및 80g/l)과 두 pH(5.5 내지 7.0)에서 측정되었다.
도 14는 N-아세틸글루코사민 생산을 위한 선택적인 경로의 개요이다.
도 15는 포스포글루코이소머라제 활성(Pgi)에 대한 인산화된 아미노당의 영향을 나타낸 선형 그래프이다.
도 16은 글루코오스-6-포스페이트-디하이드로제나제에 대한 인산화된 아미노당의 영향을 나타낸 선형 그래프이다.
도 17은 N-아세틸글루코사민 발효 중에 효소의 활성 정도를 나타낸 선형 그래프이다.
도 18은 쉐이크 플라스크 실험에서 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 오탄당 및 글루코네이트의 영향을 나타낸 것이다(각 당은 쉐이크 플라스크에 10gl-1로 배지에 첨가한다).
도 19는 발효조에서 초기 및 후기 IPTG 유도로 7107-87#25에 의해 N-아세틸글루코사민 생산을 나타낸 것이다.
도 20은 N-아세틸글루코사민 생산에 아연 및 철 농도의 영향을 나타낸 선형 그래프로, 특히 아연을 제거함으로 인한 이로운 효과를 나타낸다.
도 21은 N-아세틸글루코사민(M9A 배지에 10g/l)의 산/가열 가수분해를 나타낸 선형 그래프이다.
도 22는 산/가열 가수분해 조건에서 글루코사민의 안정성을 나타낸 것이다(M9A 배지에 10g/l).
도 23은 서로 다른 온도에서 0.1N 염산을 이용하여 N-아세틸글루코사민(M9A 배지에 20g/l)의 산 가수분해를 나타낸 선형 그래프이다.
도 24는 90℃에서 N-아세틸글루코사민/글루코사민 가수분해를 나타낸 선형 그래프이다.
도 25는 90℃에서 N-아세틸글루코사민/글루코사민 가수분해로부터 암모니아의 형성을 나타낸 선형 그래프이다.
다음은 본 발명에서 언급 및/또는 기술된 다양한 유전적으로 변형된 미생물의 리스트이다. 균주들 중 일부는 위에서 인용된 미국특허 US 6,372,457에 개시되어 있으며 본 발명에서 특이적으로 기술된 유전적 변형을 위한 부모 균주로서 이용되었다.
Figure 112004063145669-pct00001
Figure 112004063145669-pct00002
Figure 112004063145669-pct00003

주:
1) 표에 기재된 모든 균주는 동일한 부모 균주 W3110으로부터 유도되었다.
2) 표에 기재된 주요 균주는 균주 7107-18(TetR::Δnag manXYZ DE3 T7-glmS*54::galK)로부터 개발되었다. 단순화를 위해 이 균주의 유전자형을 새로운 변환이 추가된 7107-18로 기재되어 있다.
3) 대장균이 아닌 다른 기원으로부터의 유전자를 2개의 문자로 구별하였다. Sc: 사카로마이세스 세레비시애, Ca: 캔디다 알비칸스, At: 아라비돕시스 탈리아나, Bs: 바실러스 섭틸리스
4) 유전자 통합을 위해 삽입된 발현 카세트는 그것이 다르게 지정된 경우를 제외하고 표적 사이트의 유전자 또는 오페론과 동일한 방향이다.
< 실시예 1 >
본 실시예에서는 보다 좋은 글루코사민 생산을 위한 돌연변이 스크린을 기술한다.
미국 특허 제 6372457호(여기에서 참고자료로 완전히 통합됨)에서는 많은 양의 글루코사민을 생산하는 재조합 대장균(E. coli) 균주에 대해 개시하고 있다. 이 균주는 대사성 공학 기술 접근법을 사용하여 구축되었다. 이 접근법은 세 단계로 구성된다. 첫 번째 단계는 물질대사와 글루코사민 및 그 6-포스페이트 유도체의 유입을 제한하는 돌연변이를 도입하는 것이다. 두 번째 단계는 핵심 생합성 효소인 글루코사민 신타제(glucosamine synthase; GlmS)를 암호하하는 대장균 glmS를 과잉 발현(over-express)시키는 것이다. 세 번째 단계는 생체외(in vitro)에서 효소의 돌연변이 유발에 의해 GlmS의 생산 억제를 최소화하는 것이다. 재조합 균주 2123-54는 T7 프로모터에 의한 제어하에 생산물-저항성 재조합 대장균 glmS 돌연변이 유전자를 보유했고 글루코오스가 보충된 단순 무기염 배지에서 쉐이크 플라스크 배양을 할 때 가장 높은 생산물 역가(product titer)를 나타냈다. 이 균주는 더욱 개선된 신규한 균주를 평가하기 위한 참고로서 사용되었다. 또한 상기 균주는 세포 성장과 IPTG로 유도되는 글루코사민 생산을 개선하기 위해 설계된 실험에서 사용되었다.

IPTG로 유도될 수 있는 글루코사민 생산 균주 2123-54의 유전자형:
2123-54는 W3110로 표시된 실험실의 대장균 K-12 균주로부터 유도되었다. 관련 유전자형을 표 1에 나타냈다.
글루코사민 생산 균주 2123-54의 유전자형
유전자적 변화 내 용
TetRatΔnag nag 레귤론 서열을 글루코사민-6-포스페이트 대사와 글루코사민 흡수에 관련된 유전자를 제거하는 테트라사이클린 저항성 마커로 대체.
manXYZ 돌연변이 만노오스에 특이적이고 또한 글루코사민을 수송하는 당 수송 시스템을 제거하는 돌연변이.
lacZ::T7-glmS*54 GlcN6P 신타제를 암호화하는 glmS 유전자를 과잉 발현하기 위한 통합 구조. glmS 유전자는 T7 프로모터에 의해 제어되어 위치된다. 상기 구조는 lacZ 유전자의 대장균 염색체에서 통합된다.*54 표시는 생산물에 의한 피드백 억제에 저항성이 있는 효소를 유발하는 glmS에서의 돌연변이를 나타낸다.
DE3 IPTG로 유도될 수 있는 lacUV 프로모터에 의해 구동되는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자를 암호화하는 유전자적 요소

nag 및 manXYZ 돌연변이는 글루코사민 생산에 긍정적 효과를 갖는 것으로 나타났고 새로운 생산 균주로 계속해서 운반되었다. T7 발현 시스템을 이용하여 대장균 야생형 glmS 유전자가 과잉 발현되었고 IPTG 유도를 이용하여 수 배 더 많은 양의 글루코사민을 생산하였다. 대장균 야생형 GlmS가 그 생산물인 글루코사민-6-포스페이트에 의해 강하게 억제되기 때문에 대장균 glmS 돌연변이주의 풀(pool)을 에러-프로운(error-prone) PCR에 의해 생산하고 상승된 글루코사민 생산물을 플레이트 투입 분석(plate feeding assay)에 의해 스크린하였다. 개선된 글루코사민 생산자에서 glmS* 돌연변이주를 발현하는 발현 구조를 염색체의 lacZ 부위에서 통합하여 안정한 생산 균주를 생성하였다. 다수의 돌연변이 균주가 생산물 저항성의 글루코사민 신타제를 합성하였다. 쉐이크 플라스크 실험에서 이 돌연변이 균주는 대장균 야생형 glmS 발현 구조를 갖는 균주와 비교할 때 글루코사민의 생산량이 크게 증가하였다. 균주 2123-54(T7-glmS* 54 발현 구조를 보유)는 리터당 11g 이상의 글루코사민을 생산하였다.
단순화된 쉐이크 플라스크 스크린 방법의 개발:
미국 특허 제 6372457호에 개시된 바와 같이 여러 글루코사민 생산 균주를 쉐이크 플라스크 배양에서 글루코사민 생산을 위해 글루코오스가 보충된 무기염 배지에서 성장시켰다. 이전의 실험에서 글루코오스와 황산 암모늄이 고갈되게 되면 그들을 배양액에 투입하여 연속적인 글루코사민 생산이 가능하였다. 그러나 이는 자주 모니터링하고 3일 동안(매 6 내지 8시간) 투입하여야 했다. 따라서 더욱 간단하면서도 여러 글루코사민 생산 균주를 신뢰할 수 있는 수준으로 평가할 수 있는 쉐이크 플라스크 배양 프로토콜의 개발이 요구되었다.
단순한 무기염 배지로서 글루코사민 생산에 사용된 것은 M9A였다(표 2 참조). 균주의 평가를 위해 3단계 프로토콜이 개발되었다. 제 1단계로 LB 플레이트에서 새롭게 성장한 세포를 사용하여 3ml LB에서 배양을 개시하고, 37℃에서 약 8시간 동안 성장시켰다. 제 2단계로 1.5ml의 배양액을 사용하여 50ml의 M9A 배지를 250ml 쉐이크 플라스크에 접종하고 상기 배양액을 약 16시간 동안(하룻밤 동안) 37℃에서 인큐베이션하고 225rpm으로 쉐이킹하였다. 배양액의 세포 밀도는 600nm에서 측정하였다. 이 단계는 세포를 최소의 배지에 적용하고 글루코사민 생산 결과의 재현가능성을 위해 포함되었다. 제 3단계로 250ml 쉐이크 플라스크에서 IPTG(0.2mM)를 포함하는 50ml M9A 배지에 세포 엘리쿼트(aliquot)을 첨가하였다. 초기 세포의 OD는 0.3이었다. 세포를 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하고 225rpm으로 쉐이킹하였다. 배양 액체배지에서 글루코사민의 양을 측정하기 위해 24, 48 및 72시간에 샘플(1ml)을 채취하였다. 24 및 48시간에 소량의 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정하였고, 20g l-1이 되도록 글루코오스를 첨가하였다. 이러한 실험 조건하에서 대조 균주 2123-54는 72시간에 약 6g l-1의 글루코사민을 생산하였다.
글루코사민 생산에 사용된 M9A 및 M9B 배지*
거대요소(g l-1) M9A M9B
KH2PO4 14 6
K2HPO4 16 24
Na3Citrate-2H2O 1 1
(NH4)2SO4 7.5 7.5
MgSO4-7H2O 0.25 0.25
CaCl2-2H2O 0.015 0.015
글루코오스 20 20
pH 7.0 7.0
* 발효를 위해 배지에 안티폼(antifoam)(Mazu 204 및 0.25ml/l)이 보충된다.
쉐이크 플라스크 실험에서의 돌연변이 스크린:
통합된 glmS 돌연변이 구조를 갖는 약 150개의 재조합 대장균 균주를 최적화된 프로토콜을 사용하여 재평가하였다. 에어리히 시약(Ehrlich's reagent)을 사용하여 비색 정량법에 따라 글루코사민을 분석하였다. 균주 2123-72 및 2123-103이 2123-54보다 조금 더 많은 글루코사민을 생산하였다(표 3 참조).
쉐이크 플라스크 배양에서 IPTG 유도된 글루코사민의 생산
균주 글루코사민(g l-1)
24시간 48시간 72시간
2123-54 2.085(100%)* 5.599(100%)* 6.462(100%)*
2123-72 2.141(103%) 6.699(120%) 7.791(120%)
2123-103 2.390(115%) 7.230(129%) 8.712(135%)
* 괄호에 표시된 백분율 값은 여러 시간에서 2123-54로부터의 값에 상대적이다.
1L 발효조에서 고 글루코사민 생산 균주 2123-72 및 2123-103의 평가:
잠재적으로 더 좋은 글루코사민 생산 균주 2123-72 및 2123-103을 1L의 발효조에서 2123-54와 비교하였다. 안티폼(0.25ml/l에서 Mazu 204) 및 미량원소가 보충된 개시 용적 475ml의 M9A 배지로 발효조를 준비하였다(표 4 참조). pH를 6.9로 제어하기 위해 75%의 NH4OH를 사용하여 발효를 진행하였다. 발효 동안 온도는 30℃로 유지하였다. 통기와 교반(agitation)을 이용하여 용존 산소 농도가 포화 공기의 20%를 유지하도록 조정하였다. 접종시 시간당 0.40의 성장속도, 6시간까지 최대 5ml/hr를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 발효시 정확한 pH, 산소 및 글루코오스 농도의 제어가 가능하였다. 플라스크에서보다 발효조에서 더욱 고농도의 글루코사민이 생성되었다.
각 균주의 2세트를 2개의 다른 조건에서 수행하였다. 발효조의 한 세트는 저농도의 글루코오스(10g l-1, 글루코오스 제한)로 시작하고 다른 세트는 고농도의 글루코오스(40g l-1, 과잉 글루코오스)로 시작하였다. 과잉 글루코오스 조건은 쉐이크 플라스크 성장 조건과 더욱 유사하였다. 글루코오스 제한 조건은 발효 실험에서 보통으로 사용되었고 일반적으로 2123-54로 더욱 높은 글루코사민 생산을 유발하였다. 배양액은 모두 발효 개시로부터 IPTG로 유도하였다. 글루코오스의 제한 또는 과잉 조건하에서 균주 2123-72 및 2123-103은 모두 50시간까지 14g l-1의 글루코사민을 생산하여 2123-54가 50시간까지 10g l-1을 생산한 것과 비교할 때 더욱 잘 수행하였다(데이터 미기재).
특정 실험에서 사용되는 성장 배지에 보충된 미량 원소
거대요소 mg l-1
CoCl2-6H2O 0.87
H3BO3 1.72
CuCl2-2H2O 0.60
FeCl3-6H2O 10.50
MnCl2-4H2O 12.00
ZnCl2 1.50
Na2MoO4-2H2O 1.50

< 실시예 2 >
본 실시예에서는 글루코사민 생산을 위한 과잉 발현하는 여러 glmS 유전자를 기술한다.
세균성 글루코사민 신타제 유전자(glmS) 및 효모 상동체(GFA 유전자)을 클로닝하고 대장균에서 발현시켜 글루코사민 대사 경로 공학기술에서 그들의 유용성을 증명하였다. 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로부터 여러 유전자를 PCR로 증폭하고, 발현 벡터 pET24d(+)의 T7 프로모터 제어하에 두었다. 상기 구조를 대장균 균주 7101-17(DE3)로 형질전환하고 자유 복제 플라스미드로서 유지하였다. 또한 T7 프로모터에 의해 구동된 캔디다 알비칸스 GFA1 유전자를 염색체 내의 7101-17(DE3) lacZ 사이트에서 통합하였다. IPTG 유도를 사용하여 여러 glmS 및 GFA 유전자의 숙주 균주의 유전자 발현과 글루코사민 생산에 대해 평가하였다.
바실러스 섭틸리스 glmS 유전자 클로닝:
바실러스 섭틸리스 glmS 유전자는 1803 bp의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 보유하고 약 65kDa(세포에서 보통 제거되는 개시제 메티오닌을 제외하고 599 잔기)의 단백질을 암호화한다. 바실러스 섭틸리스 glmS 개방 리딩 프레임의 핵산서열이 서열번호 15에 기재되어 있다. 디듀스된(deduced) 바실러스 섭틸리스 GlmS 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 16에 기재되어 있다. 상기 glmS 유전자를 균주 ATCC23856 및 ATCC23857로부터 PCR로 증폭하였다. 포워드 프라이머는 ATG 개시 코돈 및 Bsa I 사이트를 포함하였다(서열번호 21): 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGA ATC GTA GGT TAT ATC GGT C-3'. 리버스 프라이머는 종료 코돈 및 Xho I 사이트를 포함하였다(서열번호 22): 5'-GAT CCT CGA GTT ACT CCA CAG TAA CAC TCT TCG CAA GGT TAC G-3'.
예상한 크기의 PCR 생산물을 pET24d(+)(Novagen Inc, Wisconsin)로 라이게이션하였다. 벡터를 효소 Nco I 및 Xho I로 전분해(predigestion)하였다. 재조합 플라스미드 pSW07-15#83을 제한 분석에 의해 확인하고 7101-17(DE3)로 형질전환하여 대장균 균주 7107-24(바실러스 섭틸리스 ATCC23856으로부터의 glmS 유전자) 및 7107-25(바실러스 섭틸리스 ATCC23857로부터의 glmS 유전자)를 생성하였다. 대조군으로서 공벡터(empty vector) pET24d(+)를 또한 7101-17(DE3)로 형질전환하여 균주 7107-22를 생성하였다.
사카로마이세스 세레비시애 GFA1 유전자 클로닝:
사카로마이세스 세레비시애 GFA1 오픈 리딩 프레임은 2154bp 및 716 잔기(개시제 메티오닌 제외)의 펩티드를 암호화한다. 사카로마이세스 세레비시애 GFA1의 핵산서열이 서열번호 17에 기재되어 있다. 디듀스된(deduced) 사카로마이세스 세레비시애 GFA1 단백질의 아미노산 서열이 서열번호 18에 기재되어 있다. 서열로부터 예상된 단백질 크기는 약 80kDa였다. GFA1 유전자 서열에는 인트론이 존재하지 않아 균주 사카로마이세스 세레비시애 S288C(ATCC204508)로부터 준비한 유전체 DNA로부터 유전자를 증폭하였다.
ATG 개시 코돈 및 Bsa I 사이트를 포함하는 포워드 프라이머의 서열은 다음과 같다(서열번호 23): 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATC TTT GGT TAC-3'. 종료 코돈 및 EcoR I 사이트를 포함하는 리버스 프라이머의 서열은 다음과 같다(서열번호 24): 5'-GAT CGA ATT CTT ATT CGA CGG TAA CAG ATT TAG-3'.
약 2.2kb의 PCR 생산물을 pPCR-Script Amp SK(+)로 클로닝하였다. 재조합 플라스미드를 제한 효소 분해로 확인하였다. 사카로마이세스 세레비시애 GFA1 단편을 EcoR I 및 Bsa I의 분해에 의해 분리하고 pET24d(+)의 EcoR I 및 Nco I 사이트로 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드를 제한 분석에 의해 확인하고 7101-17(DE3)로 형질전환하여 대장균 균주 7107-101을 생성하였다.
캔디다 알비칸스 GFA1 클로닝
캔디다 알비칸스 GFA1 유전자는 인트론이 없고 상기 유전자의 2142-bp 오픈 리딩 프레임은 약 80kDa(712 잔기, 개시제 메티오닌 제외)의 펩티드를 암호화한다. 캔디다 알비칸스 GFA1 개방 리딩 프레임의 핵산서열은 서열번호 19에 기재되어 있다. 디듀스된 캔디다 알비칸스 GFA1 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 20에 기재되어 있다. 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 사용하여 GFA1 코딩 서열을 균주 ATCC10261로부터 PCR로 증폭하였다. 포워드 프라이머는 ATG 개시 코돈 및 Bsa I 사이트를 포함하였다: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GTC-3'(서열번호 25). 리버스 프라이머는 종료 코돈 및 Xho I 사이트를 포함하였다: 5'-GAT CCT CGA GTT ACT CAA CAG TAA CTG ATT TAG CC-3'(서열번호 26).
PCR 생산물을 벡터 pMOSBlue(Amersham Pharmacia Biotech, New Jersey)로 클로닝하고 재조합 플라스미드를 제한 효소 분해로 확인하였다. Bsa I-Xho I 단편을 분리하고 Nco I 및 Xho I로 분해하여 제조된 pET24d(+)로 라이게이션하였다. 합성된 플라스미드를 숙주 7101-17(DE3)로 형질전환하여 대장균 균주 7107-23을 생성하였다.
캔디다 알비칸스 GFA1 유전자를 또한 발현 벡터 pET23b(+)(Novagen Inc)로 클로닝하였다. pET24d(+)와는 달리 이 벡터는 T7 프로모터의 하류에(downstream) lac 오퍼레이터(operator) 서열을 포함하지 않는다. lac 오퍼레이터의 부재는 더 많은 양의 재조합 단백질의 발현을 유발할 수 있다. 캔디다 알비칸스 GFA1 유전자 코딩 서열을 효모 유전체 DNA로부터 PCR로 증폭하였다. 포워드 프라이머는 ATG 개시 코돈 및 Nde I 사이트를 포함하였다: 5'-GCG GGT ACC CAT ATG TGT GGT ATT TTT GGT TAC GT-3'(서열번호 27). 리버스 프라이머는 BamH I 사이트를 포함하였다: 5'-GCG GGA TCC TTA CTC AAC AGT AAC TGA TTT AGC CA-3'(서열번호 28). 정확한 크기의 PCR 생산물을 Nde I 및 BamH I 사이트에서 pET23b로 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드를 제한 분석으로 확인하고 발현 숙주 7107-17(DE3)로 형질전환하여 대장균 균주 7107-58 및 7107-59를 생성하였다. 대조군으로서 공벡터 pET23b를 또한 7107-17(DE3)로 형질전환하여 균주 7107-57을 생성하였다.
대장균 pET 발현 시스템을 사용한 캔디다 알비칸스 GFA1 단백질의 과잉 발현이 이미 공지되어 있다(P. Sachadyn et al., Protein Expression and Purification 19, 343-349 2000). 그러나 글루코사민 생산은 전혀 증명되거나 논의되지 않았다. 또한 보고된 GFA1 유전자는 상이한 캔디다 알비칸스 균주(ATCC13153)로부터 클로닝되었다. 비록 두 GFA1 단백질이 동일한 아미노산 서열을 갖지만 ATCC13153으로부터의 GFA1 유전자는 ATCC10261에서와 같이 TTA 및 GCT 대신에 각각 CTA 및 GCC에 의해 암호화된 잔기 Leu 29 및 Ala 655를 갖는다. 잔기 Leu 29 및 Ala 655에서 여러 코돈을 사용하는 것이 대장균의 GFA1 유전자 발현에 영향이 있는지 여부에 대한 테스트가 시도되었다. Stratagene QuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, CA)에 기초한 방법을 사용하는 사이트가 유도된 돌연변이 유발을 수행하여 플라스미드 pET23b(+)/캔디다 알비칸스 GFA1에서 Leu 29 코돈을 CTA로, Ala 655 코돈을 GCC로 전환하고 플라스미드 pET23b(+)/캔디다 알비칸스 GFA1-M을 생산하였다. 신규한 플라스미드에서 시퀀싱으로 양 돌연변이의 존재를 확인하였고 상기 플라스미드를 7107-17(DE3)로 형질전환하여 대장균 균주 7107-60 및 7107-61 을 생성하였다.
GlmS 및 GFA 단백질 과잉 발현:
여러 glmS 및 GFA1 유전자를 포함하는 pET 벡터로 형질전환한 균주를 LB 배지에서 성장시켜 GlmS 및 GFA1 단백질 발현을 증명하였다. 우선 세포를 시험튜브 내의 LB 배지에서 37℃의 온도로 하룻밤 성장시켰다. 플라스미드를 유지하기 위해 상기 배지에 카나마이신(25mg l-1)을 보충하였다. 그 다음 50㎕의 하룻밤 배양 이식편을 사용하여 250ml 배플 플라스크(baffled flask)에서 50ml 배양을 개시하였다. 배양액을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하고 225rpm에서 쉐이킹하였다. 이 때 IPTG를 첨가하여 최종농도를 1mM으로 조정하였다. 3시간의 유도 후 SDS-PAGE 분석을 하여 배양액을 수거하였다. 음성 대조군으로서 pET24d(+) 공벡터를 갖는 세포를 또한 성장시켜 분석하였다. 비교를 위해 야생형 대장균 glmS 유전자 및 T7 프로모터로 구동되고 염색체의 lacZ 사이트에서 통합되는 돌연변이 glmS*54 유전자를 갖는 대장균 세포를 항생제 선별 없이 상기와 같이 성장시켰다.
SDS-PAGE는 다음의 표준 방법으로 수행되었다. T7-대장균 glmS 발현 카세트를 pET 플라스미드에 보유하거나 염색체 내에서 통합할 때, 매우 많은 양의 GlmS 단백질이 발현되었다(데이터 미기재). 플라스미드 pET24d(+)/T7-바실러스 섭틸리스 glmS의 숙주 세포가 GlmS 단백질의 예상 크기인 약 65kDa 단백질을 과잉 발현하였다(데이터 미기재). 통합된 카세트로부터의 발현 수준은 pET 플라스미드에 보유 된 대장균 glmS 유전자를 발현하는 세포와 비교할 만하였다.
사카로마이세스 세레비시애 GFA1 유전자의 숙주 세포는 예상 크기의 효모 단백질(80kDa, 데이터 미기재)이 과잉 발현된 단백질 밴드(band)를 명확하게 나타냈다. 캔디다 T7- 알비칸스 GFA1 발현 카세트(데이터 미기재)를 포함하는 균주 7107-23에서 80-kDa 단백질 밴드(band)의 합성은 공벡터를 갖는 균주와 비교할 때 명백하지 않았다(데이터 미기재). 그러나 GFA1 밴드는 벡터 pET23b(+)에 기초한 벡터에 의해 운반되는 캔디다 알비칸스 GFA1 유전자를 포함하는 균주 7107-58 및 7107-59에서 과잉 발현되었다(데이터 미기재). 발현량은 pET24d(+)에 기초한 벡터를 갖는 균주 7107-23보다 분명히 많았다. Leu 29 및 Ala 655에 대한 대체 코돈의 사용은 대장균에서 캔디다 알비칸스 GFA1 단백질 발현에 영향을 주지 않았다.
대장균에서 효모 GFA1 유전자의 발현량은 세균성 glmS 유전자와 비교할 때 모두 낮았다. 이는 대장균 숙주에서 진핵 유전자를 발현하려고 할 때 보통 관찰된다.
글루코사민-6-포스페이트 신타제 활성 분석:
효소 활성과 글루코사민 생산을 측정하기 위해 여러 균주를 M9A 배지에서 성장시켰다. 3단계의 프로토콜이 배양액의 제조에 사용되었다. 제 1단계로 LB 플레이트에서 새롭게 성장한 세포를 사용하여 3ml LB에서 배양이 개시되고, 37℃에서 약 6시간 동안 성장시켰다. 제 2단계로 1.5ml의 배양액을 사용하여 250ml의 배플 플라스크에 50ml M9A 배지를 접종하고 상기 배양액을 약 16시간 동안(하룻밤) 37℃ 에서 인큐베이션하고 225rpm으로 쉐이킹하였다. 이 단계는 세포를 최소의 배지에 적용하고 글루코사민 생산 결과의 재현가능성을 위해 포함되었다. 제 3단계로 250ml 배플 플라스크에서 IPTG(1mM)를 포함하는 50ml M9A 배지에 세포 엘리쿼트(aliquot)을 첨가하였다. 개시 세포 밀도는 0.3 OD600으로 조정하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고 225rpm으로 쉐이킹하였다. 원심분리 이후 배양 액체배지를 글루코사민 분석에 사용하고 세포 펠렛을 사용하여 글루코사민 신타제 활성을 측정하였다. 대표적인 실험 결과 데이터를 표 5에 나타냈다.
효소 활성은 바실러스 섭틸리스 glmS 유전자(인코딩 서열번호 16)를 발현하는 대장균 세포에서 용이하게 발견할 수 있었다. 활성 수준은 대장균 glmS(인코딩 서열번호 2) 및 대장균 glmS*54 돌연변이(인코딩 서열번호 6) 유전자를 포함하는 구조를 갖는 세포와 비교할 만하였다. 그러나 효모 GFA1 유전자(인코딩 서열번호 18 및 서열번호 20)의 숙주 세포에서는 미량의 효소 활성만이 관찰되었다. M9A 배지에서의 배양액으로부터 활성 데이터는 LB 배지에서 성장한 세포를 SDS-겔 분석한 결과와 대체로 일치하였다. 낮은 단백질 발현량은 효모 GFA1 유전자 숙주 세포에서 낮은 효소 활성을 설명하는 주된 이유 중 하나인 것으로 생각되었다.
여러 glmS 및 GFA1 유전자 발현에 의한 글루코사민 생산:
매우 적은 양의 글루코사민이 생산되고 공벡터 pET24d(+)로 형질전환된 7101-17(DE3)의 배양배지에 분비되었다(표 5 참조). 세균성 glmS 유전자(대장균 glmS 또는 바실러스 섭틸리스 glmS)의 발현으로 글루코사민 생산이 50배 이상 증가하였다. 또한 효모 GFA1 유전자를 발현하는 배양액에서는 글루코사민의 양이 수 배 증가하는 것으로 관찰되었다. pET24d(+)와 비교할 때, pET23b(+)의 사용으로 더 많은 양의 캔디다 알비칸스 GFA1 단백질 및 글루코사민 생산을 유발했다. 캔디다 알비칸스 GFA1 유전자에서 Leu 29 및 Ala 655 코돈의 변화는 글루코사민 생산량에 영향을 주지 않았다. 이러한 관찰 결과는 SDS-PAGE 분석 결과와 대체로 일치하였다. 효소 활성 분석으로 관찰할 때 균주 7107-214에서보다 2123-12에서 더 많은 양의 글루코사민이 생산되어 염색체에서 T7-대장균 glmS 발현 카세트의 통합이 유리한 것으로 생각되었다. 염색체에서 통합된 대장균 glmS*54를 갖는 대장균 균주는 다른 시험균주와 비교할 때 글루코사민 생산이 더 우수하였다.
여러 glmS 및 GFA1 상동체를 발현하는 대장균 균주에서의 글루코사민 신타제 활성 및 글루코사민 생산
균주 번호 균주 설명 효소 활성
(nmol min-1 mg-1)		 글루코사민
(mg l-1)
7107-22 pET24d(+) 미량 5
7107-24 pET24d(+)/T7-바실러스 섭틸리스 glmS 23856 637 128
7107-101 pET24d(+)/T7-사카로마이세스 세레비시애 GFA1 미량 47
7107-23 pET24d(+)/T7-캔디다 알비칸스 GFA1 미량 23
7107-58 pET23d(+)T7-캔디다 알비칸스 GFA1 미량 54
7107-60 pET23d(+)T7-캔디다 알비칸스 GFA1-M 미량 58
7107-214 pET24d(+)/T7-대장균 glmS 297 37
2123-12 lacZ::T7-대장균 glmS 613 75
2123-54 lacZ::T7-대장균 glmS*54 803 2029

주:
1) 숙주 세포: 대장균 7107-17(DE3). 유전자형: nagΔ, manXYZ DE3.
2) 세포 배양: 리터 당 7.5g의 (NH4)2SO4 및 리터 당 40g의 글루코오스가 보충된 M9A 배지를 함유하는 쉐이크 플라스크에서 26시간 동안 30℃.
3) 캔디다 알비칸스 GFA1(M): TTA와 GCT가 각각 CTA와 GCC로 변화된 Leu 29 및 Ala 655 코돈.
< 실시예 3 >
본 실시예에서는 여러 생산물 저항성 GlmS 효소(대장균 GlmS 돌연변이주 및 야생형 바실러스 섭틸리스 GlmS)의 특성을 기술한다.
천연 B. subtillus GlmS, 천연 대장균 GlmS 및 돌연변이 대장균 GlmS를 포함하여 여러 글루코사민 신테타제 효소가 생체외에서 연구되었다. 다양한 대장균 균주의 세포를 M9A 배지에서 성장시키고 수거한 다음 동결시켰다. 세포 추출물을 준비하고 글루코사민 신테타제를 특성화시킨 다음 비교하였다. 강한 생산물 저항성을 나타내고 재조합 대장균에서 높은 글루코사민을 생산을 유발하는 두 개의 추가 대장균 glmS 돌연변이주에 대한 DNA 서열을 결정하였다.

글루코사민-6-P에 의한 억제에 대한 민감도:
반응 생산물 글루코사민-6-P에 대한 효소 민감도를 검사하였다. 0 내지 30mM 글루코사민-6-P의 범위에서 글루타민과 프룩토오스-6-포스페이트양을 포화시킬 때의 초기 속도를 검사하였다. 실험 결과를 도 4 및 도 5에 나타냈다. 균주 2123-12로부터의 대장균 천연 GlmS 효소는 글루코사민-6-P 1mM에서 약 50%의 활성을 상실한다. 계속해서 글루코사민-6-P 양이 증가함에 따라 활성이 감소한다. 균주 2123-54에서 1mM의 글루코사민-6-P는 효소 활성에 실질적으로 영향이 없다. 이 양 이상에서 억제는 대체로 선형적이고 10mM의 글루코사민-6-P에 약 50%의 활성이 잔존한다. 다른 균주, 예컨대 2123-4, 2123-59, 2123-64, 2123-72, 2123-103 및 2123-124로부터의 돌연변이 GlmS 효소도 GlcN-6-P 억제에 대해 민감도가 감소하는 것으로 나타났다. 도 5에 상대적으로 "낮은"[글루코사민-6-P]에서의 활성이 나타나 있다. 도 5에서 야생형 GlmS와 이 돌연변이 GlmS 균주 사이에 극단적인 차이가 부각되어 있다. 매우 적은 양의 글루코사민-6-P는 천연 GlmS 효소를 유의적으로 억제한다.
야생형 Bacillus glmS 유전자가 대장균에서 과잉 발현할 때, 야생형 대장균 glmS 유전자의 과잉 발현보다 많은 양의 글루코사민이 생산되었다. 흥미롭게도 천연 Bacillus 효소는 대장균 돌연변이 GlmS 효소와 매우 비교할 만한 생산물 저항성을 나타냈다(도 4 참조). B. subtillus 효소의 활성을 0, 2 및 4mM의 글루코사민-6-P에서 측정하였다. 효소의 Km값(프룩토오스-6-포스페이트)은 0.62mM이고 Ki(글루코사민-6-P)는 1.25mM이다(데이터 미기재).
[억제제]에 대한 Vmax의 비선형 회귀값의 2차 도표에 의해 균주 2123-12에 대해 0.56mM의 억제 상수(Ki)를 산출하였다. 돌연변이 2123-54 및 바실러스 섭틸리스 효소는 더 높은 Ki 값을 갖는다(표 6 참조). 이 돌연변이주들에서 측정된 여러 Ki 상수는 균주 2123-12에서의 천연 효소에 대한 값의 4 내지 8배이다. 쉐이크 플라스크 연구로부터 글루코사민-6-P에 대한 감소된 민감도에 의해 더 많은 양의 글루코사민이 축적된다는 것이 명백하다. 이는 세포내 [글루코사민-6-P]가 재조합 대장균 균주에서 매우 높다는 것을 나타내고(멀티 밀리몰러; multi millimolar) 글루코사민 신테타제 활성의 감소를 유발한다는 것을 강하게 암시한다. 극단적으로 감소한 글루코사민-6-P 억제에 대한 민감도는 돌연변이 대장균 GlmS와 야생형 Bacillus GlmS 효소를 과잉 발현하는 균주에서 글루코사민 합성이 증가하는 것을 가장 간단하게 설명한다.
기질 프룩토오스-6-P 및 글루타민의 친화도:
글루타민과 프룩토오스-6-포스페이트에 대한 Michaelis-Menten 상수를 천연 추출물을 사용하여 측정하였다(표 6 참조). 야생형 대장균 GlmS 효소(균주 2123-12)에 의해 비선형 회귀값은 0.20mM(프룩토오스-6-포스페이트)와 0.17mM(글루타민)으로 산출되었다. 돌연변이 GlmS*54(균주 2123-54)를 사용한 유사 실험에서 산출된 값은 0.64mM(프룩토오스-6-포스페이트)와 0.73mM(글루타민)이었다. 이 값들은 천연 효소로 얻어진 값보다 조금 높다. 대장균(균주 7107-24)에서 발현된 바실러스 섭틸리스 GlmS 효소는 돌연변이 대장균 효소 GlmS*54와 매우 유사한 Km 값(프룩토오스-6-P)을 나타냈다.
여러 GlmS 효소의 특성
효소원 Ki(GlcN-6-P)
(mM)		 Km(프룩토오스-6-P)
(mM)		 Km(글루타민)
(mM)
WT 대장균 GlmS 0.56 0.20 0.17
돌연변이 대장균 GlmS*54 4.00 0.64 0.73
돌연변이 대장균 GlmS*110 1.60 0.41 결정되지 않음
돌연변이 대장균 GlmS*124 3.50 1.10 결정되지 않음
돌연변이 대장균 GlmS*69 1.50 0.35 결정되지 않음
돌연변이 대장균 GlmS*72 1.40 0.95 결정되지 않음
야생형 바실러스 GlmS 1.25 0.62 결정되지 않음

열 안정성:
여러 GlmS 효소의 열 안정성에서 가능한 차이점을 측정하기 위해 50℃에서 변성하였다. 천연 추출물을 50℃에서 인큐베이션 하고 90분 동안 샘플로 조사하였다. 모든 기질의 양을 포화시키면서 25℃에서의 글루코사민 신테타제 활성에 대해 상기 샘플을 분석하였다.
50℃에서의 열 안정성과 글루코사민 생산 사이에서 유의적인 상호관계는 나타나지 않았다(데이터 미기재). 균주 2123-124가 가장 낮은 안정성을 나타냈지만 가장 좋은 글루코사민 생산 균주의 하나인 것으로 나타났다. 열 안정성에 있어 균주 12, 54 및 59 사이에 유의적인 차이는 거의 없으나 다른 실험으로부터 발명자들 은 균주 54가 글루코사민 생산을 위해 더 좋은 균주인 것을 알고 있다.
< 실시예 4>
본 실시예에서는 GlmS 서열 분석을 기술한다.
균주 2123-72와 2123-103를 숙주 균주 7107-17(DE3)로부터 각각 플라스미드 pKIN23-72 및 pKLN23-103으로 형질전환하고 통합한 실험에 의해 유도하였다. 이 플라스미드의 glmS 영역(glmS*72와 glmS*103)을 시퀀싱하였다. 대장균 glmS* 72 돌연변이주 코딩 서열의 핵산서열은 서열번호 13에 기재되어 있다. 디듀스된 대장균 GlmS*72 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 14에 기재되어 있다.
흥미롭게도 양 돌연변이주 모두 위치 15, 387, 450 및 525에서(표 7 참조) 아미노산 치환을 나타내는 동일한 돌연변이를 갖는 것으로 나타났다. 대장균 야생형 GlmS(서열번호 2), 돌연변이 GlmS*49(서열번호 4), GlmS*54(서열번호 6) 및 GlmS*124(서열번호 8)의 관련 위치에서의 잔기가 비교를 위해 기재되어 있다. GlmS*72는 다른 생산물 저항성 GlmS 돌연변이주와 관련해서 일반적 돌연변이는 없지만 예외적으로 위치 450에서 세린이 프롤린으로 치환된 것이 관찰된다. 이는 GlmS*49와 GlmS*72에서도 발견되었다. 흥미롭게도 세 개의 GlmS 돌연변이 효소(GlmS*49, 72 및 124)는 450에서 469까지의 영역에서 한 잔기의 프롤린으로의 치환 을 유발하는 돌연변이가 있다. GlmS*54는 위치 472에서도 잔기의 치환이 있어 글리신이 세린으로 대체된다. 이 데이터는 단백질의 이 영역에서의 변화가 효소의 생산물 저항성에 중요한 역할을 함을 암시한다.
생산물 저항성 글루코사민 신타제를 암호화하는 대장균 돌연변이 glmS 유전자에서의 염기 변화
위치* 15 387 450 525
WT glmS Glu(GAA) Asp(GAT) Ser(TCT) Glu(GAA)
돌연변이 glmS*72 Lys(AAA) Val(GTT) Pro(CCT) Gly(GGA)
*단순성을 위해 위치는 디듀스된 아미노산 서열에 번호를 붙여 결정한다.
여러 세균성 glmS 코딩 서열의 핵산서열을 Megalign Program, J. Hein Method, Lasergene software(DNA Star, Inc, Madison, WI)의 표준 세팅을 사용하여 분석하였다. 핵산서열로부터 디듀스된 아미노산 서열 또한 Megalign Program, Lipman-Pearson Protein Alignment, Lasergene software(DNA Star)의 표준 세팅을 사용하여 비교하였다. 결과를 표 8에 나타냈다.
여러 미생물로부터의 글루코사민 신타제 효소의 펩티드 크기와 상동성
GlmS 아미노산 번호* 펩티드
크기(kDa)		 펩티드 서열 상동성(% 동일성)**
대장균 바실러스 섭틸리스 사카로마이세스 세레비시애 캔디다 알비칸스
대장균 608 67 41(50) 42(47) 42(46)
바실러스 섭틸리스 599 65 36(45) 36(45)
사카로마이세스 세레비시애 716 80 72(72)
캔디다 알비칸스 712 79
* 아미노산 잔기 번호는 해독 후 효소적으로 제거되는 개시제 메티오닌을 포함하지 않는다.
** 괄호는 뉴클레오타이드 수준에서의 상동성을 나타낸다.
바실러스 섭틸리스 glmS 유전자는 대장균 상동체보다 9 잔기 짧은 599 아미노산 잔기의 글루코사민 신타제(서열번호 16)(보통 해독후 효소적으로 제거되는 개시제 메티오닌 제외)를 암호화한다. 여러 생산물 저항성 대장균 GlmS 돌연변이주에서 돌연변이가 발견되는 위치에 상응하는 Bacillus GlmS 단백질의 아미노산 잔기를 표 9에 비교하여 나타냈다. 흥미롭게도 10개 중 6의 위치에서 Bacillus 효소는 대장균 야생형 GlmS에 관해 다른 잔기를 갖지만 대장균 돌연변이 효소에서와 동일한 변화는 나타나지 않았다.
생산물 저항성 돌연변이 대장균 GlmS와 야생형 바실러스 섭틸리스 GlmS*에서의 아미노산 잔기의 변화
위치 대장균
wt GlmS		 대장균 돌연변이 GlmS 바실러스 섭틸리스
wt GlmS**
GlmS*49 GlmS*54 GlmS*124 GlmS*72
4 Ile Thr
15 Glu Lys
39 Ala Thr Gln
250 Arg Cys Pro
272 Ile Thr Tyr
387 Asp Val
450 Ser Pro Pro Asp
469 Leu Pro Phe
472 Gly Ser
525 Glu Gly His
* 대장균 야생형 GlmS 단백질과 다른 잔기만을 나타냈다.
** Bacillus GlmS 서열의 위치는 배열에 작은 갭이 있기 때문에 대장균 야생형 GlmS 서열을 갖는 배열에 기초하고 있다.
< 실시예 5 >
본 실시예에서는 쉐이크 플라스크 배양에서 글루코사민 생산 동안의 효소 활성을 보여준다.
쉐이크 플라스크와 발효조에서 글루코사민 생산에 관련된 다양한 효소 활성을 검사하였다. 글루코오스의 대사와 N-글루코사민의 형성에 이 효소가 수반되는 것이 도 3에 개략적으로 나타나 있다. 글루코오스가 세포에 의해 섭취되고 동시에 글루코오스-6-P로 전환된다. 글루코오스는 도면에 도시된 것을 포함하여 여러 경로로 대사된다. 글루코사민 합성 경로에서 글루코오스-6-포스페이트는 프룩토오스-6-포스페이트로 이성질화되고 GlmS가 프룩토오스-6-포스페이트의 글루코사민-6-포스페이트로의 전환을 매개한다. 마지막으로 글루코사민-6-포스페이트는 탈인산화되고 분비된다. 글루코오스-6-포스페이트에 대해 주로 경쟁하는 대체 경로는 포스포프룩토키나아제를 경유하여 해당과정(glycolysis)으로 들어가는 것이다. 글루코오스-6-포스페이트의 다른 중요한 대체 경로는 글루코노락톤-6-포스페이트로의 산화이다(오탄당 포스페이트 경로로의 진입). 또한 글루코오스-6-포스페이트는 글루코오스-1-포스페이트로 전환되어 글리코겐이 만들어지고 세포에 저장될 수 있다.
균주 2123-54를 사용하는 쉐이크 플라스크 실험에서 효소 분석 결과를 도 6에 도시하였다. 세포를 M9A 배지에서 성장시키고 배양 개시부터 0.2mM IPTG로 유도하였다. 글루코사민 신타제(GlmS) 활성은 실험 전체에서 높았다. 12 시간에 높은 GlmS 활성이 나타났고 24시간까지 더욱 증가하였다. 그 후 GlmS 활성은 감소하는 것으로 보였다. 그러나 이 감소가 극단적인 것은 아니었다. 72시간에서의 활성은 여전히 높아 12시간일 때 관찰된 것과 기본적으로 동일하였다. 따라서 GlmS 활성은 실험 과정중 유의적으로 감소하지 않는 것으로 생각되었다.
포스포글루코이소머라아제(Pgi) 활성은 12시간에서 높았고 24시간까지 유의적으로 증가하였다. 그 다음 12시간에서 관찰된 수준으로 되돌아 왔고 남은 실험 기간동안 이 수준을 유지하였다. 명확하게는 글루코오스로부터 프룩토오스-6-포스페이트의 형성이 실험 조건에서 세포 내의 낮은 Pgi 활성에 의해 제한되지 않았어 야 한다.
프룩토오스-6-포스페이트로의 다른 주요 경로는 해당과정이다. 여기서 첫 번째로 수행된 단계는 포스포프룩토키나아제(Pfk)에 의해 매개된다. 가장 높은 Pfk 활성은 12시간에 나타나고 그 다음 48시간 동안 감소하였지만 활성은 여전히 관찰되었다. 이 활성 패턴은 Pfk에 전형적이다. 활성은 기하급수적 성장 동안 가장 높고 세포가 안정기에 접어들면 감소한다.
글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(Glu6P DH)가 추출물에서 발견되었다. 이 효소는 글루코오스로부터 NADPH의 재생산을 위한 오탄당 포스페이트 경로로 탄소를 공급한다. 이 효소의 활성은 측정된 다른 것들에 비해 다소 낮고 매우 안정하며 실험의 처음 24시간 후에 약간 감소하였다. 포스포글루코뮤타아제(Pgm)의 활성이 상기 실험 조건하에서 매우 낮게 관찰되었다.
< 실시예 6 >
본 실시예에서는 락토오스 유도 글루코사민 생산을 위한 재조합 대장균 균주의 개발을 기술한다.
글루코사민 생산을 위한 상업적으로 실용적인 공정을 개발하기 위해서는 두가지 인자가 필요하다. 첫째는 글루코사민 역가를 높이는 것이고 둘째는 IPTG의 비용이 글루코사민 제조 비용을 매우 높이기 때문에 발효공정에서 IPTG의 사용을 배제하는 것이다. 연구 프로그램의 초기 단계에 개발된 글루코사민 제조를 위한 균주는 글루코사민 신타제의 발현을 유도하기 위해 배양 배지에 IPTG를 필요로 하 였다.
발효공정에서 IPTG를 배제하기 위한 방법
2123-54와 같은 제조 균주에서 GlcN6P 신타제를 암호화하는 glmS 유전자의 과잉 발현 양식 때문에 발효공정에서는 IPTG가 필요하다. glmS 유전자를 대장균 염색체 DNA로부터 분리하고 박테리오파지 T7의 프로모터 후방의 발현 벡터로 클로닝하였다. 상기 프로모터는 매우 강력하고 특이적이다. 그것은 대장균 RNA 폴리머라제라기보다는 T7 RNA 폴리머라제로 인식된다. T7 RNA 폴리머라제는 DE3로 표시된 유전 요소로 제공되고 대장균 lac 프로모터와 lac 오퍼레이터에 의해 구동되는 T7 RNA 폴리머라제에 대한 유전자를 포함한다. IPTG에 의한 유도에 필요한 것은 이 프로모터 및 오퍼레이터의 사용이다. lac 프로모터는 lac 리프레서(repressor)에 의해 음성 제어되고 lac I 유전자에 의해 암호화된다. 인듀서(inducer)의 존재 없이 lac 리프레서는 lac 오퍼레이터에 결합하고 오퍼레이터, 이 경우에 있어서는 T7 RNA 폴리머라제 유전자로부터 하류로 유전자 발현을 방해한다. T7 RNA 폴리머라제가 없는 경우 재조합 glmS 유전자는 발현되지 않는다. IPTG의 존재 하에 lac 리프레서(repressor)는 T7 RNA 폴리머라제 유전자가 발현되어 glmS의 과잉 발현을 유발하는 결과를 갖는 오퍼레이터에 결합하지 않을 것이다.
또 다른 lac 프로모터의 인듀서는 알로락토오스(allolactose)이다. 이것은 락토오스에 대한 b-갈락토시다아제의 작용에 따른 부산물이다. 2123-54와 같은 글루코사민 생산 균주는 lac Z 유전자의 결실 및 분열로 인해 b-갈락토시다아제에 음 성적이다. 그러나 기능적 lac Z 유전자의 존재 하에 락토오스는 알로락토오스로 전환되어 상술한 바와 같은 glmS의 발현을 유발하는 반응의 연쇄단계를 개시할 수 있다.
상술한 관점에서 IPTG에 대한 의존도를 없애는 다양한 방법이 있다. 본 실시예에서 설명되는 하나의 접근법은 lac Z 유전자를 복원하는 것이다. 이것은 염색체의 여러 사이트에서 T7-glmS*54 발현 카세트를 통합함으로써 행할 수 있다. galK 사이트에서의 통합은 lac Z 유전자에 작용하지 않을 것이다. Lac+ 균주는 락토오스에 의해 잠재적으로 유도가 가능하면서 IPTG보다 훨씬 비용이 저렴하다. galK 사이트가 선별된 이유는 Gal-가 구성요소 균주이기 때문이었다. 그러한 균주에서 갈락토오스가 lac 프로모터에 대한 인듀서로 사용될 수 있음이 보고되었다. 더욱이 락토오스 가수분해를 통해 생성된 갈락토오스는 락토오스 유도를 증가시킬 수 있다. 이것은 거의 최적의 양의 락토오스를 글루코사민 생산 공정에 사용할 때 유도를 증진시킬 수 있다. 이론적으로 T7-glmS*54 발현 카세트가 균주 7101-17(DE3)에서 galK 사이트에 접종될 때 생성되는 균주는 균주 2123-54와 유사하지만 글루코사민 생산은 락토오스, 갈락토오스 또는 IPTG로 유도될 수 있다.
온도 선별에 의한 염색체 상에서의 표적 사이트에 유전자를 통합 또는 결실시키는 일반적인 프로토콜
온도의 변화에 의해 대장균 염색체에서 표적 유전자를 결실시키고 유전자를 통합하기 위한 벡터 및 방법이 Hamilton et al.(1989, J. Bacteriol. 171:4617-4622)에 의해 기술되었다. 상기 방법은 여러 글루코사민 생산 대장균 균주를 개발하는데 적용되었다. 유전자 통합을 위한 프로토콜은 다음의 주요 단계로 이루어진다. 첫 번째 단계는 표적 사이트의 서열을 클로닝하여 내부적으로 결실시키고 및/또는 외래 유전자를 결실 사이트에 통합하도록 삽입하는 것이다. 두 번째 단계는 이 서열을 보유하는 단편을 온도 민감성 복제 기원 및 항생제 선별 마커를 포함하는 온도 민감 통합 벡터에 서브클로닝하는 것이다. 세 번째 단계는 상기 통합 벡터를 대장균 숙주 균주 내로 형질전환하고 복제가 불가능한 온도(42℃)에서 단독 교차 재조합을 통해 염색체 내로 통합된 완전한 플라스미드를 갖는 클론을 선별하는 것이다. 네 번째 단계는 선별된 클론의 세포를 복제 가능한 온도(30℃)로 액체 배양에서 성장시키는 것이다. 통합된 플라스미드를 갖는 세포는 플라스미드를 상실하는 경향이 있다. 복제 기원부 및 항생제 저항성 유전자 또는 온전한 플라스미드를 상실한 세포는 배양액에서 성장할 것이다. 전형적으로 50-ml의 LB 배지에 2 내지 10 클론의 풀(pool)로부터 세포를 접종하고 24시간 동안 배양액을 성장시킴으로써 이 단계를 수행하였다. 배양액을 1000배 희석한 신선배지로 보내어 24시간 동안 추가로 성장시켰다. 다섯 번째 단계로 세포를 도말하고 항생제 저항성을 상실한 클론을 선별하였다. 통합된 유전자 또는 결실된 유전자의 특성에 따라 유전자 특이적 선별 공정을 사용하였다. 클론을 전형적으로 스크린하기 위해 염색체에서 의도적으로 변화된 클론과 천연적 형태가 PCR 생산물의 크기에 의해 구별할 수 있는 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행하였다. 통합 또는 결실된 DNA 서열에 특이적인 프로브를 사용하여 써던 블롯(Southern Blot) 분석에 의해 클론을 확인하였다.
온도 선별에 의해 galK 사이트에서의 T7 glmS * 54 통합을 위한 벡터의 개발
대장균 gal 오페론 서열, 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터의 카나마이신(kanamycin) 저항성 선별 마커 및 pMAK705(Hamilton, et al., 1989, J. Bacteriol. 171:4617-4622)로부터의 온도 민감성 pSC101 복제 기원의 부분을 포함하는 벡터가 온도 선별 프로토콜을 사용하는 galK 사이트에서의 유전자 통합을 위해 개발되었다. 대장균 gal 오페론 서열(3.3kb)부를 대장균 균주 W3110으로부터 PCR로 증폭하였다. PCR 생산물은 서열 galTKM(14bp에서 galT 코딩 서열의 ATG 개시 코돈의 상류로 시작하고 68bp에서 galM 코딩 서열의 종료 코돈을 따라 종료함)을 보유하고 벡터 pCRScript Amp SK(+)로 클로닝되어 재조합 플라스미드 pKLN23-157을 생성하였다. gal K 서열(제한 사이트 Sfo I과 Mlu I 사이)에서 0.7-kb를 결실시키고 결실 사이트에서 (Sal I, Bgl II 및 Mcs I에) 고유 제한 사이트를 첨가하여 플라스미드 pKLN07-1을 생산하였다. 카나마이신 저항성 카세트를 Pst I 분해 및 말단을 무디게 하기 위한 T4 DNA 폴리머라제의 처리에 의해 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 Pst I 단편으로 분리하였다. 단편을 플라스미드 pKLN07-1(기원이 결정되지 않음) 의 Not I 사이트(T4 DNA 폴리머라제로 무뎌짐)로 라이게이션하였다. kanr::galTKM 단편을 플라스미드로부터 BamH K/Sac II(말단이 T4 DNA 폴리머라제로 무뎌짐) 단편으로 제거하고 pMAK705(Hamilton, et al., 1989, J. Bacteriol. 171:4617-4622)의 온도 민감성 복제단위를 포함하는 Pvu II/Sma I 단편으로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-4를 생산하였다. 발현 카세트 T7-glmS*54를 플라스미드 pKLN23-54(미국 특허 제 6372457호에 개시됨)로부터 Not I 단편 및 T4 DNA 폴리머라제에 의해 무뎌진 말단으로 분해하였다. 상기 단편을 Msc I 사이트에 pSW07-4로 클로닝하여 플라스미드 pSW07-9를 생성하였다.
락토오스 유도가 가능한 균주의 선별
pSW07-9로 대장균 균주 7107-17(DE3)을 형질전환한 다음 온도에 민감한 통합 돌연변이주의 선별을 위해 Hamilton et al.(1989)으로부터 적용된 프로토콜을 사용하였다. pMAK705로부터 온도에 민감한 복제단위를 갖는 플라스미드를 위해 30℃에서 플라스미드를 복제하였으나 플라스미드 통합은 항생제 선별 하에서 복제 불가능한 온도(42℃)에서 강제되었다. 42℃에서 형질전환된 세포를 인큐베이션하고 플라스미드를 통합한 균주를 선별하였다. 이것은 카나마이신을 포함하는 플레이트에 세포를 도말하고 42℃에서 플레이트를 인큐베이션하고 콜로니를 선별함으로써 수행되었다. 보통 온전한 플라스미드를 상동체 재조합에 의해 염색체로 통합하였다. gal T 또는 gal M 영역에서 단독 교차 사건이 일어날 수 있었다.
복제 근원 때문에 통합된 플라스미드를 갖는 세포는 염색체로부터 플라스미드를 고리형태로 만드는 경향이 있다. 통합된 온전한 플라스미드를 갖는 세포는 30℃에서 매우 불량하게 성장하지만 플라스미드 또는 복제 근원 부분을 상실한 세포는 정상 성장을 나타냈다. 따라서 42℃에서 선별한 세포가 30℃에서 성장할 때 플라스미드를 상실한 세포는 플라스미드를 보유한 세포보다 더 잘 성장한다. 원칙적으로 세포가 상동체 재조합을 통해 플라스미드를 상실하는 방법은 2가지가 있다. 전체 플라스미드를 상실하여 천연 gal 오페론으로 복귀돌연변이(revertent) 균주를 유발하거나 또는 단지 복제 근원과 선별 마커를 포함하는 플라스미드 부분만을 상실하여 galK 사이트에서 통합된 T7-glmS*54 서열을 갖는 균주를 유발한다. 42℃ 선별로부터 분리된 콜로니의 세포를 30℃, 액상 배양액에서 인큐베이션하고 항생제를 포함하지 않는 플레이트 위에 도말하였다. 통합 결과 galK 유전자가 불활성화하였기 때문에 구성요소 균주는 갈락토오스를 유일한 탄소원으로서 사용할 수 없었다. 갈락토오스 플레이트를 사용하여 상기 구성요소 균주를 스크린하고 galK 서열을 프로브로 사용하여 Southern Blot 혼성화에 의해 확인하였다. 이 락토오스 유도가 가능한 글루코사민 생산 균주를 7107-16 및 7107-18로 명명하였다.
< 실시예 7 >
본 실시예에서는 락토오스 유도가 가능한 글루코사민 생산을 기술한다.
galK 사이트(7107-16 및 7107-18)에서 통합된 T7-glmS*54 발현 카세트를 갖 는 균주는 IPTG 또는 락토오스 유도 후 많은 양의 글루코사민을 생산한다. IPTG 유도하에서 대조 균주(2123-54)는 4.2g/l를 생산하였다. 락토오스 유도가 가능한 균주에서 글루코사민 생산은 IPTG에 의해 유도된 2123-54와 비교할 만하였다. 2123-54에서의 글루코사민의 양 및 락토오스 유도가 가능한 균주를 도 7에 나타냈다.
글루코사민 신타제 활성을 락토오스가 유도된 배양액의 샘플에서 평가하였다. 상이한 양(리터 당 그램을 나타내는 수)의 글루코오스 및/또는 락토오스를 포함하는 M9A 배지에서 세포를 성장시켰다. 효소 활성과 글루코사민을 24시간 성장 후 평가하였다. 표 10에 나타난 바와 같이 락토오스는 GlmS 활성 및 글루코사민 합성을 유도한다. 락토오스 유도는 배지 내의 글루코오스 양에 의해 영향받는다. 많은 양의 글루코오스는 락토오스 유도에 대한 강한 억제를 나타냈다. 락토오스 유도 프로토콜을 더욱 개선하기 위해 균주 7107-18을 선별하였다. 균주를 쉐이크 플라스크 및 1 리터 발효조에서 다양한 락토오스 유도 계획 하에 평가하였다.
락토오스 유도가 가능한 균주 7107-16에서의 글루코사민 신타제 활성 및 글루코사민 생산량
성장조건1) GlmS 활성2)(μmol min-1 mg-1) GlcN(gl-1)
30 글루코오스/0.2mM IPTG 0.107 2.386
30 글루코오스/20 락토오스 0.046 0.202
5 글루코오스/25 락토오스 1.140 2.042
/40 락토오스 0.840 2.810

주:
1) 상이한 양의 글루코오스 및/또는 락토오스(리터 당 그램을 나타내는 숫자)를 포함하는 M9A 배지에서 세포를 성장시켰다.
2) 효소 활성과 글루코사민을 24시간 성장 후 평가하였다.
락토오스 유도 및 글루코오스 억제:
발효 실험에서 락토오스 유도 후 락토오스 또는 글루코오스를 투입하면서 다양한 양의 락토오스가 시도되었다. 글루코사민 양을 72시간 동안 모니터링하였다. 락토오스 유도를 위한 첫 번째 프로토콜은 락토오스를 (글루코오스가 lac 오페론을 억제하기 때문에 글루코오스 없이) 접종하기 전에 락토오스를 첨가한 다음 성장, GlcN 형성 및 바이오매스 유지(biomass maintenance)를 위한 탄소를 공급하기 위해 글루코오스를 투입한 점에서 IPTG 유도와 유사하였다. 세포가 40g/l의 락토오스로 성장하고 연속적으로 락토오스를 투입할 때 세포는 계속하여 락토오스를 소비하였다. 그에 따라 갈락토오스가 유의적으로 축적되어 40g/l까지 축적되었다. 글루코사민 생산량은 IPTG 유도 하의 2123-54와 유사하였다(약 10g/l).
세포를 24시간동안 40g/l의 락토오스로 성장시킨 다음 글루코오스로 투입물을 전환하였다. 이러한 조건 하에서 세포는 락토오스의 이용을 정지하고 갈락토오스는 남은 실험 동안 10g/l로 일정하게 잔존하였다. 글루코사민은 양호한 속도로 계속해서 생산되었고 균주 2123-54와 비교할 만한 수준에 도달하였다. 이 결과는 글루코사민 생산이 락토오스 이용이 정지한 후에 글루코오스에 의해 강하게 지지된 다는 것을 암시한다. 또한 유도에 적은 양의 갈락토오스의 축적을 유발하는 단지 적은 양의 락토오스만이 필요하다는 것을 내포하고 있다. 락토오스의 요구량과 갈락토오스 축적량의 감소는 비용절감 및 생산물 회수에 바람직하다.
50 및 60g/l의 증가된 락토오스에 뒤이어 글루코오스를 투입하는 유도 개요에 의해 글루코오스 첨가 후 어느 정도 계속해서 락토오스를 이용하는 것으로 나타났다. 이는 글루코오스에 의한 억제가 락토오스 양이 더 많은 경우에는 불완전하다는 것 또는 유도된 효소가 글루코오스 첨가 후 글루코사민 생산을 지지하기 위해 적절한 수준에서 계속해서 작용한다는 것을 나타낸다.
더 적은 양의 락토오스 사용이 바람직하고 실험결과가 시험된 가장 적은 양의 락토오스에서 글루코오스 억제가 최소화될 수 있음을 보여주었기 때문에 더욱 적은 양의 락토오스를 시험하였다. 더욱 개선된 작업은 유도에 필요한 최소량의 락토오스, 최적의 유도 타이밍과 지속 시간 및 락토오스 유도 전 글루코오스에 의한 초기 성장 단계의 장점을 확증하는 데 중점을 두었다. 후자는 특히 제어된 발효에서 더 높은 세포 밀도가 요구될 때 중요할 것이다.
세포의 글루코오스가 고갈될 때까지 글루코오스로 세포를 성장시킨 다음 락토오스 유도가 뒤따르는 시험을 하였다. 글루코오스에 의한 성장으로 세포 밀도는 약 17g l-1에 이르렀고 이 때 지연 락토오스 투입을 개시하였다. 이러한 조건에서 GLcN 생산은 10g l-1에 이르렀다. 이 방법은 GlcN 생산을 위한 이후의 실험에서 사용되었다.
아세테이트의 효과:
아세테이트는 대장균 발효의 일반적인 부산물이다. 글루코오스가 과도한 때, 성장 속도가 임계 수준을 초과할 때 또는 형성된 대사물의 해당 및 산화 속도가 호흡 용량이 포화되어 균형이 맞지 않을 때 호기성 조건에서도 아세테이트가 형성된다. 배양액에 아세테이트를 첨가하면 성장과 글루코사민 축적 양자 모두에 유의적인 부정적 효과를 나타냈다. 아세테이트는 글루코사민 생산 동안 축적되는 것으로 나타났다. 미량 원소의 양은 아세테이트 형성량에 영향을 주었다(이하 참조).
공정 개선을 통해 아세테이트 축적을 감소시키는 방법은 지연 글루코오스 투입에 의한 제한된 성장을 포함하였고 그 경우 글루코오스는 포화되지 않았다. 이 방법은 프로그램 전체를 걸쳐서 채택되었다. 그러한 조건은 초미량원소 또는 칼륨 제한과 같이 유의적인 양의 아세테이트를 유발할 수 있다. 낮은 pH가 아세테이트의 억제효과를 증가시켰다.
온도의 영향:
미국 특허 제 6372457호에 개시된 바와 같이, 성장과 글루코사민 생산에 더욱 바람직한 온도는 30℃였다. 더 높은 성장 온도(37℃)는 더 높은 성장 속도, 증가된 글루코오스 섭취 및 최종적으로 억제하는 아세테이트 수준을 유발한다. 더 높은 온도는 또한 비용해성/비활성 재조합 GlmS 단백질을 포함하는 봉입체(inclusion body)의 형성을 유발할 수 있다. 플라스크에 의한 연구에 의해 온도가 유도 이후 30℃에서 25℃로 변화할 때 아세테이트 양 및 비교할 만한 GLcN 양이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 아세테이트 축적을 감소시키는 낮은 온도(25℃)를 발효조에서 평가하였다. 그 결과 더 낮은 온도, 심지어 글루코오스 축적 조건하에서도 아세테이트 축적이 감소하였다.
미량 원소의 영향:
바이오매스(biomass)를 더 높은 밀도로 성장시키기 위해서 특히 철, 아연 및 망간의 특정 미량 원소가 필요하다. 전체 미량 원소 패키지의 개시 적정은 바이오매스 생산이 미량 원소량이 너무 적은 때 제한된다는 것을 보여주었다. 철이 주요 제한 성장인자인 것으로 결정되었지만 과도할 경우 더 낮은 GLcN 역가 및 더 높은 아세테이트 양을 나타낼 것이다. 망간은 플라스크 배양에서 세포 밀도 및 GLcN 양에 유사하지만 약한 영향을 갖는다. 망간의 영향은 철의 영향에 부가적인 것으로 나타났다. 망간의 부정적 영향을 발효조에서 확인하였다(도 8 참조). 세포가 락토오스에 의해 적절하게 유도되기 위해 철의 적절한 공급이 필요함을 알게 되었다. 따라서 임계 농도의 범위는 성장 요건, 유도 요건 및 아세테이트와 GLcN 생산에 대한 영향의 균형을 맞추도록 확립되어야 한다. 해당과정으로부터 탄소 유입을 제한하는 철, 망간 및 아연의 제한은 시트릭 산 발효의 개선공정에서 우선한다.
여러 실험 후 최종 계획이 세워졌다: 배지에서의 3mg l-1의 황산철(iron sulfate)과 5㎍ g-1의 글루코오스의 비율로 글루코오스 투입이 첨가된 황산철. 배 지의 황산철 3mg의 개시수준에서 낮은 수준의 바이오매스 성장을 유지하고 GLcN 생산을 확대하기 위해 글루코오스 투입 용액에 대한 철의 첨가가 필요하였다.
포스페이트 농도의 영향:
인은 세포에 필요한 다량영양이고 주로 핵산 합성, 인지질 및 조효소에 사용된다. 또한 인 함유 대사 매개체가 세포 대사에 필요하다. M9A 배지의 높은 포스페이트 농도는 플라스크 조건에서 용이하게 제어되지 않는 배양액에서 pH를 완충하는 방법으로서 작용한다. 그러나 발효 규모로 이 배지의 크기를 조정하는 것은 포스페이트가 정상 바이오매스 요구량보다 과도하게 초과하게 된다는 것을 의미한다. 높은 염 농도는 생산물 회수 문제를 제공하였다. 따라서 포스페이트 양을 감소시키는 것이 바람직하였다. 포스페이트 양을 감소시킨 여러 실험에서 성장은 더 좋았으나 GLcN 생산은 훨씬 낮았다. 예컨대 포스페이트 칼륨 수준을 30g l-1에서 6g l-1로 내릴 때 성장은 개선되었으나 GLcN 생산은 대단히 감소하였다(도 9 참조).
< 실시예 8 >
본 실시예는 락토오스 유도가 가능한 글루코사민 생산 균주 7107-18의 성장에 대한 pH의 영향에 대해 기술한다.
실시예 11에 나타낸 바와 같이 글루코사민은 대장균 성장에 사용되는 보통의 pH 범위에서 불안정하다. 글루코사민은 또한 균주 7107-18에 대해 독성을 유발하 였다. 20g l-1과 같이 낮은 농도에서 글루코사민을 세포 접종 이전 3.5시간 동안 배지(pH 7)에서 전배양시켰을 때에도 독성이 발견되었다. 독성은 7.0의 개시 pH를 갖는 배지에서 적어도 부분적으로 GlcN 분해 생산물에 기인하였다. GlcN은 pH가 낮을수록 더욱 안정하고, 글루코사민은 pH 4.7 또는 그 이하에서 분해되지 않았다. 그러나 낮은 수준의 pH는 세포 성장을 제한하는 것으로 알려져 있다. 따라서 7107-18을 pH 7.0, 6.0, 5.5, 5.0 및 4.7에서 성장시키는 실험을 수행하였다. 주된 목적은 더 낮은 pH(GlcN을 갖는)에서 세포 성장을 연구하고 미리 관찰된 GlcN 분해에 의해 유발된 세포 사멸(cell death)이 더 낮은 pH에서 감소될 수 있는지 알아보기 위한 것이었다.
40g l-1의 글루코오스와 20g l-1의 GlcN을 갖는 M9A 배지를 5개의 다른 pH로 조정하였다. 하나의 플라스크 세트를 즉시 7107-18 세포로 접종시켰다. 접종 전에 동일한 배지의 복제 플라스크를 10시간 동안 세포 없이 인큐베이션하였다. 48시간에 걸쳐 pH, OD600 및 GlcN 농도를 측정하기 위해 플라스크에서 7회 샘플을 채취하였다. 각각의 샘플 채취 시점에서 배양액의 pH를 초기 설정값으로 재조정하였다.
글루코사민 전배양 없이 pH 7.0에서의 세포 배양액은 배지에서 20g l-1의 글루코사민을 갖는 양호한 성장을 나타냈다(도 10 참조). pH 7.0과 4.7 사이에서 pH가 감소함에 따라 성장속도가 감소하였다. 그러나 pH 4.7에서 세포는 계속해서 유 의적인 성장을 나타냈다.
이전의 관찰에서와 유사하게 배양액이 pH 7.0에서 글루코사민을 보유하면서 전배양된 이후에는 잘 자라지 않았다. 전배양 배지로의 접종 후 세포 성장이 관찰되었다. 성장은 테스트된 모든 pH 값에서 매우 낮았다. 이는 낮은 pH 및 세포 배양에서의 글루코사민 분해의 영향의 조합에 기인한 것으로 생각되었다.
이러한 실험에 기초하여 생산물 손실과 글루코사민 분해에 기인한 독성 효과를 최소화하기 위해 7.0보다 더 낮은 pH 값에서 7107-18 세포를 성장시키는 것이 타당해 보였다. 그러나 최적의 pH 및 배양 조건은 주의깊게 조정되어야 한다: 낮은 pH 값은 글루코사민을 안정화시키지만 부정적으로 세포 대사 및 세포 성장에 영향을 준다. 상대적으로 낮은 pH 값에서 가동되는 발효조에서의 GlcN 생산 프로토콜은 제조된 GlcN을 보존하는데 확실히 도움을 줄 수 있고 분해 생산물의 농도를 감소시킴으로써 제조공정 중 세포를 보호할 것이다. 이러한 이점은 이러한 방법으로 성장한 세포의 감소된 대사 활성에 대해 균형이 맞추어져야 한다. 계속되는 GlcN 합성은 세포에서 일정한 에너지의 생산을 필요로 하고 이 낮은 pH 값에서 느리게 성장하는 세포는 요구되는 에너지를 충분하게 생산할 수 없었다.
< 실시예 9 >
본 실시예에서는 글루코사민을 안정화시키기 위한 낮은 pH에서의 발효를 기술한다.
대장균에 대한 정상 최적 성장 pH는 중성(pH 7.0)에 가깝고 따라서 GLcN 발 효에 초기 pH 6.7 내지 6.9를 사용하였다. 그러나 GLcN은 용액에서 특히 중성 내지 알칼리성 pH에서 분해되기 쉬운 것으로 알려졌다. 유기체는 pH에 민감하여 pH가 감소하면 잘 성장하지 못한다. 따라서 성장 단계에 이어 글루코사민 합성 및 축적에 대한 낮은 pH의 영향을 측정하기 위한 테스트가 수행되었다. 글루코사민 분해가 산화력이 있는 것으로 믿어짐에 따라 용존 산소 수준의 영향을 테스트하였다. pH 6.7에서 세포를 성장시켜 세포의 밀도가 상승하였다. 배양이 유도된 다음 pH가 6.7에서 5.5로 감소하였고 용존 산소량 또한 20%에서 5% 포화 수준으로 감소하였다. 본 실시예에서 가장 좋은 글루코사민 축적은 낮은 pH에서 나타났고 낮은 산소량 또한 도움이 되는 것으로 나타났다(도 11 참조). pH를 계속해서 부과함에 따라 낮은 분해에 의해 최소한 약간 향상되었고, 낮은 그러나 글루코오스 투입을 유지할 때의 글루코사민 축적이 정지한 후 산소 변수가 낮은 pH의 배양액에서 훨씬 낮은 분해를 나타냈다.
< 실시예 10 >
본 실시예는 락토오스가 유도된 글루코사민 발효 공정에 사용되는 조건에 대한 요약을 기술한다.
발효 공정은 락토오스가 유도된 글루코사민 생산을 위한 재조합 대장균 균주 7107-18을 사용하여 개발되었다. 생산물 역가는 72시간에서 글루코사민 약 20g l-1이었다. 본 기술 분야의 당업자에게 상기 공정은 본 발명에서 개시된 관찰에 기초 하여 더욱 최적화될 수 있다. 또한 실행을 증진시키기 위한 글루코사민 발효 공정에 다른 발효 공정을 개발하는 방법을 적용할 수 있다. 본 발명에 개시된 공정의 주된 인자 및 요소가 아래에 요약되어 있다.
균주: 재조합 대장균
유도: 세포 농도가 10g/l에 도달한 후 락토오스 30g/l을 (10시간 동안에 걸쳐 느리게 첨가된 35%의 투입으로서) 첨가하였다. 본 공정 동안 글루코오스 억제를 방지하기 위해 투입된 글루코오스를 현탁하였다. 락토오스를 모두 첨가한 후 글루코오스를 다시 첨가하였다.
투입: 5㎍의 FeSO4-7H2O/g 글루코오스와 0.33㎍ MnSO4-H2O/g 글루코오스를 갖는 50%의 글루코오스, 제한 농도로 투입된 글루코오스.
발효 시간: 72 시간
발효 모드: 50%의 필요한 글루코오스가 첨가된 유가식(Fed Batch)이 글루코오스의 제한 농도를 유지하였다.
접종: 부피에 대해 5%.
pH: 성장 중 6.9, 유도 후 6.7. 10N의 NH4OH에 의해 제어됨
온도: 30℃, 유도 후 25℃로 변환.
산소: 20% 또는 그 이상의 용존 산소. 교반(agitation)에 의해 제어.
통기: 0.5에서 1vvm
배지:
성분 농도
KH2PO4 14g l-1
K2HPO4 16g l-1
Na3-citrate 1g l-1
(NH4)2SO4 5g l-1
CaCl2-H2O 0.05g l-1
MgSO4-7H2O 0.6g l-1
FeSO4-7H2O 3mg l-1
ZnSO4-7H2O 3.8mg l-1
MnSO4-H2O 0.33mg l-1
CuSO4-5H2O 0.1mg l-1
NaMoO4-2H2O 0.1mg l-1
H3BO3 0.1mg l-1
CoCl2-6H2O 0.1mg l-1
글루코오스 >200g l-1, 필요한 때
Mazu 204 디포머 0.25g l-1

글루코오스(점진적으로 첨가됨)와 Fe, Zn, Mn, Cu, B, Mo, Co 미량원소(멸균 후 첨가됨)를 제외하고 멸균전에 모든 성분을 첨가하였다.
< 실시예 11>
본 실시예에서는 글루코사민과 N-아세틸글루코사민 안정성 및 그들의 대장균에 대한 영향에 대해 기술한다.
글루코사민의 안정성:
40g/l의 글루코오스가 보충된 세포가 없는 M9A 배지(K2HPO4 14g l-1, KH 2PO4 16g l-1, Na3citrate.2H2O 1g l-1, (NH4)2 SO4 5g l-1, 10mM의 MgSO4, 1mM의 CaCl2, pH 7.0)에서 글루코사민 안정성을 시험하였다. 30% 글루코사민-염산 농축 용액으로 글루코사민을 준비하고 0, 4, 13, 26 및 42g l-1의 최종 농도로 첨가하였다(250ml의 플라스크에서 총 50ml). 배지의 pH를 6.9로 조정하였다. 플라스크를 쉐이커 위에 놓고 약 225rpm으로 교반하였다. 약 24시간 동안 30℃에서 글루코사민의 양 및 pH를 모니터링하였다. 글루코사민은 불안정한 것으로 판명되었고 그 분해는 농도에 의존하여 글루코사민 농도가 높아짐에 따라 분해속도가 빨라졌다. 글루코사민의 절반 이상이 42g l-1의 글루코사민을 갖는 배지에서 하루 이내에 분해되었다. 개시 글루코사민 농도가 4g l-1일 때 단지 약 25% 정도가 분해되었다. 글루코사민 분해에 따라 배지의 pH 감소가 수반되었다. 글루코사민이 없는 배지에서 약 0.15 단위만의 pH 변화가 이루어진 것과 비교할 때, 42g l-1의 글루코사민 샘플에서는 배지의 pH가 24시간 이후 0.7 단위 낮아졌다(6.9에서 6.2).
4개의 개시 pH 값에서의 글루코사민(60g l-1) 감소를 30℃, 세포가 없는 M9A-글루코오스(40g l-1)에서 52시간 동안 모니터링하였다. 각각의 샘플 채취 시간에 용액은 원래의 pH로 재조정되었다. 각 조건을 3개씩 수행하였다. 도 12에 나타난 것과 같이 분해는 pH에 강하게 의존하였고, 더 높은 pH에서 더 빠르게 분해되었다. 글루코사민의 감소는 pH 5.5에서 18%인 것과 비교할 때, pH 7.0에서는 68% 였다. pH에 대한 분해률의 외삽법은 약 pH 4.7 이하에서는 분해가 발생하지 않을 것을 암시한다.
글루코사민이 분해함에 따라 용액은 황호박색으로 변화하였다. 색상 형성의 범위를 360 내지 400nm에서의 흡광도로 판단하였다. 분해 속도가 더욱 빨라지는 초기 샘플링 기간을 제외하고 분해된 글루코사민의 양과 배지에서의 호박색의 밀도 사이에 강한 상호관계가 있었다. 두 가장 낮은 pH 값에서 감소하는 글루코사민과 형성되는 색상사이에 현저한 시간의 지체가 있어 색상을 나타내는 혼합물이 직접적인 글루코사민의 분해 생산물은 아니라는 것을 나타냈다. 테스트된 모든 pH 수준에서 분해 속도가 느려졌고 노란색으로 분해된 글루코사민의 비율은 일정했다.
글루코사민 분해와 색상의 형성에 관한 분자 수준의 해명은 거의 알려져 있지 않다. 수중에서 그리고 건조 조건에서 글루코사민의 열적 분해에 관한 보고서가 있다(Shu, 1998, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 46, pp. 1129-1131; Chen and Ho, 1998, Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 46, pp. 1971-1974, 여기서는 양자 모두 참고자료로 완전히 통합됨). 그러나 본 발명에서 사용된 온화한 조건에서 동일한 유형의 화학 반응이 일어나는지는 알려져 있지 않다. 비록 연구자가 글루코사민으로부터 갈색 생산물의 형성을 발견하고 갈색 생산물의 항산화적인 활성을 연구하였지만(Oyaizu and Mankoto, 1988, Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, vol. 35, pp. 771-775, 여기서는 전체가 통합되어 참조된다.), 갈색 생산물은 그들의 연구에서 화학적으로 확인되지 않았다. 글루코사민의 분자 구조를 고려할 때, 알데히드 및 아미노 그룹이 분해 및/또는 중합 에 관련될 것이다. 색상의 변화는 접합된 이중결합 및 복잡한 구조물이 형성됨을 암시한다.
알데히드 그룹의 영향을 시험하기 위해서 30g l-1의 글루코사민을 함유하고 40g l-1의 글루코오스를 보유하는 및 이를 보유하지 않는 M9A 배지에서 분해를 모니터링하였다. 알데히드 그룹이 관계된다면 글루코오스의 존재는 글루코사민 분해/중합 속도에 영향을 끼칠 것이다. 글루코사민 분해에 어떠한 유의적 차이도 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은 글루코사민 분해에서 아미노 그룹의 역할을 암시한다.
대장균 7107-18에 대한 글루코사민의 영향:
글루코사민은 중요한 세포벽 성분을 합성하는 전구물질이기 때문에 대장균의 성장에 필수적이다. 대장균은 또한 글루코사민과 N-아세틸글루코사민을 유일한 탄소원으로 사용할 수 있다. 아미노 당의 이화(catabolism)에는 균주 7107-18에서 결실된 nagB 유전자에 의해 암호화된 기능적인 글루코사민 데아미나제가 필요하다. 예상한 바와 같이 7107-18은 유일한 탄소원으로 글루코사민을 함유하는 플레이트에서 성장할 수 없었다. 글루코사민이 대장균 7107-18 세포 성장과 40g l-1 글루코오스를 포함하는 배지에서의 생존에 영향을 주는지 여부를 조사하기 위한 실험을 수행하였다. 신선하게 접종된 배양액의 성장은 리터당 10과 20g의 글루코사민에 의해 조금 억제되었다. 리터당 40g에서의 글루코사민은 세포 성장을 방지하였고 세 포 평판화에 의해 나타난 바와 같이 약 16시간의 인큐베이션 후에 세포 살상을 시작하였다. 52시간 후에 살아 있는 세포는 원래 숫자의 약 5분의 1이었다.
대장균 7107-18에 대한 글루코사민의 독성효과를 조사하기 위해 더욱 많은 실험이 수행되었다. 35g l-1의 글루코사민을 함유하는 M9A-글루코오스(40g l-1)로 즉시 접종된 세포는 상당히 잘 자랐으나 3.5 시간의 짧은 기간 동안 전배양된 동일한 배지로 접종된 때에는 세포는 빠르게 사멸하였다. 이것은 사멸이 대개 접종 전에 배지에서 형성된 글루코사민 분해 생산물 때문이라는 것을 나타낸다. 배지가 만들어진 후 즉시 접종하면 왜 세포가 생존하고 성장하는지 알려져 있지 않다. 하나의 설명으로서 글루코사민이 연속적으로 생산물 A, B, C 및 D로 분해된다는 것을 들 수 있다. 세포는 상대적으로 낮은 수준에서 초기 생산물을 저항하거나 흡수하는 능력이 있는 반면 후기 생산물 및/또는 더 높은 수준의 초기 생산물은 더욱 독성을 나타낼 수 있다. 이러한 가설은 더 높은 글루코사민 농도 및 더 긴 전배양 시간이 생육 수(viable count)의 감소를 유발한다는 관찰과 일치한다. 35g l-1의 글루코사민으로 접종시보다 105배로 생육수를 감소시켰다. 세포는 배지의 전배양 없이도 50g l-1의 글루코사민을 갖는 배지에서 사멸하였다.
N-아세틸글루코사민의 안정성:
아미노 그룹은 pH의 영향에 의해 암시된 바와 같이 분해에 중요한 역할을 하 는 것으로 나타났다. 이것이 사실이라면 N-아세틸글루코사민은 훨씬 더 안정하여야 한다. 또한 pH 효과는 글루코사민에서 만큼 극단적이지 않을 것이다. N-글루코사민의 안정성을 글루코사민 분해 연구와 유사한 실험으로 테스트하였다. 2일에 걸쳐 글루코오스가 없는 M9A 배지에서 pH 5.5 및 7.0에서 80 및 40g l-1의 N-아세틸글루코사민의 안정성을 모니터링하였다. 어떠한 유의적인 분해도 일어나지 않았다(도 13 참조). 이것은 글루코사민을 갖는 경우에 나타난 분해와 단적인 대조를 이룬다. 글루코사민이 분해될 때 배지의 색상이 호박색으로 변하였다. 48시간에 걸쳐 N-아세틸글루코사민을 포함하는 M9A 배지에서는 어떠한 색상의 형성도 발견되지 않았다. 또한 인큐베이션 동안 pH의 유의적인 감소도 없었다. 상기 결과로 자유 아미노 그룹이 글루코사민 분해 및/또는 중합에 관련된 핵심 기능 그룹인 것이 확인되었다.
N-아세틸글루코사민의 대장균 7107-18에 대한 영향:
세포를 62g/L의 N-아세틸글루코사민을 함유한 M9A 글루코오스(40g/L)에 접종시켰다. 배지를 8시간 이상 전배양한 때에도 유의적인 성장억제는 발견되지 않았다.
요약해서 N-아세틸글루코사민은 대장균 균주 7107-18에 부정적 영향을 갖지 않고 글루코사민보다 더욱 안정하다. 따라서 글루코사민 대신 N-아세틸글루코사민을 생산하는 것이 유리할 수 있다. 글루코사민은 세포로 전송되고 서브유닛이 manXYZ 유전자에 의해 암호화되는 만노오스(mannose) 트랜스포터 및 ptsG 유전자에 의해 암호화되는 글루코오스 트랜스포터를 통해 인산화되는 것으로 알려져 있다. 균주 7107-18에서 manXYZ 유전자가 결실되지만 글루코사민은 여전히 글루코오스 트랜스포터에 의해 유입될 수 있다. 배지가 높은 농도를 함유하면 유의적인 양의 글루코사민이 세포로 유입될 수 있다. 7107-18에서 만노오스 트랜스포터(manXYZ) 및 N-아세틸글루코사민 트랜스포터(nagE)를 암호화하는 유전자의 결실에 의해 N-아세틸글루코사민은 세포에 재수송되지 않고 배지내에서 많은 양이 축적될 수 있다. 이는 글루코사민보다 N-아세틸글루코사민을 생산할 때의 가능한 또 다른 이점을 의미한다.
< 실시예 12 >
본 실시예에서는 글루코사민 측정을 위한 HPLC법을 기술한다.
크로마토그래피적으로 글루코사민의 양을 정확히 측정하는 간단한 HPLC법의 개발이 요구된다. 바람직하게는 상기 방법에는 최소 샘플 제조 및 상당히 정확한 글루코사민 측정이 포함되는 것이 좋다. 여기에 제시된 방법은 Way et al(J. Liq. Chromatography & Related Technol. 23: 2861. 2000)에 의해 기술된 방법에 기초한다. Way et al의 공정에서 유동상(mobile phase)의 변형으로 쉐이크 플라스크 세포 배양 샘플에서 관찰된 다른 피크로부터 글루코사민 피크를 분석하는 것이 가능하다.
방법의 기술:
컬럼: Phenomenex Prodigy ODS(3) C18 - 5μ, 150 x 4.6mm (Phenomenex Torrance, CA)
유동상: MeOH: 수용액 버퍼(1:4v/v). 수용액 버퍼는 pH 5.1의 10mM의 아세트산 나트륨 및 10mM의 옥탄황산 나트륨으로 구성된다. 완전한 유동상은 다음에 따라 제조된다. 1리터의 탈이온수에 대해 0.8g의 아세트산 나트륨 및 2.16g의 옥탄황산 나트륨(Sigma-ultrapure)을 첨가한다. 염을 용해시킨 다음 빙초산을 사용하여 pH를 5.1 +/- 0.1로 조절한다. 이 1리터 용액에 대해 250ml의 메탄올을 첨가하고 용액의 가스를 제거한다. 저장소와 컬럼을 실온으로 유지한다.
유속: 0.7ml/min
디텍터: 30℃ 굴절 지수 디텍터
샘플: M9A 배지에서 10㎕
살균된 M9A 성장 배지의 접종으로 크로마토그램 상에 2개의 주요한 피크를 나타났다. 또한 크로마토그램은 글루코오스, 칼슘 및 마그네슘염이 결여된 M9A를 분석하면 본질적으로 변화하지 않는다. M9A에서 글루코사민의 접종은 별개의 단독 추가적 피크를 유발하였다. 그 다음 이러한 조건에서 글루코사민은 약 13분에 즉시 대단히 큰 음성 피크를 나타내며 용리하였다. 또한 pH, 이온 강도, 메탄올(MeOH) 농도 또는 옥탄황산 농도를 변형하여 해상도를 증가시키데 성공하지 못하였 다. 글루코사민 피크에 이어 항상 음성 편향(negative deflection)이 나타난다. 그러한 음성 편향을 제거하는 보통의 방법은 유동상에서 샘플을 희석하는 것이다. 그러나 샘플을 20배 희석하는 것으로도 음성 편향이 완전히 제거되지 않았고 그러한 높은 희석은 쉐이크 플라스크 또는 발효조에 있어 실용적이지 못하다.
피크 영역 대신에 피크 높이를 사용하여 적분하는 것이 약 500 내지 10000ppm의 범위에서 글루코사민의 정량 측정을 가능하게 한다는 것을 발견하였다. 상기 범위를 결정하기 위해 물 또는 유동상에서 보다 M9A에서 표본을 준비할 필요가 있었다. 그에 따라 모든 샘플을 M9A 성장 배지에서 준비하였고 또한 M9A를 사용하여 희석하였다. 각 샘플에 대하여 활성시간은 20분이었다.
확인 방법:
첫 번째로 M9A에서 여러 개의 표본을 준비하였다. 주사를 반복하여 상당히 정확한 결과(+/- 5%)를 얻었다.
두 번째로 비색 분석 및 HPLC를 모두 이용하여 쉐이크 플라스크 샘플을 분석하였다. 얻어진 값은 대체로 비색 분석의 10% 이내였다. HPLC와 비색 분석 사이의 근사한 일치가 반드시 비색 분석에 고유한 표준 편차 때문에 예상되는 것이라고 할 수는 없다. 예컨대 비색법으로 분석된 10000ppm의 2개의 샘플이 나타낸 값은 8.9와 9.3g/l이었다.
세 번째로 쉐이크 플라스크 샘플에 공지된 양의 글루코사민을 첨가하고 분석하였다. 비희석 쉐이크 플라스크 샘플은 1479ppm의 값을 나타냈다. 동 부피의 5000ppm의 글루코사민 표본으로 희석한 다음 희석된 플라스크 샘플은 3440값을 나타냈다(예상치는 3240). 예상된 값과 불일치한 부분은 M9A에 의한 것으로 생각된다. 실제로 M9A은 단독으로 100PPM 정도의 잘못된 글루코사민 "값"을 나타낼 것이다.
쉐이크 플라스크 배양 샘플을 HPLC법과 비색법으로 분석하였다. 그 결과를 표 11에 나타냈다. 입자를 제거하기 위하여 원심분리와 여과에 의해 배양 상청액을 수거하고 분석시까지 -20℃에 보관하였다. HPLC를 M9A 배지에서 준비한 단독 포인트 2500ppm 표준 용액을 사용하여 보정하였다. 해동한 다음 샘플을 즉시 HPLC로 분석하였다. 자동 샘플 채취기(autosampler)에서 하룻밤 동안 보관한 다음 샘플을 다시 분석하였다. 두 방법 사이의 값은 거의 일치하였다. 여러주동안 -20℃에서 저장된 샘플은 글루코사민 농도의 감소를 나타내지 않았다. 여과된 샘플을 상온에서 하룻밤 보관하는 것은 글루코사민 농도의 감소를 유발하지 않았다.
글루코사민 정량에 대한 HPLC 법과 비색법의 비교*
샘플 ID 비색법 HPLC(0시간) HPLC(24시간)
D1 4505 4900 4963
D2 4138 4641 4618
E2 451 533 589
F1 1643 1856 1815
F2 1938 1875 1968
H1 1380 1365 1439
H2 1341 1379 1548
* 입자를 제거하기 위해 배양 샘플을 원심분리하고 여과한 다음 분석시까지 -20℃에서 저장하였다. 해동된 샘플(0시간)로 HPLC 분석을 하였고 샘플은 상온에서 자가 샘플 채취기에 하룻밤(24시간) 보관하였다. 글루코사민 농도는 PPM으로 나타냈다.
< 실시예 13 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜서퍼라아제 1 유전자(GNA1)의 과잉 발현을 기술한다.
다음 실시예에서 N-아세틸글루코사민의 합성을 증가시키는 재조합 대장균에서 여러 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜서퍼라아제 1 유전자(GNA1)의 클로닝 및 과잉 발현을 기술한다. 효모 사카로마이세스 세레비시애(ScGNA1), 효모 캔디다 알비칸스(CaGNA1) 및 고등식물 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana: AtGNA1)로부터 GNA1 유전자를 포함하는 pET에 기초한 과잉 발현 벡터를 사용하여 본 방법의 타당성을 보여주었다.
pET 벡터의 T7 lac 프로모터 뒤에 GNA1 유전자의 코딩 서열을 클로닝하고 재조합 pET 플라스미드를 락토오스 유도가 가능한 글루코사민 생산 균주 대장균 7107-18로 형질전환함으로써 GNA1 클로닝 및 과잉 발현을 수행하였다. 상기 유전자의 기능적 발현은 SDS-PAGE 및 효소 활성 분석에 의해 측정하였다. N-아세틸글루코사민 합성을 쉐이크 플라스크 실험에서 모니터링하였다.

대장균에서의 과잉 발현을 위한 사카로마이세스 세레비시애 GNA1의 클로닝:
사카로마이세스 세레비시애 GNA1 유전자(ScGNA1)를 클로닝하고 발현하기 위해 공지된 GNA1 유전자 서열(Murakami et al., 1995, Nat. Genet. 10, pp. 261-268, 여기에서는 그대로 참조된다)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. PCR을 사용하여 사카로마이세스 세레비시애 균주 S288C로부터 분리된 유전체 DNA로부터 GNA1 코딩 서열을 증폭하기 위해 프라이머를 사용하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-83 및 리버스 프라이머 07-84이고 다음의 서열을 갖는다: 07-83: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG AGC TTA CCC GAT GGA TTT TAT ATA AGG C-3'(서열번호 35); 07-84: 5'-GAT CCT CGA GCT ATT TTC TAA TTT GCA TTT CCA CGC CTG C-3'(서열번호 36). 프라이머 07-83은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 35의 뉴클레오타이드 5 내지 10에 나타남) 및 그에 뒤따르는 ATG 개시 코돈(서열번호 36의 뉴클레오타이드 13 내지 43으로 나타남)으로부터 개시하는 GNA1 코딩 서열의 31개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-84는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 36의 뉴클레오타이드 5 내지 10에 나타남) 및 그에 뒤따르는 해독 종료 코돈(서열번호 36의 뉴클레오타이드 11 내지 40으로 나타남)에서 개시하는 GNA1 코딩 서열의 30개 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 증폭은 표준 프로토콜을 사용하여 수행되어 Bsa I와 Xho I 사이트가 접한 전체 ScGNA1 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편을 생성하였다.
GNA1 서열을 포함하는 PCR 생산물을 벡터 pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene, LaJolla, CA)로 클로닝하고 플라스미드 pSW07-60을 생성하였다. 플라스미드 PSW07-60으로부터 ScGNA1 단편을 Bsa I 및 Xho I의 분해에 의해 분리하고 발현 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 클로닝하여 플라스미드 SW07-60을 생산하였다. 이러한 방법의 클로닝은 ScGNA1 서열을 pET24d(+)의 T7-lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7-lac-ScGNA1의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서의 과잉 발현을 위한 캔디다 알비칸스 GNA1 유전자의 클로닝:
캔디다 알비칸스 GNA1(CaGNA1)을 클로닝하고 발현하기 위해 프라이머를 공지된 GNA1 서열(Mio et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 424-429, 여기에서는 그대로 참조된다)에 기초하여 합성하였다. PCR을 사용하여 캔디다 알비칸스 ATCC 10261 유전체 DNA의 GNA1 코딩 서열을 증폭하기 위해 프라이머 07-92 및 07-93을 사용하였다. 포워드 프라이머 07-92 및 리버스 프라이머 07-93는 다음의 서열을 갖는다: 07-92: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG ATG TTA CCA CAA GGT TAT AC-3'(서열번호 37); 07-93: 5'-GAT CCT CGA GCT AGA ATC TAC ATA CCA TTT CAA C-3'(서열번호 38). 프라이머 07-92는 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 37의 뉴클레오타이드 5 내지 10에 나타남) 및 그에 뒤따르는 ATG 개시 코돈(서열번호 37의 뉴클레오타이드 13 내지 35로 나타남)으로부터 개시하는 GNA1 코딩 서열의 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-93은 Xho 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 38의 뉴클레오타이드 5 내지 10에 나타남) 및 그에 뒤따르는 해독 종료 코돈(서열번호 38의 뉴클레오타이드 11 내지 34로 나타남)에서 개시하는 GNA1 코딩 서열의 24 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 증폭은 표준 조건 하에서 수행되어 Bsa I와 Xho I 사이트가 접한 전체 CaGNA1 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편을 생성하였다.
CaGNA1 서열을 포함하는 PCR 생산물을 벡터 pCR-Script Amp SK(+)(Stratagene, LaJolla, CA)의 SrfI 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-33을 생성하였다. 플라스미드 pKLN07-33으로부터 CaGNA1 단편을 제한 효소 Bsa I 및 Xho I로 분리하고 발현 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 클로닝하여 플라스미드 pKLN07-34 및 pKLN07-35를 생산하였다. 이러한 방법의 클로닝은 CaGNA1 서열을 pET24d(+)의 T7lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7lac-CaGNA1의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서의 과잉 발현을 위한 아라비돕시스 GNA1 유전자의 클로닝:
아라비돕시스 탈리아나 GNA1(AtGNA1)을 클로닝하고 발현하기 위해 프라이머 07-94 및 07-95를 공지된 GNA1 서열(Genebank AL391144)에 기초하여 합성하였다. PCR을 사용하여 BAC 클론 F14F8(Arabidopsis Biological Resource Center DNA Stock Center, Columbus, OH)로부터 GNA1 코딩 서열을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 사용하였다. 포워드 프라이머 07-94 및 리버스 프라이머 07-95는 다음의 서열을 갖는다: 07-94: 5'-GAT GGT CTC GCA TGG CTG AGA CAT TCA AGA TC-3'(서열번호 39); 07-95: 5'-GAT CCT CGA GTT AAT CGA AGT ACT TAG ACA TTT GAA TC-3'(서열번호 40). 프라이머 07-94는 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 39의 뉴클레오타이드 4 내지 9에 나타남) 및 그에 뒤따르는 ATG 개시 코돈(서열번호 39의 뉴클레오타이드 12 내지 32로 나타남)으로부터 개시하는 GNA1 코딩 서열의 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-95는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 40의 5 내지 10에 나타남) 및 그에 뒤따르는 해독 종료 코돈(서열번호 40의 뉴클레오타이드 11 내지 38로 나타남)에서 개시하는 GNA1 코딩 서열의 24개 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 증폭은 표준 프로토콜을 사용하여 수행되어 Bsa I와 Xho I 사이트가 접한 전체 GNA1 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편을 생성하였다 . PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 발현 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 클로닝하여 플라스미드 pSW07-70을 생산하였다. 이러한 방법의 클로닝은 AtGNA1 서열을 pET24d(+)의 T7lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7lac-AtGNA1의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서의 여러 재조합 GNA1 유전자의 기능적 발현 및 N-아세틸글루코사민 생산
재조합 플라스미드 pSW07-62(사카로마이세스 세레비시애 GNA1 유전자 포함), pKLN07-34(캔디다 알비칸스 GNA1 유전자 포함) 및 pSW07-70(아라비돕시스 탈리아나 GNA1 유전자 포함)을 대장균 균주 7107-18로 형질전환하고 각각 균주 7107-87, 7107-117 및 7107-93을 생성하였다. 대조 균주 7107-88을 공벡터를 동일한 숙주로 형질전환하여 준비하였다. 표준 프로토콜을 따라 형질전환체의 세포 배양액을 LB 배지에서 성장시키고 1mM IPTG로 유도하였다. SDS-PAGE 분석으로 GNA1 단백질 과잉 발현이 확인된 유도된 배양액으로부터 샘플을 수거하였다. 예상된 단백질 AtGNA1, CaGNA1 및 ScGNA1의 크기는 각각 17kDa, 16.9kDa 및 18.1kDa였다. 예상된 크기의 과잉 발현된 단백질은 다양한 GNA1 유전자를 발현하는 유도된 배양액으로부터 샘플에서 나타났다. 모든 경우에서 과잉 발현된 단백질은 매우 가용성인 것으로 나타났다. 예상한 바와 같이 GNA1 유전자의 예상 크기 부근에 과잉 발현된 단백질이 대조 균주 7107-88에서는 나타나지 않았다.
여러 대장균 균주를 스크린하여 재조합 GNA1 단백질의 기능적 발현을 확인하였다. 사카로마이세스 세레비시애, 캔디다 알비칸스 및 아라비돕시스 탈리아나 GNA1 발현 벡터의 숙주 균주를 40g l-1 글루코오스, 10g l-1 리보오스, 5g l-1 효모 추출물, 0.6g l-1 MgSO4-7H2O, 0.05g l-1 CaCl2-2H 2O, 25mg l-1 카나마이신 및 0.2mM IPTG가 보충된 M9B 생산 배지[미량 금속(0.2mg l-1 FeSO4-7H2O, 0.015mg l-1 ZnSO4-7H2O, 0.015mg l-1 MnSO4-H2O, 0.001mg l-1 CuSO 4-5H2O, 0.001mg l-1 NaMoO4-2H2O, 0.001mg l-1 H3BO3 및 0.001mg l-1 CoCl2-6H2 O)이 추가된 6g l-1 KH2PO4, 24g l-1 K2HPO4, 1g l-1 Na3Citrate-2H2O, 10g l-1 (NH4)2SO4(pH 7.4로 조정된 포스페이트)]에서 성장시켰다. HPLC 결과에 기초하여 24시간에 글루코오스를 하루당 총 30g l-1를 첨가하고 1g/l 이하로 양이 떨어진 경우 플라스크에 5g l-1 (NH4)2SO4 를 첨가하였다. 각각의 균주로부터 복제 플라스크를 제조하여 하나의 플라스크를 24시간에, 다른 것은 48시간에 효소 분석 및 N-아세틸글루코사민과 아세테이트 양의 측정을 위해 수거하였다.
글루코사민 신타제(GlmS) 활성을 분석하였는데 모든 균주가 좋은 활성 수준을 나타냈다. Mio et al.(Journal of Biological Chemistry, 1999, 274, pp. 424-429(표 12 참조))에 의해 기재된 방법에 따라 샘플을 글루코사민-6-P N-아세틸트랜스퍼라아제(GNA1) 효소 활성에 대해 분석하였다. 예상한 대로 대조 균주는 유의적 수준의 GNA1 활성을 나타내지 않았다. 효모와 고등 식물 GNA1 유전자의 발현은 높은 아세틸트랜스퍼라아제 활성을 유발하였다. 이 GNA1 형질전환체는 또한 N-아세틸글루코사민을 다량 합성하였다(표 12 및 13 참조). 사카로마이세스 세레비시애(7107-87)와 캔디다 알비칸스(7107-117)의 GNA1 유전자를 발현하는 균주에서 아세틸트랜스퍼라아제의 활성은 비교할 만하였다. 그러나 N-아세틸글루코사민 생산은 사카로마이세스 세레비시애 유전자를 발현하는 균주에서 4배 더 높았다. 아라비돕시스 탈리아나 유전자를 갖는 균주에서 GNA1 효소 활성은 캔디다 알비칸스 유전자를 갖는 균주에서보다 낮았지만, N-아세틸글루코사민 생산량은 전자가 더 많았다. 명백하게 GNA1 활성 수준과 N-아세틸글루코사민 생산과의 단순 상호관계는 존재하지 않았다; 다양한 기원으로부터의 GNA1 효소로 인해 효소 특성에 다양성을 가질 수 있다. 상기 데이터는 N-아세틸글루코사민을 생산한 대사 엔지니어링에서 여러 GNA1 유전자의 유용성을 보여준다. 테스트된 세 GNA1 유전자 중에서 사카로마이세스 세레비시애 GNA1은 N-아세틸글루코사민 생산 관점에서 다른 것보다 더욱 잘 수행하였다. 따라서 사카로마이세스 세레비시애 GNA1 유전자를 본 발명에 개시된 후속 연구 대상으로 선별하였다.
세 개의 다른 GNA1 유전자를 발현하는 균주에서의 글루코사민 신타제 및 아세틸트랜스퍼라아제 활성
구조 균주 효소 활성 GlcNAc
(g l-1)
GlmS GNA1
벡터 7107-88 0.53 0.06 0
사카로마이세스 세레비시애 GNA1 7107-87(25) 0.48 19.0 24.6
캔디다 알비칸스 GNA1 7107-117(1) 0.37 21.7 6.3
7107-117(2) 0.42 19.9 6.0
7107-117(3) 0.29 25.2 6.0
아라비돕시스 탈리아나 GNA1 7107-93(1) 0.50 6.3 13.3
7107-93(2) 0.14 5.6 10.7
1) 효소 활성은 μmol min-1 mg-1 단백질로 표현된다.
2) N-아세틸글루코사민 양은 23시간에 수득한 샘플에서 측정되었다.
3) 괄호의 숫자는 다양한 자매세포(sibling)를 나타낸다.
균주 7107-18은 HPLC에 의해 감지할 수 있는 많은 양의 글루코사민을 생산한다. 그러나 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 과잉 발현하는 균주에서 거의 없거나 아주 미량의 글루코사민(0.5g l-1이하)이 감지되지 않았다. 이것은 명확하게 GNA1 형질전환체에서 중간매개 글루코사민-6-P의 유의적인 생성이 없음을 나타내고 효소 GNA1이 N-아세틸글루코사민의 많은 생산에 주된 구동력임을 확인시켜 주었다.
아세테이트의 축적은 대장균에서의 많은 양의 재조합 단백질과 다른 발효 산물을 만들어내는 데 있어서의 장애물로 인식된다. 배지에서 초과 글루코오스에 의해 대장균 세포는 많은 양의 아세테이트와 다른 유기산을 합성하는 경향이 있고 보통 성장 억제를 유발한다. 아세테이트 생산은 글루코사민 생산 대장균 균주에서 문제가 되어 왔다. 그러나 N-아세틸글루코사민 생산 균주는 대조 균주가 멀티 그램 수준의 아세테이트를 축적하는 조건하에서 23 시간에 아세테이트를 아주 적게 축적하거나 거의 축적하지 않았다. N-아세틸글루코사민의 합성에는 아세테이트 형성의 전구체인 아세틸-CoA가 소모된다. 아세틸-CoA의 사용이 세포에 대사적 부담을 부과하지만, 아세테이트 축적이 방지됨에 따라 N-아세틸글루코사민 생산으로의 아세틸-CoA 재순환은 명백하게 유의적인 이익을 나타낸다. N-아세틸글루코사민을 생산하는 균주가 대조 균주보다 더 높은 세포 밀도를 나타냈다는 것에 유의할 필요가 있다.(표 13).
여러 GNA1 발현 구조물로 형질전환된 대장균 균주에서 세포 성장 및 N-아세틸글루코사민 생산
균주 구조물 성장(OD600) 아세테이트(g l-1) GlcNAc(g l-1)
23시간 48시간 23시간 48시간 23시간 48시간
7107-88 벡터 3.75 4.2 4.4 5.2 발견되지 않음 발견되지 않음
7107-89 사카로마이세스 세레비시애 GNA1 7.80 12.0 발견되지 않음 발견되지 않음 11.7 24.6
7107-117 캔디다 알비칸스 GNA1 10.00 13.8 0.5 5.1 5.1 6.1
7107-93 아라비돕시스 탈리아나 GNA1 8.70 13.2 발견되지 않음 4.0 8.0 12.0

여러 GNA1 효소의 서열 분석:
다양한 GNA1 유전자를 과잉 발현하는 대장균 균주에서 비활성 및 NAG 생산의 유의적 차이가 관찰되었다. 그러나 모든 효소가 동일한 반응을 촉진시키기 때문에 다양한 GNA1의 뉴클레오타이드와 단백질 양 사이에 상동성이 예측된다. 서열번호 29는 사카로마이세스 세레비시애 GNA1 유전자의 코딩 서열을 포함한다. 서열번호 29는 여기에서 서열번호 30으로 표현된 사카로마이세스 세레비시애 GNA1 아미노산 서열을 암호화한다. 서열번호 33은 아라비돕시스 탈리아나 GNA1 유전자의 코딩 서열을 포함한다. 서열번호 33은 서열목록 34로 여기에서 표현되는 아라비돕시스 탈리아나 GNA1 아미노산 서열을 암호화한다. 서열번호 31은 캔디다 알비칸스 GNA1 유전자의 코딩 서열을 포함한다. 서열번호 31은 여기에서 서열번호 32로 표현되는 캔디다 알비칸스 GNA1 아미노산 서열을 암호화한다. J. Hein DNA 정렬법(DNA Star reference)에 의할 때 핵산서열은 유의적인 상동성을 나타냈다. ScGNA1 및 At-GNA1 코딩 서열은 49.7%의 동일성을 공유하는 반면 ScGNA1 및 CaGNA1 코딩 서열은 53.1%의 동일성을 공유한다. CaGNA1 및 AtGNA1 코딩 서열은 47.2%의 동일성을 공유한다.
Lipman-Pearson 단백질 정렬법(DNA Star, Inc., Madison, WI)에 의할 때, 코딩 서열의 아미노산 서열로의 해독은 다양한 GNA1 단백질 사이에서 유의적인 상동성을 나타냈다. 표 14에 나타난 바와 같이 ScGNA1 서열(서열번호 30)은 CaGNA1 서열(서열번호 32)과 44%의 동일성을 공유하고 AtGNA1(서열번호 34)와는 38.9%의 동일성을 공유한다. 어떤 영역은 더욱 고도로 보존되는 것으로 나타났다; 예컨대 아미노산 GHIED는 모든 서열(ScGNA1 서열(서열번호 30)의 아미노산 96-100으로 정렬)에서 보존되었다. 서열번호 30의 ScGNA1 잔기 129-148에 대응하는 20 잔기 영역 또한 고도로 보존되었다. 이 영역은 CaGNA1 서열에 대응하는 영역에 75%, AtGNA1 서열에서 대응하는 영역에 70%의 동일성을 보유하였다.
ScGNA1, AtGNA1 및 CaGNA1의 펩티드 크기 및 상동성
GNA1 아미노산 숫자 펩티드 크기
(kDa)		 펩티드 서열 상동성(%동일성)*
ScGNA1 AtGNA1 CaGNA1
ScGNA1 158 18 38.9(49.7) 44.0(53.1)
AtGNA1 148 17 37.6(47.2)
CaGNA1 148 17
* 괄호는 뉴클레오타이드 수준에서의 상동성을 나타낸다.
< 실시예 14 >
본 실시예에서는 대장균 nagB 및 사카로마이세스 세레비시애 GNA1의 과잉 발현을 통해 N-아세틸글루코사민을 생산하는 균주의 구성을 기술한다.
nag 레귤론(regulon)의 일부인 nagB 유전자는 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(NagB)를 암호화하고 nag 레귤론의 일부로서 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 이화 경로에 관계된다. 상기 nag 레귤론은 오페론 nagBACD 및 다르게 전사된 nagE(Plumbridge, JA., 1991, Mol. Microbiol. 8:2053-2062)로 구성된다. 외인성 GlcNAc는 세포에 전달될 때 인산화되어 GlcNAc-6-P를 형성한다. 상기 nagA 유전자 생산물은 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 디아세틸라아제를 암호화하고, GlcNAc-6을 GlcN-6P로 전환한다. NagB가 그때 GlcN-6-P의 프룩토오스-6-포스페이트(F-6-P)로의 전환을 촉진시킨다.
대장균에서의 glmS 유전자 생산물은 리포폴리사카라이드 및 펩티도글리칸의 형성 경로에서 본질적인 중간매개물인 GlcN-6-P의 합성을 촉진시킨다. 따라서 결실 glmS를 갖는 돌연변이주는 외인성 GlcN 또는 GlcNAc에 의존한다. 그러나 NagB는 정상적으로 GlmS에 의해 수행된 상기 반응을 촉진시키고 F-6-P를 GlcN-6-P로 전환시키는 것으로 나타났다. 실제로 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(nagB)를 발현하는 고카피(high-copy) 플라스미드에 의한 glmS 돌연변이주의 형질전환은 glmS 돌연변이를 억제하는 것으로 나타났다(J Bac 1989 Dec; 171(12): 6589-6592). NagB가 F-6-P에서 GlcN-6-P로의 전환을 촉진시키기 때문에 발명자들의 생산 균주에 서 glmS*54 대신 nagB가 과잉 발현하는 것은 글루코사민의 축적을 유발할 가능성이 있다. T7lac-ScGNA1 카세트가 균주에 존재하면, GlcN-6-P는 GlcNAc-6-P로 전환되고 배지에 NAG로서 축적될 수 있다.
nagB 유전자의 과잉 발현에 의해 글루코사민 또는 N-아시틸글루코사민 생산의 효율성을 테스트하기 위해 GNA1 클로닝 및 통합에서 기술한 방법 및 프로토콜이 T7lac-nagB 발현 카세트를 대장균 7107-17(DE3) 염색체의 pfkB 사이트에서 클로닝하고 통합하는데 적용하였다. 내인성 glmS 유전자는 이 균주에서 비활성화될 필요가 있을 것이다. glmS 서열은 glmS 상류의 명백한 프로모터 서열을 갖지 않는 glmU 서열로부터 하류에 위치한다. glmU 및 glmS가 오페론 glmUS를 형성하는 것으로 생각된다. glmS 서열 및 약간의 측면 서열을 대장균 유전체 DNA로부터 PCR로 증폭시키고 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 적절한 제한 분해를 사용하여 glmS 서열로부터 내부 단편을 제거하였다. 내부 결실을 갖는 glmS 서열을 온도 민감성 복제 기원 및 카나마이신 선별 마커에 라이게이션하여 통합 벡터를 생산하였다. 온도 선별 프로토콜을 glmS가 결실된 돌연변이주의 선별에 사용하였다. 글루코사민은 세포 활성에 지극히 중요하기 때문에 글루코사민을 돌연변이주의 성장을 위한 배양 배지에 공급될 필요가 있다.
대장균에서의 과잉 발현을 위한 nagB 유전자의 클로닝
대장균 nagB 유전자의 공지된 서열(Peri et al., 1990, Biochem. Cell Biol. 68, pp. 123-137, 여기에서는 그대로 참조된다)에 기초한 정보를 사용하여 bagB 코딩 서열을 증폭하기 위해 프라이머를 설계하였다. 포워드 프라이머 07-141 및 리버스 프라이머 07-142를 사용하여 nagB 코딩 서열을 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 PCR로 증폭하였다. 그 서열을 나타내면 다음과 같다: 07-141: 5'-GAT GGT CTC GCA TGA GAC TGA TCC CCC TGA C-3'(서열번호 43); 07-142: 5'-GAT CCT CGA GTT ACA GAC CTT TGA TAT TTT CTG CTT CTA ATT C-3'(서열번호 44).
프라이머 07-141은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 43의 뉴클레오타이드 4 내지 9에 나타남) 및 ATG 개시 코돈(서열번호 43의 뉴클레오타이드 12 내지 31로 나타남)으로부터 개시하는 nagB 코딩 서열의 20개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-142는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 44의 뉴클레오타이드 5 내지 10에 나타남) 및 해독 종료 코돈(서열번호 44의 뉴클레오타이드 11 내지 43으로 나타남)으로부터 nagB 코딩 서열의 33개 뉴클레오타이드를 포함한다. 대장균 nagB 코딩 서열 및 NagB 아미노산 서열은 각각 서열번호 41 및 서열번호 42로 표시된다.
nagB 코딩 서열을 포함하는 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 플라스미드 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션시켜 플라스미드 pSW07-93을 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 nagB 서열을 pET24d(+)의 T7-lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7-lac-nagB의 발현 카세트를 생산하였다.
nagB 유전자의 과잉 발현
플라스미드 pSW07-93#3, #8 및 #16을 균주 7107-17(DE3)로 형질전환하고 균주 7107-636, 7107-637 및 7107-638을 각각 생성하였다. pET24d(+) 플라스미드를 균주 7107-17(DE3)로 형질전환하여 음성 대조 균주 7107-639를 생성하였다. 형질전환체의 세포 배양액을 LB 배지에서 성장시키고 1mM IPTG로 유도하는 표준 유도 실험을 수행하였다. 샘플을 다양한 시간대에서 유도된 배양액으로부터 수득하여 SDS-PAGE에 의해 NagB 단백질 과잉 발현을 확인하였다. 과생산된 NagB 단백질의 예상된 크기는 29.8kDa였다. NagB의 예상된 크기에 대응되는 단백질이 균주 7107-636 및 7107-637에서 과잉 생산되었다. 이 크기의 과잉 생산된 단백질이 대조 균주 7107-639에서는 명백하지 않았다. 유도 후 2시간부터의 단백질 샘플은 대부분의 과잉 생산된 NagB 단백질이 가용성 분획임을 나타냈다. 그러나 유도 후 4시간에 단지 25%의 단백질만이 가용성 분획인 것으로 나타났다.
염색체의 pfkB 로커스에서의 T7lac-nagB 카세트의 통합
NagB의 과잉 생산을 성공적으로 확인한 이후 다음 단계는 T7lac-nagB 발현 카세트를 대장균 7107-17(DE3)의 염색체로 통합하는 것이었다. 대장균 염색체의 pfkB 유전자에 통합할 표적을 결정하였다. pfkB 유전자가 대장균에 존재하는 전체 포스포프럭토키나아제 활성의 10%를 공급하는 마이너 포스포프럭토키나아제를 암호화한다. 따라서 이 사이트로의 통합 표적 결정은 성장 또는 N-아세틸글루코사민 생산에 영향을 주지 않아야 한다.
균주 7107-17(DE3) 염색체의 pfkB에서 T7lac-nagB 발현 카세트를 직접 통합을 유도하는 벡터를 개발하기 위해 여러 클로닝 단계가 필요하다. 첫 번째 단계는 측면 영역이 추가된 pfkB 코딩 서열을 포함하는 대장균 유전체로부터의 영역을 클로닝하는 것이었다. 프라이머는 공지된 서열(Blattner et al., 1997, Science 227(5331): 1453-1474)에 기초하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터의 측면이 접하는 영역이 추가된 pfkb를 증폭하도록 설계하였다. PCR에 의해 pfkB 영역을 증폭하는 데 사용된 프라이머 07-16 및 07-17은 다음의 서열을 갖는다: 07-16: 5'-GAT CGC CGG CTT ACA TGC TGT AGC CCA GC-3'(서열번호 45); 07-17: 5'-GAT CCT GCA GTC ATG CTG CTA ATA ATC TAT CC-3'(서열번호 46).
프라이머 07-16은 Nae I 사이트(GCCGGC, 서열번호 45의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 pfkB 코딩 서열 개시코돈(서열번호 45의 뉴클레오타이드 11-29로 표시됨)의 상류로 1045 뉴클레오타이드로부터 증폭된다. 프라이머 07-17은 Pst I 사이트(CTGCAG, 서열번호 46의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 첨가하고 pfkB 종료 코돈(서열번호 46의 뉴클레오타이드 11-32로 표시됨)의 하류로 1357 염기쌍으로부터 증폭된다. 측면이 접하는 영역에 추가된 pfkB을 포함하는 3332 염기쌍 PCR 생산물을 pPCR-Script Amp SK(+)(Stratagene, LaJolla, CA)의 Srf I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-14를 생성하였다.
T7-lac-nagB 카세트를 플라스미드 pSW07-93#3(상기 참조)으로부터 포워드 프라이머 07-145 및 리버스 프라이머 07-146을 갖는 표준 PCR 조건하에서 증폭하였다. 상기 프라이머는 다음 서열을 갖는다: 07-145: 5'-GAT CTA CGT AAG CAA CCG CAC CTG TGG C-3'(서열번호 47): 07-146: 5'-GAT CCA ATT GAT CCG GAT ATA GTT CCT CCT TTC AGC-3'(서열번호 48).
프라이머 07-145는 SnaB I 사이트(TACGTA, 서열번호 47의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 T7 프로모터(서열번호 47의 뉴클레오타이드 11-28로 표시됨)의 상류로 76 뉴클레오타이드로부터 증폭한다. 프라이머 07-146은 Mfe I 사이트(CAATTG, 서열번호 48의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 T7 터미네이터(서열번호 48의 뉴클레오타이드 11-36로 표시됨)의 하류로 25 염기쌍부터 증폭한다.
다음의 클로닝 단계로 T7lac-nagB 카세트를 플라스미드 pKLN07-14로 라이게이션하였다. 플라스미드 pKLN07-14를 제한 엔도뉴클레아제 SnaB I 및 Mfe I로 분해시켜 pfkB 코딩 서열의 523 bp부를 제거하였다. T7lac-nagB 카세트를 포함하는 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 SnaB I 및 Mfe I으로 분해하고 pKLN07-14의 SnaB I 및 Mfe I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-97을 생성하였다. 따라서 플라스미드 pSW07-97은 T7lac-nagB 카세트로 대체된 pfkB 코딩 서열 523 뉴클레오타이드 영역을 갖는 측면이 접하는 유전체 영역이 추가된 pfkB를 포함한다.
pPCR-Script MCS 부분을 추가한 ORFb1722-DpfkB::T7-lac-nagB-ORFb1725를 포함하는 단편을 플라스미드 pSW07-97로부터 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I로 분해시켰다. 카나마이신 저항성 카세트가 추가된 온도 민감성 복제단위를 포함하는 단편을 플라스미드 pKLN07-21(전술하였음)로부터 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I로 절단하였다. 2개의 단편을 함께 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-98을 생성하였다.
플라스미드 pSW07-98을 사용하여 염색체의 DpfkB에서 T7lac-nagB를 갖는 대장균 균주를 생성하였다. 대장균 7101-17(DE3)을 pSW07-98로 형질전환한 다음 온도 선별 프로토콜을 사용하여 pfkB 사이트에서 통합된 T7-lac-nagB를 갖는 균주를 선별하였다. 그 결과 선별된 균주를 7107-645로 명명하고 nagB 코딩 서열을 프로브로 사용하여 표준 높은 엄격성 서던 혼성화(Southern hybridization)에 의해 확인하였다.
통합된 T7lac-nagB 카세트를 갖는 대장균 균주에서 glmS 유전자의 결실
대장균 균주 7107-645의 glmS 유전자를 결실시키기 위해 glmS 서열 대체 벡터를 개발하였다. 벡터를 구성하는데 여러 단계가 요구된다. 첫 번째 단계는 측면이 접하는 서열(참조)이 첨가된 glmS 유전자를 포함하는 유전체 영역을 증폭하는 것이었다. 다음으로 이 단편은 온도 민감성 복제 기원과 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 pKLN07-21(이전에 기술함)로부터 단편으로 라이게이션된다. 마지막으로 glmS 코딩 서열의 부분을 상기 결과 플라스미드로부터 절개하여 대장균 유전체에 glmS 결실의 표적을 결정하기 위한 통합 벡터를 생성하였다.
첫 번째 단계 동안 측면이 접한 구역(참조)이 추가된 공지된 glmS 유전자 서열에 기초하여 프라이머를 합성하였다. 상기 프라이머를 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 glmU, glmS 및 pstS 유전자를 포함하는 단편을 증폭하였다. 상기 증폭에 사용된 프라이머는 07-139 및 07-140으로 명명되고 다음과 같은 서열을 나타냈다: 07-139: 5'-GAT GCG GCC GCA TGT TGA ATA ATG CTA TGA GCG TAG TGA TC-3'(서열번호 49); 07-140: 5'-GAT CGT CGA CTT AGT ACA GCG GCT TAC CGC TAC TGT C-3'(서열번호 50).
포워드 프라이머 07-139는 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 49의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨)에 뒤따르는 ATG 개시코돈(서열번호 49의 뉴클레오타이드 12-41로 표시됨)으로부터 glmS 코딩서열의 처음 30개 뉴클레오타이드를 포함한다. 리버스 프라이머 07-140은 Sal I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GTCGAC, 서열번호 50의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)에 뒤따르는 그 해독 종료 코돈으로부터 시작하는 pstS 코딩 서열의 마지막 27개 뉴클레오타이드를 포함한다. 표준조건하에서 PCR을 행하여 Not I 및 Sal I 제한 엔도튜클레아제 사이트가 측면에 접한 glmU-glmS-pstS 코딩 서열을 포함하는 단편을 생성하였다.
상기 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I로 분해시켰다. 카나마이신 저항성 카세트 단편이 추가된 온도 민감성 복제단위를 플라스미드 pKLN07-21(이전에 기술함)로부터 제한 엔도뉴클레아제 Not I와 Sal I로 절개하였다. 2개의 단편을 함께 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-94#43을 생산하였다.
플라스미드 pSW07-94#43을 제한 엔도뉴클레아제 Sac II로 분해시켜 glmS 코딩 서열의 980 뉴클레오디드를 제거하였다. 플라스미드의 남은 부분을 자가 라이게이션하여 통합벡터 pSW07-95를 생성하였다.
대장균 염색체에 glmS 돌연변이를 생성하기 위한 재조합 빈도수를 개선하기 위해서 플라스미드 pSW07-95에 glmU의 상류 영역으로 772 뉴클레오타이드를 첨가하 여 플라스미드 pSW07-99를 구성하였다. 프라이머를 측면이 접하는 영역(참조)이 추가된 glmU 유전자의 공지된 서열에 기초하여 합성하였다. 상기 프라이머를 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 glmU 개시코돈의 상류로 772 뉴클레오타이드 및 glmU 코딩 서열의 처음 246 뉴클레오타이드를 포함하는 단편을 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머를 07-147 및 07-148로 명명하였고 그 서열은 다음과 같았다: 07-147: 5'-GAT GCG GCC GCA TGG CAA TGA CTT ACC ACC TGG AC-3'(서열번호 51); 07-148: 5'-CGT ACC CAG CTG CTC TGC CTG AAG CAC CC-3'(서열번호 52).
포워드 프라이머 07-147은 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 51의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨)에 뒤따르는 atpC 코딩 서열(서열번호 51의 뉴클레오타이드 12-35로 표시됨)의 처음 24개 뉴클레오타이드를 포함한다. 리버스 프라이머 07-148은 그 ATG 개시코돈의 하류로 246 염기쌍부터 개시하는 glmU 코딩 서열(서열번호 52의 뉴클레오타이드 1-29로 표시됨)의 29개 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR을 표준 조건에서 수행하여 glmU 코딩 서열의 atpC 개시코돈으로부터 뉴클레오타이드 246까지 유전체 DNA 영역을 포함하는 단편을 생산하였다. 상기 PCR 생산물을 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 SexA I로 분해하고 플라스미드 pSW07-95#6의 Not I 및 SexA I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-99를 생성하였다.
플라스미드 pSW07-95 및 pSW07-99를 사용하여 염색체에서 glmS 결실을 갖는 대장균 균주를 생성하였다. 플라스미드 pSW07-95 또는 pSW07-99로 대장균 균주 7107-645(20), 7107-645(30) 및 7107-645(43)를 형질전환한 다음 온도 선별 프로토 콜을 사용하여 glmS 결실을 갖는 균주를 선별하였다. 글루코사민(2g l-1)을 모든 플라스크에 통과하도록 첨가하였고 통과 후 모든 플레이트에 첨가하였다. glmS 결실의 존재를 위해 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 카나마이신 민감성 균주를 선별하고 스크린하였다. 성장 감소를 알아내기 위해 PCR로 확인된 잠재적인 glmS 결실 균주를 글루코사민의 첨가 없이 LB 플레이트에 도말하였다. 어떤 균주는 LB 플레이트 상에서 제한된 성장을 갖는 반면 다른 것들은 성장을 보이지 않았다. glmS 코딩 서열을 포함하는 단편 2.0-kb를 사용하여 높은 엄격성 하에서 서던(Southern) 혼성화에 의해 glmS를 결실을 갖는 균주들을 확인하였다. 그 결과 얻어진 균주를 7107-646으로 명명하였다.
nagB의 기능적 발현 및 글루코사민 생산에 대한 영향
균주 7107-646의 글루코사민 생산 및 효소 활성을 테스트하기 위해 쉐이크 플라스크 스크린 61을 수행하였다. 10g l-1 글루코오스, 0.6g l-1 MgSO4-7H 2O, 0.05g l-1 CaCl2-2H2O 및 0.2mM IPTG가 보충된 M9B 배지[미량 금속(0.2mg l-1 FeSO4-7H2O, 0.015mg l-1 ZnSO4-7H2O, 0.015mg l-1 MnSO4-H 2O, 0.001mg l-1 CuSO4-5H2O, 0.001mg l-1 NaMoO4-2H2O, 0.001mg l-1 H3BO3 및 0.001mg l -1 CoCl2-6H2O)이 추가된 6g/l KH2PO4, 24g/l K2HPO4, 1g l-1 Na3Citrate-2H2O, 10g l -1 (NH4)2SO4(pH 7.4로 조정된 포스페이트)]를 포함하는 플라스크에서 상기 균주를 테스트하였다. 배양액은 30℃에서 24시간 배양하였고 25℃에서 방치하였다. 각 배양액의 pH를 24시간 및 48시간에서 7.2로 조정하였다. 24 및 48시간에서 하루에 총 약 30g l-1의 글루코오스를 플라스크에 첨가하고 1g l-1 이하의 수준으로 떨어진 경우 플라스크에 5g l-1의 (NH4 )2SO4을 첨가하였다. 샘플을 24 및 48시간에 채취한 다음 미국특허 제 6372457에 개시된 정형화된 Elson-Morgan 분석을 사용하여 배양상등액의 글루코사민 농도를 측정하였다. 어떤 샘플에서도 글루코사민이 발견되지 않았다. NagB 활성을 알아보기 위해 48시간에 균주 7107-646#7 및 7107-646#20으로부터의 샘플을 테트스하였다. 이 균주는 58 및 53mmol min-1 mg-1의 효소 활성을 보유하여 대조 균주 7107-17(DE3)에서 활성이 발견되지 않은 것과 비교할 때 nagB의 성공적인 과잉 발현을 나타냈다. 실험에서 7107-646 균주가 대조 균주 7107-17(DE3)보다 더 잘 성장한다는 사실은 과잉 발현된 nagB가 glmS 돌연변이를 억제할 수 있음을 나타낸다. 그러나 nagB의 과잉 발현은 글루코사민 축적의 증가를 유발하지 않았다.
T7lac-ScGNA1 카세트의 통합
glmS 결실 균주에서 nagB의 과잉 발현은 잠재적으로 NagB가 보통 GlcN-6-P의 탈아미노화를 촉진하기 때문에 글루코사민 축적을 유발하지 않았다. NagB 효소에 의해 생산된 적은 양의 GlcN-6-P는 신속하게 프룩토오스-6-P로 전환되어 GlcN-6-P의 축적을 방지하였다. 그러나 GNA1 효소가 도입되면 GNA1은 GlcN-6-P를 GlcNAc-6-P로 전환하고 연속적으로 프룩토오스-6-포스페이트로부터 글루코사민-6-포스페이트의 형성을 유발한다. 이 가능성을 테스트하기 위해 균주 7107-646(3) 및 7107-646(7)의 manXYZ에서 T7lac-ScGNA1 카세트를 통합하였다. 실시예 16에 기술된 것처럼 플라스미드 pSW07-68#25로 GNA1 통합을 수행하였다. 표준 PCR 프로토콜로 카나마이신 민감성 균주를 manXYZ 결실 사이트에서의 T7lac-ScGNA1의 존재를 확인하기 위해 스크린하였다. ScGNA1 코딩 서열을 포함하는 단편을 프로브로 사용하여 표준 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 PCR 양성 균주를 확인하였다. 그 결과 균주 7107-646(3) 및 7107-646(7)으로부터 유도된 균주 7107-660 및 7107-661에 대해 NAG 축적을 테스트하였다.
대장균에서의 nag B의 기능적 발현 및 N-아세틸글루코사민의 생산
glmS 결실, pfkB에서의 T7lac-nagB 카세트 및 manXYZ에서의 T7lac-ScGNA1 카세트의 N-아세틸글루코사민 생산을 테스트하기 위해 쉐이크 플라스크 스크린 67을 수행하였다. 대조 균주 7107-17 및 7107-607(2) 뿐만 아니라 균주 7107-660(1), 7107-660(4), 7107-661(1), 7107-661(2) 및 7107-661(3)를 10g l-1 글루코오스, 10g l-1 락토오스, 0.6g l-1 MgSO4-7H2O, 0.05g l-1 CaCl2-2H2O 가 보충된 M9B 배지(전술함)를 포함하는 플라스크에서 성장시켰다. 배양액을 37℃에서 8시간동안 성장시키 고 30℃를 유지하였다. 접종 8시간 후 글루코오스를 25g l-1가 될 때까지 첨가하고 pH를 7.2로 조정하였다. 24, 31, 48 및 56 시간에 글루코오스를 HPLC 결과에 기초하여 하루에 총 30 내지 40g l-1로 첨가하고, 플라스크에서의 수준이 1g l-1이하인 경우 (NH4)2SO4 5g l-1를 첨가하고 pH를 7.2로 조정하였다. 27시간에 락토오스를 5g l-1로 첨가하였다. NAG 수준의 HPLC 분석을 위해 샘플을 8, 24, 48 및 72시간에 제거하였다. 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(GNA1), 글루코사민 신타제(GlmS) 및 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(NagB)활성을 분석하기 위해 세포 배양액을 72시간에 수거하였다.
효소 분석에 의해 상기 7107-660 및 7107-661 균주는 기능성 GlmS 단백질이 결여된 것으로 확인되었다. 예상한 바와 같이 NagB 활성은 이 균주에서 상승하였다. 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성은 대조 균주 7107-607(2)에서 보인 것과 유사하였고 이 균주에서 GNA1 단백질의 기능적 발현을 나타냈다.
nagB 및 GNA1을 과잉 발현하는 glmS 결실 균주는 N-아세틸글루코사민을 생산할 수 있었다(표 15 참조). 균주 7107-661이 가장 잘 수행하였는데 생산균주 7107-607#2에 의해 얻어진 NAG 양의 75%를 생산하였다. 흥미롭게도 균주 7107-660(1)은 다른 자매세포보다 20배 더 낮은 NagB 활성을 보였고 결과적으로 훨씬 적은 양의 GlcNAc를 생산하였다. 글루코사민-6-P 아세틸트랜스퍼라제가 글루코사민- 6-포스페이트 형성 방향으로 NagB에 의해 촉진되는 반응을 구동할 수 있을 것으로 생각된다. 상기 데이터는 N-아세틸글루코사민 합성의 신규한 생물학적 경로의 기능성을 증명한다. 또한 GNA1과 접합된 nagB의 과잉 발현은 대장균에서의 N-아세틸글루코사민을 생산하는 효율적인 방법이다.
nagB를 과잉 발현하는 glmS 돌연변이 균주에서 효소 활성 및 GlcNAc 생산
구조물 균주 효소 활성 GlcNAc
(g l-1)
NagB GlmS GNA1
대조군 7101-17 0.0 0.08 0.0 0.0
glmS*54, GNA1의 2개의 카피 7107-607(2) 0.0 0.22 3.8 30.0
glmS 결실, nagB 및 GNA1 7107-660(1) 2.0 0.0 3.5 5.5
7107-660(4) 42 0.0 2.9 18.7
glmS 결실, nagB 및 GNA1 7107-661(1) 54 0.0 3.5 22.0
7107-661(2) 62 0.0 4.1 22.1
7107-661(3) 58 0.0 3.9 24.2
1) 효소 활성 및 N-아세틸글루코사민 양은 72시간에 수득한 샘플에서 측정하였다.
2) 효소 활성은 μmol min-1 mg-1 단백질로 표시된다.
3) 괄호의 숫자는 여러 자매세포를 나타낸다.
< 실시예 15 >
본 실시예는 균주 7107-18에서 N-아세틸글루코사민 생산을 위한 glmM 및 glmU의 클로닝 및 과잉 발현을 기술한다.
대장균에서 glmM 및 glmU 유전자는 GlcN-6-P를 UDP-GlcNAc로 전환하는 처음 세 단계를 촉진하는 효소를 암호화한다. UDP-GlcNAc는 본질적인 세포 외피 성분을 합성하는데 필요하다. GlmM은 GlcN-1,6-디포스페이트가 1차 생산물 및 2차 기질 양자로 모두 작용하는 2 단계의 핑퐁 반응 메카니즘에 의해 GlcN-6-P 및 GlcN-1-P의 상호 변환을 촉진한다. GlmM은 인산화된 형태에서만 활성이 있는 것으로 알려져 있고 생체 내에서 효소의 활성은 알려져 있지 않다. 많은 양의 GlmM을 과잉 생산하는 균주에서 인산화된 효소의 총량은 증가하지 않아 GlmM 인산화의 수준이 강하게 조절될 수 있음을 알 수 있다(Mengin-Lecreulx and van Heifenoort, J. Biol. Chem. 1996 271:32-39). GlmU는 분리된 유리딜트랜스퍼라제(N-말단) 및 아세틸트랜스퍼라제(C-말단) 도메인(domain)을 갖는 이작용기성 효소이다. 상기 아세틸트랜스퍼라제 영역은 GlcN-1-P의 GlcNAc-1-P로의 전환을 촉진하는 역할을 한다; 이때 상기 유리딜트랜스퍼라제 도메인이 GlcNAc-1-P를 UDP-GlcNAc로 전환한다. 최근에 공지된 바에 따르면 GlmU의 절단된 형(version)이 N-말단 His6 태그로 발현되었고 아세틸트랜스퍼라제 및 유리딜트랜스퍼라제의 활성에 대해 분석되었다(Pomp대 et al., J. Biol. Chem. 2001 276:3833-3839). 완전한 길이의 GlmU에 관하여 1320 인자에 의해 감소된 유리딜트랜스퍼라제 활성을 갖는 GlmU의 절단된 형태는 단백질로부터 처음 78 N-말단 아미노산 잔기를 결실시킴으로써 얻어졌다. 이 절단된 GlmU 단백질은 완전한 길이의 GlmU에서 보이는 아세틸트랜스퍼라제 활성의 66%를 보유하였다.
도 14는 GlcN-6-P가 GlmM 및 GlmU 효소의 작용을 통해 UDP-GlcNAc로 전환되는 세균성 경로를 나타낸다. glmM, glmU, 절단된 glmU 또는 glmM 및 glmU의 조합의 과잉 발현으로 배지에서 N-아세틸글루코사민의 축적이 유발될 수 있다. 따라서 이 유전자의 과잉 발현을 위해 균주가 구축되었다.
대장균에서의 과잉 발현을 위한 glmM 유전자의 클로닝
대장균 glmM 유전자를 클로닝하고 과잉 발현하기 위해 glmM의 공지된 유전자 서열(Mengin-Lecreulx, and van Heijenoort.. J. Biol. Chem., 1996, 271:32-39)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. glmM 코딩 서열을 대장균 W3110 유전자 DNA로부터 표준조건하에서 포워드 프라이머 07-163 및 리버스 프라이머 07-164를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: 07-163: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG AGT AAT CGT AAA TAT TTC-3'(서열번호 59); 07-164: 5'-GAT CCT CGA GTT AAA CGG CTT TTA CTG CAT C-3'(서열번호 60).
프라이머 07-163은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 59의 뉴클레오타이드 5-10으로 나타냄) 및 이에 뒤따르는 그 ATG 개시 코돈(서열번호 59의 뉴클레오타이드 13-33으로 나타냄)으로부터 개시되는 glmM 코딩 서열의 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-164는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 60의 뉴클레오타이드 5-10으로 나타냄) 및 이에 뒤따르는 그 해독 종료 코돈(서열번호 60의 뉴클레오타이드 11-31로 나타냄)으로부터 개시되는 glmM 코딩 서열의 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. 대장균 glmM 코딩 서열 및 GlmM 아미노산 서열을 각각 서열번호 53 및 서열번호 54로 나타내었다. 표준 조건하에서 PCR 증폭을 수행하여 Bsa I 및 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트에 측면으로 접하는 완전한 glmM 코딩 서열을 생성하였다. 상기 PCR 생산물을 제한 효소 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 플라스미드 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-109를 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 glmM 서열을 pET24d(+)의 T7lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7lac-glmM의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서 과잉 발현을 위한 glmU 유전자의 클로닝:
대장균 glmU 유전자를 클로닝하고 과잉 발현하기 위해 glmU 유전자의 공지된 서열(Mengin-Lecreulx, and van Heijenoort,. J. Bac., 1993, 175:6150-6157)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. glmU 코딩 서열을 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 표준조건하에서 포워드 프라이머 07-161 및 리버스 프라이머 07-162를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: 07-161: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TTG AAT AAT GCT ATG AGC-3'(서열번호 61); 07-162: 5'-GAT CCT CGA GTC ACT TTT TCT TTA CCG GAC GAC-3'(서열번호 62).
프라이머 07-161은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 61의 뉴클레오타이드 5-10으로 나타냄) 및 이에 뒤따르는 그 ATG 개시 코돈(서열번호 61의 뉴클레오타이드 13-33으로 나타냄)으로부터 개시되는 glmU 코딩 서열의 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-162는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이 트(CTCGAG, 서열번호 62의 뉴클레오타이드 5-10으로 나타냄) 및 이에 뒤따르는 그 해독 종료 코돈(서열번호 62의 뉴클레오타이드 11-33으로 나타냄)으로부터 개시되는 glmU 코딩 서열의 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 대장균 glmU 코딩 서열 및 GlmU 아미노산 서열은 각각 서열번호 53 및 서열번호 54로 나타난다. 표준 조건하에서 PCR 증폭을 수행하여 Bsa I 및 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트에 측면으로 접한 완전한 glmU 코딩 서열을 포함하는 DNA 단편을 생성하였다. 상기 PCR 생산물을 제한 효소 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 플라스미드 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-109를 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 glmM 서열을 pET24d(+)의 T7lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7lac-glmU의 발현 카세트를 생산하였다.
N-말단이 절단된 GlmU 효소(GlmUt)의 클로닝 및 발현
절단된 glmU 코딩 서열을 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 표준조건하에서 포워드 프라이머 07-165 및 리버스 프라이머 07-162를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 프라이머 07-165는 다음의 서열을 갖는다: 07-165: 5'-GAT GGT CTC GCA TGG AGC AGC TGG GTA CGG GTC-3'(서열번호 63).
프라이머 07-165은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 63의 뉴클레오타이드 4-9로 나타냄) 및 ATG 개시 코돈(서열번호 63의 뉴클레오타이드 15-33으로 나타냄)의 하류로 232 bp에서 개시하는 glmU CDS 서열을 포함한다. 이것은 GlmU 단백질의 처음 77 아미노산의 결실을 유발한다. 개시코돈은 또한 프라 이머 07-165로 통합되었다. 프라이머 07-165 및 07-162에 의해 생성된 PCR 생산물은 처음 77 아미노산 잔기가 결실된 glmU 코딩 서열을 포함한다. 대장균 N-말단이 절단된 glmU 코딩 서열 및 N-말단이 절단된 GlmU 아미노산 서열을 서열번호 57 및 서열번호 58로 각각 나타냈다. 상기 PCR 생산물을 제한 효소 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 플라스미드 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-110을 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 절단된 glmU(glmUt) 서열을 pET24d(+)의 T7-lac 프로모터 뒤에 배치시키고 T7lac-glmUt의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서의 GlmM, GlmU 및 GlmUt 단백질의 과잉 발현
glmU, glmM 또는 glmUt를 포함하는 플라스미드 pSW07-108, pSW07-109 및 pSW07-110을 균주 7101-17(DE3)으로 형질전환하여 표 16에 기재된 균주를 생성하였다. 공벡터 pET24d(+)를 균주 7101-17(DE3)에 형질전환시켜 대조군 균주 7107-22를 얻었다. 형질전환체의 세포 배양액을 LB 배지에서 성장시키고 1mM IPTG로 유도되는 표준 유도 실험을 수행하였다. 다양한 시간대에서 유도된 배양액으로부터 샘플을 취하여 SDS-PAGE로 단백질 과잉 발현을 확인하였다. GlmU, GlmM 및 GlmUt 단백질의 예상된 크기는 각각 51kDa, 50kDa 및 42kDa였다. SDS-PAGE에 의해 glmU, glmM 및 glmUt를 과잉 발현하는 균주의 샘플에서 예상된 크기의 단백질 밴드(band)가 관찰되었다. 대조 균주에서는 GlmU, GlmM 또는 GlmUt의 예상크기 부근의 과잉 발현 단백질이 발견되지 않았다. 유도된 배양액으로부터의 전체 및 가용성 분획 (fraction)을 SDS-PAGE로 측정하였다. 시각적으로 평가하여 판단하였을 때 약 20%의 GlmU 단백질이 가용성 분획이었다. 그러나 GlmU 단백질의 절단된 형으로 관찰된 가용성 단백질은 거의 없었다. 유사하게 GlmM 단백질의 가용성 형태도 거의 존재하지 않았다.
GlmU, N-말단이 절단된 GlmU 및 GlmM 단백질에 대한 여러 플라스미드를 포함하는 균주
균주 설명 과잉 발현된 단백질
7107-667 7101-17(DE3)/pSW07-108#1 GlmU
7107-668 7101-17(DE3)/pSW07-108#3 GlmU
7107-669 7101-17(DE3)/pSW07-109#29 GlmM
7107-670 7101-17(DE3)/pSW07-109#30 GlmM
7107-671 7101-17(DE3)/pSW07-110#53 절단된 GlmU
7107-672 7101-17(DE3)/pSW07-110#54 절단된 GlmU
7107-22 7101-17(DE3)/pET24d(+) 공벡터 대조군

nag 결실 사이트에서의 T7lac-glmU 및 T7lac-glmUt의 통합
SDS-PAGE 겔은 대장균에서 GlmU 및 GlmUt 단백질의 과잉 발현을 잘 나타냈다. 따라서 생산 균주 7107-18의 염색체로 발현 카세트를 통합시키기 위한 방법이 개발되었다. 통합을 위해 선별된 표적은 균주 7107-18 염색체의 nag 결실 사이트였다. 글루코사민 생산 균주의 구성의 초기 단계에서 nag 오페론을 결실시키고 균주 IBPC590(Plumbridge, 1989, Mol. Microbiol. 3:506-515; Plumbridge, 1991, Mol. Microbiol. 5:2053-2062, Plumbridge, 1992, J. Gen. Microbiol. 138:1011-1017)으로부터 준비된 파지에 의한 P1 형질도입 이후 테트라시클린 저항 카세트를 염색체의 결실 사이트에 삽입시켰다. 따라서 염색체의 이 영역을 통합 표적으로 결정하는 것은 균주의 성장 또는 글루코사민 생산에 영향을 주지 않아야 한다.
염색체의 nag 결실 사이트에서 T7lac-glmU 카세트의 통합 표적을 결정하는 벡터를 개발하기 위한 방법의 일부로서, T7lac-glmU 단편을 플라스미드 pSW07-108#1로부터 PCR로 증폭하였다. 프라이머 GNT7nagA1-5 및 07-120을 갖는 표준 조건하에 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: GNT7nagA1-5: 5'-GCG ACG CTC TCC CGG GTG CGA CTC CTG CAT TA-3'(서열번호 64); 07-120: 5'-GAT CTG TAC AAT CCG GAT ATA GTT CCT CCT TTC AGC AAA AAA CCC C-3'(서열번호 65).
포워드 프라이머 GNT7nagA1-5는 Xma I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CCCGGG, 서열번호 64의 뉴클레오타이드 11-16으로 표시됨)를 통합하고 296 염기쌍으로부터 T7 프로모터의 상류로 증폭한다. 프라이머 07-120은 BsrG I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(TGTACA, 서열번호 65의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 25 염기쌍으로부터 T7 터미네이터의 하류로 증폭한다.
플라스미드 pCALG43(실시예 29에 기술됨)는 생산균주의 nag 결실, pMAK705로부터의 온도 민감성 복제단위(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622, 여기에서는 그 전체를 참고함) 및 플라스미드 pUC4K의 카나마이신 저항성 카세트(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)를 측면으로 접하는 서열을 포함한다. T7lac-glmU 카세트를 포함하는 PCR 생산물을 제한 효소 Xma I 및 BsrG I로 분해하고 pCALG43의 Age I 및 BsrG I 사이트에서 라이게이션하였다. 그 결과 플라스미드인 pSW07-112는 본 발명자의 생산 균주 염색체의 nag 결실 사이트로 T7lac- glmU 카세트의 통합을 조정하는 데 사용할 수 있다.
Dnag에서 T7lac-glmU(절단됨) 카세트의 통합을 위한 플라스미드를 생성하기 위해 플라스미드 pSW07-110#53이 PCR의 주형으로 작용하는 것을 제외하고 동일한 방법 및 동일한 PCR 프라이머를 사용하였다. 그 결과 플라스미드를 pSW07-113으로 명명하였다.
플라스미드 pSW07-112 및 pSW07-113을 사용하여 염색체의 nag 결실 사이트에서 통합된 T7lac-glmU 카세트 또는 T7lac-glmUt 카세트를 갖는 대장균 균주를 생성하였다. 대장균 7107-18을 플라스미드로 형질전환한 다음 실시예 13에 기술된 온도 선별 프로토콜을 사용하여 삽입 서열을 포함하는 균주를 선별하였다. nag 결실 사이트에서 glmU 발현 카세트의 존재를 확인하기 위해 카나마이신 민감성 콜로니를 PCR로 스크린하였다. 절단된 glmU PCR 생산물을 프로브로 사용하여 높은 엄격성하에서 수행된 서던 혼성화에 의해 PCR 양성 균주를 확인하였다. 균주 7107-678 및 7107-679는 nag 결실 사이트에서 통합된 T7lac-glmU를 갖는 것으로 확인하였다. 균주 7107-680 및 7107-681은 nag 결실 사이트에서 통합된 T7lac-glmUt를 갖는 것으로 확인하였다.
glg 결실 사이트에서 T7lac-glmM의 통합
SDS-PAGE 겔은 대장균에서 GlmM 단백질의 성공적인 과잉 발현을 나타냈다. 따라서 T7lac-glmM 카세트를 생산 균주 7107-18의 염색체로 통합시키는 방법이 개발되었다. 통합을 위해 선별된 표적은 glg 오페론이었다. glg 영역은 종래 글리 코겐 합성 경로를 차단함으로써 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민 생산 경로를 통해 탄소의 유량을 증가시키기 위한 결실 표적이었다. 이 돌연변이는 성장 또는 NAG 생산에 유해한 영향이 없었다. 따라서 이 염색체 사이트에서 T7lac-glmM 카세트의 통합은 부정적으로 생산 균주에 영향을 주지 않아야 한다.
glg 사이트에서 T7lac-glmM 카세트의 통합 표적을 결정하는 벡터를 개발하는 방법의 일부로서 T7lac-glmM 단편을 플라스미드 pSW07-109#29로부터 PCR로 증폭하였다. 프라이머 GNT7nagA1-5 및 GNT7nagA2-3을 갖는 표준 조건하에서 PCR을 수행하였다. 상기 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: GNT7nagA1-5: 5'-GCG ACG CTC TCC CGG GTG CGA CTC CTG CAT TA-3'(서열번호 66); GNT7nagA2-3: 5'-GCG CTA ATC AAG TTT TCC CGG GTC GAG GTG CCG TAA-3'(서열번호 67).
프라이머 GNT7nagA1-5는 Xma I 사이트(CCCGGG, 서열목록 66의 뉴클레오타이드 11-16으로 표시됨)를 통합하고 T7 프로모터의 상류로 296 염기쌍으로부터 증폭한다. 프라이머 GNT7nagA2-3은 Xma I 사이트(CCCGGG, 서열목록 67의 뉴클레오타이드 17-22로 표시됨)를 통합하고 T7 터미네이터의 하류로 254 염기쌍으로부터 증폭한다. 그 결과인 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Xma I로 분해하고 플라스미드 pCALG28-2(실시예 29에 기재)의 Age I 사이트로 라이게이션하였다. 이것은 glg 오페론을 갖는 동일한 방향에서 라이게이션된 T7lac-glmM 카세트를 갖는 pSW07-111#3 및 glg 오페론의 반대편 방향에서 라이게이션된 T7lac-glmM 카세트를 갖는 SW07-111#4를 생성하였다. 이 플라스미드를 사용하여 생산균주의 glg 영역에 T7lac-glmM의 통합을 유도할 수 있다.
플라스미드 pSW07-111#3 또는 pSW07-111#4로 대장균 7107-18을 형질전환한 다음 온도 선별 프로토콜을 사용하여 glg 사이트에서 T7-lac-glmM을 포함하는 균주를 선별하였다. glmM 코딩 서열을 프로브로 사용하여 높은 엄격성하에 서던 혼성화를 수행하였다. 균주 7107-682은 염색체(파괴된 glg 유전자로서 동일한 방향의 glmM CDS)의 glg 사이트에서 통합된 T7-lac-glmM 보유하는 것으로 확인하였다. 균주 7107-683은 염색체(파괴된 glg 유전자로서 반대 방향의 glmM CDS)의 glg 사이트에서 통합된 T7-lac-glmM 보유하는 것으로 확인하였다.
GlmM/GlmU 분석
과잉 발현 GlmM(뮤타아제), GlmU(아세틸트랜스퍼라제/유리딜트랜스퍼라제) 및 N-말단 절단 GlmU를 포함하는 다양한 균주를 검사하였다. 이 스크린으로부터 선별된 균주에서 효소의 활성을 분석하였다. 글루코사민-1-포스페이트로부터 글루코사민-6-P 방향의 짝 반응(coupled reaction)을 사용하여 포스포글루코사민 뮤타아제(GlmM)를 분석하였다. 형성된 글루코사민-6-P를 글루코사민-6-P 데아미나제(NagB), 포스포글루코이소머라제 및 글루코오스-6-P 디히드로제나아제를 사용하여 정량적으로 6-포스포글루코네이트로 전환하였다. NADH의 형성은 340nm에서의 반응을 모니터링할 수 있게 하였다. 글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(GlmU)를 글루코사민-1-포스페이트 및 아세틸-CoA를 사용하여 분석하였다. 자유 CoA의 형성을 디티오비스(2-니트로벤젠산)(DTNB) 시약을 사용하여 목표 분석(endpoint assay)으로 측정하였다. 자유 CoA의 형성을 410nm에서 모니터링하였다.
효소 활성의 수준과 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 양을 표 17에 요약하였다. 천연 형태 또는 N-말단 절단형의 과잉 발현된 GlmU을 갖는 균주에서 유의적인 양의 N-아세틸글루코사민을 생산하였다. 이 효소의 활성은 매우 낮은 수준의 활성을 나타내는 대조 균주 7017-18보다 보통 30 내지 50배 더 높았다. 유의적인 자유 글루코사민 또한 이 균주에서 형성되었다. GlmM 단백질의 과잉 발현은 더 높은 활성을 유발하지 않았다. 실험조건 하에서 GlmM 단독의 과잉 발현은 유의적인 양의 N-아세틸글루코사민의 형성을 유발하지 않았다. 더욱이 GlmU가 추가된 GlmM의 과잉 발현은 GlmU 균주에 대하여 N-아세틸글루코사민의 양을 증가시키지 않았다. 보고된 문헌에 따르면 GlmM 효소는 인산화의 조절에 구속되지만 여기에서 언급하지 않았다. 인산화 조절을 우회하고 또는 다른 향상된 반응 형태를 갖는 GlmM 돌연 변이 효소의 제조 및 사용으로 GlmS-GlmM-GlmU 또는 NagB-GlmM-GlmU의 경로를 통해 N-아세틸글루코사민 합성의 효율을 증가시킬 수 있다.
GlmM, GlmU 및 GlmUt(N-말단 절단 GlmU)을 과잉 발현하는 균주의 분석
균주 유전자형* 효소 활성
(μmol min-1 mg-1 단백질)		 대사물(g l-1)
GlmM GlmU NAG 글루코사민
7017-18 glmS 0.019 0.008 0.2 4.5
7017-607(2) glmS GNA1 0.083 5.2 발견되지 않음
7017-678(1) glmS glmU 0.030 0.480 1.3 2.5
7017-678(2) glmS glmU 0.360 1.2 2.7
7017-680(1) glmS glmUt 0.032 0.500 1.1 2.1
7017-683(1) glmS glmM 0.045 0.027 0.3 2.9
7017-689(1) glmS glmM glmU 0.046 0.310 0.9 1.4
7017-687(1) glmS glmM glmUt 0.055 0.170 0.3 2.6
* 기재된 모든 재조합 유전자는 T7 프로모터 제어하에서 과잉 발현되었다.
glmS= 글루코사민 신테타제
glmM= 포스포글루코사민 뮤타아제
glmU= 글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제
glmUt= GlmU의 N-말단 절단형
< 실시예 16>
본 실시예에서는 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민 생산균주의 염색체로 T7lac-ScGNA1 카세트의 하나 이상의 카피의 통합을 기술한다.
벡터 pET24d(+)를 사용하는 ScGNA1의 과잉 발현은 72시간 배양 후 24g/l의 N-아세틸글루코사민 생산을 유발하였다(표 1 참조). 배양에서 항생제의 사용을 피하고 N-아세틸글루코사민 생산을 최대화하기 위해서 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 염색체로 통합하기로 결정하였다. 얼마나 많은 T7lac-ScGNA1 발현 카세트의 카피가 NAG 생산에 적합한지 알려지지 않았기 때문에 카세트의 다수의(multiple) 카피를 염색체로 통합하기로 결정되었다. 표적 유전자가 세포 성장 또는 N-아세틸글루코사민 생산에 필수적이지 않다는 가정에 기초하여 통합을 위한 삽입 사이트를 선별하였다. 4개의 표적 사이트를 선별하였다: manXYZ, fucIK, treB 및 melAB.
실시예 13에 기재된 온도 선별의 일반적인 방법과 프로토콜이 염색체에서의 GNA1 통합에 적용되었다. 각각 온도 민감성 복제 기원, 항생제 선별 마커 및 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 포함하는 여러 온도 민감성 통합 벡터를 개발하였다. 각각의 벡터에 대해 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 재조합 플라스미드 pSW07-62#25로부터 분리하고 의도된 통합 사이트로부터 클로닝된 대장균 DNA 서열의 단편에 삽입하였다. 통합 벡터를 대장균 숙주 균주로 형질전환하고 온도 변이 공정을 사용하여 통합된 ScGNA1을 갖는 클론을 선별하였다.
여러 기원으로부터의 다른 GNA1 상동체를 통합하는데에 동일한 방법 및 프로토콜을 사용할 수 있다. 본 기술 분야의 당업자에게 각각의 특정 유전자에 이 방법 및 프로토콜을 적용하기 위한 변형 및 변화가 필요하다는 것이 예상된다. 상기 변형 및 변화는 이에 제한되는 것은 아니지만 클로닝을 위한 여러 제한 사이트 및 염색체의 통합을 위한 여러 위치의 사용을 포함한다.
manXYD 사이트(GNA1의 하나의 카피)에서의 GNA1 통합:
T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 7107-18 염색체의 manXYZ 사이트에서 통합하기 위해 서브클로닝하였다. 대장균 manXYD는 만노오스의 유입 및 인산화에 관련된 세 단백질 복합물을 암호화하는 오페론이다. 상기 오페론은 탄소원으로서 글루코오스를 포함하는 배지에서 대장균 성장에 영향을 주지 않고 결실될 수 있다. manXYZ 사이트에서의 GNA1 유전자 통합을 위해 대장균 manXYZ 서열을 포함하는 플라스미드를 개발하였다. 표준 PCR법을 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 측면이 접한 영역이 추가된 manXYZ 오페론을 증폭하기 위해 대장균 manXYZ의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331), pp. 1453-1474, 여기에서 전체의 참조 에 의함)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-87 및 리버스 프라이머 07-88로 그 서열은 다음과 같다: 07-87: 5'-GAT GCG GCC GCA CTG CAG TAA TTA CCG CAT CCA AC-3'(서열번호 68); 07-88: 5'-GAT GTC GAC ACC GAT TGA TGC AGC AAA TGC ATC C-3'(서열번호 69).
프라이머 07-87은 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 68의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨)를 포함하고 manX ATG 개시코돈의 상류로 905 염기쌍으로부터 개시한다. 프라이머 07-88은 Sal I 사이트(GTCGAC, 염기서열 NO:69의 뉴클레오타이드 4-9로 표시됨)를 포함하고 manZ 해독 종료 코돈으로부터 하류로 1010 염기쌍으로부터 개시한다. 표준 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행하여 Not I 및 Sal I 제한 사이트가 측면에 접한 영역이 추가된 manXYZ를 포함하는 단편을 생성하였다. 이 단편을 벡터 pCRㆁ2.1-TOPOㆁ (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝하여 플라스미드 pSW07-65#7을 생성하였다.
manXYZ에서 결실을 생성하기 위해 플라스미드 pSW07-65#7을 제한 효소 Hpa I로 분해시켰다. 이것은 대부분의 manXYZ의 코딩 서열을 포함하는 플라스미드의 2647 bp 부분을 방출하였다. 또한 T7lac-ScGNA1 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Nae I를 사용하여 플라스미드 pSW07-62#25(실시예 13에 기술됨)로부터 절개하였다. 플라스미드 pSW07-62#25는 T7 프로모터의 상류로 46 염기쌍 및 T7 터미네이터의 하류로 164 염기쌍에서 Nae I 사이트를 포함한다. T7lac-ScGNA1 서열을 포함하는 Nae I 단편을 pSW07-65#7의 Hpa I 사이트로 라이게이션하였다. 이 라이게이션은 말단 이 무딘 라이게이션이기 때문에 T7lac-ScGNA1 단편은 플라스미드의 모든 방향으로 라이게이션할 수 있다. 따라서 제한 효소 분해를 사용하여 manXYZ와 동일한 방향으로 삽입된 T7lac-ScGNA1 카세트를 갖는 플라스미드를 스크린하였다. 그 결과 플라스미드를 pSW07-66#25로 명명하였다.
온도 민감성 통합 벡터를 생산하기 위해서 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622, 여기에서 전체의 참조에 의함)의 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 카나마이신 저항성 카세트를 제한 효소 Not I 및 Sal I를 사용하여 플라스미드 pKLN07-21로부터 절개하였다. 플라스미드 pKLN07-21은 플라스미드 pSW07-4(실시예 6에 기술됨)로부터 온도 민감성 복제단위의 PCR 증폭, PCR 생산물의 벡터 pPCR-ScriptAMPSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로의 라이게이션 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 카나마이신 저항성 카세트의 첨가에 의해 구축하였다.
제한 효소 Not I 및 Sal I을 사용하여 플라스미드 pSW07-66#25로부터 manXYZ 측면이 접한 영역을 추가한 T7lac-ScGNA1을 포함하는 단편을 절개하였다. 이 때 상기 단편을 pKLN07-21로부터 온도 민감성 복제 기원 및 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 Not I/Sal I 단편으로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-66#25를 생성하였다. 상기 플라스미드는 온도 민감성 기원, 카나마이신 선별 마커 및 manXYZ 로커스로부터 5' 상류 및 3' 하류로 측면이 접한 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 보유하 였다.
플라스미드 pSW07-68#5를 사용하여 manXYZ 사이트에서 통합된 T7lac-ScGNA1을 갖는 대장균 균주를 생성하였다. 미국 특허 제 6372457호에 기재된 바와 같이 균주 7107-18의 manXYZ 오페론을 P1 파지 형질도입으로 돌연변이시켰다. pSW07-68#5로 대장균 균주 7107-18을 형질전환한 후 실시예 6에 기술된 온도 선별 프로토콜을 사용하여 manXYZ 사이트에서 통합된 T7-lac-ScGNA1 서열을 갖는 균주를 선별하였다. 카나마이신-민감성 균주를 fuc 레귤론에서 T7lac-ScGNA1 카세트의 존재를 확인하기 위해 PCR로 스크린하였다. 표준 높은 엄격성 및 ScGNA1 코딩 서열을 프로브로 사용하여 서던 혼성화에 의해 균주를 확인하였다. 그 결과 T7lac-ScGNA1의 카피를 갖는 균주를 7107-92로 명명하였다.
fucIK 사이트에서 GNA1의 2차 카피의 통합:
T7lac-ScGNA1 카세트의 2차 카피의 통합은 대체 탄소원으로서 L-푸코오스의 이용에 관련된 효소를 암호화하는 염색체 영역으로 유도되었다. fucP(L-푸코오스 퍼미아제를 암호화), fucI(L-푸코오스 이소머라제를 암호화), fucK(L-푸쿨로오스 키나제를 암호화) 및 fucU(비공지 단백질) 유전자가 L-푸코오스 이화에 관련된 오페론을 형성한다. fucR 유전자는 L-푸코오스 이화 레귤론을 활성화하는 조절 단백질을 암호화한다. 푸코오스 오페론에서의 T7lac-ScGNA1 카세트의 통합은 탄소원으로서 글루코오스를 갖는 배지에서 성장하는 대장균의 능력에 영향을 주지 않아야 하고 또한 N-아세틸글루코사민을 합성하는 능력에 영향을 주지 않아야 한다.
fuc 영역의 표적을 결정하는 통합 벡터를 개발하는 방법의 일부로서 푸코오스 레귤론의 공지된 서열(Chen et al., Mol. Gen. Genet. 1987 210:331-337)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. fucIKU 및 fucR 유전자를 표준 PCR 조건하에서 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 프라이머 07-113 및 07-114를 사용하여 증폭하였고 그 서열은 다음과 같다: 07-113: 5'-GAT GCG GCC GCG CAA GGC AAC AGC AAA CTG GC-3'(서열번호 70); 07-114: GAT CGG ATC CTC AGG CTG TTA CCA AAG AAG TTG CAA CCT GGC-3'(서열번호 71).
프라이머 07-113은 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 70의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨)를 포함하고 fucI ATG 개시코돈(서열번호 70의 뉴클레오타이드 12-32로 표시됨)의 하류로 824bp로부터 증폭한다. 프라이머 07-114는 BamH I 사이트(GGATCC, 서열번호 71의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 이에 뒤따르는 그 해독 종료 코돈(서열번호 71의 뉴클레오타이드 11-42로 표시됨)에서 개시하는 fucR 코딩 서열의 32개 뉴클레오타이드를 포함한다. 표준 조건하에서 PCR을 수행하여 BamH I 및 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트의 측면에 접하는 fucIKU 및 fucR 서열을 포함하는 단편을 생성하였다. 상기 단편을 pPCR-Script Amp SK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-75를 생성하였다. 플라스미드 pSW07-75를 제한 엔도뉴클레아제 Hpa I 및 BsrG I로 분해하여 fucI 및 fucK 유전자의 일부를 포함하는 1239 염기쌍 단편을 제거하였다.
T7lac-ScGNA1 카세트를 표준조건을 사용하여 플라스미드 pSW07-62#25로부터 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭은 포워드 프라이머 07-115 및 리버스 프라이머 07-112로 수행하였다. 상기 프라이머는 다음의 서열을 갖는다: 07-115: 5'-GAT CTG TAC AAG CAA CCG CAC CTG TGG C-3'(서열번호 72); 07-112: 5'-GAT CAG CGC TAT CCG GAT ATA GTT CCT CCT TTC AGC AAA AAA CCC C-3'(서열번호 73).
프라이머 07-115는 BsrG I 사이트(TGTACA, 서열번호 72의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 pSW07-62#25의 T7 프로모터 서열의 상류로 76 염기쌍으로부터 증폭한다. 프라이머 07-112는 Afe I 사이트(AGCGCT, 서열목록:73의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)을 포함하고 pSW07-62#25의 T7 터미네이터 서열의 하류로 25 염기쌍으로부터 증폭한다. PCR 단편을 BsrG I 및 Afe I로 분해하고 플라스미드 pSW07-75의 BsrG I 및 Hpa I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-76을 생성하였다. 재조합 플라스미드는 fucIK 결실 사이트로 라이게이션된 T7lac-ScGNA1 카세트를 포함하였다.
온도 민감성 통합 벡터를 생성하기 위해 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622, 여기에서 전체의 참조에 의함)의 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 카나마이신 저항성 카세트를 제한 효소 Not I 및 Kpn I를 사용하여 플라스미드 pKLN07-21로부터 절개하였다. 플라스미드 pKLN07-21은 플라스미드 pSW07-4(실시예 6에 기술됨)로부터 온도 민감성 복제단위의 PCR 증폭, PCR 생산물의 벡터 pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로의 라이게이션 및 플라 스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터 카나마이신 저항성 카세트의 첨가에 의해 구축되었다.
제한 효소 Not I 및 Kpn I을 사용하여 플라스미드 pSW07-76으로부터 fuc 측면이 접한 영역이 추가된 T7lacScGNA1을 포함하는 단편을 절개하였다. 이 때 상기 단편을 pKLN07-21로부터 온도 민감성 복제 기원 및 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 Not I/Kpn I 단편으로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-77을 생성하였다. 상기 플라스미드는 온도 민감성 기원, 카나마이신 선별 마커 및 fuc 레귤론으로부터 5' 상류 및 3' 하류로 측면이 접한 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 보유하였다. 플라스미드 pSW07-77을 사용하여 대장균의 fuc 레귤론에서 T7-lac-ScGNA1 카세트의 통합을 유도하였다.
플라스미드 pSW07-77을 균주 7107-92#1로 형질전환하였다. 온도 선별 프로토콜을 사용하여 ΔfucIK 사이트에서 통합된 T7-lac GNA1 서열을 갖는 균주를 선별하였다. 그 결과 균주를 7107-607(2), 7107-607(3) 및 7107-607(4)로 명명하였다.
treB 사이트에서 GNA1의 3차 카피의 통합:
T7lac-ScGNA1 카세트의 3차 카피의 통합은 대체 탄소원으로 트레할로스의 이용에 관련된 효소를 암호화하는 염색체 영역으로 지정되었다. 트레할로스 트랜스포터 및 트레할로스 6-P 히드롤라제를 암호화하는 treB 및 treC 유전자가 각각 오페론을 형성한다. treR 유전자는 오페론을 제어하고 트레할로스-6-포스페이트에 의해 유도가능한 억제 단백질을 암호화한다(Horlacher, R., and Boos, W., 1997, J. Biol. Chem., 272(20):13026-13032). 기존의 표적에서와 마찬가지로 트레할로스 레귤론에서 T7lac-ScGNA1의 통합은 탄소원으로서 글루코오스를 갖는 배지에서 성장하는 대장균의 능력에 영향을 주지 않아야 하고 또한 N-아세틸글루코사민을 합성하는 능력에 영향을 주지 않아야 한다.
treB 영역의 표적을 결정하는 통합 벡터를 개발하는 방법의 일부로서 treR, treB 및 treC 유전자를 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 증폭한 공지된 서열에 기초하여 프라이머를 합성하였다(Blattner et al., 1997, Science 227(5331):1453-1474). 프라이머 07-117 및 07-118을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였고 그 서열은 다음과 같다: 07-117: 5'-GAG CGG CCG CAT GCA AAA TCG GCT GAC CAT C-3'(서열번호 74); 07-118: 5'-GAT CGG GCC CTT ACT TCT GTA ACC ACC AGA CAG CCT C-3'(서열번호 75).
프라이머 07-117은 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 74의 뉴클레오타이드 3-10으로 표시됨) 및 이에 뒤따르는 ATG 개시코돈(서열번호 74의 뉴클레오타이드 11-31로 표시됨)으로부터 treR 코딩 서열의 21 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-118은 Apa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGGCCC, 서열번호 75의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 이에 뒤따르는 그 해독 종료 코돈(서열번호 75의 뉴클레오타이드 11-37로 표시됨)에서 개시하는 treC 코딩 서열의 27개 뉴클레오타이드를 포함한다. Not I 및 Apa I 제한 사이트에 접하는 treR, treB 및 treC 유전자를 포함하는 DNA의 단편을 생성하기 위해 표준 프로토콜을 사 용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 4.2kb의 PCR 생산물을 플라스미드 pPCR-ScriptTM SK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-78#20을 생산하였다.
플라스미드 pSW07-78#20을 제한 엔도뉴클레아제 Bgl II로 분해하고 표준 조건하에서 단편의 말단을 무디게 하기 위해 T4 DNA 폴리머라제로 처리하였다. 그 다음 무뎌진 단편을 제한 엔도뉴클레아제 BsrG I으로 분해하였다. 이 Bgl II 및 BsrG I에 의한 이중 분해에 의해 플라스미드 pSW07-78#20으로부터 treB 코딩 서열의 130 염기쌍 영역을 제거하여 하나의 점착성 말단(BsrG I)과 하나의 무딘 말단을 갖는 플라스미드 단편이 잔류하였다.
다음 단계는 T7lac-ScGNA1 카세트를 플라스미드 pSW07-78#20의 BsrG I 및 Bgl II(충진됨) 사이트로 라이게이션하는 것이었다. 상기 라이게이션을 위해 T7lac-ScGNA1 카세트를 플라스미드 pSW07-78#25로부터 표준조건 하에서 포워드 프라이머 07-115(서열번호 72) 및 리버스 프라이머 07-112(서열번호 73)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 프라이머 07-115는 BsrG I 사이트(TGTACA, 서열목록:72의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)을 포함하고 pSW07-62#25의 T7 프로모터 서열의 상류로 76 염기쌍으로부터 증폭한다. 프라이머 07-112는 Afe I 사이트(AGCGCT, 서열목록:73의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)를 포함하고 pSW07-62#25의 T7 터미네이터 서열의 하류로 25 염기쌍으로부터 증폭한다. PCR 단편을 BsrG I 및 Afe I로 분해하고 플라스미드 pSW07-78#20의 BsrG I 및 Bgl II 사이트로 라이게이션하여 플라 스미드 pSW07-83을 생성하였다.
온도 민감성 통합 벡터를 생성하기 위해 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622, 여기에서 전체의 참조에 의함)의 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 카나마이신 저항성 카세트를 제한 효소 Not I 및 Apa I를 사용하여 플라스미드 pKLN07-21로부터 절개하였다.
제한 효소 Not I 및 Apa I을 사용하여 플라스미드 pSW07-83으로부터 tre 측면이 접한 영역을 추가한 T7lac-ScGNA1을 포함하는 단편을 절개하였다. 이 때 상기 단편을 pKLN07-21로부터 온도 민감성 복제 기원 및 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 Not I-Apa I 단편으로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-84를 생성하였다. 플라스미드 pSW07-84를 사용하여 대장균의 treB에서 T7-lac-ScGNA1 카세트의 통합을 유도할 수 있다.
플라스미드 pSW07-84#1을 균주 7107-607(2), 7107-607(3) 및 7107-607(4)로 형질전환하였다. 온도 선별 프로토콜을 사용하여 treB 사이트에서 통합된 T7-lac GNA1 서열을 갖는 균주를 선별하였다. 카나마이신 민감성 콜로니를 염색체의 treB에서 T7lac-ScGNA1 카세트의 존재를 확인하기 위해 PCR로 스크린하였다. 균주가 염색체에서 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 3개의 카피를 보유함에 따라 표준 높은 엄격성 및 ScGNA1 코딩 서열을 프로브로 사용하여 서던 혼성화에 의해 균주를 확인하였다. 이 균주를 7107-608(1) 및 7107-608(2)로 명명하였다.
melRAB 사이트에서 GNA1의 4차 카피의 통합:
NAG 생산 균주로의 T7lac-ScGNA1 카세트의 4차 카피 통합은 염색체의 melR 및 melAB 영역으로 표적을 정하였다. 대장균에서 이 영역은 멜리비오스 유입 및 가수분해에 관련된 단백질을 암호화한다. 알파 갈락토시다아제 및 멜리비오스 퍼미아제 II를 각각 암호화하는 melA 및 melB 유전자는 오페론을 형성한다. 분리되어 전사된 melR 유전자는 멜리비오스 오페론의 레귤레이터(regulator)를 암호화한다. 이전의 통합 표적에서와 같이 T7lac-ScGNA1 카세트의 유전체의 melAB에서의 통합은 탄소원으로서 글루코오스를 갖는 배지에서 성장하는 대장균의 능력에 영향을 주지 않아야 하고 또한 N-아세틸글루코사민을 합성하는 능력에 영향을 주지 않아야 한다.
melAB 영역의 표적을 결정하는 통합 벡터를 개발하는 방법의 일부로서 대장균의 melR, melA 및 melB 유전자의 공지된 서열에 기초하여 프라이머 07-122 및 07-123을 합성하였다(Blattner et al, 1997, Science 277(5331), pp. 1453-1474). 표준조건 하에서 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 melR, melA 및 melB 유전자를 포함하는 단편을 증폭하기 위해 PCR을 수행하였다. 포워드 프라이머 07-122 및 리버스 프라이머 07-123의 서열은 다음과 같다: 07-122: 5'-GAT GCG GCC GCT TAG CCG GGA AAC GTC TGG CGG C-3'(서열번호 76); 07-123: 5'-GAT CGT CGA CTC AGG CTT TCA CAT CAC TCA CTG CAC C-3'(서열번호 77).
프라이머 07-122는 Not I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 76의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨) 및 이에 뒤따르는 해독 종료코돈(서열번호 76 의 뉴클레오타이드 12-34로 표시됨)으로부터 개시하는 melR 코딩 서열의 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-123은 Sal I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GTCGAC, 서열번호 77의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 해독 종료 코돈(서열번호 77의 뉴클레오타이드 11-37로 표시됨)에서 개시하는 melB 코딩 서열의 27 뉴클레오타이드를 포함한다. Not I 및 Sal I 제한 엔도뉴클레아제 사이트의 측면을 접하는 melR 및 melAB 코딩 서열을 포함하는 PCR 단편을 벡터 pPCR-Script AMP SK(+)(Stratagene)로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-81#5를 생성하였다.
벡터 구축의 다음 단계는 T7lac-ScGNA1 카세트를 플라스미드 pSW07-81#5의 melAB 영역으로 라이게이션하는 것이었다. 플라스미드 pSW07-81#5를 제한 엔도뉴클레아제 Bgl II 및 AsiS I로 분해하여 전체의 melA 코딩 서열 및 melB 코딩 서열의 처음 199개 뉴클레오타이드를 포함하는 1676 염기쌍 단편을 제거하였다.
T7lac-ScGNA1 카세트를 표준 조건하에서 포워드 프라이머 07-124 및 리버스 프라이머 07-125를 사용하여 플라스미드 pSW07-62#25로부터 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: 07-124: 5'-GAT GGA TCC AGC AAC CGC ACC TGT GGC-3'(서열번호 78); 07-125: 5'-GAT GCG ATC GCT ATA GTT CCT CCT TTC AGC AAA AAA CCC-3'(서열번호 79).
프라이머 07-124는 BamH I 사이트(GGATCC, 서열목록:78의 뉴클레오타이드 4-9로 표시됨)를 포함하고 플라스미드 pSW07-62#25의 T7 프로모터 서열의 상류로 76 염기쌍으로부터 증폭한다. 프라이머 07-125는 AsiS I 사이트(GCGATCGC, 서열목록:79의 뉴클레오타이드 4-11로 표시됨)를 포함하고 플라스미드 pSW07-62#25의 T7 터 미네이터 서열의 하류로 18 뉴클레오타이드로부터 증폭한다. T7lac-ScGNA1을 포함하는 PCR 생산물을 제한 엔도뉴클레아제 BamH I 및 AsiS I로 분해하고 pSW07-81#5로부터 Bgl II 및 AsiS I 단편으로 라이게이션시켜 플라스미드 pSW07-82를 생성하였다. 플라스미드 pSW07-82는 벡터 pPCR-Script(AmpSK(+))에서 mel 유전자를 포함하고 1676 염기쌍 melAB 영역이 T7lac-ScGNA1 카세트로 대체되었다.
온도 민감성 통합 벡터를 생성하기 위해서 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-4622, 여기에서 전체의 참조에 의함)의 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 카나마이신 저항성 카세트를 제한 효소 Not I 및 Sal I를 사용하여 플라스미드 pKLN07-21로부터 절개하였다.
제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I으로 플라스미드 pSW07-82를 분해하고 T7lac-ScGNA1 카세트로 파괴된 mel 유전자를 포함하는 단편을 분리하였다. 이 단편을 온도 민감성 복제 기원 및 카나마이신 저항성 마커를 포함하는 플라스미드 pKLN07-21로부터 Not I 및 Sal I 단편으로 라이게이션하였다. 그 결과 플라스미드 pSW07-84를 사용하여 대장균의 melAB에서 T7-lac-ScGNA1 카세트의 통합을 인도할 수 있다.
플라스미드 pSW07-84를 균주 7107-608(1) 및 7107-608(2)로 형질전환하였다. 실시예 6에 기술된 온도 선별 프로토콜을 사용하여 melAB 사이트에서 통합된 T7-lac GNA1 서열을 갖는 균주를 선별하였다. 카나마이신 민감성 콜로니를 염색체의 melAB에서 T7lac-ScGNA1 카세트의 존재를 확인하기 위해 PCR로 스크린하였다. 균 주가 염색체에서 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 4개의 카피를 보유함에 따라 표준 높은 엄격성 및 ScGNA1 코딩 서열을 프로브로 사용하여 서던 혼성화에 의해 균주를 확인하였다. 7107-608(1) 및 7107-608(2)로부터 유도된 균주를 각각 7107-612 및 7107-613으로 명명하였다.
또한 염색체에 T7lac-ScGNA1의 세 번째 카피를 추가하기 위해 플라스미드 pSW07-84를 균주 7107-607(2), 7107-607(3) 및 7107-607(4)로 형질전환하였다. 상기와 같이 균주를 스크린하고 염색체에서 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 3개의 카피를 보유함에 따라 표준 높은 엄격성 및 ScGNA1 코딩 서열을 프로브로 사용하여 서던 혼성화에 의해 균주를 확인하였다. 7107-607(2), 7107-607(3) 및 7107-607(4)로부터 유도된 균주를 각각 7107-609, 7107-610 및 7107-611로 명명하였다.
GNA1 발현 수준 및 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 GNA1 유전자 카피수의 영향
GNA1 발현 수준 및 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 유전자 카피수의 영향을 평가하기 위해 쉐이크 플라스크에서 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 다양한 카피수를 갖는 균주를 테스트하였다. 샘플을 수거하여 효소 활성 분석과 NAG 역가의 측정에 의해 GNA1 단백질 발현을 분석하였다.
통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 카피수가 글루코사민 신타제(GlmS) 활성, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(GNA1) 활성 및 N-아세틸글루코사민 생산에 대해 미치는 영향을 평가하기 위해 쉐이크 플라스크 스크린 53을 수행하였다. 0.6g l-1 MgSO4-7H2O, 0.05g l-1 CaCl2-2H2 O, 10g l-1 글루코오스, 40g l-1 락토오스, 5g l-1 리보오스 및 5g l-1 효모 추출물이 보충된 M9B 배지(전술함)에서 균주를 성장시켰다. 배양액을 30℃에서 처음 24시간동안 성장시키고 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 배양액의 pH를 7.2로 조정하고, 각각의 플라스크에 HPLC 결과에 기초하여 글루코오스를 하루에 총 30g l-1로 첨가하고 암모늄의 양이 1g l-1 이하인 플라스크에 5g l-1의 황산 암모늄을 첨가하였다. NAG 생산과 효소 분석을 평가하기 위해 샘플을 24, 48 및 72시간에 제거하였다. 테스트된 모든 균주가 비교될 정도의 OD600로 성장하였고 비교될 정도의 글루코사민 신타제 활성을 보유했다(표 18 참조). 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성과 T7-lac-ScGNA1 카피수 사이에 현저한 상호 관련성이 있었고 균주는 가장 높은 비활성(specific activity)를 갖는 3개의 카피를 보유하였다. 그러나 이 증가된 비활성은 쉐이크 플라스크 실험에서 NAG의 생산을 유발하지 않았다.
염색체에 통합된 T7-lac-ScGNA1 카세트의 다수 카피를 갖는 균주에서의 성장, 효소 활성 및 GlcNAc 생산의 비교
균주 GNA1 카피수 A600 효소 활성 GlcNAc
(g l-1)
GlmS GNA1
7107-92(1) 1 12.0 0.59 3.0 30.0
7107-607(2) 2 12.0 0.59 5.8 28.8
7107-608(1) 3 12.8 0.55 9.1 29.3
7107-608(2) 3 13.5 0.43 7.9 29.7
7107-609(1) 3 11.3 0.37 8.2 24.7
7107-610(1) 3 12.0 0.40 8.4 26.3
7107-611(1) 3 12.0 0.44 7.4 26.4
1) 효소 활성 및 N-아세틸글루코사민 양을 72시간에 측정하였다.
2) 효소 활성은 μmol min-1 mg-1 단백질로 표시하였다.
3) 괄호의 숫자는 여러 자매세포를 나타낸다.
1 리터의 발효조에서 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트의 다양한 카피수를 갖는 균주의 평가
카피의 수가 1 내지 4의 범위인 통합 T7lac-ScGNA1 카세트를 포함하는 균주 7107-92(1), 7107-607(2), 7107-608(2) 및 7107-612(1)를 1L의 발효조에서 평가하였다. 발효조 237-240을 475ml의 초기 부피로 준비하였다. 발효 배지의 성분은 표 19에 기재되어 있다. 발효는 pH가 6.9가 되도록 제어하기 위해 75%의 NH4OH를 사용하여 진행하였다. 온도는 발효 중 37℃로 유지하였다. 통기 및 교반을 통해 포화공기의 20%의 용존 산소 농도를 유지하도록 조절하였다. 접종시 0.40/hr, 최 대 속도 6시간에 5ml/hr의 성장속도를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 배양액을 10시간에 5g/l로 첨가된 푸드 그레이드(food grade) 락토오스로 유도하고 계속해서 글루코오스를 투입하였다.
N-아세틸글루코사민 생산에 대한 GNA1 카피수의 영향을 테스트하기 위해 사용되는 발효 배지
성분 양(g l-1)
H3PO4 4.79
KOH 3.15
Citric acid-H2O 3.56
(NH4)2SO4 5
MgSO4-7H2O 2.5
CaCl2-2H2O 0.05
미량 금속 *
Mazu 204 Antifoam 0.25
*미량 금속 원소는 5mg l-1 FeSO4-7H2O, 3.75mg l-1 ZnSO4-7H2O, 0.6mg l-1 MnSO4-H2O, 0.1002mg l-1 CuSO4-5H2O, 0.1002mg l-1 CoCl2-6H2O이다.
그 결과를 다음과 같이 요약하였다. GNA1 카세트 카피 수는 NAG 양에 약간의 영향이 있다. 발효의 종료시 T7lac-ScGNA1 카세트의 3개의 카피를 포함하는 균주 7107-608(2)가 1개의 카피를 갖는 균주에 비해 NAG를 16% 이상 더 생산하였고, 카세트의 2개의 카피를 갖는 균주에 비해 NAG를 5% 이상 더 생산하였다. 본 실험에서 T7lac-ScGNA1 의 네 번째 카피의 추가가 균주 7107-608(2)의 개선을 가져오지는 않았다. 그럼에도 불구하고 생산균주에서 T7-lac-ScGNA1 카피수의 증가의 유용성은 확인되었다.
< 실시예 17 >
다음의 실시예는 글루코사민 신타제에 대한 인산화된 당의 영향을 기술한다.
글루코사민 신테타제 활성을 다양한 인산화된 당의 존재하에 조사하였다. 락토오스 유도로 24시간동안 쉐이크 플라스크에서 성장한 7107-18의 세포로부터 천연 효소 추출물을 준비하였다. 그 결과를 아래의 표 20에 요약하였다. 데이터는 이전에 관찰된 글루코사민-6-P가 상대적으로 높은 농도에서 글루코사민 신테타제에 대해 강력한 억제를 나타냈다는 것을 보여준다. 글루코사민-1-P 또한 10mM에서 효소를 억제하였다. N-아세틸글루코사민 포스페이트에 대해서는 억제가 관찰되지 않았다.
대장균 글루코사민 신타제 GlmS*54에 대한 여러 인산화된 당의 영향
첨가 활성(%)
대조군 100
글루코사민-6-P(10mM) 70
글루코사민-6-P(20mM) 46
글루코사민-1-P(10mM) 79
N-아세틸글루코사민-6-P(10mM) 100
N-아세틸글루코사민-6-P(20mM) 100
N-아세틸글루코사민-1-P(10mM) 100

< 실시예 18 >
본 실시예에서는 N-아세틸글루코사민 합성에 관한 다른 효소에 있어서 인산화된 당의 생화학적 영향을 기술한다.
인산화된 당(글루코사민-6-P와 같은 화합물)의 잠재적인 독성 효과에 대한 이전의 논의는 아미노 당의 대사에 직접 관련된 효소에 대해서는 제한되어 왔다. 그러나 일반적인 당 독성 현상은 당 대사에서 손상된 다양한 돌연변이주에서 오래동안 관찰되어 왔다. 일반적으로 이것은 하나 이상의 효소 표적을 억제하고 대사적으로 세포에 독성이 있는 비정상적으로 많은 양의 인산화된 당 매개물의 축적에 기여해 왔다. GlmS의 생산물 억제는 하나의 예이다.
도 3은 다른 가능한 표적에 대한 많은 가능성을 암시한다. 아미노 당 대사에서 손상된 돌연변이주를 다룬 한 논문(J. Bacteriol. 101:384. 1970)에 이러한 현상이 기술되어 있고, 오탄당 당이 억제에 반전할 수 있는 것으로 나타나 있다. 따라서 글루코사민-6-P 및 N-아세틸글루코사민-6-P에 대해 여러 효소의 영향을 조사하였다.
글루코사민-6-P는 간행물(Arch. Biochem. Biophys. 64: 489. 1956)에 Pgi의 억제제로 보고되어 있다. 도 15는 Pgi(2 아미노 당에 의한 포스포글루코이소머라제 억제)를 나타낸다. 양 혼합물에서 모두 억제가 관찰되지만 N-아세틸글루코사민-6-P에서는 유의적으로 더 적게 관찰된다.
글루코사민-6-P는 포스포글루코이소머라제(J. Biol. Chem. 216:67. 1955)의 억제제로 보고되어 있다. 도 16은 글루코오스-6-P 탈수소효소(zwf)에 대한 인산화된 아미노 당의 영향, 오탄당 포스페이트 경로로의 글루코오스-6-P의 유입지점을 보여준다. 여기서 다시 글루코사민-6-P는 N-아세틸글루코사민-6-P보다 더욱 잠재적인 효소 억제제인 것으로 생각된다. 유사한 경향이 포스포글루코뮤타아제(Pgm)에 나타난다.
위에서 언급된 글루코사민-6-P 및 탄수화물 대사와 관련된 가능한 다른 효소에 대한 억제효과로 확실히 7107-18에서 관찰되는 글루코사민 생산성의 명백한 한계를 설명할 수 있다. 아마도 고농도의 글루코사민-6-P가 여러 효소의 활성을 방해하는 것으로 예상된다. 상기 경로에 아세틸트랜스퍼라제(GNA1)를 첨가하는 것은 글루코사민-6-P의 세포내 양을 더욱 낮출 가능성이 있는 것으로 예상된다. 이것은 확실히 N-아세틸글루코사민의 안정성의 개선과 함께 생산성이 증가된 주요 원인일 것이다.
N-아세틸글루코사민-6-P는 생체외에서 분석했을 때 Zwf 또는 Pgi를 실제 유의적으로 억제하지 않는다. 세포 성장과 N-아세틸글루코사민 합성에 대한 리보오스 및 글루코네이트의 긍정적 효과는 오탄당 포스페이트 경로의 하나 이상의 단계가 인산화된 아미노 당에 의해 영향을 받는다는 것을 암시한다. 다른 한편 글루코사민 N-아세틸트랜스퍼라제는 N-아세틸글루코사민-6-P에 의해 유의적인 생산물 억제를 나타내지 않았다.
< 실시예 19 >
본 실시예에서는 발효조에서 N-아세틸글루코사민 생산 중의 효소 활성을 기술한다.
발효조에서 N-아세틸글루코사민 생산에 관한 다양한 효소 활성을 조사하였다. 분석된 효소는 글루코사민 신타제(GlmS), 글루코사민 N-아세틸트랜스퍼라제(GNA1) 및 오탄당 포스페이트 경로의 핵심 효소인(도 3 참조) 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소였다
GNA1 플라스미드를 갖는 균주(발효조 #102):
관련된 효소 활성을 발효조 102에서 샘플 7107-87(25)로부터 조사하였다. 이 균주는 플라tm미드 상에 아세틸트랜스퍼라제 유전자 구조를 포함하였다. 이 실험은 80g/l의 N-아세틸글루코사민을 생산하였다. 효소 활성의 결과 및 N-아세틸글루코사민 농도를 도 17에 나타냈다. 유도 후 곧 높은 아세틸트랜스퍼라제 활성이 관찰되었고, 실험 내내 높게 유지하였다. 흥미롭게도 아세틸트랜스퍼라제의 활성은 90시간 이상에서도 존재하였고 이때 글루코사민 신테타제 활성은 사라졌다. N-아세틸글루코사민 생산은 대략 70시간에 실질적으로 정지하였다. 글루코오스-6-P 탈수소효소 활성은 실험 내내 일정하였다.
통합된 GNA1 구성을 갖는 균주(발효조 #121-128)
본 실험은 통합된 아세틸트랜스퍼라제 구성을 포함하는 대장균 균주 7017-92(1)를 사용하였다. 배지에 첨가된 철의 양, 철의 추가 투입 및 포스페이트 버퍼 의 양(1X=40g/l) 등 발효변수를 조사하였다. 효소 활성을 표 21에 요약하였다. 발효조 121에 사용된 적은 양의 철을 제외하고 글루코사민 신테타제 및 아세틸트랜스퍼라제 활성은 다른 7 발효조에서 실험 내내 매우 높았다. 이미 관찰된 바와 같이 아세틸트랜스퍼라제 활성은 높은 수준을 유지하는 경향이 있다. 글루코사민 신테타제 활성은 철의 추가 공급 여부에 따라 조사된 다른 철의 양(5-20PPM)에서 명확하게 적합하였다. 더 적은 양의 철은 더 높은 N-아세틸글루코사민의 활성을 나타내지만 더 낮은 글루코사민 신테타제 활성을 나타낸다. 이 감소된 활성은 여전히 많은 N-아세틸글루코사민을 생산하는 데에 적합하였다.
N-아세틸글루코사민 발효에서의 효소 활성(발효조 #121 내지 128)
샘플 시간 GlmS
(μmol min-1mg-1 단백질)		 GNA1
(μmol min-1mg-1 단백질)		 [NAG]
(g l-1)		 철
(mg l-1)		 Fe
투입		 포스페이트
121-2 24 0.0 0.0 7.1 2.5 + 1X
121-5 46 0.0 0.5 23
121-7 70 0.0 0.6 29
122-2 24 0.0 0.0 6.0 5 + 1X
122-5 46 0.43 5.7 56
122-7 70 0.40 6.3 88
122-8 95 0.18 5.5 88
123-2 24 0.0 0.0 5.7 10 + 1X
123-5 46 0.81 7.5 49
123-7 70 0.99 10 77
124-2 24 0.0 0.0 6.0 20 + 1X
124-5 46 0.81 5.4 50
124-7 70 0.96 6.5 76
125-2 24 0.0 0.0 5.8 5 - 1X
125-5 46 0.43 5.2 57
125-7 70 0.30 5.7 92
126-2 24 0.0 0.0 7.0 10 - 1X
126-5 46 0.57 3.7 68
126-7 70 1.0 5.5 83
127-2 24 0.0 0.0 4.3 20 - 1X
127-5 46 0.61 5.1 49
127-7 70 0.80 5.7 78
128-2 24 0.0 0.0 7.0 10 + 0.2X
128-5 46 0.49 7.7 44
128-7 70 0.63 10 69
주:
1) 배지에서 철의 양은 FeSO4-7H2O(mg l-1)의 양이다.
2) 철은 글루코오스 1g당 5㎍의 FeSO4-7H2O로 글루코오스 투입에 의해 공급되었다.
3) 포스페이트 양: 1X=40g l-1 포스페이트 칼륨
< 실시예 20 >
본 실시예에서는 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민의 생산을 위한 사카로마이세스 세레비시애의 대사 공학을 기술한다. 특히 생산물 저항성 글루코사민 신타제, 대장균 glmS*54 및 바실러스 섭틸리스 glmS를 암호화하는 유전자와 글루코사민-6-포스페이트 N-아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 사카로마이세스 세레비시애 GNA1 유전자를 효모 발현 벡터로 클로닝하고 과잉 발현을 위해 효모에 도입하였다.
글루코사민과 N-아세틸글루코사민 생산을 위한 이전의 실시예에서 기술된 주요 요소는 생산물 저항성 GlmS 효소 및 GNA1 효소의 과잉 발현이다. 사카로마이세스 세레비시애 및 캔디다 알비칸스와 같은 천연 GNA1 유전자를 갖는 숙주에서 생산물 저항성 GlmS의 과잉 발현은 N-아세틸글루코사민 생산량을 증가시킬 수 있다. 그러나 아미노 당의 주요 생산물은 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민일 수 있다. 주요 생산물로서 N-아세틸글루코사민을 생산하기 위해 GNA1 유전자를 과잉 발현할 필요가 있다.
글루코사민 분해는 중성 발효 pH에서 글루코사민을 생산하기 위한 병목이다. 사카로마이세스 세레비시애와 같은 몇몇 효모와 세균이 상대적으로 낮은 pH에 적용되고 글루코사민이 안정한 4 내지 5의 pH 범위에서 정상적으로 성장하기 때문에 이러한 유형의 숙주에서 생산물 저항성 GlmS 효소를 과잉 발현하는 것이 상업적으로 실용적인 글루코사민의 직접 생산 공정의 개발을 유발할 수 있다. 더욱이 사카로마이세스 세레비시애가 GRAS 유기체이고 내독소를 생산하지 않기 때문에 생산물의 특정 응용을 위한 글루코사민/N-아세틸글루코사민을 생산하는 바람직한 발효 숙주일 수 있다.
효모에서 발현하기 위한 E. col 돌연변이 glmS * 54 유전자의 클로닝
대장균 변이 glmS*54 유전자를 발현 벡터 yEp352-ADH1으로 클로닝하였다. 이 벡터는 표준 테크닉을 사용하여 yEp352(Hill et al., 1986 Yeast 2:163-167)로부터 유도되었다. 그것은 효모 세포당 다수의 카피를 복제하고 알코올 탈수소효소(ADH) 프로모터 및 터미네이터를 포함한다. 상기 벡터는 대장균에서 선별되는 암피실린 저항성 마커 및 효모에서 선별되는 URA3 마커를 보유한다.
포워드 프라이머 nMD7107-021 및 리버스 프라이머 nMD7107-022를 대장균 돌연변이주 glmS*54 유전자의 코딩 서열의 PCR 증폭을 위해 설계하였다. 클로닝을 촉진하는 말단에서 제한 사이트를 통합하였다. 상기 glmS*54 코딩 서열을 포워드 프라이머 nMD7107-021(Sac I) 및 리버스 프라이머 nMD7107-022(Hind III)을 사용하여 표준조건하에서 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: nMD7107-021(Sac I): 5'-AGC TGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG CGC GA-3'(서열번호 80); nMD7107-022(Hind III): 5'-TAC GAA GCT TAC TCA ACC GTA ACC GAT TTT GC-3'(서열번호 81). 프라이머 nMD7107-021은 서열번호 80의 뉴클레오타이드 11-32로 표시되는 glmS*54 코딩 서열의 22개 뉴클레오타이드를 포함하고 프라이머 nMD7107-022 는 서열번호 81의 뉴클레오타이드 9-32로 표시되는 glmS*54 코딩 서열의 24개 뉴클레오타이드를 포함한다.
대장균 glmS*54 유전자(미국특허 제 6372457호에 기술됨)를 포함하는 플라스미드 pKLN23-54를 PCR 반응에서 DNA 주형으로 사용하였다. 예상된 크기의 PCR 생산물 단독 밴드(single band)를 Taq 폴리머라제를 사용하여 표준 PCR 조건하에서 생산하였다. 상기 PCR 생산물을 제한 효소 Sac I 및 Hind III으로 분해하고 아가로스 겔을 통해 정제한 다음 동일한 효소로 미리 분해된 yEP353-ADH-1 벡터로 클로닝하였다. DNA 라이게이션 생산물을 암피실린 선별의 의해 대장균 Top 10세포(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA로부터 수득됨)로 형질전환하였다. 먼저 10 풀의 콜로니(풀당 10)을 포워드 및 리버스 프라이머를 사용하여 PCR로 스크린하였다. 양성 풀에서 개별 콜로니를 PCR로 분리하였고 제한 분해로 확인하였다. 재조합 플라스미드 MD7107-238 및 MD7107-239는 ADH 프로모터 및 터미네이터를 갖는 효모 발현 카세트에서 대장균 glmS*54 유전자를 포함하였다.
Geitz et al.(1995)에 의해 기술된 LiOAc 방법에 따라 재조합 플라스미드를 사카로마이세스 세레비시애 SWY6 세포로 형질전환하였다. 효모 균주는 ura 및 his 보조영양 선별 마커를 갖는다. 20mg l-1의 L-히스트딘이 보충된 SCE-마이너스 배지의 플레이트에서 효모 형질전환체를 선별하였다(표 22 참조). 형질전환된 효모 세포주를 분석하여 GlmS와 GNA1의 활성, 글루코사민과 N-아세틸글루코사민의 양을 결 정하였다.
효모 성장을 위한 SC-마이너스 배지
성분 양(g l-1)
아미노산이 없는 효모 질소 염기(YNB) 6.7
글루코오스 20
L-아르기닌 0.02
L-메티오닌 0.02
L-티로신 0.03
L-이소류신 0.03
L-리신 0.03
L-페닐알라닌 0.05
L-글루타메이트 0.1
L-아스파레이트 0.1
L-발린 0.15
L-트레오닌 0.2
L-세린 0.4

효모에서 발현하기 위한 바실러스 섭틸리스 glmS 유전자의 클로닝
바실러스 섭틸리스 야생형 glmS를 발현 벡터 yEp352-ADH1으로 클로닝하였다. 바실러스 섭틸리스 야생형 glmS 유전자의 코딩서열을 증폭하기 위해 포워드 프라이머 nMD7107-023 및 리버스 프라이머 nMD7107-024를 합성하였다. 클로닝을 촉진하는 말단에서 제한 사이트를 통합하였다. glmS 코딩 서열을 포워드 프라이머 nMD7107-023 및 리버스 프라이머 nMD7107-024를 사용하여 표준 조건하에서 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: nMD7107-023(Kpn I): 5'-AGC TGG TAC CAT GTG TGG AAT CGT AGG TTA TAT C-3'(서열번호 82); nMD7107-024(Sph I); 5'-TAC GCA TGC TTA CTC CAC AGT AAC ACT CTT CGC A-3'(서열번호 83). 프라이 머 nMD7107-023는 서열번호 82의 뉴클레오타이드 11-34에 표시된 glmS 코딩 서열의 24개 뉴클레오타이드를 포함하고 프라이머 nMD7107-024는 서열목록:83의 뉴클레오타이드 10-34에 표시된 glmS 코딩서열의 25개 뉴클레오타이드를 포함한다.
Bacillus glmS 유전자(실시예 2에서 기술된 플라스미드)를 포함하는 플라스미드 pSW07-15#83을 PCR 반응에서 DNA 주형으로 사용하였다. 예상된 크기의 PCR 생산물 단독 밴드를 Taq 폴리머라제를 사용하여 표준 PCR 조건하에 생산하였다. 상기 PCR 생산물을 적절한 제한 효소로 분해하고 아가로스겔을 통해 정제한 다음 동일한 효소로 미리 분해된 yEP352-ADH-1 벡터로 클로닝하였다. DNA 라이게이션 생산물을 암피실린 선별에 의해 대장균 Top 10세포(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA로부터 수득됨)로 형질전환하였다. 먼저 10 풀의 콜로니(풀당 10)을 포워드 및 리버스 프라이머를 사용하여 PCR로 스크린하였다. 양성 풀에서 개별 클론을 PCR로 분리하였고 제한 분해로 확인하였다. 플라스미드 MD7107-240 및 MD7107-241은 ADH 프로모터 및 터미네이터를 갖는 효모 발현 카세트에서 Bacillus glmS 유전자를 포함하였다.
재조합 플라스미드를 사카로마이세스 세레비시애 SWY5 세포로 형질전환하였다. 20mg/l의 L-히스트딘이 보충된 SCE-마이너스 배지의 플레이트에서 효모 형질전환체를 선별하였다. 형질전환된 효모 세포주를 분석하여 GlmS와 GNA1의 활성, 글루코사민과 N-아세틸글루코사민의 양을 결정하였다.
효모에서 과잉 발현을 위한 사카로마이세스 세레비시애 GNA1의 클로닝
ScGNA1 코딩 서열을 포함하는 단편을 플라스미드 pSW07-60#3(실시예 13에서 이전에 기술함)으로부터 제한 엔도뉴클레아제 EcoR I 및 Sac I를 사용하여 분해하였다. 그 결과의 단편을 셔틀 벡터 pADH313-956의 EcoR I 및 Sac I 사이트로 라이게이션시켰다. 이와 같이 클로닝함으로써 ScGNA1 코딩서열을 ADH1 프로모터와 터미네이터 사이에 배치시킨다. 상기 벡터는 히스티딘 선별 마커를 포함한다. 그 결과 플라스미드 pSW07-114(#1 및 #18)를 사카로마이세스 세레비시애 SWY5의 세포로 형질전환하였다. 20mg l-1의 우라실이 보충된 SCE-마이너스 배지의 플레이트에서 효모 형질전환체를 선별하였다. 형질전환된 효모 세포주를 분석하여 GlmS와 GNA1의 활성, 글루코사민과 N-아세틸글루코사민의 양을 결정하였다.
ScGNA1 발현 카세트를 갖는 플라스미드를 대장균 glmS*54 구조 또는 Bacillus glmS 구조에 의해 이미 형질전환된 효모 세포주로 형질전환하였다.
< 실시예 21 >
본 실시예에서는 N-아세틸글루코사민 생산을 향상시키는 대장균 균주 7107-92의 임의적 돌연변이 유발을 기술한다.
균주 7107-92(실시예 16에서 기술된 염색체로 통합된 T7-glmS*54 및 T7-ScGNA1을 보유)를 자외선으로 돌연변이 유발하고 882가 분리된 콜로니를 미국 특허 제 6372457 B1호에서 기술된 바와 같이 자력영양 생물학적 검정으로 분석하였다. 글루코사민 자력영양 균주 대장균 2123-15를 지시제 균주로 사용하였다. 할로 크 기에 기초하여 19 돌연변이주를 선별하고 분리를 위해 줄을 긋고 각 5 콜로니를 재평가하였다. 두 돌연변이 균주 7107-512 및 7107-513이 가장 큰 할로 직경을 나타냈다. 그들은 플라스크 배양에서 평가되도록 저장되었다. 돌연변이 대장균 균주 7107-512(ATCC No. PTA-5303) 및 7107-513(ATCC No. PTA-5304)을 American Type Culture Collection(ATCC), P,O. Box 1549, Manassas, Virginia 20108, 미국으로 특허절차상 국제 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 근거하여 2003년 7월 1일 기탁하였다.
상기 돌여변이주를 부모 균주에 비교하였다. 모든 균주가 2 개의 다른 조건하에서 5g/l의 리보오스 및 5g/l의 효모 추출물을 갖는 M9B 배지에서 성장하였다. 한 세트의 배양액을 30g/l 글루코오스 및 0.2mM IPTG(IPTG 유도)를 갖는 배지에서 성장시켰다. 일단 글루코오스가 고갈되면 상기 배양액은 락토오스에 의해 유도되었다(락토오스 유도). IPTG 유도하에서 돌연변이주 7107-512에 의한 N-아세틸글루코사민 생산은 부모 균주와 비교될 정도였다. 돌연변이주 7107-513은 부모 균주보다 71시간에 36% 이상 많은 글루코사민을 생산하였다. 이전에 관찰된 바와 같이 부모 균주는 IPTG 유도하에서보다 락토오스 유도하에서 N-아세틸글루코사민을 더욱 많이 생산하였다. 두 돌연변이주는 동일한 양의 글루코사민을 생산하였고 71시간에 부모 균주보다 약 28% 이상 더 높았다. 돌연변이 로커스가 결정되지 않았고 돌연변이주에서 개선된 N-아세틸글루코사민 생산 메카니즘이 알려지지 않고 있다. 단지 약 900 돌연변이 클론을 스크린하였기 때문에 데이터는 임의의 돌연변이 유발에 의해 생산 숙주를 더욱 개선할 가능성을 명확하게 보여주었다.
자외선 돌연변이주에서 N-아세틸글루코사민 생산
실험 균주 N-아세틸글루코사민(g l-1)
23시간 47시간 71시간
IPTG 유도 7107-92 7.2 11.8 13.8
7107-512 7.0 12.0 13.0
7107-513 7.2 14.6 18.7
락토오스 유도 7107-92 4.7 13.3 23.3
7107-512 8.0 19.0 29.9
7107-513 7.1 17.4 29.8

< 실시예 22 >
다음의 실시예는 NAG 생산이 성장과 분리될 수 있도록 pfkA 결실을 갖는 돌연변이 NAG 생산 균주의 생성을 기술한다.
포스포프럭토키나제는 프룩토오스-6-포스페이트(F-6-P)로부터 프룩토오스-1,6-비포스페이트의 형성을 촉진하는 해당과정에서의 주요 조절 효소이다. pfkA에 의해 암호화된 대장균에서의 주요 포스포프럭토키나제는 90%의 포스포프럭토키나제 활성을 제공한다. 남은 10%의 활성은 pfkB에 의해 암호화된 부수적인 포스포프록토키나제에 의해 공급된다. NAG 생산 균주에서 과잉 발현된 GlmS*54는 F-6-P를 글루코사민-6-포스페이트(GlcN-6-P)로의 전환을 촉진시키고 그 때 사카로마이세스 세레비시애로부터 과잉 발현된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(GNA1)의 작용을 통해 GlcNAc-6-P로 전환될 수 있다.
실시예 22에 기술된 실험 원리는 다음과 같다. 탄소원(예컨대 글루코오스와 프룩토오스)의 조합에 의한 pfkA 돌연변이 균주의 성장은 NAG 생산으로부터 분리될 수 있게 한다. pfkA 돌연변이주가 탄소원으로서 글루코오스에 의해 잘 성장하지 않기 때문에 세포성장을 위해 프룩토오스를 사용한다. 유입된 프룩토오스를 fruA 및 fruK 유전자 생산물의 작용을 통해 프룩토오스-1,6-비포스페이트로 전환하여 해당경로에 진입할 수 있도록 하였다. 글루코오스는 그 유입에 따라 인산화되고 그 결과 글루코오스-6-포스페이트가 pgi 유전자 생산물인 포스포글루코오스 이소머라제에 의해 F-6-P로 전환되었다. pfkA 유전자 결실 때문에 단지 부수 PfkB 이소자임이 F-6-P의 F-1,6-비포스페이트로의 전환을 담당한다. 전환은 제한될 수 있다. 그 결과로서 과잉 발현된 GlmS*54에 의해 글루코사민-6-포스페이트로의 전환에 유용한 F-6-P의 양이 증가할 것이다. 따라서 pfkA의 결실은 F-6-P의 해당경로로의 유입을 감소시키고 잠재적으로 더욱 많은 탄소를 글루코사민 생산으로 전환시킬 수 있다. ScGNA1을 과잉 발현하는 생산 균주에서 이것은 더 높은 NAG 역가를 궁극적으로 유발할 수 있다.
pfkA 결실 균주의 생성
온도 민감성 선별 방법을 사용하여 pfkA 결실을 생산 균주의 유전체에 첨가하였다. 이것은 결실을 위한 pfkA 영역의 표적을 정하는 통합 벡터의 구축을 필요로 한다. 벡터 구축의 첫 번째 단계는 대장균 W3110 유전체 DNA로부터의 측면에 접하는 영역이 추가된 pfkA 코딩 서열을 포함하는 서열을 증폭하는 것이었다. 대장균 유전체로부터의 측면에 접하는 영역이 추가된 pfkA의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331):1453-1474)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. PCR 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-89 및 리버스 프라이머 07-90이고 그 서열은 다음과 같다: 07-89: 5'-GAG CGG CCG CAT GAA TCA ATC TTA TGG ACG GC-3'(서열번호 86) ; 07-90: 5'-GAG TCG ACT CAG CGT TTG CTG ATC TGA TCG AAC GTA C-3'(서열번호 87).
프라이머 07-89는 Not I 사이트(GCGGCCGC, 서열번호 86의 뉴클레오타이드 3-10으로 표시됨)을 포함하고 yiiP 코딩 서열의 ATG 개시코돈을 증폭하며 ATG 개시코돈 (서열번호 86의 뉴클레오타이드 11-32로 표시됨)의 상류에 1083 염기쌍에 위치한다. 프라이머 07-90은 Sal I 사이트(GTCGAC, 서열번호 87의 뉴클레오타이드 3-8로 표시됨)을 포함하고 sbp 코딩 서열의 해독 종료 코돈으로부터 증폭하며 pfkA 종료 코돈 (서열번호 87의 뉴클레오타이드 9-37로 표시됨)의 하류에 1310 염기쌍에 위치한다. Not I 및 Sal I 제한 엔도뉴클레아제 사이트에 의해 측면으로 접한 yiiP, pfkA 및 sbp 코딩서열을 포함하는 단편을 생성하기 위한 표준 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이 단편을 제조업자에 의해 공급된 재료 및 지시에 따라 벡터 pPCR-ScriptAMPSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 클로닝하였다. 그 결과 플라스미드를 pSW07-61로 명명하였다.
온도 민감성 통합 벡터를 생성하기 위해 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9):4617-462) 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)의 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 단편 을 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I을 갖는 플라스미드 pKLN07-21로부터 절단하였다. 측면이 접하는 영역이 추가된 pfkA를 플라스미드 pSW07-61로부터 제한 효소 Not I 및 Sal I로 분해시켰다. 상기 두 단편을 함께 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-63을 생성하였다.
pfkA의 코딩 서열에서 결실을 만들기 위해 플라스미드 pSW07-63을 Pvu II로 그 다음 Ahd I에 의한 부분적으로 분해로써 분해를 완성하였다. 이것은 pfkA 코딩 서열의 781 염기쌍 단편을 제거하였다. pfkA 결실을 포함하는 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 말단을 채우고 스스로 라이게이션된 말단이 무딘 단편을 얻었다. 그 결과 플라스미드 pSW07-64를 얻었다.
pfka 결실을 포함하는 균주를 생성하기 위해 플라스미드 pSW07-64를 대장균 7107-18로 형질전환하였다. 온도 민감성 선별 및 통과 프로토콜에 따라 카나마이신 민감성 콜로니를 탄소원으로서 글루코오스를 포함하는 한정 배지 플레이트에서 지연 성장하도록 스크린하였다. yiiP 및 pfkA 서열 부분을 포함하는 1153 염기쌍 단편을 사용하여 표준 고 반응온도 서던 혼성화에 의해 균주를 확인하였다. 이 균주를 7107-90(1) 및 7107-90(2)라고 명명하였다.
균주 7107-90(1) 및 7107-90(2)에서 각각 0.054 및 0.035mmol min-1 mg-1 단백질의 Pfk 비활성을 관찰하였다. 0.78mmol min-1 mg-1의 비활성은 야생형 pfkA 유전자를 갖는 대조균주 7107-87(25)에서 관찰되었다. 따라서 pfkA 돌연변이주는 대략 대조 균주에서 관찰된 Pfk 활성의 5-6%를 갖는다. 이 잔여 Pfk 활성에 공헌하는 것은 의심할 여지없이 PfkB 이소자임이다.
균주 7107-90(1) 및 7107-90(2)의 염색체로 T7-lac-ScGNA1 카세트의 통합.
7107-90 균주를 글루코사민 생산 균주 7107-18로부터 유도하였다; 따라서 그들은 더 이상 측정가능한 NAG를 생산하지 않는다. pfkA 결실을 갖는 NAG 생산균주를 생성하기 위해서 T7-lac-ScGNA1 발현 카세트를 균주에 도입할 필요가 있다. 초기에 기술한 방법에 따라 T7-lac-ScGNA1 발현 카세트를 균주 7107-90(1)과 7107-90(2) 염색체의 manXYZ 사이트에서 통합하여 균주 7107-602 및 7107-603을 각각 생성하였다. 표준 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 manXYZ 결실 사이트에서 통합된 T7lac-ScGNA1을 갖는 ScGNA1 코딩 서열을 포함하는 단편을 프로브로 사용하여 이 균주를 확인하였다.
균주 7107-602 및 7107-603의 쉐이크 플라스크 분석
변형된 글루코오스/프룩토오스 혼합물을 사용하여 균주 7107-602(1) 및 7107-603(2)을 쉐이크 플라스크 스크린 48에서 테스트하였다. 배양액을 24시간 후 0.2mM IPTG로 유도하였다. 흥미롭게도 이 균주는 대조 균주 7107-92(1)보다 더 많은 NAG를 생산하지 않았지만 테스트된 조건하에서 거의 아세테이트를 생산하지 않았다(데이터 미기재). 쉐이크 플라스크 스크린 53으로 락토오스 유도 조건하에 다시 균주 7107-602(1)와 7107-603(1)을 테스트하였다. 다시 이 균주에서 아세테이트가 생산되지 않았고, NAG 수준은 대조 균주 7107-92(1)에 나타난 것과 유사하였 다.
균주 7107-602(1)에서의 아세테이트 형성을 더욱 평가하기 위해 효모 추출물(YE), 리보오스 또는 고 미량원소(TE)의 첨가를 포함하여 아세테이트 형성을 증가시키는 조건하에서 쉐이크 플라스크 스크린 56을 수행하였다. 변형된 M9B 배지[6g/l KH2PO4, 24g/l K2HPO4,, 1g/l Na3Citrate.2H 2O, 10g/l (NH4)2SO4(pH 7.4로 조정된 포스페이트)]에서 배양액을 성장시켰다. 적은 양의 미량금속(0.3mg/l FeSO4-7H2O, 0.375mg/l ZnSO4-7H2O, 0.02mg/l MnSO4-H2O, 0.001mg/l CuSO4-5H2O, 0.001mg/l NaMoO4-2H2O, 0.001mg/l H3BO3 및 0.001mg/l CoCl2-6H 2O) 또는 많은 양의 미량금속(12mg/l FeSO4-7H2O, 0.375mg/l ZnSO4-7H2O, 0.8mg/l MnSO 4-H2O, 0.001mg/l CuSO4-5H2O, 0.001mg/l NaMoO4-2H2O, 0.001mg/l H3BO3 및 0.001mg/l CoCl2-6H2O)을 표 24에 나타난 바와 같이 첨가하였다. 배양액에 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2 -2H2O, 10g/l 글루코오스 및 20g/l 락토오스를 보충하였다. 추가적으로 5g/l 리보오스 및/또는 5g/l 효모 추출물을 표 24에 기재된 것과 같이 배양액에 첨가하였다. 24시간동안 37℃에서 배양액을 성장시키고 25℃로 조정하였다. 12시간에 20g/l 글루코오스를 그것이 고갈된 배양액에 첨가하고 pH를 7.2로 조정하였다. 24, 30, 48 및 54시간에 배양액의 pH를 7.2로 조정하고 HPLC 결과에 기초하여 글루코오스를 하루당 총 30g/l으로 첨가하고, 24, 30, 48 및 52시간에 1g/l 이하로 떨어진 경우 플라스크에 5g/l의 (NH4)2SO4를 첨가하였다.
균주 7107-602(1) 및 7107-92(1)에서 아세테이트 형상에 대한 미량 원소, 리보오스 및 효모 추출물의 다양한 양의 영향
균주 조건 시간(hr) OD600 아세테이트
(g/l)		 GlcNAc
(g/l)
TE 리보오스 YE
7107-602(1) 낮음 5g/l 5g/l 24 4.5 0 8.6
48 9.6 0 18.2
72 13.2 0 14.2
높음 5g/l 5g/l 24 4.75 0 8.7
48 9.0 0 22.8
72 12.9 7.2 22.3
낮음 없음 5g/l 24 4.5 0 6.8
48 4.8 0 15.6
72 10.8 0 28.2
높음 없음 5g/l 24 4.5 0 6.8
48 9.0 0 16.4
72 12.0 9.8 16.3
낮음 5g/l 없음 24 1.75 0 4.15
48 2.4 0 13.0
72 5.4 0 23.0
높음 5g/l 없음 24 1.0 0 4.35
48 4.8 2.2 13.2
72 10.5 0 27.8
7107-92(1)
(대조군)		 낮음 5g/l 5g/l 24 8.5 0 7.0
48 12.6 6.1 18.6
72 13.8 13.6 15.8
높음 5g/l 5g/l 24 7.5 0 5.2
48 12.6 8.4 13.6
72 12.9 14.4 11.7
낮음 없음 5g/l 24 9.0 0 4.9
48 15.0 7.8 9.7
72 15.0 15.0 9.2
높음 없음 5g/l 24 9.5 0 5.4
48 12.6 10.9 7.6
72 13.2 17.1 7.4
낮음 5g/l 없음 24 7.0 0 4.2
48 7.2 1.8 16.6
72 7.8 3.7 19.2
높음 5g/l 없음 24 10.0 0 7.17
48 13.2 7.4 13.10
72 13.2 13.0 11.7

많은 양의 아세테이트를 생산하기 위해 대조 균주 7107-92(1)를 유도하도록 설계된 조건하에서도 7107-602(1)에서의 아세테이트 생산은 0이거나 상대적으로 낮다(표 23 참조). 더 나아가, OD 측정이 균주 7107-607(2)에 대해 더 낮아지는 경향이 있지만, 보통 이 배양액에서 더 높은 NAG 역가가 보였다. 따라서 pfkA 돌연변이주 균주는 NAG 생산 숙주로서 사용하기 적절한 것으로 보였다.
< 실시예 23 >
본 실시예는 글루타민 신테타제(glnA) 유전자의 클로닝 및 과잉 발현, 대장균 염색체로의 T7lac-glnA 카세트의 통합 및 GlcN/GlcNAc 생산에 대한 glnA 유전자 과잉 발현의 효과를 기술한다.
글루타민은 다른 화합물 뿐만 아니라 아미노 당에 질소를 제공하는 암모니아 동화의 1차 생산물이다. glnA에 의해 암호화된 글루타민 신테타제는 NH3 및 ATP를 필요로 하는 반응에서 L-글루타메이트의 L-글루타민으로의 전환을 촉진한다. L-글루타민은 글루코사민-6-포스페이트의 생합성을 필요로 한다; GlmS는 L-글루타민 및 F-6-P를 D-글루코사민-6-P 및 L-글루타민으로 전환하는 반응을 촉진시킨다. GlcN/GlcNAC 생산 수준을 최대로 하기 위해 적절한 수준의 글루타민이 세포에 존재하는 것이 필수적이다. glnA 유전자의 과잉 발현은 글루타민의 수준을 증가시킬 수 있고, 궁극적으로 GlcN 및 또는 NAG 역가를 증가시킬 수 있다.
대장균 glnA 유전자의 클로닝 및 과잉 발현
대장균 glnA의 클로닝 및 과잉 발현을 위해 glnA 유전자(Blattner et al, 1997, Science 277(5331):1453-1474)의 공지된 서열에 기초하여 프라이머를 합성하였다. 대장균 glnA 유전자의 코딩 서열의 핵산서열이 서열번호 88에 기재되어 있다. 대장균 GlnA 단백질의 디듀스된 아미노산 서열이 서열번호 89에 기재되어 있다. 상기 프라이머를 사용하여 대장균 7107-17(DE3) 유전체 DNA로부터 PCR을 사용하여 glnA 코딩 서열을 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-gln 및 리버스 프라이머 07-15이고 그 서열은 다음과 같았다: 07-gln: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG TCC GCT GAA CAC GTA CTG AC-3'(서열번호 90) ; 07-15: 5'-GAT CCT CGA GTT AGA CGC TGT AGT ACA GCT C-3'(서열번호 91).
프라이머 07-gln은 Bsa I 사이트(GGTCTC, 서열번호 90의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 ATG 개시 코돈(서열번호 90의 뉴클레오타이드 13-35로 표시됨)으로부터 glnA 코딩 서열의 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-15는 Xho I 사이트(CTCGAG, 서열번호 91의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 해독 종료코돈(서열번호 91의 뉴클레오타이드 11-31로 표시됨)으로부터 glnA 코딩 서열의 21개 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR을 표준 조건하에 수행하여 Bsa I 및 Xho I 제한 엔도튜클레아제 사이트에 의해 측면으로 접한 glnA 코딩 서열을 포함하는 단편을 생성하였다.
glnA를 포함하는 PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라 이게이션하여 플라스미드 pKLN07-28을 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 pET24d(+)의 T7lac 프로모터의 뒤에 glnA 서열을 배치시키고 T7lac-glnA의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서 재조합 glnA의 기능적 발현
glnA의 기능적 발현을 테스트하기 위해 재조합 플라스미드 pKLN07-28을 균주 7107-18로 형질전환하여 균주 7107-163을 생성하였다. 7107-18을 pET24d(+) 공벡터로 형질전환하여 대조 균주 7107-88을 준비하였다. 세포 배양액을 LB에서 성장시키고 1mM IPTG로 유도하는 표준 유도 프로토콜을 따랐다. SDS-PAGE로 GlnA 단백질 과잉 발현을 확인하기 위해 유도된 배양액으로부터 샘플을 수거하였다. GlnA 단백질의 예상된 단백질 크기는 약 52kDa였다. 약 52kDa의 과잉 발현된 단백질이 관찰되었다. 대부분의 과잉 생산된 단백질은 불용성으로 나타났고 용해된 분획에서는 발견되지 않았다. 상기 과잉 발현된 단백질이 대조 균주에서 관찰되지 않았고 과잉 발현된 단백질이 GlnA 효소인 것으로 나타났다.
T7lac-glnA를 대장균 염색체로 직접 통합하는 벡터의 구축
glnA 유전자의 성공적인 과잉 발현을 확인한 이후 다음 단계는 생산 균주의 유전체로 T7lac-glnA 카세트를 통합하는 것이었다. 통합 벡터를 이러한 목적으로 구축하였다. 대장균 pfkB 유전자를 통합의 표적 사이트로 선별하였다. pfkB는 대장균에서 전체 포스포프럭토키나제 활성의 10%를 담당하는 포스포프룩토키나제의 부수 이소자임으로 암호화한다. 따라서 이 로커스에서 카세트의 통합은 유의적으로 균주의 작용에 영향을 주지 않아야 한다.
통합 벡터를 생성하는 방법의 일부로서 측면이 접한 영역이 추가된 pfkB를 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 PCR로 증폭하였다. 프라이머를 그 측면이 접한 영역이 추가된 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331): 1453-1474)에 기초하여 합성하였다. pfkB 영역을 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-16 및 리버스 프라이머 07-17이고 그 서열은 다음과 같았다: 07-16: 5'-GAT CGC CGG CTT ACA TGC TGT AGC CCA GC-3'(서열번호 92); 07-17: 5'-GAT CCT GCA GTC ATG CTG CTA ATA ATC TAT CC-3'(서열번호 93).
프라이머 07-16은 Nae I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GCCGGC, 서열번호 92의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 잠정 해독 종료코돈에서 개시하는 ORF b1722의 19 염기쌍을 포함하고 pfkB 개시코돈(서열목록:92의 뉴클레오타이드 11-29로 표시됨)의 상류에 1042 염기쌍에 위치한다. 프라이머 07-17은 Pst I 제한 뉴클레아제 사이트(CTGCAG, 서열목록:93의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 잠정 해독 종료코돈에서 개시하는 ORF b1725의 22 염기쌍을 포함하고 pfkB 코딩 서열의 상기 해독 종료코돈(서열번호 93의 뉴클레오타이드 11-32로 표시됨)의 하류에 1357 염기쌍에 위치한다. PCR을 표준 조건하에 수행하여 Nae I 및 Pst I 제한 엔도뉴클레아제 사이트의 측면에 접한 ORFb1722, pfkB, ORFb1724 및 ORFb1725 서열을 포함하는 단편을 생성하였다. 그 결과의 단편을 벡터 pPCR- ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-14를 생성하였다.
다음 단계는 플라스미드 pKLN07-14에 플라스미드 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 카나마이신 저항성 카세트를 첨가하는 것이었다. 상기 카나마이신 저항성 카세트를 pUC4K로부터 제한 엔도뉴클레아제 Pst I로 절개하였다. 플라스미드 pKLN07-14를 또한 제한 엔도뉴클레아제 Pst I로 분해하고 ORFb1725 잠정 코딩 서열의 386 염기쌍을 포함하여 플라스미드의 412 염기쌍 단편을 제거하였다. 상기 카나마이신 저항성 카세트를 플라스미드 pKLN07-14의 백본(backbone)의 Pst I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-17을 생성하였다. 플라스미드 pKLN07-17을 제한 엔도뉴클레아제 SnaB I 및 Btr I로 분해하고 플라스미드로부터 pfkB 코딩 서열의 870 염기쌍을 제거하였다.
T7lac-glnA 카세트를 포함하는 단편을 플라스미드 pKLN07-28로부터 제한 엔도뉴클레아제 Nae I로 절개하여 벡터 pET24d(+)로부터 T7 프로모터의 상류의 50 염기쌍 및 T7 터미네이터의 하류의 164 염기쌍과 측면으로 접한 T7lac-glnA 카세트를 포함하는 단편을 생성하였다. Nae I 단편을 플라스미드 pKLN07-17의 SnaB I 및 Btr I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-29를 생성하였다.
마지막 단계는 pfkB 결실 사이트의 T7lac-glnA 카세트 및 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 플라스미드 pKLN07-29로부터의 단편에 pMAK705로부터의 온도 민감성 복제단위를 첨가하는 것이었다. 플라스미드 pKLN07-29를 pPCR-Script 백본으 로부터 T7lac-glnA 및 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 단편을 분리하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Kpn I로 분해시켰다. 플라스미드 pKLN07-20(이전에 기술함)을 Not I 및 Kpn I로 분해하고 온도 민감성 복제단위를 포함하는 단편을 절개하였다. 양 단편을 상호 라이게이션하여 온도 민감성 복제단위, 카나마이신 저항성 카세트 및 pfkB 결실 사이트로 라이게이션된 T7lac-glnA 카세트를 갖는 대장균 유전체 서열을 포함하는 플라스미드 pKLN07-30을 생성하였다. 플라스미드 pKLN07-30은 염색체의 pfkB에서 온도 민감성 선별 및 통과 프로토콜을 따라 T7lac-glnA 카세트의 통합을 인도하는데 사용될 수 있다.
플라스미드 pKLN07-30을 글루코사민 생산 균주 7107-18로 형질전환하였다. 온도 민감성 선별 및 통과에 따라 카나마이신 민감성 콜로니를 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 pfkB 결실 사이트에서 T7lac-glnA 카세트의 존재를 확인하기 위해 스크린하였다. PCR에 의해 확인된 여러 균주를 프로브로 glnA 코딩 서열을 포함하는 단편을 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다. 이 균주를 7107-118 내지 7107-123으로 명명하였다.
균주 7107-118, 7107-119 및 7107-120의 염색체로 T7lac-ScGNA1 카세트의 통합
균주 7107-118, 7107-119 및 7107-120을 글루코사민 생산 균주 7107-18로부터 유도하였다; 따라서 그들은 측정가능한 NAG를 생산하지 않는다. NAG 생산 균주를 생성하기 위해서 T7lac-ScGNA1 발현 카세트를 균주에 도입할 필요가 있다. 이 전에 기술한 바와 같이 T7-lac-ScGNA1의 발현 카세트를 균주 7107-118, 7107-119 및 7107-120의 염색체의 manXYZ에서 통합하여 균주 7107-125(7107-119로부터 유도됨), 7107-126(7107-120으로부터 유도됨), 7107-132(7107-118로부터 유도됨), 7107-133(7107-118로부터 유도됨) 및 7107-134(7107-119로부터 유도됨)를 생성하였다. 이 균주를 manXY 결실 사이트에서 통합된 T7lac-ScGNA1을 갖는 ScGNA1 코딩 서열을 포함하는 단편을 프로브로 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다.
쉐이크 플라스크 스크린 51: NAG 생산 배경에서 통합된 T7lac-glnA의 과잉 발현 테스트
쉐이크 플라스크 스크린 51을 통합된 T7lac-glnA 카세트를 포함하는 균주 7107-125, 7107-126 및 7107-133을 평가하기 위해 수행하였다. 배양액을 미량 금속 및 다음의 성분이 보충된 M9B 배지에서 성장시켰다: 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 10g/l 글루코오스, 40g/l 락토오스, 5g/l 리보오스 및 5g/l 효모 추출물. 배양액을 30℃에서 24시간동안 성장시키고 25℃로 방치하였다. 24 및 48시간에서 배양액의 pH를 7.2로 조정하고, 글루코오스를 30g/l로 첨가하고, 수준이 1g/l 이하로 떨어진 경우 플라스크에 24 및 48시간에서 5g/l (NH4)2SO4를 첨가하였다. 샘플을 24, 48 및 72시간에 OD 및 NAG 수준의 결정을 위해 수거하였다. 배양액을 효소 활성 분석을 위해 72시간에 수거하였다.
표 25에 나타난 바와 같이 glnA를 과잉 발현하는 균주는 대조 균주 7107-92(1)보다 약 8% 이상의 NAG를 생산하여 더욱 잘 수행하였다. 암모니아가 고갈된 경우가 없었으므로 질소는 제한하지 않았다. glnA 과잉 발현 균주에서 GlmS 및 GNA1의 효소 활성은 대조균주 7107-92(1)과 비교될 만하다. 요약하면 glnA 과잉 발현은 최적화된 조건하에서 강조될 수 있는 NAG 역가를 약간 상승시키는 것으로 보인다.
glnA를 과잉 발현하는 균주에서 세포 성장, 효소 활성 및 GlcNAc 생산
균주 구성 OD600 효소 활성 GlcNAc(g/l)
GlmS GNA1
7107-92(1) 대조군 9.75 0.34 3.2 24.3
7107-125 T7lac-glnA 10.10 0.36 3.3 26.5
7107-126 T7lac-glnA 9.75 0.25 3.0 26.0
7107-133 T7lac-glnA 9.75 0.31 2.8 26.7
1) OD, 효소 활성 및 GlcNAc 수준을 72시간의 샘플에서 측정하였다.
2) 효소 활성은 μmol min-1 mg-1 단백질로 표시된다.
통합된 T7lac-glnA를 갖는 NAG 생산 균주를 테스트하는 발효 실험
통합된 T7lac-glnA 카세트를 포함하는 균주 7107-133을 1 리터 발효조에서 평가하였다. 발효조는 초기 부피 475ml로 준비되었다. 발효 배지의 조성이 표 26에 나타나 있다. 발효시 pH를 6.9로 제어하기 위해 75%의 NH4OH를 사용하였다. 발효하는 동안 온도는 37℃를 유지하였다. 통기 및 교반에 의해 용존 산소 농도가 포화 공기의 20%를 유지하도록 조정하였다. 접종시 0.40/hr, 최대 속도 6시간에 5ml/hr의 성장속도를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 배양액을 10시간에 5g/l로 첨가된 푸드 그레이드로 유도하고 글루코오스 공급을 계속하였다.
균주 7107-133으로부터의 발효 결과를 동일한 조건 하에 발효 237에서 이전에 수행된 균주 7107-92(1)의 발효와 비교하였다. 양 균주 모두 하나의 통합된 T7lac-ScGNA1 카세트 카피를 보유하였다. 그 결과는 균주 7107-133에서 T7lac-glnA 카세트의 존재가 균주 7107-92(1)에 대해 약간의 이점을 제공할 수 있음을 나타낸다. 균주 7107-133은 균주 7107-92(1)에서 59.8시간에 96.6g/l의 NAG와 비교하여 59.6시간에 107.1g/l NAG를 얻었다.
발효 배지의 조성
성분 양(g/l)
H3PO4 4.79
KOH 3.15
Citric acid-H2O 3.56
(NH4)2SO4 5
MgSO4-7H2O 2.5
CaCl2-2H2O 0.05
미량 금속 *
Mazu 204 Antiform 0.25
* 미량 금속 조성은 5mg/l FeSO4-7H2O, 3.75mg/l ZnSO4-7H 2O, 0.6mg/l MnSO4-H2O, 0.1002mg/l CuSO4-5H2O, 0.1002mg/l CoCl2-6H2O이다.
< 실시예 24 >
본 실시예는 클로닝, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(zwf) 유전자의 과잉 발현, T7lac-zwf 카세트의 대장균 염색체로의 통합 및 T7 프로모터 제어하에서 NAG 생산에 대한 zwf 과잉 발현의 영향에 대해 기술한다.
오탄당 포스페이트 경로는 아미노산, 뉴클레오타이드 및 세포벽 생합성의 중간 매개체를 제공한다. 또한 오탄당 포스페이트 경로의 산화 부분은 세포에서 NADPH의 중요 원천이다. 대장균의 zwf 유전자는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(G6PDH)를 암호화하고, 이는 오탄당 포스페이트 경로에서 첫 단계를 촉진하여 글루코오스-6-포스페이트를 글루코노-1,5-락톤으로 전환시킨다. zwf 유전자의 발현은 세포 성장속도로 조정된다(Rowley, D. and Wolf, R., J. Bac., 1991, 173(3): 968-977).
문헌은 대장균이 NAG 또는 GlcN에서 성장할 수 없도록 분리된다고 기술하고 있다(J. Bac., 1970, 101: 384-391). 저자는 아미노 당 포스페이트의 축적이 포스포헥토스 이소머라제 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소에 의해 촉진된 반응을 억제하여 오탄당 아사현상을 유발할 것이라고 추측하였다. 오탄당 또는 글루코네이트의 첨가는 상기 균주의 성장을 억제를 반전하였다.
GlcN/GlcNAc를 생산하는 재조합 대장균 균주는 아미노 당 포스페이트를 특정 수준까지 축적할 수 있다. 이러한 경우 글루코네이트 또는 리보오스와 같은 오탄당의 첨가는 성장 및 NAG 생산의 증가를 유발할 것이다. NAG 생산 균주 7107- 87#25에 의해 수행된 쉐이크 플라스크 실험은 리보오스 또는 글루코네이트의 첨가가 성장 및 NAG 역가를 모두 증가시킨다는 것을 보여주었다. 따라서 NAG 생산 균주가 오탄당 또는 글루코네이트의 첨가에 의해 완화될 수 있는 오탄당 아사를 경험하는 것으로 보인다.
외인성 을탄당를 첨가하지 않고 오탄당 아사현상을 완화하기 위한 방법으로서 NAG 생산 균주에서 zwf 유전자를 과잉 발현하기로 결정하였다. zwf의 과잉 발현은 오탄당 포스페이트 경로에서 인산화된 아미노 당의 억제를 줄일 것으로 추측되었다. 만약 그렇다면 우리의 균주에서 NAG 역가를 증가시키기 위한 추가적인 오탄당 또는 글루코네이트를 공급할 필요가 없어지게 된다.
대장균 zwf의 클로닝 및 발현
대장균 zwf의 클로닝 및 발현을 위해 zwf 유전자의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331):1453-1474)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. 대장균 zwf 유전자의 코딩 서열의 핵산서열이 서열번호 94에 기재되어 있다. 대장균 ZWF 단백질의 디듀스된 아미노산 서열이 서열번호 95에 기재되어 있다. 상기 프라이머를 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 PCR을 사용하여 zwf 코딩 서열을 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-101 및 리버스 프라이머 07-102이고 그 서열은 다음과 같다: 07-101: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG GCG GTA ACG CAA ACA GC-3'(서열번호 96) ; 07-102: 5'-GAT CCT CGA GTT ACT CAA ACT CAT TCC AGG AAC GAC C-3'(서열번호 97).
프라이머 07-101은 Bsa I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(GGTCTC, 서열번호 96의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 ATG 개시 코돈(서열번호 96의 뉴클레오타이드 13-32로 표시됨)으로부터 zwf 코딩 서열의 20개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-102는 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CTCGAG, 서열번호 97의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 해독 종료코돈(서열번호 97의 뉴클레오타이드 11-37로 표시됨)으로부터 zwf 코딩 서열의 27개 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR을 표준 조건하에 수행하여 Bsa I 및 Xho I 제한 엔도튜클레아제 사이트에 의해 측면으로 접한 zwf 코딩 서열을 포함하는 단편을 생성하였다.
PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Bsa I 및 Xho I로 분해시키고 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-71을 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 pET24d(+)의 T7lac 프로모터의 뒤에 zwf 서열을 배치시키고 T7lac-zwf의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서 재조합 ZWF 단백질의 기능적 발현
각각 pET24d(+)에서 T7lac-zwf 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 pSW07-71#17, #20 및 #33을 NAG 생산 균주 7107-92(1)로 형질전환하여 균주 7107-96(1)(pSW07-71#17로 형질전환됨), 7107-96(2)과 7107-96(3)(pSW07-71#20으로 형질전환됨) 및 7107-96(4)(pSW07-71#33으로 형질전환됨)을 생성하였다. 대조 균주 7107-95를 pET24d(+)를 갖는 균주 7107-92(1)의 형질전환에 의해 준비하였다. 세 포 배양액을 LB에서 성장시키고 1mM IPTG로 유도시키는 표준 유도 프로토콜을 따랐다. SDS-PAGE를 위해 유도된 배양액으로부터 샘플을 수거하였다. 그 결과에 의해 G6PDH 단백질의 예상된 크기에 대응하여 약 56kDa의 단백질의 과잉 생산을 확인하였다. 그러나 대부분의 과잉 생산된 단백질은 불용성의 형태인 것으로 보였다.
IPTG 유도의 4시간 후, 세포 배양액을 수거하여 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소 활성을 분석하였다. 균주 7107-96(2), 7107-96(3) 및 7107-96(4)는 69.7, 78.1 및 90.1mmol min-1 mg-1 단백질의 G6PDH 활성을 나타냈고 0.04mmol min -1 mg-1 단백질을 나타내는 대조 균주 7107-95와 비교하였다. 이것에 의해 zwf가 NAG 생산 균주에서 성공적으로 과잉 발현되는 것을 확인하였다.
T7lac-zwf 카세트의 대장균의 염색체로의 통합
대장균 7107-92#1에서 재조합 ZWF 단백질의 기능적 발현을 확인한 이후 다음 단계는 NAG 생산 균주의 염색체로 Tlac-zwf 카세트를 안정하게 통합하는 것이었다. 통합 벡터를 유전체의 rha 영역에 카세트의 통합 표적을 결정하도록 설계하였다. 대장균 rhaBAD 유전자는 람눌로키나제, L-람노즈 이소머라제 및 람눌로스-1-포스페이트 알돌라제 각각을 암호화하는 오페론을 형성한다. 이 유전자는 대체 탄소원으로서 람노스의 이용에 관련되고 비본질적 유전자로 생각된다. 따라서 이 영역의 파괴는 성장 또는 NAG 생산에 영향을 끼치지 않을 것이다.
통합 벡터를 생성하는 첫 번째 단계는 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 rhaBAD 영역을 클로닝하는 것이었다. 프라이머를 그 측면이 접한 영역이 추가된 rhaBAD 오페론의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331): 1453-1474)에 기초하여 합성하였다. rha 영역을 증폭하기 위해 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-107 및 리버스 프라이머 07-108이고 그 서열은 다음과 같았다: 07-107: 5'-CGA ATA TCA CGC GGT GAC CAG TTA AAC-3'(서열번호 98); 07-108: 5'-CAC AGT GTG CCG ATG ATT TTG ACC-3'(서열번호 99).
프라이머 07-107은 rhaB 개시코돈의 상류로 1096 염기쌍으로부터 증폭하였다. 프라이머 07-108은 rhaD 종료코돈의 하류로 977 염기쌍으로부터 증폭하였다. PCR을 표준 조건하에 수행하여 서열이 측면에 접한 rhaBAD 오페론을 포함하는 단편을 생성하였다. PCR 단편을 벡터 pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 클로닝하여 플라스미드 pSW07-72를 생성하였다.
통합 벡터 생성의 다음 단계는 T7lac-zwf 카세트를 플라스미드 pSW07-72로 첨가하는 것이었다. T7-lac-zwf 카세트를 PCR에 의해 플라스미드 pSW07-71로부터 표준 조건을 사용하여 증폭하였다. PCR 증폭을 포워드 프라이머 07-111 및 리버스 프라이머 07-112로 수행하였고, 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: 07-111: 5'-GAC CAA TGG CCT AAT GGA GCA ACC GCA CCT GTG GC-3'(서열번호 100); 07-112: 5'-GAT CAG CGC TAT CCG GAT ATA GTT CCT CCT TTC AGC AAA AAA CCC C-3'(서열번호 101).
프라이머 07-111은 Xcm I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(CCA NNN NNN NNN TGG, 서열목록 NO;100의 뉴클레오타이드 3-17로 표시됨)을 포함하고 pET24d(+)의 T7 프로모터 서열(서열번호 100 뉴클레오타이드의 18-35로 표시됨)의 상류로 80 bp로부터 증폭한다. 프라이머 07-112는 Afe I 제한 엔도뉴클레아제 사이트(AGCGCT, 서열목록 NO;101의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨)을 포함하고 T7 터미네이터(서열번호 101 뉴클레오타이드의 11-46으로 표시됨)의 하류로 25 bp로부터 증폭한다. 그 결과인 1.8-kb PCR 생산물을 제한 엔도뉴클레아제 Xcm I 및 Afe I로 분해하였다.
플라스미드 pSW07-72를 제한 효소 Xcm I 및 Afe I로 분해하고, pSW07-72 백본으로부터 3.6kb 단편을 절개하였다. Xcm I 및 Afe I 말단을 갖는 T7lac-zwf를 포함하는 PCR 단편을 플라스미드 pSW07-72의 절개 사이트에서 라이게이션 하여 플라스미드 pSW07-73을 생성하였다. 플라스미드 pSW07-73은 따라서 결실 사이트에 접종된 T7-lac-zwf를 갖는 거의 온전한 3.6kb의 rhaBAD 오페론 결실을 갖는다.
통합 플라스미드의 구축의 마지막 단계는 온도 민감성 복제단위 및 플라스미드 pKLN07-21로부터 카나마이신 저항성 카세트를 첨가하는 것이었다. 플라스미드 pKLN07-21을 Not I 및 Kpn I로 분해하고 온도 민감성 복제단위 및 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 단편을 절개하였다. 플라스미드 pSW07-73을 제한 효소 Not I 및 Kpn I로 분해하고 pPCR Script 백본으로부터 rhaBAD 측면을 갖는 T7-lac-zwf를 포함하는 단편을 방출하였다. 두 단편을 상호 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-74를 생성하였다. 플라스미드 pSW07-74는 대장균 염색체의 rha 영역에서 T7lac-zwf의 직접 통합에 사용될 수 있다.
플라스미드 pSW07-74를 NAG 생산균주 7107-92(1)로 형질전환하였다. 온도 민감성 선별 및 통과에 이어 카나마이신 민감성 콜로니를 rhaBAD 결실 사이트에서 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 T7lac-zwf 카세트의 존재를 확인하기 위해 스크린하였다. PCR에 의해 확인된 여러 균주를 프로브로 zwf 코딩 서열의 1.0-kb 단편을 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다. 이 균주를 7107-606(1), 7107-606(2), 7107-606(3) 및 7107-606(4)로 표시하였다.
통합된 T7lac-zwf 카세트를 갖는 균주에서의 NAG 생산
쉐이크 플라스크 스크린 46을 균주 7107-606(1) 및 7107-606(3)에서 NAG 생산에 대한 T7 프로모터의 제어하에 과잉 발현하는 zwf의 영향을 평가하기 위해 수행하였다. 이전에 논의된 것과 같이 zwf의 과잉 발현은 오탄당의 아사현상을 완화하고 인산화된 아미노 당에 의해 유발된 성장 억제를 없애는 것으로 추측되었다. 배양액을 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 40g/l 글루코오스 및 0.02mM IPTG(지연유도를 갖는 플라스크에 대해 IPTG를 24시간에 첨가하였다)가 보충된 M9B 배지(이전에 기술됨)에서 성장시켰다. 표 27에 기재된 바와 같이 10g/l의 리보오스 및 5g/l의 효모 추출물을 배양액에 첨가하였다. 배양액을 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 배양액의 pH를 7.2로 조정하고 글루코오스는 하루에 총 30g/l로 첨가하였다. 5g/l (NH4)2SO4를 24 및 48시간에 1g/l 이하로 수준이 떨어진 경우 플라스크에 첨가하였다. OD 및 NAG 양을 측정하기 위해 24, 48 및 72시간에 샘플을 제거하였다. 배양액을 효소 분석을 위해 72 시간에 수거하였다.
zwf를 과잉 발현하는 균주에서 성장, 효소 활성 및 GlcNAc 생산에 대한 다양향 유도 시간, 리보오스 첨가 및 효모 추출물 첨가의 영향
균주 조건 OD600 효소 활성2 GlcNAc(g/l)
리보오스 YE IPTG GlmS GNA1 G6PDH
7107-92(1) 10g/l 5g/l 0.2mM 13.0 0.21 6.7 0.36 12.9
없음 5g/l 0.2mM 10.5 0.15 2.8 없음 7.7
없음 없음 0.2mM1 6.5 0.11 0.0 없음 4.4
7107-606(1) 10g/l 5g/l 0.2mM 12.5 0.12 3.0 21.8 6.4
없음 5g/l 0.2mM 13.0 0.06 0.4 13.8 5.5
없음 없음 0.2mM1 6.75 0.0 0.0 29.2 2.4
7107-606(3) 10g/l 5g/l 0.2mM 11.5 0.04 1.73 18.8 6.3
없음 5g/l 0.2mM 12.5 0.13 1.93 17.2 5.4
없음 없음 0.2mM1 6.75 0.0 0.0 41.8 2.6
1 지연 유도를 위해 24시간에 첨가된 IPTG
2 효소 활성은 μmol min-1 mg-1 단백질로 표시된다.
상기 결과는 T7 프로모터에 의해 구동된 zwf를 과잉 발현하는 균주가 대조 균주에서보다 50 내지 100배 더 높은 G6PDH 활성을 보유했다. zwf 과잉 발현은 대조 균주의 성장과 비교할 때 첨가된 리보오스가 없는 배양액에서 약간 성장을 증가시켰다. 그러나 GlmS 활성은 zwf를 과잉 발현하는 균주에서 감소하는 경향이 있었고 NAG 생산 수준은 대조 균주 7107-92(1)에서 보이는 양에 도달하지 않았다. 이것은 더욱 많은 탄소가 글루코사민 경로와 떨어져서 오탄당 포스페이트 경로를 통 해 집중될 수 있음을 나타낸다.
< 실시예 25 >
본 실시예에서는 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소(zwf) 유전자의 클로닝, 천연 프로모터를 갖는 zwf 유전자의 대장균 염색체로의 통합 및 그 천연 프로모터 제어하에서 세포 성장 및 NAG 생산에 대한 zwf 과잉 발현의 영향에 대해 기술한다.
천연 프로머터와 조절 영역을 갖는 대장균 zwf의 클로닝
실시예 24에서 기술한 바와 같이 성장 및 NAG 생산을 향상시키는 방법의 일부로서 통합된 T7lac-zwf 카세트로 균주를 구축하였다. zwf의 과잉 발현으로 오탄당 포스페이트 경로에 대한 인산화된 아미노 당의 억제가 감소할 수 있을 것으로 예상되었다. 그렇다면 우리의 균주에서 NAG 역가를 증진시키기 위해 추가적인 오탄당 또는 글루코네이트를 공급할 필요가 없어질 수 있을 것이다.
통합된 T7lac-zwf 카세트를 포함하는 균주 7107-606은 대조균주보다 다소 더 잘 성장하였고 오탄당 아사현상의 부분적인 완화를 나타냈다. 그러나 NAG 생산에 관하여 대조 균주만큼 잘 수행하지 않았다. 이것은 매우 많은 양의 ZWF 단백질의 발현을 유발할 수 있는 강력한 T7 프로모터의 사용 에 기인할 수 있다. 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 초과 활성은 오탄당 포스페이트 경로를 통해 원하지 않는 너무 많은 양의 탄소를 집중시켰다. 따라서 천연 프로모터를 갖는 zwf를 과 잉 발현하도록 결정하여 zwf 발현이 세포에 의해 조절되었다. 대장균에서 zwf는 성장속도 의존 조절에 구속된다. 또한 zwf는 soxRS 레귤론 및 다중 항생제 저항성(mar) 레귤론의 일원이다. 따라서 천연 zwf의 클로닝은 천연 프로모터 뿐만 아니라 "Soxbox"와 같은 조절 영역을 포함하여야 한다(Fawcett, W. and Wolf, R., 1995, J. Bac. 177(7): 1742-1750). 염색체에 대한 zwf의 2개의 카피의 존재는 NAG 생산에 대한 것과 같이 다른 경로를 통한 탄소 유입에 큰 영향을 주지 않고 오탄당 포스페이트 경로를 통해서 유입량의 증가를 유발할 수 있었다.
대장균 zwf의 클로닝 및 발현을 위해 프라이머를 zwf 유전자의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331): 1453-1474)에 기초하여 합성하였다. PCR을 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 조절 영역이 추가된 zwf 코딩 서열을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 사용하였다. 상기 증폭에 사용된 프라이머는 리버스 프라이머 07-129 및 포워드 프라이머 07-130으로 그 서열은 다음과 같다: 07-129: 5'-GAT GCT AGC TAA CCG GAG CTC ATA GGG C-3'(서열번호 102); 07-130: 5'-GAT TTC GAA TGA TCA GTG TCA GAT TTT TAC CC-3'(서열번호 103).
포워드 프라이머 07-130은 BstB I 사이트(TTCGAA, 서열번호 102 뉴클레오타이드 4-9로 표시됨)를 포함하고 zwf 개시코돈의 상류로 203 염기쌍으로부터 증폭한다. 리버스 프라이머 07-129는 Nhe I 사이트(GCTAGC, 서열번호 103의 뉴클레오타이드 4-9로 표시됨)을 포함하고 zwf 종료코돈의 하류로 154 염기쌍으로부터 증폭한다. 표준 조건하에서 PCR을 수행하여 Nhe I 및 BstB I 제한 엔도뉴클레아제 사이트의 측면에 접하는 1.8-kb 단편을 형성하였다.
재조합 zwf를 대장균의 염색체로의 통합
유전체의 rha 영역에 zwf 카세트의 통합 표적을 결정하기 위한 통합 벡터를 설계하였다. 대장균의 rhaBAD 유전자는 람눌로키나제, L-람노스 이소머라제 및 람눌로스-1-포스페이트 알돌라제를 각각 암호화하는 오페론을 형성한다. 이 유전자는 대체 탄소원으로서 람노스의 이용에 관계되고 필수적이 않은 유전자로 생각된다. 따라서 이 영역의 파괴는 우리의 균주에서 성장 또는 NAG 생산에 영향을 주지 않을 것이다.
플라스미드 pSW07-72#45(실시예 24에서 기술함)를 통합벡터의 생성을 위한 첫 번째 단계로 사용하였다. 측면이 접하는 서열이 추가된 rhaBAD 오페론을 포함하는 이 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제 BstB I 및 Nhe I로 분해시켰다. 이것은 플라스미드로부터 rhaB 및 rhaA 코딩 서열의 부분을 포함하는 720 염기쌍 단편을 제거하였다. 조절 영역이 추가된 zwf 코딩 서열을 포함하는 PCR 단편을 제한효소 BstB I 및 Nhe I로 분해하고 pSW07-72#45의 BstB I 및 Nhe I 사이트로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-86을 생성하였다.
플라스미드 pSW07-86을 rha 유전자의 측면이 접하는 zwf를 포함하는 6.9 kb 단편을 분리하기 위해 제한 효소 Kpn I 및 Not I로 분해시켰다. 이 단편을 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622)로부터의 온도 민감성 복제단위 및 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터의 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 pKLN07-21로부터 4.2kb Kpn I/ Not I 단편으로 라 이게이션하였다. 그 결과 플라스미드인 pSW07-87을 대장균 염색체의 rhaBA 영역으로 zwf의 통합을 유도하도록 사용하였다.
플라스미드 pSW07-87을 각각 하나 또는 2개의 ScGNA1 카세트이 카피를 포함하는 균주 7107-92(1) 및 7107-607(2)로 형질전환하였다. 온도 민감성 선별 및 통과에 따라 카나마이신 민감성 콜로니를 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 rhaBA 결실 사이트에서 T7lac-zwf 카세트의 존재를 확인하기 위해 스크린하였다. PCR에 의해 확인된 여러 균주를 프로브로 zwf 코딩 서열을 포함하는 단편을 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다. 7107-607(2)로부터 유도된 균주를 7107-633으로 명명하고 7107-92(1)로부터 유도된 균주를 7107-634로 명명하였다.
NAG 생산균주에서 천연 프로모터 제어하에 zwf의 과잉 발현
스크린은 천연 프로모터 제어하에서 NAG 생산에 대한 zwf의 과잉 발현의 영향을 평가하기 위해 균주 7107-633 및 7107-634를 포함하였다. 배양액을 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 5g/l 효모 추출물, 10g/l 글루코오스 및 40g/l 락토오스가 보충된 M9B 배지(이전에 기술됨)에서 성장시켰다. 배양액을 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 실험의 잔여부를 위해 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 각 배양액의 pH를 7.2로 조정하고 HPLC 결과에 기초하여 하루에 총 글루코오스를 30g/l으로 첨가하였다. 5g/l (NH4)2SO4를 24 및 48시간에 그 양이 1g/l 이하로 떨어진 경우 플라스크에 첨가하였다. OD 및 NAG 양을 측정하기 위해 24, 48 및 72시간에 샘플을 제거하였다. 그 결과를 표 28에 나타냈다.
천연 프로모터를 갖는 zwf를 과잉 발현하는 균주에서 성장 및 GlcNAc의 생산
균주 설명 OD600 GlcNAc(g/l)
48시간 72시간 48시간 72시간
7107-92(1) 1GNA1 8.5 12.0 9.6 16.0
7107-607(2) 2GNA1 10.0 13.8 10.4 16.3
7107-606(4) 1GNA1;T7lac-zwf 11.5 14.4 11.9 19.7
7107-634(1) 1GNA1;zwf 12.0 13.8 11.6 16.9
7107-634(2) 1GNA1;zwf 10.0 12.6 12.7 21.4
7107-633(1) 2GNA1;zwf 10.0 13.2 10.4 17.8
7107-633(5) 2GNA1;zwf 9.5 12.6 9.8 17.3

결과는 천연 또는 T7 프로모터를 갖는 과잉 발현된 zwf가 세포 성장을 증가시키고 적어도 오탄당 부족을 부분적으로 완화시키는 것으로 나타났다. NAG의 생산은 또한 여러 균주에서 증가하였다. 예를 들면 균주 7107-634(2)가 대조 균주 7107-92(1)보다 약 25% 더 많은 NAG를 생산하였다. 본 실험에서 과잉 발현된 zwf를 갖는 T7lac-ScGNA1 카세트의 2 카피를 갖는 균주는 카세트의 한 카피 및 과잉 발현된 zwf를 갖는 것보다 향상되지 않았다.
1 리터 발효조에서 zwf 유전자를 과잉 발현하는 균주의 평가
다음으로 zwf를 과잉 발현하는 균주를 1-L 발효조에서 평가하였다. 이 결과를 또한 이전에 동일한 조건하에서 구별되는 발효조에서 수행된 균주 7107-92(1)로부터의 결과와 비교하였다. 발효조를 초기 부피 475ml로 준비하였다. 발효조 배 지의 조성이 표 26에 기재되어 있다. 발효는 pH를 6.9로 조절하기 위해 75% NH4OH를 사용하여 수행하였다. 온도는 발효 내내 37℃를 유지하였다. 통기 및 교반을 통해 포화공기 중 20%의 용존 산소 농도를 유지하였다. 접종시 0.40/hr, 최대 속도 6시간에 5ml/hr의 성장 속도를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 배양액을 10시간에 5g/l로 첨가된 푸드 그레이드 락토오스로 유도하고 계속해서 글루코오스를 투입하였다.
발효 결과 균주 7107-606(1)이 특히 초기 시간에 대조 균주보다 더 높은 OD600을 나타내게 된다는 것을 알게 되었다. 이것은 이 균주에서 오탄당 투입이 증가하였기 때문일 것이다. 다른 한편으로 그 천연 프로모터를 갖는 zwf를 과잉 발현하는 균주는 대조 균주와 거의 동일한 OD600로 성장하였다. 본 실험에서 zwf를 과잉 발현하는 어떠한 균주도 GlcNAc 생산에서 대조균주 7107-607(2) 또는 7107-92(1)보다 뛰어나지 않았다. 그러나 발효 조건은 생산 균주 7107-92(1) 및 7107-607(2)을 위해 최적화되었다. 균주를 과잉 발현하는 zwf는 성장 및 NAG 생산에서 충분한 가능성을 나타내기 위해 조금 다른 발효 조건을 필요로 할 수 있다.
< 실시예 26 >
본 실시예에서는 포스포글루코오스 이소머라제(pgi) 유전자의 클로닝, 대장균 염색체로의 T7lac-pgi 카세트의 통합 및 NAG 생산에 대한 pgi 유전자 과잉 발현의 영향을 기술한다.
대장균 pgi 유전자는 글루코오스-6-포스페이트를 프룩토오스-6-포스페이트로의 상호전환을 촉진하는 효소인 포스포글루코오스 이소머라제를 암호화한다. pgi의 과잉 발현은 세포에서 F-6-P의 풀을 증가시킬 수 있고, 더 높은 GlcN/GlcNAc 생산을 유발할 수 있다. 이러한 가능성을 테스트하기 위해 대장균 NAG 생산 배경에서 pgi 유전자를 클로닝하고 과잉 발현하였다.
대장균 pgi의 클로닝 및 과잉 발현
대장균 pgi의 클로닝 및 과잉 발현을 위해 pgi 유전자의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331):1453-1474)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. 대장균 pgi 유전자 코딩 서열의 핵산서열이 서열번호 104에 기재되어 있다. 대장균 PGI 효소의 디듀스된 아미노산 서열이 서열번호 105에 기재되어 있다. 상기 프라이머를 사용하여 대장균 W3110 유전체 DNA로부터 pgi 코딩 서열을 PCR로 증폭하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 포워드 프라이머 07-103 및 리버스 프라이머 07-104이고 그 서열은 다음과 같다: 07-103: 5'-GAT CGG TCT CGC ATG AAA AAC ATC AAT CCA ACG CAG AC-3'(서열번호 106) ; 07-104: 5'-GAT CCT CGA GTT AAC CGC GCC ACG CTT TAT AGC-3'(서열번호 107).
프라이머 07-103은 Bsa I 사이트(GGTCTC, 서열번호 106의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 ATG 개시 코돈(서열번호 106의 뉴클레오타이드 13-38로 표시됨)으로부터 pgi 코딩 서열의 26개 뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머 07-104는 Xho I 사이트(CTCGAG, 서열번호 107의 뉴클레오타이드 5-10으로 표시됨) 및 그 해독 종료코돈(서열번호 107의 뉴클레오타이드 11-33으로 표시됨)으로부터 pgi 코딩 서열의 23개 뉴클레오타이드를 포함한다. 표준 조건하에서 PCR을 수행하여 Bsa I 및 Xho I 제한 엔도뉴클레아제 사이트에 의해 측면으로 접한 pgi 코딩 서열을 포함하는 단편을 생성하였다.
PCR 단편을 제한 엔도뉴클레아제 Bsa I 및 Xho I로 분해하고 벡터 pET24d(+)(Novagen, Inc., Madison, WI)의 Nco I 및 Xho I 사이트에서 라이게이션하여 플라스미드 PKLNO736 및 PKLNO7-37을 생성하였다. 이러한 방법의 클로닝은 pET24d(+)의 T7lac 프로모터의 뒤에 pgi 서열을 배치시키고 T7lac-pgi의 발현 카세트를 생성하였다.
대장균에서 재조합 pgi의 기능적 발현
플라스미드 pKLN07-36을 NAG 생산 균주 7107-92(1)로 형질전환하여 균주 7107-124를 생성하였다. 공벡터 pET24d(+)로 7107-92(1)을 형질전환하여 대조 균주 7107-95를 생성하였다. 표준 유도 프로토콜에 따라 LB에서 세포 배양액을 성장시키고 1mM IPTG로 유도하였다. SDS-PAGE를 위해 유도된 그리고 비유도된 배양액으로부터 샘플을 수거하였다. 그 결과에 의해 PGI 단백질의 예상된 크기에 대응하여 약 62kDa의 단백질의 과잉 생산을 확인하였다. 전체 및 가용성 단백질의 양을 IPTG 유도 후 4시간에 SDS-PAGE에 의해 결정하였다. 7107-124(1) 및 7107-124(2)로부터의 샘플은 62kDa 단백질의 과잉 생산을 나타내 재조합 PGI 단백질의 성공적인 과잉 발현을 나타냈다. 유도된 그리고 비유도된 배양액 모두에서 과잉 생산된 단백질의 존재는 인듀서 없이 pgi 유전자의 누출 발현을 나타낸다. 그러한 단백질 밴드는 대조 균주 7107-95로부터의 샘플에서는 발견되지 않았다. 총 PGI 단백질의 적어도 절반이 가용성 형태인 것으로 나타났다.
유도의 4시간 후, 세포 배양액을 수거하여 포스포글루코오스 이소머라제 활성을 측정하였다. 균주 7107-124(1), 7107-124(2) 및 7107-124(3)는 각각 242, 158 및 215mmol min-1 mg-1 단백질의 PGI 비활성을 보유하는 것으로 나타났고 0.94mmol min-1 mg-1 단백질을 나타내는 대조 균주 7107-95와 비교하였다. 이것에 의해 대조군과 비교할 때 100 내지 200배의 수준에 도달해 성공적인 Pgi 단백질의 과잉 발현을 확인하였다.
대장균 염색체로의 T7lac-pgiA의 통합을 인도하는 벡터의 구축
pgi의 기능적인 발현을 확인한 후 다음 단계는 T7lac-pgi 카세트의 대장균 염색체로의 통합 표적을 결정하는 벡터를 구축하는 것이었다. 통합을 위해 선별된 표적은 대장균 유전체의 araBAD 영역이었다. L-리불로키나제, L-아라비노스 이소머라제 및 L-리불로스-5-P 4-에피머라제 단백질을 암호화하는 araBAD 오페론은 탄소원으로서 L-아라비노스의 이용과 관련된다. 이 단백질들은 오탄당 포스페이트 경로의 중간매개체로서 L-아라비노스를 D-크실룰로스-5-포스페이트로의 전환을 촉진시킨다. L-아라비노스가 NAG 발효 공정에서 탄소원으로 사용되지 않기 때문에 이 사이트에서의 유전자 통합은 세포 성장 또는 NAG 생산에 영향을 끼치지 않을 것 이다.
통합 벡터를 생성하는 첫 번째 단계는 araBAD 오페론을 포함하는 유전체 영역을 클로닝하는 것이었다. 공지된 araBAD 오페론의 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331):1453-1474)에 기초하여 프라이머를 합성하였다. araBAD 영역을 증폭하기 위해 사용된 상기 프라이머는 포워드 프라이머 07-105 및 리버스 프라이머 07-106이고 그 서열은 다음과 같다: 07-105: 5'-GGA TCC TAC CTG ACG CTT TTT ATC GCA ACT C-3'(서열번호 108) ; 07-106: 5'-CGG ACG CAC ATC GGC CTC GTA GAC-3'(서열번호 109).
프라이머 07-105는 araB의 ATG 개시코돈의 상류로 74 염기쌍으로부터 증폭하고 프라이머 07-106은 araD 해독 개시코돈의 하류로 404 염기쌍으로부터 증폭한다. 결과인 araBAD 오페론을 포함하는 4.7-kb PCR 단편을 pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA)로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-38을 생성하였다.
다음 단계는 플라스미드 pKLN07-37로부터 T7lac-pgi 카세트를 플라스미드 pKLN07-38로 첨가하는 것이었다. 포워드 프라이머 07-109 및 리버스 프라이머 07-110을 갖는 플라스미드 pKLN07-37로부터 T7lac-pgi 카세트를 PCR로 증폭하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: 07-109: 5'-GAT TCC GGA AGC AAC CGC ACC TGT GGC-3'(서열번호 110) ; 07-110: 5'-GAT CAC CTG GTT ATA GTT CCT CCT TTC AGC AAA AAA CCC-3'(서열번호 111).
프라이머 07-109는 BspE I 제한 뉴클레아제 사이트(TCCGGA, 서열번호 110의 뉴클레오타이드 4-9로 표시됨)를 포함하고 pET24d(+)의 T7 프로모터의 상류로 80 염기쌍으로부터 증폭한다. 프라이머 07-110은 SexA I 제한 뉴클레아제 사이트(ACCTGGT, 서열번호 111의 뉴클레오타이드 5-11로 표시됨)를 포함하고 pET24d(+)의 T7 프로모터의 하류로 18 염기쌍으로부터 증폭한다. 표준조건하에서 PCR을 수행하여 BspE I 및 SexA I 제한 엔도뉴클레아제 사이트의 측면에 접하는 T7lac-pgi 카세트를 포함하는 단편을 생성하였다. 상기 PCR 단편은 2차로 제한 엔도뉴클레아제 BspE I 및 SexA I로 분해되었다.
플라스미드 pKLN07-38을 제한 엔도뉴클레아제 BspE I 및 SexA I로 분해하고 araB 코딩 서열의 마지막 621 염기쌍, 온전한 araA 코딩 서열 및 araD 코딩서열의 처음 59 염기쌍을 포함하는 2477 염기쌍 단편을 절개하였다. 분해된 T7lac-pgi PCR 단편(이전에 기술함)을 pKLN07-38인 BspE I 및 SexA I로 라이게이션하여 플라스미드 pKLN07-41을 생성하였다. 따라서 플라스미드 pKLN07-41은 결실 사이트에 삽입된 T7-lac-pgi를 갖는 araBAD 오페론의 부분의 2.4kb 결실을 갖는다.
마지막 클로닝 단계를 위해 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I로 플라스미드 pKLN07-41로부터 T7lac-pgi 삽입을 갖는 araBAD 서열을 포함하는 단편을 분해시켰다. 이 단편을 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622)로부터의 온도 민감성 복제단위 및 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터의 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 pKLN07-21로부터 4.2kb의 Sal I/ Not I 단편으로 라이게이션하였다. 상기 결과 플라스미드인 pKLN07-47을 대장 균 염색체의 araBAD 영역으로 pgi의 통합을 조정하는데 사용할 수 있다.
균주 7107-92(1)를 플라스미드 pKLN07-47로 형질전환하였다. 온도 선별 프로토콜을 수행하였다. 표준 조건하에서 염색체에서의 araBAD 결실 사이트에서 T7lac-pgi의 존재를 확인하기 위해 PCR에 의해 카나마이신 민감성 콜로니를 스크린하였다. PCR에 의해 구분된 여러 균주를 프로브로 pgi 코딩 서열을 포함하는 단편을 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다. 이 균주를 7107-136 내지 7107-141로 명명하였다.
균주 7107-136 및 7107-141의 쉐이크 플라스크 평가
균주의 스크린은 NAG 생산에 대한 pgi의 과잉 발현의 영향을 평가하기 위해 균주 7107-136 및 7107-141을 포함하였다. 배양액을 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 5g/l 효모 추출물, 5g/l 리보오스, 10g/l 글루코오스 및 40g/l 락토오스가 공급된 M9B 배지(이전에 기술됨)에서 성장시켰다. 배양액을 30℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고 실험의 잔여부를 위해 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 각 배양액의 pH를 7.2로 조정하고 HPLC 결과에 기초하여 하루에 글루코오스를 총 30g/l으로 첨가하였다. 24 및 48시간에 1g/l 이하로 떨어진 플라스크에 5g/l (NH4)2SO4를 첨가하였다. OD 및 NAG 양을 측정하기 위해 24, 48 및 72시간에 샘플을 제거하였다. 효소 분석을 위해 72시간에 배양액을 수거하였다. 그 결과를 표 29에 나타냈다.
pgi를 과잉 발현하는 균주에서 성장 및 GlcNAc 생산
균주 설명 OD600 GlcNAc(g/l)
48시간 72시간 48시간 72시간
7107-92(1) 1GNA1 12.0 12.0 19.3 30.0
7107-136 1GNA1;T7lac-pgi 12.75 13.5 16.0 27.4
7107-141 1GNA1;T7lac-pgi 13.1 12.4 18.5 29.5

본 실험에서 과잉 발현된 pgi를 갖는 균주에서 유의적인 향상이 나타나지 않았다. 그러나 최적화된 쉐이크 플라스크 또는 발효 조건에서 과잉 발현된 pgi는 성장 및/또는 NAG 생산에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.
1 리터 발효에서 균주 7107-141의 평가
pgi를 과잉 발현하는 균주 7107-141을 1L 발효조에서 평가하였다. 이 결과를 또한 이전에 동일한 조건하에서 구별되는 발효조에서 수행된 균주 7107-92(1)로부터의 결과와 비교하였다. 발효조를 초기 부피 475ml로 준비하였다. 발효조 배지의 조성이 표 3에 기재되어 있다. 발효는 pH를 6.9로 조절하기 위해 75% NH4OH를 사용하여 수행하였다. 온도는 발효 내내 37℃를 유지하였다. 통기 및 교반을 통해 대기중 20%의 용존 산소 농도를 유지하도록 조절하였다. 접종시 0.40/hr, 최대 속도 6시간에 5ml/hr의 성장 속도를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 배양액을 10시간에 5g/l 로 첨가된 급식 등급 락토오스로 유도하고 계속해서 글루코오스를 투입하였다.
쉐이크 플라스크 실험과 유사하게 pgi 유전자를 과잉 발현하는 균주에서 글루코사민 생산의 유의적 향상이 나타나지 않았다. 그러나 이전에 논의한 바와 같이 이 균주들의 최적화 조건 하에서 pgi 과잉 발현은 성장 및/또는 NAG 생산에 긍정적인 영향을 줄 수 있다.
< 실시예 27 >
다음의 실시예는 글리코겐 합성이 glgXCA 유전자의 결실에 의해 차단되는 글루코사민/N-아세틸글루코사민 생산균주의 개발을 기술한다. 또한 글루코사민/N-아세틸글루코사민 생산에 대한 글리코겐 합성 차단의 영향에 대해 보여준다.
세균 세포는 저장된 탄소 보유고의 주요 형태로서 글리코겐을 축적한다. 글리코겐 합성은 세 효소와 관련이 있다: ADP-글루코오스 피로포스포릴라제, 글리코겐 신타제 및 분지효소. 이 효소들은 각각 글루코오스-1-포스페이트로부터 모노사카라이드 도너(ADP-글루코오스)의 합성, (1-4) 글루코오스 중합체를 형성하는 모노사카라이드 단위의 중합 및 사슬에서 (1-6) 분지를 형성하는 이 중합체의 재배치를 촉진한다. 상기 ADP-글루코오스 피로포스포릴라제는 글리코겐 합성에서 중요한 효소이고, 알로스테리 효과기에 의해 강하게 조정된다. 글리코겐 합성 및 분해에 관련된 유전자는 glgB(1,4-알파-글루칸 분지 효소), glgX(글리코실 히드롤라제, 탈분지(debranching) 효소), glgC(ADP-글루코오스 피로포스포릴라제), glgA(글리코겐 신타제) 및 glgP(글리코겐 말토테트라오스 포스포릴라제)를 포함하는 glg 오페론 (glgBXCAP)로 구성된다. 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민 생산 경로로 탄소 유입을 증가시키기 위해 글리코겐 합성 경로는 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민을 생산하는 균주에서 유전자 결실에 의해 차단된다.
다음의 서열의 PCR 프라이머를 glg 오페론으로부터 서열을 클로닝하기 위해 합성하였다. GNglgBXCAP1-5: 5'-GAG TCA TCC GGA TAC AGT ACG CGA-3'(서열번호 112) 및 GNglgBXCAP2-3: 5'-ATA AAC CAG CCG GGC AAA TGG-3'(서열번호 113).
표준 조건을 사용하여 프라이머로 PCR 증폭을 하여 대장균 균주 W3110으로부터 glg 오페론의 5373-bp 단편의 생성을 유발하였다. 증폭된 서열은 glgB로부터 glgP의 범위까지 미친다. PCR 생산물을 pCR®2.1-TOPO®(Invitrogen TOPO TA Cloning Kit, Catalog #K4500-01)로 라이게이션하여 재조합 플라스미드 pCALG18-1을 생성하였다.
pCALG18-1을 플라스미드로부터 glgX의 3'부분, 전체 glgC 및 glgP의 5'부분을 결실시키기 위해 Age I로 분해하였다. 플라스미드의 남은 부분을 재순환시켜 pCALG21-1을 생성하였다. 이 재조합 플라스미드는 절단된 glg 오페론(glgXCAD)을 포함한다.
glgXCAD를 균주를 생산하는 글루코사민 및/또는 N-아세틸글루코사민으로 통합하는데 필요한 플라스미드를 생성하기 위해서 추가로 2개의 공정이 필요하였다. 첫째 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Catalog # 27-4958-01, GenBank Accession # X060404)부터의 Kanr 유전자를 pCALG23-1을 생성하기 위해 pCALG21-1에 첨가하였다. 두 번째 pMAK705(Hamilton, C., et al, 1989, Journal of Bacteriology, 171:9, pp4617-4622)로부터의 온도 민감성 복제 기원을 pCALG23-1에 첨가하여 pCALG28-1을 생성하였다. 첫째 공정을 수행하기 위해 pCALG21-1 및 pUC4K를 모두 BamH I로 분해하였다. BamH I 분해는 glgXCA 결실 사이트의 상류로 pCALG21-1을 선형으로 만들고 pUC4K로부터 Kanr 단편을 방출한다. 선형화된 pCALG21-1 및 Kanr 단편을 라이게이션하여 pCALG23-1을 생성하였다. pCALG28-1을 생성하기 위해 pCALG23-1로부터 Kanr-glgXCAD 단편을 올리고뉴클레오디드 GNTOPO2-5(서열번호 114) 및 GNTOPO3-4(서열번호 115)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. GNTOPO2-5의 서열: 5'-CGC CAA GCT TGG TAC CG-3'(서열번호 114). 프라이머 서열은 pCR®2.1-TOPO®의 230에서 246 뉴클레오타이드와 동일하다. GNTOPO3-4의 서열: 5'-CCC TCT AGA TGC ATG CTC GAG-3'(서열번호 115). 서열은 pCR®2.1-TOPO®의 334에서 354 뉴클레오타이드에 역 상보적이다.
pMAK705로부터 분리된 온도 민감성 복제 기원을 포함하는 Sma I 단편에 상기 PCR 생산물을 라이게이션하였다. 그 결과의 재조합 플라스미드 pCALG28-1은 Kanr, glgXCAD 서열 및 온도 민감성 복제 기원을 포함한다.
내인성 glgBXCAP 서열을 재조합 glgXCAD 서열로 대체함으로써 글리코겐 합성이 고갈된 균주를 생성하였다. pCALG28-1을 대장균 균주 7107-18로 형질전환하고 내인성 glgBXCAP가 pCALG28-1로부터 재조합 glgXCAD로 대체된 클론을 온도 선별 공정을 사용하여 생성하였다. 바람직한 클론을 PCR 스크린에 의해 분리하고 요오드 증기 테스트에 의해 확인하였다. 상기 PCR 스크린에 올리고뉴클레오타이드 GNglgBXCAP3-5(서열번호 136) 및 GNglgBXCAP4-3(서열번호 137)이 사용되었다. GNglgBXCAP3-5의 서열은 다음과 같다: 5'-GGC GGC TTA AAA TGT CCT GAA TG-3'(서열번호 136). 상기 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 GNglgBXCAP1-5(서열번호 112) 및 GNglgBXCAP2-3(서열번호 113)으로부터 생성된 glgBXCAP PCR 단편 5'말단의 상류에 위치한다. GNglgBXCAP4-3의 서열은 다음과 같다: 5'-CGA AAT CAT CGT TGC CAG TAA CTT TAC G-3'(서열번호 137). 상기 프라이머는 올리고뉴클레오타이드 GNglgBXCAP1-5(서열번호 112) 및 GNglgBXCAP2-3(서열번호 113)으로부터 생성된 glgBXCAP PCR 단편 3'말단의 하류에 위치한다.
PCR 스크린에서 2 균주가 glgXCAP 서열에 대한 예상된 크기(2295bp)의 PCR 생산물을 생산하였다. 이 2 균주는 7107-308 및 7107-309로 명명되었다. 상기 균주는 요오드 증기 테스트에 적합하여 이들 균주가 글리코겐을 축적할 수 없음을 보여주었다. 상기 테스트를 수행하기 위해서 7107-18, 7107-308 및 7107-309 세포를 갖는 플레이트를 요오드 결정으로부터 증기에 노출하였다. 단지 균주 7107-18만이 암갈색으로 편하여 글리코겐의 존재를 나타냈다.
글리코겐 결핍 균주에서 NAG 생산을 테스트하는 쉐이크 플라스크 실험
쉐이크 플라스크 스크린으로 glg 결실에 의해 글리코겐 합성이 차단된 균주 를 평가하였다. 균주는 40g/l 글루코오스, 10g/l 리보오스 및 5g/l 효모 추출물이 보충된 M9B 배지에서 성장하였다. glg 결실을 갖는 균주 중에서 흥미로운 차이점이 나타났다. 어떤 glg 결실 균주(예컨대 7107-604)가 대조균주보다 더 잘 자라지만 더 적은 양의 NAG를 생산하였다. 균주 7107-605-1은 대조군에 대해 비교할 만한 성장을 나타냈으나 NAG에서는 12%의 향상만을 가져왔다.
쉐이크 플라스크 실험에서 glg 결실 균주의 성장 및 NAG 생산
균주 OD NAG(g/l)
23시간 47시간 71시간 23시간 47시간 71시간
대조군 7107-92(1) 4.2 10 10.5 6.7 10 10
glg 결실 7107-604(1) 8.4 12 12 6.3 7.1 7.6
7107-604(2) 8.1 12 12.5 6.5 7.7 7.6
7107-605(1) 4.2 10 11.5 6.9 10.4 11.2
7107-605(2) 4.7 10.5 11 6.2 10.3 10.9

< 실시예 28 >
다음 실시예는 2개의 lac I 유전자중 하나의 결실 및 lac 프로모터의 lacUV5 프로모터로의 교체가 글루코오스 억제 및 글루코사민/N-아세틸글루코사민 생산의 완화에 미치는 영향에 대해 기술한다.
배지에서 글루코오스의 존재가 대장균에서 lac 프로모터로부터 발현을 억제하는 것으로 알려져 왔다. lac 오페론은 세 개의 단백질을 암호화한다: LacZ, LacY 및 LacA. lacZ는 락토오스를 글루코오스 및 갈락토오스로 분할하고, 또한 락토오스를 진정한 오페론 인듀서인 알로락토오스로 전환시키는 b-갈락토시타제 효소 를 암호화한다. 알로락토오스는 리프레서(lacI 유전자에 의해 암호화됨)와의 상호작용에 의해 lac 오페론을 유도하고 그것을 lac 오퍼레이터에서 결합하지 못하게 한다. lacY 유전자는 세포로 락토오스의 유입을 제어하는 락토오스 퍼미아제를 암호화한다. lacA 유전자는 대사가 불가능한 피라노시드의 세포 독성을 제거하는 데 도움을 줄 수 있는 효소인 티오갈락토시드 트랜스아세틸라제(갈락토시드 아세틸트랜퍼라제)를 암호화한다.
lac 오페론의 전사는 cAMP 및 그 수용체 단백질(CRP) 사이에 형성된 복합체인 CRP:cAMP 복합체에 의해 lac 프로모터 서열의 결합을 필요로 한다. 글루코오스가 세포에서 cAMP 수준을 감소시킴으로써 lac 오페론을 억제하는 것으로 믿어져 왔다. lacUV5 프로모터는 특정 뉴클레오타이드 변화를 포함하는 lac 프로모터의 돌연변이형이다. 이 변화 때문에 lac 프로모터는 더 이상 전사를 활성화하기 위해 CRP:cAMP 복합체에 의한 결합을 필요로 하지 않는다. 이것은 lacUV5의 제어하에 lac 오페론이 글루코오스 억제에 민감하지 않을 것이라는 것을 암시한다. 따라서 lac 프로모터는 글루코오스 억제를 최소화하기 위해 대장균 균주를 생산하는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민에서 lacUV5 프로모터(여기에서 서열번호 135로 표시됨)에 의해 대체되었다.
균주를 생산하는 어떤 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민은 lacI 리프레서 유전자의 2개의 카피를 보유한다. 하나는 천연 lac 오페론 성분이고 다른 것은 DE3 요소에서 발견된다. 세포 lacI 리프레서 단백질의 양은 억제의 강도에 영향을 주지 않는다. 따라서 lacI 유전자 중 하나의 결실은 글루코사민/N-아세틸글 루코사민 생산의 락토오스 유도에 영항을 주지 않는다.
lac 프로모터의 lacUV5 프로모터로의 대체
균주를 생산하는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민으로 lacUV5를 통합하는 데 사용된 플라스미드 구축에 앞서 여러 전구체 플라스미드를 생성시켰다.
대장균 균주 W3110으로부터 mphRlacIlacZ 단편의 PCR 증폭을 포함하는 첫 번째 전구체 플라스미드의 생성은 올리고뉴클레오타이드 프라이머 GNmphRlacIlacZ1-5(서열번호 116) 및 GNmphRlacIlacZ2-3(서열번호 117)을 사용하여 수행되었다. GNmphRlacIlacZ1-5의 서열은 다음과 같다: 5'-ATT GTG CGC TCA GTA TAG GAA GG-3'(서열번호 116). 또한 GNmphRlacIlacZ2-3의 서열은 다음과 같다: 5'-CGA TAC TGA CGG GCT CCA G-3'(서열번호 117). mphRlacIlacZ 서열을 포함하는 교정된 크기의 PCR 생산물을 pCR®2.1-TOPO®로 클로닝하여 pCALG3-1을 생성하였다.
다음 전구체 플라스미드는 올리고뉴클레오타이드 GNlacdel2-5(서열번호 118) 및 GNlacdel3-5(서열번호 119)를 사용하여 사이트가 인도되는 pCALG3-1의 돌연변이(Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Catalog # 200517)에 기인하였다. GNlacdel2-5의 서열은 다음과 같다: 5'-(인산화된)GCA AAA CCT TTC GCG GTC ACC CAT GAT AGC GCC CG-3'(서열번호 118). 상기 프라이머는 lacI 개시코돈의 BstE II 사이트(서열번호 118의 뉴클레오타이드 15-21로 표현됨) 5'를 추가하기 위해 만들어진 ATGG에서 CACC로의 변화를 제외한 W3110 lacI 서열과 동일하 다. GNlacdel3-5의 서열은 다음과 같다: 5'-(인산화된)CGG GCG CTA TCA TGG GTG ACC GCG AAA-GGT TTT GC-3'(서열번호 119). 상기 올리고핵산서열은 lacI 개시코돈의 BstE II 사이트(서열번호 119의 뉴클레오타이드 15-21로 표현됨) 5'를 추가하기 위해 만들어진 CCAT에서 GGTG로의 변화를 제외한 W3110 lacI 서열에 역 상보적이다.
올리고뉴클레오타이드 GNlacdel2-5(서열번호 118) 및 GNlacdel3-5(서열번호 119)를 사용하여 사이트가 인도되는 pCALG3-1의 돌연변이는 lacI 개시코돈의 BstE II 사이트 5'를 첨가하여 pCALG5-1을 생성하였다. 이 재조합 플라스미드는 pCR®2.1-TOPO®의 백본에서 lacI 개시코돈의 BstE II 사이트 5'를 갖는 mphRlacIlacZ 서열로 구성된다.
다음으로 pCALG5-1을 BstE II와 lacI의 3'서열을 포함하는 단편으로 분해하고 lac 프로모터를 갖는 lacZ 유전자의 부분, pCR®2.1-TOPO® 및 mphR로부터의 서열을 분리하였다. pCALG5-1로부터 분리된 단편을 스스로 라이게이션하여 pCALG10-1을 생성하였다. 재조합 pCALG10-1 플라스미드는 pCR®2.1-TOPO®의 백본에서의 mphR 서열, lacID, lac 프로모터, lacZ 서열을 포함한다.
다음으로 pCALG10-1을 BstE II 및 Nde I로 분해하고 pCR®2.1-TOPO®을 포함하는 단편 및 mphR 서열을 분리하였다. 분리된 pCALG10-1 단편을 이때 2 PCR 생산물로 라이게이션하였다. pCAL610으로부터 생성된 첫 번째 PCR 생산물은 lacZ 개시 코돈의 5'를 즉시 첨가한 Nde I 사이트를 갖는 lacZ 서열을 포함하였다. 표준조건 하에서 PCR 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 GNLacZ1-5(서열번호 120)와 GNLacZ2-3(서열번호 121)을 사용하여 lacZ를 포함하는 pCALG10-1의 부분을 증폭하였다. 상기 GNLacZ1-5의 서열은 다음과 같다: 5'-CAC AGG AAA CAC ATA TGA CCA TGA TTA CGG-3'(서열번호 120). 상기 프라이머 서열은 Nde I사이트(서열번호 120의 뉴클레오타이드 12-17)를 첨가하는 G1932C 및 C1933A 뉴클레오타이드 변화를 제외하고 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 1921에서 1950과 동일하다. GNLacZ2-3의 서열은 다음과 같다: 5'-CCA CCA TGA TAT TCG GCA AGC AG-3'(서열번호 121). 상기 서열은 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 6523에서 6545에 역상보적이다.
표준 조건 하에서 PCR 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 GNLacuv53-5(서열번호 122)과 GNLacuv54-3(서열번호 123)를 사용하여 2차 PCR 생산물인 균주 7107-17(DE3)의 lacUV5 프로모터를 증폭하였다. GNLacuv53-5의 서열은 다음과 같다: 5'-CCT TTC GCG GTC ACC AGC AAA-3'(서열번호 122). 상기 서열은 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 1253 내지 1273과 동일하고 lacI 내의 내인성 BstE II 사이트(서열번호 122의 핵산서열 9 내지 15로 표시됨)를 둘러싼다. GNLacuv54-3의 서열은 다음과 같다: 5'-CCG TAA TCA TGG TCA TAT GTG TTT CCT GTG-3'(서열번호 123). 상기서열은 Nde I 사이트(서열번호 123의 뉴클레오타이드 14-19로 표시됨)를 첨가하는 C1932G 및 G1933T 뉴클레오타이드 변화를 제외하고 pCALG10-1(lac 프로모터/lacZ 교차(junction))의 1921에서 1950 뉴클레오타이드에 역상보적이다.
PCR로 생성된 lacUV5 프로모터 단편을 Nde I가 추가된 BstE II로 분해하고 정제하였다. 동일하게 lacZ 서열을 포함하는 PCR 생산물을 Nde I로 분해하고 정제하였다. 다음 전구체 플라스미드를 생성하기 위해서 pCALG10-1로부터의 mphR 단편(NdeI-BstE II), lacUV5 프로모터 단편(BstE II-Nde I) 및 lacZ 단편(NdeI-Nde I)을 함께 라이게이션시켰다. 그 결과 재조합 플라스미드인 pCALG16-3은 벡터 pCR®2.1-TOPO®에서 mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터, lacZ 서열(서열의 천연형태와 반대 순서임)을 포함한다. pCALG16-3의 정확한 lacUV5 프로모터 서열을 시퀀싱에 의해 확인하였다.
그 다음 pCALG10-1에서 lacZ 단편을 표준 조건 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머 GNlacZ1-5(서열번호 120)과 GNlacZ3-3(서열번호 124)을 사용하여 PCR로 증폭하였다.
GNlacZ3-3의 서열은 다음과 같다: 5'-GAC GAA GCG GCC GCG TAA ACG-3'(서열번호 124). 상기 서열은 Not I 사이트(서열번호 124의 뉴클레오타이드 7에서 14로 표시됨)를 첨가하는 T3625C, C3626G 및 C3630G 뉴클레오타이드 변화를 제외하고 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 3618 내지 3638의 역상보적이다.
lacZ PCR 단편을 Nde I 및 Not I로 분해하고 분리하였다. 추가적으로 pCALG16-3을 Nde I에서 Not I 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함하는 단편으로 분해하고 mphR, lacID 및 lacUV5 프로모터로부터의 서열을 분리하였다. lacZ PCR 단편과 pCR®2.1-TOPO®, mphR, lacID로부터의 서열을 포함하는 pCALG16-3 단편 및 lacUV 프 로모터를 함께 라이게이션하여 pCALG20-1을 생산하였다. 재조합 pCALG20-1 플라스미드는 pCR®2.1-TOPO®, mphR, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시 코돈의 5'으로 즉시의 Nde I 사이트를 보유)의 서열 및 5'에서 3'방향의 lacZ 코딩 영역을 포함한다.
이전에 구축된 pCALG3-1을 pCALG20-1과 함께 사용하여 다음 전구체 플라스미드를 생산하였다. pCALG3-1와 pCALG20-1 양자 모두를 Apa I로 분해하였다. lacUV5 프로모터 및 lacZ 서열을 포함하는 pCALG20-1 단편과 pCR®2.1-TOPO®, mphR 서열 및 전체 길이의 lacI를 포함하는 pCALG3-1 단편을 분리하고 함께 라이게이션하여 pCALG22-1을 생산하였다. 재조합 pCALG22-1은 mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈 5'으로 즉시의 Nde I 사이트를 보유), lacZ 서열 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함한다.
pCALG22-1 및 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Catalog # 27-4958-01, GenBank Accession # X06404)를 사용하여 다음 전구체 플라스미드를 생성하였다. pCALG22-1 및 pUC4K를 BamH I로 함께 분해하였다. mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터, lacZ 서열 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함하는 pCALG22-1 단편과 Kan r을 포함하는 pUC4K 단편을 분리하고 함께 라이게이션하여 pCALG25-1을 생성하였다. 재조합 pCALG25-1은 Kanr, mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터(lacZ 개 시코돈 5'으로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함한다.
다음 전구체 플라스미드를 생성하기 위해 pCALG25-1 및 pKLN07-20(어디선가 기술함)을 Kpn I 및 Not I로 분해하였다. Kanr, mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터 및 lacZ 서열을 포함하는 pCALG25-1 단편과 pMAK705(이전에 기술함)로부터 온도 민감성 복제 기원을 포함하는 pKLN07-20 단편을 분리하고 함께 라이게이션하여 pCALG29-1을 생성하였다. 재조합 pCALG29-1 플라스미드는 Kanr, mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pMAK705로부터의 온도 민감성 영역을 포함한다.
pCALG29-1을 구축한 후, 이것이 최종 통합 벡터일 것으로 생각하였다. 그러나 이어서 lacZ 개시 코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트의 첨가가 lacZ의 적합한 발현을 저지한다는 것을 발견하였다. 따라서 pCALG29-1은 사이트가 인도되는 돌연변이 유발(Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Catalog # 200517)이 용이하여 Nde I 사이트를 파괴하고 Nde I 뉴클레오타이드 변화를 내인성 lacUV5 뉴클레오타이드로 대체하였다. pCALG29-1로의 필요한 변화를 만들기 위해 pCALG29-1을 올리고뉴클레오타이드 GNlacZ-Ndel(서열번호 125) 및 GNlacZ-Nde2(서열번호 126) 사이트가 인도되는 돌연변이 유발이 용이하게 하고 pCALG31-1을 생산하였다.
GNlacZ-Ndel의 핵산서열은 다음과 같다: 5'-CAC ACA GGA AAC AGC TAT GAC CAT GAT TAC GGA TTC-ACT GG-3'(서열번호 125). 상기 서열은 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 1919 내지 1959와 동일하다. GNlacZ-Nde2의 핵산서열은 다음과 같다: 5'-CCA GTG AAT CCG TAA TCA TGG TCA TAG CTG TTT CCT G-TGT G-3'(서열번호 126). 상기 서열은 pCALG10-1의 뉴클레오타이드 1919 내지 1959에 역상보적이다.
상기 결과의 재조합 pCALG31-1 플라스미드는 Kanr, mphR 서열, 전체 길이의 lacI, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 내인성 뉴클레오티드를 보유함), lacZ 서열 및 pMAK705로부터의 온도 민감성 영역 기원을 포함한다.
재조합 pCALG31-1을 7107-18로 형질전환하고 온도 선별 공정을 사용하여 lacUV5 프로모터의 대체를 갖는 클론을 생성하였다. 정확한 클론을 확인하기 위해 유전체 DNA를 준비하고 lacUV5 프로모터 영역을 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 생산물을 lacUV5 프로모터의 존재를 확인하기 위해 시퀀싱하였다. 하나의 균주가 예상된 크기의 PCR 생산물을 생성하였고 정확한 DNA 서열을 보유하였다. 이 균주를 7107-310으로 명명하였다.
LacI 결실 및 lac 프로모터의 lacUV5 프로모터로의 대체
lac 오페론으로부터 lacI을 결실시키는데 필요한 플라스미드를 생성하고 균주를 생산하는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민에서 lac 프로모터를 lacUV5 프로모터로 교체하기 위해서 2개의 전구체 플라스미드를 개발하였다. 1차 전구체 플라스미드를 생성하기 위해 pCALG20-1(상기 참조) 및 pUC4K(Amersham Parmacia Biotech, Catalog # 27-4958-01, GenBank Accession # X06404)를 BamH I로 분해시켰다. mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함하는 pCALG20-1 단편 및 Kan r을 포함하는 pUC4K 단편을 분리하고 함께 라이게이션하여 pCALG26-1을 생성하였다. 재조합 pCALG26-1은 Kanr, mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pCR®2.1-TOPO®를 포함한다.
다음 전구체 플라스미드를 생성하기 위해, pCALG26-1 및 pKLN07-20(다른 곳에 기술됨)을 Kpn I 및 Not I로 분해하였다. Kanr, mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함) 및 lacZ 서열을 포함하는 pCALG26-1 단편과 pMAK705(이전에 기술함)로부터 온도 민감성 복제 기원을 포함하는 pKLN07-20을 분리하고 함께 라이게이션하여 pCALG30-1을 생성하였다. 재조합 플라스미드 pCALG30-1은 Kanr, mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pMAK705로부터 온도 민감성 복제 기원을 포함한다.
pCALG30-1을 구축한 다음 그것이 최종 통합 벡터인 것으로 생산되었다. 그러나 이어서 lacZ 개시 코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트의 첨가가 lacZ의 적합한 발현을 저지한다는 것을 발견하였다. 따라서 pCALG30-1은 사이트가 인도되는 돌연 변이 유발(Stratagene® QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit, Catalog # 200517)을 용이하게 하여 Nde I 사이트를 파괴하고 Nde I 뉴클레오타이드 변화를 내인성 lacUV5 뉴클레오타이드로 교체하였다. pCALG30-1로의 필요한 변화를 만들기 위해 pCALG30-1을 올리고뉴클레오타이드 GNlacZ-Ndel(서열번호 125) 및 GNlacZ-Nde2(서열번호 126) 사이트가 인도되는 돌연변이에 구속시키고 pCALG31-1을 생산하였다. 그 결과인 재조합 pCALG32-2 플라스미드는 Kanr, mphR 서열, lacID, lacUV5 프로모터(lacZ 개시코돈의 5'로 즉시의 Nde I 사이트를 보유함), lacZ 서열 및 pMAK705로부터 온도 민감성 복제 기원을 포함한다.
재조합 pCALG32-2을 7107-18로 형질전환하고 온도 선별 공정을 사용하여 lacUV5 프로모터의 대체를 갖는 클론을 생성하였다. 정확한 클론을 확인하기 위해 유전체 DNA를 준비하고 lacUV5 프로모터 영역을 PCR로 증폭하였다. 상기 PCR 생산물을 lacUV5 프로모터의 존재를 확인하기 위해 시퀀싱하였다. 세개의 균주가 예상된 크기의 PCR 생산물을 생성하였고 정확한 DNA 서열을 보유하였다. 이 균주를 7107-313, 7107-314 및 7107-315로 명명하였다.
DE3 요소로부터 LacI의 결실
DE3 요소로부터 생산균주의 유전체에서 lacI 유전자를 결실시키기 위해 실시예 13에서 기술한 온도 민감성 선별 방법을 사용하였다. 이 방법은 lacI 결실을 위한 DE3 요소를 표적으로 결정하는 통합 벡터의 구축에 관계된다. 구축의 1차 단 계로서 DE3 요소의 lacI를 포함하는 영역을 대장균 7107-73 유전체 DNA으로부터 PCR로 증폭하였다. 프라이머를 대장균 유전체의 T7 RNAP 및 attB 영역의 공지된 서열(Blattner et al, 1997, Science 277(5331): 1453-1474)에 기초하여 합성하였다. 포워드 프라이머 07-74 및 리버스 프라이머 07-48을 사용하여 증폭하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다: 07-74: 5'-GAT CCC GGG AAC GGA CGA TTA GAG ATC ACC-3'(서열번호 127); 07-48: 5'-GTC AGA GAA GTC GTT CTT AGC GAT G-3'(서열번호 128).
포워드 프라이머 07-74는 Sma I 사이트(CCCGGG, 서열번호 127의 뉴클레오타이드 4-9)를 첨가하고 대장균 유전체의 attB 사이트의 상류로 1194 염기쌍으로부터 증폭하였다. 리버스 프라이머 07-48은 T7 유전자 1 ATG 개시 코돈의 상류로 36 염기쌍으로부터 증폭하였다. 결과물인 ~3.2kb PCR 단편을 벡터 pPCR-ScriptTMSK(+)(Stratagene Clonging Systems, La Jolla, CA)로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-53 #7 및 #17을 생성하였다. DNA 시퀀싱은 PCR 단편이 DE3 요소로부터 lacI lacZ' 단편에 추가된 attB 사이트의 상류의 유전체 영역을 포함한다는 것을 나타냈다.
lacI 결실을 생성하기 위해 플라스미드 pSW07-53 #17을 제한 엔도뉴클레아제 Mlu I 및 Sfo I로 분해하고 lacI 코딩 서열의 640 염기쌍 단편을 제거하였다. pSW07-53 플라스미드의 잔여부를 T4 DNAP로 처리하여 무딘 말단을 생산하고 스스로 라이게이션하여 플라스미드 pSW07-55#13을 생성하였다.
lacI 결실을 갖는 DE3 서열을 포함하는 단편을 플라스미드 pSW07-55#13으로부터 제한 엔도뉴클레아제 Not I 및 Sal I로 분해하였다. 이 단편을 pMAK705(Hamilton et al., 1989, J. Bac. 171(9): 4617-4622)로부터의 온도 민감성 복제단위 및 pUC4K(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)로부터의 카나마이신 저항성 카세트를 포함하는 pKLN07-21의 4.2kb Sal I 및 Not I 단편으로 라이게이션하였다. 그 결과 플라스미드 pKLN07-56#13을 사용하여 대장균 염색체에 DE3 요소의 lacI의 결실을 생성하였다.
DE3 요소의 lacI 결실을 갖는 균주를 생성하기 위해 대장균 7107-18을 플라스미드 pSW07-56#13으로 형질전환하였다. 온도 민감성 선별 및 통과 프로토콜을 따라 균주를 결실이 존재하도록 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 스크린하였다. PCR에 의해 확인된 여러 균주를 DE3 요소의 lacI 및 lacZ의 부분을 포함하는 단편을 프로브로 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다. 이 균주를 7107-84(1) 내지 7107-84(4)로 명명하였다.
쉐이크 플라스크에서 lacID 및/또는 lacUV5 프로모터의 대체를 갖는 균주에서의 글루코사민 생산
균주 7107-84(1)는 2개의 기능적 lacI 유전자를 갖는 균주 7107-18에 반대되는 단지 하나의 기능적 lacI 유전자를 포함한다. 쉐이크 플라스크 스크린 42를 수행하여 균주 7107-84(1)의 lacI 결실의 락토오스 유도에 대한 영향을 측정하였다. 초과 글루코오스 및 락토오스의 존재에서 락토오스에 의한 유도는 lac 오퍼레이터 에 결합하는 LacI 리프레서 단백질에 의해 균주 7107-18에서 억제되어 전사를 방해한다. 더 적은 LacI 리프레서 단백질이 lac 오퍼레이터를 결합하기 위해 존재하기 때문에 글루코오스에 의한 이 억제는 균주 7107-84(1)에서 감소되어 lac 프로모터로부터 전사를 증가시킨다. 이것은 세포에서 T7 RNAP의 풀을 증가시켜 T7lac-glmS*54 카세트로부터 전사의 증가를 유발한다. 결국 많은 양의 글루코사민은 균주 7107-84(1)를 유발한다. 또한 lacI 결실을 포함하는 균주에서도 lac 오페론(예컨대 7107-313, 7107-314 및 7107-315)은 락토오스 유도에 의해 더 많은 양의 GlcN을 생산할 것이다.
lac 오페론(7107-310)으로부터 결실된 lac I 유전자, DE3 요소(7107-84#1)로부터 결실된 lac I 유전자 및 lac 프로모터가 lavUV5 프로모터(7107-313, 7107-314 및 7107-315)로 대체된 lac 오페론으로부터 lacI 결실을 갖는 대장균 균주를 쉐이크 플라스크 실험에서 균주 7107-18과 비교하였다. 모든 균주를 M9B 배지를 포함하는 플라스크에서 성장시켰다: 0.6g/l MgSO4-7H2O와 0.05g/l CaCl2-2H 2O가 보충된 6g/l KH2PO4, 24g/l K2HPO4, 1g/l Na3Citrate-2H 2O, 10g/l (NH4)2SO4(pH 7.4로 조정된 포스페이트) 및 미량 금속(0.2mg/l FeSO4-7H2O, 0.015mg/l ZnSO4-7H2 O, 0.015mg/l MnSO4-H2O, 0.001mg/l CuSO4-5H2O, 0.001mg/l NaMoO4 -2H2O, 0.001mg/l H3BO3 및 0.001mg/l CoCl2-6H2O). 글루코오스 억제를 테스트하기 위해 플라스크가 다양한 양의 글루코오스 및 락토오스를 포함하였다. 플라스크에서 사용된 글루코오스 및 락 토오스의 양을 표 4 및 표 5에 나타냈다. 배양액을 225rpm으로 쉐이킹하며 30℃에서 24시간동안 성장시키고 실험의 남은 부분을 위해서 225rpm으로 쉐이킹하며 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 각각의 배양액을 pH 7.0으로 조정하고 글루코오스를 약 30g/l로 플라스크에 첨가하고 암모니아 수준이 1g/l 이하로 떨어진 경우 배양액에 5g/l의 (NH4)2SO4을 첨가하였다. 24 및 48시간에 샘플을 채취하였다. 각각의 시간에서 배양 상청액에서 글루코사민의 농도를 미국 특허 제 6372457 B1 호에 기술된 조정된 Elson-Morgan 분석을 사용하여 측정하였다. 글루코사민 양을 표 31에 나타냈다.
예상한 것처럼 균주 7107-18, 7107-84(1), 7107-310 및 7107-313을 글루코오스 단독 또는 락토오스 단독인 상태에서와 유사하게 수행하였다. 글루코오스에서 성장하였을 때 인듀서가 없기 때문에 어떠한 균주에서도 GlcN 생산이 거의 발견되지 않았다. 인듀서로서 락토오스로 균주를 성장시켰을 때 양 균주에서 유의적으로 글루코사민이 축적되었다. 그러나 균주를 글루코오스 및 락토오스 모두의 존재하에 성장시켰을 때 염색체로부터 lacI 유전자의 하나의 카피의 제거가 유의적으로 락토오스 유도에 영향을 주어 글루코사민 역가에 영향을 주었다. 균주 7107-313 및 7107-84(1)은 48시간에 균주 7107-18에서 관찰된 글루코사민 양의 약 6 내지 8배의 수준을 나타냈다. 이것은 LacI 리프레서 단백질의 감소가 lac 프로모터로부터의 전사를 증가시켜 글루코사민 생산량의 증가를 유발한다는 것을 확인시킨다.
쉐이크 플라스크 스크린 42로부터 여러 샘플에서의 글루코사민 농도
균주명 유전자형 글루코오스
(g/l)		 락토오스
(g/l)		 글루코사민 농도(g/l)
24시간 48시간
7107-18 galKΔ::T7-lac-glmS*54 0 40 1.5 4.3
30 0 0 0.2
30 20 0.1 0.4
7107-84#1 galKΔ::T7-lac-glmS*54, DE3 요소에서의 laclΔ 0 40 1.7 4.9
30 0 0 0.2
30 20 0.8 3.2
7107-310 galKΔ::T7-lac-glmS*54, lac UV5 프로모터 0 40 1.8 4.4
30 0 0.3 0.2
30 20 0.3 0.4
7107-313 galKΔ::T7-lac-glmS*54, lacUV5 프로모터, lac 오페론에서의 lacΔ 0 40 1.6 4.2
30 0 0 0.2
30 20 0.7 2.3

lacID 및/또는 lacUV5 프로모터의 대체를 갖는 균주에서 T7lac-ScGNA1 카세트의 통합
NAG 생산 균주에서 글루코오스 탈억제에 대한 lacI 결실의 영향을 평가하기 위해 균주 7107-84(1) 및 7107-84(2)의 염색체에 T7lac-ScGNA1 카세트를 첨가할 필요가 있었다. GNA1 클로닝 및 플라스미드 pSW07-68#5를 갖는 온도 민감성 선별에 의한 통합을 위해 기술된 방법 및 프로토콜이 여러 곳에서 상세하게 사용되고 있다. 결과인 균주 7107-97 및 7107-98을 통합된 염색체의 manXYZ 결실 사이트에서 통합된 T7lac-ScGNA1을 갖는 ScGNA1 코딩 서열을 프로브로 사용하여 높은 엄격성 서던 혼성화에 의해 확인하였다.
유사하게 잠재적인 글루코오스 탈억제된 균주의 다른 형(version)을 구축하였다. 균주 7107-310을 lac 오페론의 프로모터를 프로모터의 lacUV5 형으로 변이함으로써 구축하였다. 균주 7107-313, 7107-314 및 7107-315를 lac 오페론의 프로모터를 프로모터의 lacUV5형으로 변이하는 것에 추가하여 lacI 유전자의 염색체 카피를 결실시킴으로써 구축하였다. NAG 생산 배경에서 글루코오스 탈억제에 대한 이 돌연변이의 영향을 평가하기 위해 T7lac-ScGNA1 카세트를 균주의 염색체에 추가하였다. GNA1 클로닝 및 플라스미드 pSW07-68#25를 갖는 온도 민감성 선별에 의한 통합을 위해 기술된 방법 및 프로토콜을 균주 7107-310 및 7107-313에 적용하였다. 그 결과 균주 7107-129 및 7107-130(균주 7107-310으로부터의) 및 7107-131(균주 7107-313으로부터의)이 ScGNA1 코딩 서열을 갖는 높은 엄격성 서던 혼성화를 프로브로 사용하여 염색체의 manXYZ 결실 사이트에 의해 통합된 T7lac-ScGNA1을 갖는 것으로 확인하였다.
쉐이크 플라스크에서 lacID 및/또는 lacUV5 프로모터 대체를 갖는 균주에서 N-아세틸글루코사민의 생산
NAG 생산 균주에서 글루코오스 탈억제에 대한 DE3의 lacI 결실의 영향을 평가하기 위해 스크린을 수행하였다. 균주 7107-97 및 7107-98(2)를 다양한 양의 글루코오스 및 락토오스로 리보오스의 첨가 여부에 따라 테스트하였다. lacI의 2 카피를 갖는 NAG 생산 균주 7107-92(1)을 대조군으로서 포함하였다. 0.6g/l MgSO4- 7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 다양한 농도의 글루코오스와 락토오스 및 5g/l 효모 추출물이 보충된 M9B 배지(이전에 기술함)에서 배양액을 성장시켰다. 균주는 글루코오스가 고갈되면 락토오스 사용에 대한 스위치를 갖는 10g/l의 글루코오스에서 초기에 성장하였다. 초과 글루코오스 조건(락토오스의 존재하에서)은 또한 글루코오스 억제에 대한 민감도를 측정하는 데 사용되었다. 각 변수는 리보오스의 첨가 여부에 따라 얻어졌다. 배양액을 30℃에서 24시간동안 성장시키고 실험의 잔여부를 위해 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 각각의 배양액을 pH 7.0으로 조정하고 글루코오스를 약 30g/l로 플라스크에 첨가하였다. 암모니아 양이 1g/l 이하가 된 경우 배양액에 5g/l의 (NH4)2SO4을 첨가하였다. 24, 48 및 72시간에 샘플의 NAG 생산에 대해 분석하였다.
대조 균주를 비억제 조건에서 수행하여 20g/l 이상의 NAG를 생산하였으나 과량의 글루코오스를 갖는 단지 약 5g/l을 생산하였다(표 32 참조). 하나의 돌연변이 균주(7107-98)를 대조군과 유사하게, 다른 하나(7107-97)는 글루코오스 저항성을 나타나게 수행하여 초과 글루코오스가 존재할 때 20g/l의 NAG를 생산하였다. 실제 이 균주는 NAG 생산 및 아세테이트 축적에 대한 비억제 조건하에서 대조군보다 더 잘 수행하는 것으로 나타났다. 배양액에 리보오스의 첨가는 본 실험에서 성장 또는 NAG 역가의 유의적인 증가를 나타내지 않았다. 전체 결과는 DE3 요소의 lacI의 결실이 적어도 부분적으로 글루코오스 억제를 완화하여 생산 균주에서 NAG 역가의 향상을 유발한다는 것을 나타낸다.
다양한 양의 글루코오스 및 락토오스의 존재하에 글루코오스 탈억제에 대한 DE3 요소의 lacl 결실의 영향
균주 초기 당(g/l) OD600 아세테이트(g/l) NAG(g/l)
글루코오스 락토오스 리보오스
7107-92(1) (대조군) 10 40 5 9.8 0 20.9
30 20 5 14.0 6.2 5.0
40 20 5 12.0 6.2 4.5
7107-97 10 40 5 15.0 0 26.2
30 20 5 15.5 0 25.4
40 20 5 14.0 2.6 21.7
7107-98(2) 10 40 5 16.0 4 14.2
30 20 5 15.0 9.4 7.7
40 20 5 14.5 10.1 8.0
7107-92(1) 10 40 없음 10.5 0 17.6
30 20 없음 14.5 6.4 5.7
40 20 없음 14.5 6.9 5.7
7107-97 10 40 없음 12.5 3.4 16.2
30 20 없음 14.5 0 24.5
40 20 없음 15.5 0 21.9
7107-98(2) 10 40 없음 14.5 7.3 12.0
30 20 없음 14.0 7.8 7.7
40 20 없음 14.5 9.0 7.3
1) 균주: 대조군 7107-92(1): 2개의 lacI 유전자.
7107-97 및 7107-98(2): 단지 하나의 lacI 유전자(DE3에서 하나만 결실됨)
2) OD600, 아세테이트 양 및 NAG 양은 72시간부터이다.
글루코오스 비억제에 대한 균주 7107-129, 7107-130 및 7107-131을 평가하기 위해 또 다른 스크린을 수행하였다. lacI의 2 카피를 갖는 NAG 생산 균주 7107- 92(1)을 대조군으로 포함하였다. 배양액을 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2 -2H2O, 다양한 농도의 글루코오스와 락토오스, 5g/l 리보오스 및 5g/l 효모 추출물이 공급된 M9B 배지(이전에 기술함)에서 성장시켰다. 균주는 글루코오스가 결실되면 락토오스 사용에 대한 스위치를 갖는 10g/l의 글루코오스에서 초기에 성장하였다. 유도에 관한 글루코오스의 민감도를 측정하기 위해 글루코오스가 항상 존재하는 초과 글루코오스 조건(락토오스의 존재하에서)을 균주 7107-131을 테스트하는데 사용되었다. 배양액을 30℃에서 24시간동안 성장시키고 실험의 잔여부를 위해서 25℃를 유지하였다. 24 및 48시간에 각각의 배양액을 pH 7.2로 조정하고 글루코오스를 하루에 약 30g/l로 플라스크에 첨가하였다. 암모니아 수준이 1g/l 이하로 떨어진 경우 배양액에 24시간 및 48시간에 5g/l의 (NH4)2SO4을 첨가하였다. 24, 48 및 72시간에 샘플의 NAG 생산에 대해 분석하였다.
표 33에 나타난 바와 같이 lacUV5 돌연변이 균주(7107-130)의 하나 및 lacI 결실(7107-131)을 갖는 lacUV5 돌연변이 균주가 글루코오스 고갈 후 락토오스에 대한 스위치를 갖는 글루코오스에서 초기에 성장할 때 대조균주 7107-92(1)보다 더 잘 수행하였다. 초과 글루코오스 조건에서 균주 7107-131은 대조 균주 7107-92(1)보다 더 잘 수행하여 30% 이상의 NAG를 생산하였다. 이것은 어떤 lacI 카피의 결실이 글루코오스 억제의 완화를 도와 초과 글루코오스 존재에서 유도를 유발하고 NAG 역가를 향상시킨다는 것을 나타낸다.
글루코오스 제한 또는 과잉 조건 하에서 NAG 생산에 대한 lacl 결실 및/또는 lacUV5 프로모터의 영향
균주
 초기 당(g/l) OD600 아세테이트
(g/l)		 NAG(g/l)
글루코오스 락토오스
글루코오스
제한 조건		 7107-92(1) 10 40 9.75 2.4 24.3
7107-129 10 40 9.75 2.0 23.3
7107-130 10 40 11.25 3.0 30.4
7107-131 10 40 11.25 2.2 31.6
글루코오스
과잉 조건		 7107-92(1) 40 10 12.75 6.4 5.3
40 20 13.5 6.5 5.8
7107-131 40 10 15.0 5.7 15.4
40 10 13.87 6.0 14.2
40 20 15.75 4.0 21.0
40 20 14.25 5.0 18.6
1) 균주: 대조 균주 7107-92(1): lacI(lac), lacI(DE3)
7107-129, 7107-130: lacUV5, lacI(lac), lacI(DE3)
7107-131: lacUV5, lacIΔ(lac), lacI(DE3)
2) OD600, 아세테이트 양 및 NAG 양은 72시간부터이다.
< 실시예 29 >
다음 실시예는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민 축적에 대한 갈락토오스 사용의 반환 효과에 대해 보여준다.
galKΔ::T7-lac-glmS*54 구성을 포함하는 균주를 생산하는 락토오스가 유도된 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민은 galKΔ 때문에 갈락토오스를 탄소원 으로 사용할 수 없다. 이 균주는 b-갈락토시다제에 의해 락토오스가 글루코오스 및 락토오스로 분할되기 때문에 갈락토오스를 축적한다. 이 균주에서 갈락토오스의 축적을 감소시키기 위해 T7-lac-glmS*54 발현 카세트는 다른 염색체 위치로 통합될 필요가 있다. 이전에 구축된 균주를 생산하는 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민은 nagΔ::Tetr을 포함한다. 상기 유전체의 nagΔ::Tetr 부분은 부모 균주 IBPC590(Plumbridge(1991) Mol. Microbiol. 5, 2053-2062)로부터 미국 특허 제 6,372,457 B1호에 기술된 P1 파지 형질도입에 의해 운반하였다. 생산 균주에서 Tetr의 존재는 바람직하지 않다. 따라서 T7-lac-glmS*54로의 Tetr의 대체는 T7-lac-glmS*54에 대한 통합 사이트로 작용할 뿐만 아니라 동일한 공정에서 Tetr을 제거할 수 있다.
균주 7107-18(실시예 7에서 이전에 기술함)을 생산하기 위한 ΔgalkT7-lac-glmS*54 구조의 7107-17(DE3)으로의 통합은 글루코사민 생산에서 유의적인 증가를 유발했다. 또한 manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1 구성의 7107-18로의 통합은 실시예 16에서 기술한 N-아세틸글루코사민의 생산을 유발하였다. 갈락토오스를 대사할 수 있는 N-아세틸글루코사민 생산 균주를 개발하기 위해, T7-lac-glmS*54 발현 카세트를 nagD::Tetr 사이트에서 통합하고 뒤이어 manXYZ 사이트에서 T7-lac-ScGNA1 발현 카세트의 삽입하였다.
nagΔ::T7-lac-glmS*54 및 manXYZΔ::T7-lac-ScGNA1을 포함하는 균주의 구축에 관련된 상기 단계는 세 개의 전구체 플라스미드의 생성을 포함하였다. 첫 번째 전구체 플라스미드를 생성하기 위해 pKLN23-54(미국 특허 제 6372457 B1호에 기술됨)로부터의 T7-lac-glmS*54 단편을 올리고뉴클레오타이드 프라이머 GNglmSnagE3-5(서열번호 129) 및 GNglmSnagE4-3(서열번호 130)을 갖는 표준 조건 하에서 PCR로 증폭하였다.
GNglmSnagE3-5: 5'-GGA TCT AAA CCT CAG TAG CGA CCG GTC TAG AAC TA-GTG-3'(서열번호 129) 상기 프라이머는 다음의 예외를 갖는 pKLN23-54의 1109 내지 1146과 동일하다: C1115A, C1116A, G1120T, G1122A, G1125A, G1129A 및 C1133G. pKLN23-54의 뉴클레오타이드 1115 내지 1125에서의 변화(서열번호 129의 뉴클레오디드 8, 12, 14, 17, 21 및 25에 대응함)는 PCR에서 프라이머의 안정성을 증가하도록 하였고 pKLN23-54의 1129 및 1133의 변화는 서열번호 129(서열번호 129의 위치 21에서 26으로 표시됨)에 Age I 사이트를 첨가하도록 하였다.
GNglmSnagE4-3: 5'-CCC TCG CCC CTC TAG AGC ATT TAA ATT CAG TCA ATT-AC-3'(서열번호 130). 상기 프라이머는 다음의 예외를 갖는 pKLN23-54의 뉴클레오타이드 3237 내지 3274에 역상보적이다: T3251A, G3253T, G3256A, A3270C 및 T3273C(각각 서열번호 130의 위치 24, 22, 19, 5 및 2로 표시됨). 3251 내지 3256에서의 변화는 Swa I 사이트(서열번호 130의 위치 19 내지 26으로 표시됨)을 첨가하도록 하였고, 3270 및 3273에서의 변화는 PCR에서 프라이머의 안정성을 증가시키도록 하 였다.
그 결과 PCR 생산물을 pCR®-BluntII-TOPO®(Invitrogen Zero Blunt® TOPO ® PCR Cloning Kit, Catalog #K2800-20)로 라이게이션하였다. 재조합 플라스미드 pCALG38-2는 Age I 사이트 및 Swa I 사이트에 의해 측면이 접한 T7-lac-glmS*54 발현 카세트를 포함한다.
2차 전구체 플라스미드를 생성하기 위해 nagΔ::Tetr::asn 단편을 PCR에 의해 GNnagEtetR1-5(서열번호 131) 및 GNnagEtetR2-3(서열번호 132)를 사용하여 대장균 균주 7107-18로부터 증폭하였다. GNnagEtetR1-5의 핵산서열은 다음과 같다: 5'-CAC GCA GGC AGG CTT TAC CTT CTT C-3'(서열번호 131). GNnagEtetR2-3의 핵산서열은 다음과 같다: 5'-CGG AAG AAC AAG CGA CGG AAG GAC-3'(서열번호 132).
상기 PCR 생산물을 pCR®-BluntII-TOPO®로 라이게이션하여 재조합 플라스미드 pCALG35-1을 생성하였다.
3차 전구체 플라스미드를 생성하기 위해 pCALG38-2를 Age I 및 Swa I로 분해하고 T7-lac-glmS*54 단편을 정제하였다. 또한 pCALG35-1을 AgeI 및 Nru I로 분해하고 asn-pCR®-BluntII-TOPO®-nagD 단편으로 정제하였다. pCALG38-2 및 pCALG35-1로부터 정제된 단편을 라이게이션하여 pCALG40을 생성하였다. 재조합 pCALG40 플라스미드는 pCR®-BluntII-TOPO®에서 nagD::T7-lac-glmS*54::asn 단편을 포함한다.
재조합 nagD::T7-lac-glmS*54::asn 단편을 유전체로 통합하는데 필요한 최종 플라스미드를 생성하기 위해 다음의 작업을 수행하였다. pCALG40을 Kpn I 및 Not I로 분해하고 nagD::T7-lac-glmS*54::asn을 포함하는 단편을 분리하였다. 또한 pKLN07-21(이전에 기술함)을 Kpn I 및 Not I로 분해하고 Kanr(pUC4K로부터, 이전에 기술함) 및 온도 민감성 복제 기원(pMAK705로부터)을 포함하는 단편을 분리하였다. pCALG40으로부터의 nagD::T7-lac-glmS*54::asn 단편 및 Kanr과 온도 민감성 복제 기원 pKLN07-21의 단편을 라이게이션하여 pCALG43-2를 생성하였다.
플라스미드 pCALG43-2를 7107-17(DE3)으로 형질전환하고 유전체에서 nagD::T7-lac-glmS*54를 갖는 클론을 생성하였다. 정확한 클론을 PCR로 확인하고 서던 블롯 분석에 의해 확인하였다. 이 클론을 테트라시클린에 대한 저항성의 상실에 의해 또한 확인하였다.
nagD::T7-lac-glmS*54::asn을 포함하는 균주에 대한 PCR 스크린을 위해 한쌍의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 합성하였다. 포워드 프라이머 GNnagET7glmS1-5는 다음의 서열을 갖는다: 5'-CAC GAT AAA CGG TGA AGC CAT GTC G-3'(서열번호 133). 리버스 프라이머 GNnagET7glmS2-3은 다음의 서열을 갖는다: 5'-CGT CCA TTT TCT TGA ACG CTT CAT CCC-3'(서열번호 134). 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 각각 올리고뉴클레오타이드 GNnagEtetR1-5(서열번호 133) 및 GNnagEtetR2-3(서열번호 134)로부터 생성된 nagD::Tetr::asn PCR 단편의 5' 및 3'에 위치한다. PCR에 의해 4개의 균주가 확인되었고 7107-321#1, #2, #3 및 #4로 명명하였다.
7107-321 균주에서 nagΔ::T7-lac-glmS*54 통합을 확인하기 위해 유전체 DNA를 분리하고 표준 조건하에서 nagE 특이적 프로브를 사용하여 서던 블롯에 의해 분석하였다. 상기 7107-321 균주는 서던 분석에 의해 정확하게 알게 되었다. 또한 nagΔ::Tetr::asn의 부존재는 7107-321 균주의 비활성 때문에 확인되어 테트라시클린을 포함한 배지에서 성장하였다.
manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1 구조를 첨가하기 위해 재조합 pSW07-68 플라스미드(이전에 기술함)를 각각의 7107-321 균주로 형질전환하였다. 유전체로 통합된 manXYZΔ::T7-lac-Sc GNA1을 갖는 클론을 온도 선별 공정을 사용하여 생성하였다. PCR에 의해 클론을 확인하고 서던 블롯 분석에 의해 확인하였다. 12 균주가 예상된 크기의 PCR 생산물을 생성하였다. 상기 균주는 7107-325#1, #2 및 #3, (7107-321#1로부터 유도됨); 7107-326#1, #2 및 #3, (7107-321#2로부터 유도됨); 7107-327#1, #2 및 #3, (7107-321#3으로부터 유도됨); 및 7107-328#1, #2 및 #3, (7107-321#4로부터 유도됨)으로 명명되었다. 상기 모든 균주를 GNA1 특이적 프로브를 사용하여 서던 블롯 분석에 의해 정확하게 확인하였다.

쉐이크 플라스크 실험에서 갈락토오스를 대사할 수 있는 N-아세틸글루코사민 생산 균주의 평가
갈락토오스를 대사할 수 있는 N-아세틸글루코사민 생산 균주(7107-325#1, 7107-326#1, 7107-327#1 및 7107-328#1)를 쉐이크 플라스크 실험으로 테스트하였다(표 34 참조). 균주를 0.6g/l MgSO4-7H2O와 0.05g/l CaCl2-2H2O가 보충된 M9B 배지를 포함하는 플라스크에서 시험하였다. 스크린 54 및 55의 미량 금속 보충이 0.2mg/l FeSO4-7H2O, 0.015mg/l ZnSO4-7H2O, 0.015mg/l MnSO 4-H2O, 0.001mg/l CuSO4-5H2O, 0.001mg/l NaMoO4-2H2O, 0.001mg/l H3BO3 및 0.001mg/l CoCl2-6H2O를 포함한 반면, 스크린 59 및 66의 미량 금속 보충은 0.5mg/l FeSO4-7H2O, 0.38mg/l ZnSO4 -7H2O, 0.033mg/l MnSO4-H2O, 0.01mg/l CuSO4-5H2O 및 0.01mg/l CoCl 2-6H2O를 포함하였다. 표 34에 나타난 바와 같이 다양한 양의 글루코오스(Glu), 락토오스(Lac), 효모 추출물(YE) 및 웨이 퍼미에이트(Whey Permeate: WP, Formost Whey, Wisconsin)를 플라스크에서 사용하였다. 스크린 54 및 55에 대해 배양액을 30℃, 24시간 동안 225rpm으로 쉐이킹하며 성장시키고 본 실험의 남은 부분을 위해 225rpm으로 쉐이킹하며 25℃에 보관하였다. 스크린 59 및 66에 대해 배양액을 37℃, 8 내지 10시간 동안 225rpm으로 쉐이킹하며 성장시키고 본 실험의 잔여부를 위해 225rpm으로 쉐이킹하며 30℃에 보관하였다. 스크린 59 및 66에서 10시간에 pH를 7.2로 조정하고 배양액의 글루코오스가 고갈된 경우 20내지 25g/l의 글루코오스를 첨가하였다. 네 개의 모든 스크린에 대해 24 및 48시간에 각각의 배양액을 pH 7.2로 조정하였고 글루코오스를 약 30g/l로 플라스크에 첨가하였고, 암모니아 수준이 1g/l 이하로 떨어진 경우 배양액에 5g/l (NH4)2SO4를 첨가하였다. 스크린 66에서 30 및 54시간에 필요하다면 글루코오스를 첨가하고 pH를 7.2로 조정하였다. 암모니아 수준이 1g/l 이하로 떨어지면 2.5g/l (NH4)2SO4을 첨가하였다. 4개의 모든 스크린에 대해 24 및 48시간에 샘플을 수집하고 배양액 상청액에서 N-아세틸글루코사민 및 갈락토오스 농도를 HPLC 탄수화물 컬럼을 사용하여 측정하였다.
여러 샘플에서 N-아세틸글루코사민 농도를 표 34에 나타냈다. 이 실험으로부터 어떤 조건 하에서 galK 사이트 대신에 nagΔ 사이트에서 T7lac-glmS*54의 통합이 N-아세틸글루코사민의 생산을 향상시킨다는 결론을 내릴 수 있다. 표 34는 여러 배양액에서의 갈락토오스 농도를 나타낸다. 예상한 것과 같이 galK 사이트 대신 nagΔ 사이트에서의 T7-lac glmS*54의 통합은 갈락토오스 축적을 없앴다.
여러 성장 조건하에서 N-아세틸글루코사민 및 갈락토오스의 양
쉐이크 플라스크 스크린# 균주*번호(7107-) 배지에의 첨가(g/l) GlcNAc(g/l) 갈락토오스(g/l)
Glu Lac YE WP 24시간 48시간 72시간 24시간 48시간 72시간
54 대조군 10 40 5 0 2.0 7.0 13.0 2.6 3.4 4.0
325#1 3.6 9.9 14.6 0 0 0
55 대조군 10 40 5 0 2.4 9.6 16.0 2.9 3.3 3.5
325#1 4.1 12.3 17.0 0 0 0
326#1 4.1 11.9 16.6 0 0 0
327#1 4.1 11.4 15.2 0 0 0
328#1 4.1 14.6 21.5 0 0 0
59 대조군 8 20 0 0 11.3 20.5 26.3 1.6 2.7 3.6
10 0 10.9 21.3 24.3 1.6 2.3 2.9
5 0 11.8 21.3 26.2 1.6 2.2 2.0
2.5 0 9.6 18.4 21.0 1.0 1.1 0.8
1.25 0 10.6 18.7 22.5 0.8 0 0
0 10 12.3 21.7 26.3 1.8 3.1 3.5
0 5 10.7 21.4 27.4 1.6 2.4 2.4
0 2.5 12.6 21.7 28.3 1.5 1.4 1.2
325#1 20 0 10.8 18.6 21.2 0 0 0
10 0 11.6 20.6 23.6 0 0 0
5 0 11.7 20.7 24.2 0 0 0
2.5 0 7.4 14.0 16.1 0 0 0
1.25 0 9.7 16.1 18.8 0 0 0
0 10 11.2 19.2 22.2 0 0 0
0 5 11.2 19.6 22.5 0 0 0
0 2.5 11.8 18.9 21.3 0 0 0
66 대조군 8 10 0 0 10.1 23.9 26.2 1.2 1.6 1.9
328#1 12.1 26.7 28.8 0 0 0
* 대조군: 비 갈락토오스 사용 균주 7107-92
모든 다른 균주는 갈락토오스 사용 자매세포이다
Glu= 갈락토오스, Lac= 락토오스, YE= 효모 추출물, WP= Whey Permeate
1 리터 발효조에서 갈락토오스를 대사할 수 있는 N-아세틸글루코사민 생산 균주의 평가
갈락토오스(7107-325#1 및 7107-328#1)을 사용할 수 있는 균주를 1리터 발효조에서 갈라토오스 비사용 균주(7107-92#1)와 비교하였다. 발효조는 발효 배지를 갖는 초기 부피 475ml로 준비하였다: 4.79g/l H3PO4, 3.15g/l KOH, 3.56g/l citric acid-H2O, 5g/l (NH4)2SO4, 2.5g/l MgSO4-7H2 O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 미량 금속(5mg/l FeSO4-7H2O, 3.75mg/l ZnSO4-7H2O, 0.6mg/l MnSO4-H 2O, 0.1002mg/l CuSO4-5H2O 및 0.1002mg/l CoCl2-6H2O) 및 0.25g/l Mazu 204 Antifoam. pH를 45% KOH를 사용하여 7.0으로 조정하였다. 상기 배지의 pH(6.9)를 75% NH4OH를 사용하여 유지하고 온도를 37℃로 유지하고 통기 및 교반 속도를 포화공기의 20%의 용존 산소 농도를 유지하도록 사용하였다. 접종시 0.40hr-1, 최대 속도 6시간에 5ml/hr의 성장 속도를 달성하기 위한 컴퓨터 프로그램에 의해 제어되는 투입속도로 65%의 글루코오스를 배양액에 투입하였다. 약 10시간에 5g/l 농도로 첨가된 푸드 그레이드 락토오스로 배양액을 유도하고 글루코오스 투입을 유지하였다.
발효 가동중 약 10, 21, 28, 35, 45, 52 및 60시간에 7 샘플을 수집하였다. 각각의 샘플에 대해 배양액의 건강을 모니터링하기 위한 다른 여러 성분의 농도에 추가하여 N-아세틸글루코사민 및 갈락토오스 농도를 HPLC 탄수화물 컬럼을 사용하여 관찰하였다. 예상한 바와 같이 갈락토오스를 대조 균주 7107-92#1(샘플 7에서 0.6g/l)로부터 배지에서 발견하는 동안 갈락토오스는 균주 7107-325#1 및 7107- 328#1을 갖는 배지에서 축적하지 않았다. 이러한 조건하에서 갈락토오스를 소비할 수 있는 균주에서 GlmS*54의 발현은 N-아세틸글루코사민 생산을 증가시키지 않았다. 그러나 이 발효에 사용된 배지는 7107-92#1에 최적화되었다. 갈락토오스 사용 균주는 적합한 수행을 위해 다소 다른 발효 조건이 필요할 수 있다. 배지가 생성되는 것은 7107-325#1 및 7107-328#1 균주가 7107-92#1보다 더 높은 양의 N-아세틸글루코사민을 생산하도록 하는 것일 것이다. 따라서 galK 사이트 대신에 nagD 사이트에서 T7-lac-glmS*54 발현 카세트의 통합이 N-아세틸글루코사민 및/또는 글루코사민 생산에 도움이 되는 것으로 판명되는 증거가 될 수 있다.
N-아세틸글루코사민 생산에 대한 발효 공정의 개발
< 실시예 30 >
본 실시예는 ScGNA1 플라스미드를 포함하는 균주를 갖는 NAG 생산을 최적화하기 위한 쉐이크 플라스크 실험을 기술한다.
대장균 글루코사민 생산 균주에서 ScGNA1의 과잉 발현이 많은 양의 NAG를 유발하는 것을 발견한 후 다음 단계는 NAG의 생산에 대한 조건을 최적화는 것이었다. 세이크 플라스크에서 초과 아세테이트를 생산하지 않고 세포의 밀도 및 그에 따라 NAG 역가를 증가시키려는 접근이 있었다. 플라스미드 pET24d(+)의 T7 프로모터로부터 ScGNA1을 발현하는 균주 7107-87#25가 초기 최적화 실험에 사용되었다.
효모 추출물 첨가 및 지연 유도
쉐이크 플라스크 스크린은 균주 7107-87#25에서 성장, 아세테이트 축적 및 NAG 생산에 대한 효모 추출물 첨가의 영향을 시험하였다. 또한 0.2mM IPTG에 의한 지연 유도에 대한 초기 유도의 효과를 시험하였다. 균주를 (NH4)2SO4가 7.5g/l로 감소한 M9B 배지(이전에 기술함)에서 성장시켰다. 상기 M9B 배지는 30g/l 글루코오스, 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O 및 25mg/ml 카나마이신이 보충되었다. 지연 유도에 대한 것을 제외하고 모든 플라스크에 0.2mM IPTG를 첨가하였고 접종 이후 24시간에 첨가되었다. 대조 플라스크에는 효모 추출물을 첨가하지 않았다. 시험 플라스크에 대해 효모 추출물(0.5 내지 4.0g/l의 범위)을 개시시 또는 접종 후 24시간에 첨가하였다. 배양액을 24시간까지 30℃에서 성장시키고 25℃로 유지하였다. 24 및 48시간에 5g/l (NH4)2SO4 및 20g/l 글루코오스를 각각의 플라스크에 첨가하고 pH를 7.2로 조정하였다.
표 35에 나타난 바와 같이 효모 추출물의 첨가는 성장과 NAG 생산의 증가를 유발하였다. 실제로 초기에 4g/l의 효모추출물이 첨가된 플라스크는 가장 좋은 수행을 보여 대조 균주에서 2.9g/l의 NAG를 생산한 것과 비교할 때 8.9g/l의 NAG를 나타냈다. 그러나 3.0g/l의 아세테이트 또한 이 플라스크에서 축적되었다. 24시간 후에 첨가된 효모추출물을 갖는 플라스크는 초기에 효모추출물이 첨가된 것과 비슷하게 성장하였지만 아세테이트의 축적은 적었다. 그러나 이러한 조건하에서 NAG 생산은 4g/l의 효모 추출물을 갖는 플라스크에서 48시간에 4.9g/l에 이르렀다. 더욱이 지연 유도를 갖는 플라스크는 0.2mM IPTG로 초기에 유도된 것보다 더욱 잘 자랐으나 NAG 생산은 지연되었다. 이것은 N-아세틸글루코사민 합성의 유도가 세포의 성장에 부정적인 영향을 준다는 것을 암시한다.
균주 7107-87#25에서 성장, 아세테이트 축적 및 NAG 생산에 대한 효모 추출물 첨가 및 지연 유도의 영향
조건 OD600 아세테이트
(g/l)		 GlcNAc
(g/l)
효모추출물(g/l) 효모 추출물 첨가 시간
개시시
IPTG 추가		 없음(대조군) 2.7 0 2.9
0.5 시작(0시간) 3.2 0 2.1
1.0 시작(0시간) 4.0 0 2.9
2.0 시작(0시간) 5.7 1.9 5.0
4.0 시작(0시간) 8.4 3.0 8.9
0.5 24 시간 2.3 0 2.4
1.0 24 시간 2.7 0 2.8
2.0 24 시간 4.3 0 3.5
4.0 24 시간 6.3 0 4.9
24시간에
IPTG 추가		 없음 6.6 2.8 0
2.0 시작(0시간) 6.9 4.0 3.1
1) 48시간에 얻은 결과
다양한 당과 효모 추출물의 첨가
효모 추출물을 갖는 다양한 당의 균주 7107-87#25에서의 성장, 아세테이트 축적 및 NAG에 대한 영향을 평가하기 위해서 쉐이크 플라스크 스크린을 수행하였 다. 균주를 (NH4)2SO4가 7.5g/l로 감소한 M9B 배지(이전에 기술함)에서 성장시켰다. 상기 M9B 배지는 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O 및 25mg/ml 카나마이신이 보충되었다. 이전 실험에서 보인 효모 추출물의 양성 효과 때문에 모든 플라스크에 5g/l의 효모추출물을 포함시켰다. 0.2mM의 IPTG와 당 락토오스, 글루코오스, 프룩토오스 및 리보오스의 다양한 혼합물 및 다양한 농도를 표 36에 나타난 바와 같이 플라스크에 첨가하였다. 락토오스의 존재하에 성장한 균주 7107-87#25가 그것이 락토오스 유도가 가능하므로 유도에 IPTG를 필요로 하지 않는다는 점을 인지할 필요가 있다. 배양액을 30℃에서 24시간동안 성장시키고 25℃를 유지하였다.
약 24시간에 각각의 배양액의 pH를 7.2로 조정하였다. 5g/l (NH4)2SO4를 각각의 플라스크에 첨가하고 글루코오스를 HPLC 결과에 기초하여 하루에 총 약 30g/l로 첨가하였다. 32.5시간에 15g/l 글루코오스, 2.5g/l 리보오스 및 2.5g/l (NH4)2SO4을 플라스크 7에 첨가하였다. 48시간에 10g/l 글루코오스를 각각의 플라스크에 첨가하였다. 추가적인 2.5g/l의 리보오스 및 5.0g/l의 (NH4)2SO4을 49.5시간에 플라스크 7에 첨가하였다. 샘플을 플라스크로부터 24, 48 및 72시간에 제거하여 OD600, N-아세틸글루코사민 양 및 아세테이트 양을 모니터링하였다.
균주 7107-87#25에서 성장, 아세테이트 축적 및 NAG 생산에 대한 다양한 당 혼합물의 영향
플라스크 조건 IPTG
(mM)		 OD600 아세테이트
(g/l)		 GlcNAc
(g/l)
글루코오스(g/l) 다른 당(g/l)
1 0 락토오스(40) 0 10.0 2.5 9.0
2 10 락토오스(30) 0 13.5 0 13.7
3 0 없음 0.2 11.0 4.7 12.3
4 0 프룩토오스(30) 0.2 5.0 0 9.1
5 0 리보오스(20) 0.2 11.0 4.8 10.6
6 15 프룩토오스(15) 0.2 11.0 4.4 14.8
7 20 리보오스(10) 0.2 13.5 3.1 27.0
1) 72시간에 결과를 얻음
2) 모든 플라스크에 효모 추출물(5.0g/l)을 포함하였다.
표 36에 나타난 결과는 세 개의 당(락토오스, 글루코오스 및 리보오스)이 성장을 잘 지지하고 NAG의 유의적인 축적을 유발한다는 것을 나타낸다. 프룩토오스를 포함하는 플라스크는 높은 OD600을 나타내지 않지만 NAG 역가는 9.1g/l에 이르렀다. 프룩토오스 또는 락토오스를 포함하는 플라스크에서 글루코오스를 초기에 포함하는 것은 NAG 역가 뿐만 아니라 성장을 향상시켰다. 그러나 최고의 결과는 글루코오스와 리보오스 모두를 초기에 포함하는 플라스크에서 달성되었다.
문헌은 대장균이 NAG 또는 GlcN(J. Bac., 1970, 101:384-391)에서 성장할 수 없는 것으로 분리한다. 저자는 아미노 당 포스페이트의 축적이 포스포헥소스 이소머라제 및 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소에 의해 촉진되는 반응을 저지하여 오탄당 아사현상을 유발한다고 추측하였다. 오탄당 또는 글루코네이트의 첨가는 돌연변이주의 성장 억제를 반전한다. NAG 생산 균주 7107-87#25는 또한 아미노 당 포스페이트(GlcN-6-P 및/또는 GlcNAc-6-P)를 축적할 수 있고 그것에 의해 오탄당 아사현상을 유발할 수 있다. 이러한 경우 리보오스 또는 글루코네이트의 첨가는 성장과 NAG 생산을 향상시킨다. 실제로 성장 및 N-아세틸글루코사민이 리보오스의 첨가에 의해 향상하였다. 이 실험에서 10g/l 리보오스가 추가된 20g/l 글루코오스는 가장 높은 NAG 수준인 27g/l을 생산하였다. 이것은 30g/l 글루코오스를 포함하는 플라스크에서 생산된 양의 두 배이다. 성장은 또한 리보오스 및 글루코오스 모두를 포함하는 플라스크에서 향상되었다.
글루코오스 및 리보오스 양
이전 실험은 리보오스를 글루코오스를 포함하는 플라스크에 첨가하는 것이 균주 7107-87#25에서 유의적으로 긍정적인 NAG 생산에 대한 영향을 준다는 것을 나타냈다. 쉐이크 플라스크 스크린 #35를 성장 및 NAG 생산에 대한 여러 글루코오스/리보오스 혼합의 영향을 시험하기 위해 수행되었다. 균주 7107-87#25를 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 25mg/ml 카나마이신, 0.2mM IPTG 및 5.0g/l 효모 추출물이 보충된 M9B 배지(이전에 기술함)에서 성장시켰다. 글루코오스와 리보오스의 다양한 혼합이 표 37에 기재된 바와 같이 각각의 플라스크에 첨가되었다. 배양액을 24시간동안 30℃에서 성장시키고 25℃를 유지하였다. 약 24 및 48시간에 플라스크의 pH를 7.2로 조정하였다. 24시간에 모든 플라스크에 5g/l (NH4)2SO4 를 첨가하였다. 29시간에 플라스크 4 내지 9에 추가적인 2.5g/l의 (NH4)2SO4를 첨가하고 플라스크 10 내지 15에 추가적인 5.0g/l의 (NH4)2SO4을 첨가하였다. 약 48시간에 5g/l (NH4)2SO4을 플라스크 7 내지 9에 첨가하고 2.5g/l의 (NH4 )2SO4을 플라스크 10 내지 15에 첨가하였다. 글루코오스를 첨가하여 글루코오스 양을 24 및 48시간에 약 30g/l로 조정하였다. 플라스크로부터 샘플을 약 24, 29, 48 및 72시간에 제거하고 OD600, N-아세틸글루코사민 양 및 아세테이트 양을 모니터링하였다. 선별된 플라스크를 효소 분석을 위해 72시간에 수거하였다.
표 37에 나타난 바와 같이 글루코오스 농도는 잔여 글루코오스가 존재하는 한 NAG 생산에 유의적 영향을 주지 않았다. 다른 한편, 5g/l 리보오스가 NAG 양의 큰 증가를 유발하여 리보오스 없이 플라스크에서 약 14g/l인 것과 비교하여 72시간까지 플라스크 4, 5 및 6에서 약 30g/l에 이르렀다. 가장 좋은 결과는 10g/l의 리보오스에서 나타났다. 이 플라스크에서 NAG 수준은 72시간에 약 36g/l에 이르렀다. 성장 또한 리보오스를 포함하는 배양에서 긍정적인 영향을 받았다. 선별된 플라스크로부터의 효소 분석은 GlmS와 GNA1 양 효소의 활성 수준이 배지에서 리보오스가 첨가여부와 관계없이 동일하기 때문에 리보오스 첨가가 GlmS 또는 GNA1 활성에 직접적인 영향을 주지 않는다는 것을 밝혀냈다. 이것은 리보오스 첨가의 효과가 오탄당 포스페이트 경로 중간매개체의 결핍이 완화된 결과와 유사함을 암시한 다.
균주 7107-87#25의 성장, 아세테이트 축적 및 NAG 생산에 대한 글루코오스 및 리보오스의 영향
플라스크 조건 OD600 아세테이트(g/l) GlcNAc
(g/l)		 효소 활성
(μmol min-1mg-1 단백질)
글루코오스
(g/l)		 리보오스
(g/l)		 GlmS GNA1
1 20 없음 12.5 5.4 14.0
2 30 없음 13.0 5.4 14.7
3 40 없음 12.8 5.5 14.5 0.114 7.8
4 20 5 15.6 0 28.1
5 30 5 14.5 2.9 30.6
6 40 5 14.5 3.1 29.0 0.140 7.9
7 20 10 16.0 2.8 35.2
8 30 10 14.5 0 37.1
9 40 10 15.0 0 36.4 0.105 8.0
10 20 15 15.5 4.3 31.3
11 30 15 16.5 0 33.4
12 40 15 16.0 0 34.0 0.101 8.2
13 20 20 15.0 4.4 30.0
14 30 20 15.0 4.7 26.3
15 40 20 16.0 4.5 28.4 0.121 7.7
1) 결과는 72시간에 얻음
2) 모든 플라스크에 효모 추출물(5.0g/l)이 포함되었다.
오탄당 포스페이트 경로의 리보오스 및 다른 중간매개체
글루코오스 및 리보오스에서 성장한 배양액에서 나타난 긍정적 결과의 관점에서 성장과 NAG 생산에 대한 여러 다른 오탄당 및 글루코네이트의 영향을 관찰하기 위해 쉐이크 플라스크 스크린 #36을 수행하였다. 균주 7107-87#25를 0.6g/l MgSO4-7H2O, 0.05g/l CaCl2-2H2O, 5.0g/l 효모 추출물, 25mg/ml 카나마이신 및 0.2mM IPTG이 공급된 M9B 배지(이전에 기술함)에서 성장시켰다. 표 38에 나타낸 바와 같이 글루코오스, 리보오스, 크실로스, 아라비노스 및 글루코닉 산(칼륨염)을 플라스크에 첨가하였다. 배양액을 24시간동안 30℃에서 성장시키고 25℃를 유지하였다. 약 24 및 48시간에 플라스크의 pH를 7.2로 조정하였다. 약 24시간에 글루코오스를 24시간 샘플로부터의 HPLC 결과에 기초하여 하루에 총 약 30g/l으로 첨가하였다. 또한 모든 플라스크에 5g/l (NH4)2SO4를 첨가하였다. 24 및 48시간 모두에 플라스크 11 및 12에 10g/l의 추가적인 리보오스를 첨가하였고 48시간에 5g/l의 리보오스를 플라스크 3 및 4에 첨가하였다. 28.5시간에 플라스크 10에 추가적인 10g/l의 글루코닉 산을 첨가하였다. 약 48시간에 글루코오스를 첨가하여 글루코오스 양을 약 30g/l로 조정하였다. 플라스크 11 및 12에 추가적으로 5.0g/l의 (NH4)2SO4 을 첨가하였다. 각각의 플라스크로부터 샘플을 약 24, 30, 48, 54 및 72시간에 제거하고 OD600, N-아세틸글루코사민 양 및 아세테이트 양을 모니터링하였다. 선별된 플라스크를 효소 분석을 위해 72시간에 수거하였다.
성장과 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 5-탄소 화합물 및 글루쿠로닉 산의 영향
플라
스크		 조건 OD600 아세테이트
(g/l)		 GlcNAc
(g/l)		 효소 활성
(μmol min-1mg-1 단백질)
글루코오스
(g/l)		 다른 당
(10g/l)		 GlmS GNA1
1 30 없음 11.0 4.5 14.6 .230 11.4
2 40 없음 12.5 4.8 15.0
3 30 리보오스 14.0 1.6 29.1 .215 12.5
4 40 리보오스 14.0 1.2 30.8
5 30 크실로스 12.0 4.1 17.1 .211 12.5
6 40 크실로스 11.5 4.1 17.0
7 30 아라비노스 12.5 3.2 20.3 .180 11.4
8 40 아라비노스 12.5 3.3 20.4
9 30 글루코닉산 12.0 4.0 24.3 .190 9.0
10 40 글루코닉산 13.0 3.8 22.1
11 30 Ribose+ribose 13.0 2.8 25.0
12 40 Ribose+ribose 13.0 3.0 24.9
1) 결과는 72시간에 얻음
2) 플라스크 11 및 12에 24 및 48시간에 추가적 리보오스(10g/l)를 첨가하였다.
3) 모든 플라스크에 효모 추출물(5.0g/l)이 포함되었다.
오탄당 및 글루코닉 산의 첨가는 대조군과 비교할 때(도 18 참조) NAG 역가의 증가 및 성장의 향상을 유발했다. 이 배양액은 대조군보다 더 적은 양의 아세테이트를 포함하였다. 그러나 리보오스의 첨가는 가장 많은 NAG 생산을 유발하였다. 글루코닉 산은 다른 당보다 저렴하기 때문에 산업적 규모로 사용하기에 적합하다. 글루코닉 산 첨가는 대조군과 비교할 때 NAG 생산의 증가를 가져오기 때문 에 이 실험은 산업적 발효에서 오탄당 아사 현상을 완화하는 가능 지수를 확인한다. 선별된 플라스크로부터 효소 활성 수준은 리보오스 및 글루코네이트의 N-아세틸글루코사민 생산에 대한 큰 영향이 GlmS 또는 GNA1의 활성에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 성장 및 생산에 대한 여러 수준의 글루코오스/리보오스의 효과를 비교하는 쉐이크 플라스크 스크린에서 나타난 바와 같이 활성 수준은 배양 배지에서 리보오스의 유무와 무관하게 유사하다.
< 실시예 31 >
본 실시예는 ScGNA1 플라스미드를 포함하는 균주 7107-87#25를 사용하여 NAG 생산을 최적화하도록 l 리터 발효조에서 수행된 실험을 기술한다.
IPTG 유도 시간:
발효 실험을 수행하여 성장 개시시 및 성장(약 13g/l의 세포의 양) 24시간 후에 IPTG를 갖는 유도를 평가하였다. 성장은 초기 유도에 의해 매우 방해되어 도 19에 나타난 바와 같이 지연 유도(70시간까지 50g/l)와 비교하여 매우 낮은 NAG 역가(<5g/l)를 나타냈다. 성장은 오탄당 포스페이트 경로의 특정 효소를 방해하는 세포에서 아미노 당 포스페이트가 축적되기 때문에 방해되는 것으로 생각된다. 이러한 가설은 세포 성장 및 NAG 생산에 대한 오탄당 포스페이트 중간매개체의 긍정적인 효과의 발견에 의해 지지되었다.
오탄당 포스페이트 포스페이트(PPP) 중간매개체의 영향:
발효조를 세 개의 다른 밀도에서 세포로 접종하였다: 낮음(OD=20), 중간(OD=30) 및 높음(OD=40). 지연 유도 계획을 접종 후 약 24시간에 유도하는데 사용하였다. 더 높은 세포 밀도 접종은 더 많은 NAG 생산을 유발하였다. 세포 밀도 접종과 무관하게 리보오스의 첨가가 지연 유도 계획에서까지 NAG 생산을 향상시켰다.
< 실시예 32 >
본 실시예는 통합된 ScGNA1 구성을 포함하는 균주를 사용하여 NAG 생산을 최적화하는 여러 발효 실험을 기술한다. ScGNA1 플라스미드를 포함하는 균주를 갖는 이전의 실험에서 락토오스가 매우 불충분하였기 때문에 NAG 생산을 유도하는데 IPTG를 사용하여야 했다. 통합된 ScGNA1 구조로 NAG 생산이 락토오스 첨가에 의해 효과적으로 유도되었다.
락토오스 유도:
염색체에서 통합된 ScGNA1 구조의 하나의 카피를 포함한 균주 7107-92#1의 개발로 인해 NAG 생산에 대한 락토오스 유도 공정의 개발이 가능하였다. 초기 IPTG 유도에 의한 성장 억제를 나타내는 쉐이크 플라스크 결과의 관점에서 지연 유도 계획을 발효조에서 시험하였다. 세포를 먼저 접종시키고 약 15 내지 20g/l 세포로 성장시켰다. 이때 락토오스를 글루코오스 투입이 정지한 동안 7시간 동안 10, 20 또는 30g/l로 투입하였다. 후에 글루코오스를 계속적인 성장 및 NAG 생산을 위해 재투입하였다. 락토오스 양이 10g/l일 때 효과적인 것으로 나타났고 78시간까지 50g/l NAG에 도달하는 것을 알게 되었다.
분리 락토오스 투입 방법이 공정에 복잡성을 야기하기 때문에 여러 선별을 평가하기 위한 실험을 수행하였다: 글루코오스 투입이 중단된 상태에서의 10g/l의 락토오스 투입, 계속적인 글루코오스 투입하의 IPTG 유도 및 글루코오스 투입의 계속 또는 정지 상태에서의 10g/l의 락토오스의 단독 포인트 첨가. 테스트된 또다른 변수는 40g/l까지 확대된 락토오스 투입이었고 뒤이어 글루코스를 투입하였다 . 단독 포인트 락토오스 첨가는 다른 유도 방법만큼 효과적이었다. 모두 45-55g/l의 범위의 NAG를 생산하였다. 글루코오스 투입이 연속적이었지만 그 농도는 여전히 세포에 제한되고 있었다(첨가되면 빠르게 소모됨). lac 오페론이 글루코오스 존재에 의해 정상적으로 억제되기 때문에 글루코오스 한정 투입 속도는 명백하게 락토오스 유도의 비억제적 조건을 가능하게 하였다. 단독 포인트 락토오스 첨가의 사용으로 공정이 매우 단순화되었다.
실험은 초기 성장 기간 후 단독 포인트 락토오스 유도(1.25 내지 10g/l)의 양을 평가하였다. 또한 2 포인트 유도(각각의 시간에 5g/l)를 시도하였다. 1.25g/l 만큼 낮은 락토오스가 매우 효과적이어서 역가가 거의 100g/l NAG를 나타냈다. 그러나 5g/l에서 락토오스 유도는 100g/l 이상의 NAG 양에 이르렀다. 따라서 5g/l에서의 락토오스 유도가 안전한 수준으로서 다음 시험에 적용되었다. 2 포인트 유도는 또한 효과적이어서 더욱 빠른 초기 NAG 생산 속도를 야기하였지만 최 종 역가는 5 또는 10g/l 락토오스를 갖는 단독 포인트 유도의 역가를 초과하지 않았다.
더 높은 pH 및 온도의 영향:
더 낮은 온도 및 pH의 사용은 주로 더 높은 pH 및 온도에서 GlcN의 불안정한 성질 때문에 GLcN 발효를 안정화하는데 중요 인자였다. 그러나 NAG는 중성 pH에서 안정한 것으로 나타났다. NAG 생산의 발효는 프로그램을 통해 6.7 내지 7.0 pH 범위에서 작용하였다. 실험 데이터는 NAG가 37℃ 및 pH 7.0에서 글루코오스 투입이 정지한 후 적어도 50시간 동안 안정한 것을 나타냈다.
GlcN 공정에서 사용된 상대적으로 낮은 온도(30℃ 및 25℃)는 고가이고 산업적 규모로 유지하기 어렵다. 더욱이 세포 성장 속도는 37℃보다 30℃에서 훨씬 더 낮다. 30℃ 온도의 사용은 상대적으로 높은 NAG 생산에 필요한 바이오매스를 성취하는데 오랜 기간이 필요하다. 따라서 유도 이전에 4개의 다른 성장 속도를 평가하기 위해 37℃에서 실험을 수행하였다. 이러한 방법으로 더 일찍 필요한 바이오매스가 수득되어 전체적으로 더욱 생산적인 공정이 유발되었다. 모든 발효조가 30℃에 요구되는 22 내지 24시간과 대비하여 10시간에 유도되었고, 모두 잘 수행하여 50시간 내에 100g/l 이상의 NAG에 도달하고 70시간까지 거의 120g/l을 달성하였다. 이러한 관점에서 37℃를 성장 및 생산 온도로 사용하였다.

글루코오스 투입 속도의 영향:
접종후의 부피에 기초하여 6g l-1 hr-1의 속도를 모든 실험에서 사용하였다. NAG 생산 속도가 글루코오스 제한에 의해 제한되는지 알아보기 위해 더 높은 글루코오스 속도를 시험하였다. 7.5g l-1 hr-1로 공급속도를 증가시키는 것은 더 높은 NAG 생산 초기 속도를 유발하였으나 최종 역가는 더 높게 또는 더 빠르게 도달하지 않았다. 9.5g l-1 hr-1로 더욱 투입 속도를 증가시키면 더욱 빠른 NAG 생산의 초기 속도를 나타냈다. 그러나 이 배양액은 훨씬 빠르게 생산을 중지시키는 것으로 보였고 실제로 최종 역가(85 에서 65g/l NAG)를 감소시켰다. 동일한 실험에서 느린 투입 속도(6g l-1 hr-1)는 100g/l의 NAG 수준을 가능하게 하였다. 이러한 시간 포인트로부터 글루코오스 투입 속도를 NAG 발효에서 6.5g l-1 hr-1에서 유지하였다.
포스페이트 앵의 영향:
발효 배지는 30g/l의 전체 포타슘 포스페이트 염(potassium phosphate salt)을 포함한다. 더 많은 포스페이트염 양은 대부분의 염이 세포에 의해 사용되지 않고 생산물 정제 동안 제거되어야 한다는 회복에 대한 유의적 문제를 나타냈다. NAG 공정에서 많은 양의 포스페이트는 위험하지 않은 것으로 나타났다. 전체 포스페이트는 NAG 생산에 대한 영향을 거의 갖지 않은 채 7.5g/l로 4배 감소하였다. 이 포스페이트 양을 이후 실험에서 사용하였다.
마그네슘 및 철의 중요성:
마그네슘 및 철은 많은 바이오매스를 생성하고 배양액을 안정하기 위한 영양분으로 필요하다. GLcN 공정에서 철의 양은 위험한 인자로 보였다. 더 높은 바이오매스 및 락토오스 유도를 달성하기 위해 특정량이 필요하였으나 매우 많은 철은 더 높은 아세테이트 및 더 낮은 GLcN 수준을 유발하였다. GLcN 공정에서 측정된 철의 양은 글루코오스 투입(5㎍/g 글루코오스)에서 FeSO4-7H2O을 포함함으로써 추가적인 철이 투입된 배지에서 3mg/l FeSO4-7H2O였다. 동일한 철의 양이 초기 NAG 생산 실험을 위해 선별되었다. 글루코오스 투입에 첨가된 철은 공정을 복잡하게 한다. 따라서 초기 철 농도 및 철 투입의 효과를 평가할 필요가 있었다. 마그네슘의 영향 또한 연구되었다.
첫 번째 실험의 결과는 5 내지 10mg/l FeSO4-7H2O가 비교될 정도의 NAG 생산량을 유발하고 철의 양은 GLcN 공정에서만큼 위험하지 않을 수 있다는 것을 타나냈다. 철, 마그네슘을 갖는 연구에 따라 철의 투입이 절대적으로 필요한 것은 아니라는 것을 알게 되었다. 투입물 중 마그네슘은 안정화 효과를 갖는다. 이 시험은 7.5g l-1 hr-1의 높은 투입 속도에서 수행되고 이어서 6.5g l-1 hr-1 에서의 또 다른 시험이 수행되었는데 둘 다 생산성의 유의적 감소 없이 투입에서 제외될 수 있는 것으로 나타났다.
철 및 마그네슘의 중요성이 인식된 반면 투입물에서 그들을 제외하는 것은 생산 공정을 단순화하는 관점에서 바람직하였다. 따라서 글루코오스 투입시 철 및 마그네슘을 제외하였고 철은 초기 농도 5mg/l의 FeSO4-7H2O을 보유하였다. 5 내지 10mg/g 글루코오스의 속도로 글루코오스 투입에서 사용된다면 마그네슘은 초기 속도 0.6g/l MgSO4-7H2O로 첨가되었다.
마그네슘은 배양액에 중요한 것으로 인식되었고 제한되지 않아야 하였다. 마그네슘은 특정 멸균 조건(과도한 열, 노출시간 및 pH)하에서 포스페이트에 의해 분리되어 불용성 마그네슘 포스페이트 염 침전과 같이 유기체에 사용불가능하게 될 수 있다. 초과 마그네슘 또는 제한하는 마그네슘을 사용하는 플라스크 연구는 상기 양이 NAG 생산에 매우 위험하고, 멸균 후 마그네슘의 첨가는 마그네슘 양이 더 높다면 침전 효과를 감소하는 데 바람직하다는 것을 나타냈다. 발효 실험을 수행하여 멸균 전후의 마그네슘 첨가를 비교하였다. 결과는 멸균 전 첨가된 마그네슘을 갖는 배양액은 양호하게 수행하지 않는다는 것을 보여주었다.
초기 마그네슘 양은 이때 1g/l MgSO4-7H2O의 거의 두배였고, 연구는 멸균 후 첨가되거나 또는 증가된 양의 시트릭 산이 첨가되고 멸균전 배지가 산성화한다면 상기 양이 사용될 수 있음을 보여줬다. 이것은 프로토콜의 단순화를 위한 매우 긍정적인 암시이다. 산성화에 의해 모든 미량원소를 멸균전에 첨가할 수 있게 되었다. 이에 따라 글루코오스를 제외한 모든 원소가 멸균전에 첨가된 배지를 제조하는 프로토콜을 개발하였다. 배지의 산성화는 초기에 포스포러스를 공급하기 위해 포타슘 포스페이트염 대신 포스포릭 산을 사용하여 달성되었다. 또한 멸균 후 pH 를 배지에 칼륨을 공급하는 수산화칼륨에 의해 요구되는 pH(7.0)로 조정하였다. 그러나 이 방법은 불필요하게 많은 양의 칼륨을 필요로 하였다. 단염기 포타슘 포스페이트를 배지 산성화에 사용하고 멸균 후 수산화 암모니아로 pH를 조정하여 프로토콜을 더욱 개선하였다. 이것은 배지로부터 황산 암모니움의 제거를 가능함으로써 프로토콜을 더욱 단순화하였다.
미량 원소 제거 및 아연의 중요성:
미량 원소 패키지는 원래 ㎍ 내지 mg/l의 양으로 첨가된 다음의 원소의 염으로 구성되었다: 철, 아연, 망간, 구리, 코발트, 몰리브덴 및 보론. 몰리브덴 및 보론은 최종 생산물에서 발견되면 독성 문제를 야기하고, 다른 요소의 영향은 알려져 있지 않다. 따라서 단독 고갈 실험을 수행하여 어떠한 것이 제거가능한지 관찰하였다. 처음 시험은 몰리브덴 및 보론 고갈이 NAG 생산에 유의적인 부정적 효과를 나타내지 않아 이후의 실험에서 제외하였다. 코발트 고갈 또한 긍정적 효과를 나타냈으나 이것이 비타민 B12의 전체 작용에 필요한 것으로 인식되었고 그에 따르는 연구에서 고갈에 대한 영향이 없었기 때문에 고갈하지 않았다.
그 결과 NAG 생산에 대한 아연 제거의 긍정적 효과가 나타났다. 다음의 연구에서 완전한 아연의 제한이 더 낮은 바이오매스의 양을 유발하고 유의적으로 NAG 수준을 60시간에 118g/l까지 더 상승시킨다는 것을 확인하였다(도 20 참조). 이것은 특히 더 높은 초기 철의 양이 10mg/l FeSO4-7H2O까지 사용될 수 있기 때문에 흥 미로웠다.
< 실시예 33 >
본 실시예는 더욱 바람직한 NAG 생산을 위한 발효 프로토콜을 기술한다. 발효 프로토콜을 이하에 나타냈다.
균주: 재조합 대장균
유도: 세포 밀도가 15 내지 20g/l에 도달한 후 단독 포인트 첨가로 5 내지
10g/l 락토오스 첨가. 글루코오스가 이 과정 중에 투입되었으나 초
기 부피에 기초하여 6.5g l-1 hr-1로 고정되었다.
투입: 보충없이 65% 글루코오스 투입. 제한 농도로 투입됨
발효 시간: 60 내지 72시간
발효 상태: 65% 글루코오스가 요구되는 만큼 첨가된 유가식(Fed Batch). 글
루코오스 제한 농도 유지
접종량: 부피당 2.5% 내지 5%
pH: 6.9, 12N NH4OH로 제어됨
온도: 37℃
산소: 용존 산소 20% 이상, 교반으로 제어됨
통기: 0.5에서 1vvm
배지:
성분 농도(리터당 양)
KH2PO4 6.67g
시트릭 산 3.25g
CaCl2-H2O 0.05g
MgSO4-7H2O 2.5g
FeSO4-7H2O 5mg
ZnSO4-7H2O 3.8mg
MnSO4-H2O 0.33mg
CuSO4-5H2O 0.1mg
CoCl2-6H2O 0.1mg
글루코오스 >200g (필요한 때)
Mazu 204 defoamer 0.25g
모든 성분을 글루코오스(증가하도록 첨가됨)를 제외하고 멸균 전에 첨가하였다. 초기 pH는 멸균 후 약 3.0이고 접종 전 NH4OH로 6.9로 조정하였다.
< 실시예 34 >
본 실시예는 이중 결정화에 의한 N-아세틸글루코사민의 정제를 기술한다.
발효 액체배지는 여과 및 미세여과에 의한 세포의 제거를 용이하게 하였다. 발효 조건에 따라 용해된 고형물에서 N-아세틸글루코사민의 백분율은 70 내지 87%(w, 건조한 고형물에 기초함)의 범위였다. 따라서 천연 N-아세틸글루코사민 생산물을 정제하여야 하였다. 이것은 천연 액체배지에서 N-아세틸글루코사민 순도를 증가시키는 양이온과 음이온 탈이온화 단계의 조합에 의해 수행될 수 있다. 여러 결정 프로토콜이 사용될 수 있다. 다음의 실시예는 N-아세틸글루코사민 정제를 위한 프로토콜 및 조건을 확정하는 여러 실험을 기술한다. 나타낸 바와 같이 98% 이상의 순도를 나타내는 N-아세틸글루코사민은 실시예 34, 35, 36, 40 및 41에 기술 된 방법을 사용하여 수득하였다. 순도는 실시예 37에 기술된 방법에 의해 더욱 증가하였다.
N-아세틸글루코사민을 Supelcosil LC-18-DB(250 x 4.6mm, 5㎛) 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA에 의해 수득됨) 및 1ml/min으로 유동상의 10%(v) 아세토니트릴을 사용하여 액체 크로마토그래피에 의해 관찰하였다. 외부 표준으로서 상업적인 N-아세틸글루코사민(Sigma, 99% 이상)을 사용하여 210nm에서 N-아세틸글루코사민을 측정하였다. 관찰 결과 접종 부피가 4㎕ 일 때 5g/l N-아세틸글루코사민까지 선형적 반응을 나타냈다. 샘플 및 표본을 보통의 방법으로 약 3g/l로 준비하고 적어도 2번 접종하였다. 피크 영역의 유도는 평균값보다 2% 더 낮았다.
활성 탄소(100 mesh G-60, Norit Americas, Atlanta, GA)로부터 사용가능함)를 용해 고형물에서 70%(w) N-아세틸글루코사민을 포함하는 발효 샘플(30g/l)에 첨가하고 한 시간동안 실온에서 저어준 다음 혼합물을 배지 필터 종이를 사용하여 여과하였다. 여과액은 색상이 감소하여 연한 황갈색을 띠었다. 고형물의 양을 측정하였고 고형물에서의 N-아세틸글루코사민의 백분율이 75%(w)였다.
77.5g의 용해 고형물(그 중 N-아세틸글루코사민은 58.1g)을 포함하는 위에서 수득된 샘플을 탄소가 처리된 샘플을 진공에서 51%(w) 고형물(농축 동안 고형물의 손실이 없다는 가정하의 샘플 중량에 의해 계산됨) 하에 45℃-50℃에서 농축하였다. 2시간동안 가끔식 혼합하면서 실온에 보관하였다. 침전물을 배지 필터 종이에서 여과에 의해 수집하고 100-ml 물에 재용해시켰다. 고형물 내용이 19.7%(w)의 고형물(전체 고형물 26.2g)인 것으로 관찰되었다.
재용해된 샘플을 다시 44%(w) 용해된 고형물로 농축시켰다. 약 2mg 순수 N-아세틸글루코사민 분말을 첨가하고 샘플을 실온에서 2시간 동안 쉐이커에서 혼합하였다. 침전물을 여과로 수집하고 에탄올로 세척하였다(고형물 현탁 없이 2번 및 현탁에 의한 2번). 흰 고형물을 실온에서 중량이 5.32g(98% N-아세틸글루코사민, 전체의 9% 회수) 생산물로 유지할 때까지 진공상태에서 건조시켰다.
<실시예 35 >
본 실시예는 50℃에서의 단독 결정화에 의해 N-아세틸글루코사민의 정제를 기술한다.
용해된 고형물에서 87%(w)의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 발효 샘플의 또다른 배치를 실시예 34에 기술된 활성 탄소로 처리하였다. 용해된 고형물의 양을 측정하였고 고형물의 N-아세틸글루코사민 백분율이 88%(w)였다. 80.5g 고형물(그 중 N-아세틸글루코사민은 71g) 탄소가 처리된 샘플을 진공하에서 45%(w) 고형물(농축 동안 고형물의 손실이 없다는 가정하의 샘플 중량에 의해 계산됨)로 45℃-50℃에서 농축시키고 실온에서 16시간동안 쉐이킹하였다. 침전물을 배지 필터 종이에서 여과에 의해 수집하고 에탄올로 세척하였다(고형물 현탁 없이 2번 및 현탁에 의한 2번). 진공하에서 건조한 후 33.2g의 백색 고형물을 수득하였다(100% 순수 N-아세틸글루코사민, 47% 회수).
< 실시예 36 >
본 실시예는 70℃에서의 단독 결정화에 의해 N-아세틸글루코사민의 정제를 기술한다.
부분적으로 정제된 N-아세틸글루코사민을 탄소로 처리된 발효 샘플의 하나의 결정화에 의해 수득하였다(실시예 34 참조). 결정화전에 농축된 정도 및 용해된 고형물에서 N-아세틸글루코사민의 초기 백분율에 따라 N-아세틸글루코사민의 순도는 86% 내지 90%였다.
86% 또는 90%의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 고형물 샘플을 물로 44%(w) 고형물에 혼합하였다. 혼합물을 가끔씩 혼합하면서 70℃에서 가열하여 용해하였다. 그 다음 약 16시간 동안 실온에 방치하였다. 결정을 여과에 의해 수집하고 에탄올로 세척하였다(고형물 현탁 없이 2번 및 현탁에 의한 2번). 진공하에서 실온에서 건조한 후 생산물은 99%의 N-아세틸글루코사민을 포함하였다(24-30% 회수)
< 실시예 37 >
본 실시예는 양이온 교환 처리에 의한 N-아세틸글루코사민의 정제를 기술한다.
탈색된 발효 액체배지를 양이온 교환 컬럼에 대한 입력 공급으로 사용하였다. 상기 컬럼은 1.6 x 15cm이고 20g DOWEXTM Monosphere 88 resin(Dow Corp., Midland, MI로부터 사용가능함)을 수소형태로 포함하였다. 상기 실험을 Pharmacia FPLCTM 셋업(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ로부터 사용가능)를 사용하여 4 ℃에서 수행하였다. 입력 공급은 고형물 기초에 대하여 약 76%의 N-아세틸글루코사민, 10.5mS/cm의 전도도를 나타냈고 pH는 약 6.5였다. 상기 물질을 1ml/min의 속도로 펌핑하였다. 초기 출력 pH는 약 2.3이었다. 컬럼 용량에 도달한 때 pH가 상승하고 마침내 입력 공급과 동일하게 되었다. 전도도는 약 125ml에서 약 10.5mS/cm으로부터 약 2.5mS/cm으로 감소하였다. 이 때 전도도는 pH의 상승에 따라 증가하였다. N-아세틸글루코사민 순도는 고형물 기초에서 측정하였을 때 pH가 약 2.5를 유지하는 동안 또한 신속하게 증가하였다 . 순도가 약 85%의 N-아세틸글루코사민으로 증가하였다. 컬럼 용량이 소모되었을 때 순도가 감소하였고, 200ml의 입력 증기와 본질적으로 동일하였다. N-아세틸글루코사민 순도는 양이온 처리에 의해 증가하였다.
< 실시예 38 >
본 실시예는 음이온 교환 처리에 의한 N-아세틸글루코사민 정제를 기술한다. 탈색되고 양이온 교환 수지로 처리된 N-아세틸글루코사민 액체배지는 음이온 교환 수지 Dow Monosphere 77에 대한 입력 물질로 사용되었다. 실험 조건은 상기 양이온 교환 수지 실험에서 기술하였다. 입력 공급은 고형물을 기초로 약 81%의 N-아세틸글루코사민, 3.8mS/cm의 전도도를 나타냈고 pH는 약 3.0이었다. 출력 pH가 약 8.0까지 급속히 상승하고 그 후 250ml에서 약 3.8로 하강하였다. 전도도는 1mS/cm 이하로 급속히 하강하였고 실험 중 상기 수준을 유지하였다. N-아세틸글루코사민의 순도가 증가하였고 또한 유의적으로 높은 수준을 유지하였다. N-아세틸글루코 사민의 순도는 약 81%의 입력 증기 순도로부터 약 87%의 N-아세틸글루코사민으로 증가하였다.
양이온 및 음이온 처리의 조합은 전체 건조 고형물 기초에 기초한 천연 액체배지에서 N-아세틸글루코사민 순도를 유의적으로 증가시키는 단순한 방법을 제공한다.
< 실시예 39 >
본 실시예는 활성 탄소 및 혼합된 베드 이온 교환을 갖는 발효 액체배지의 처리를 기술한다.
발효 샘플을 먼저 실시예 34에 기술된 활성 탄소로, 제조업자의 추천에 기초한 컬럼에서 혼합-베드 이온 교환 수지 AG501-X8(D)(Bio-Rad, Hercules,CA로부터의)에 의해 처리하였다. 샘플을 천천히 적재하였고 흐름을 중력으로 구동하였다. 샘플 적재량은 금색으로 변하는 청색 지시제에 의해 나타나는 것과 같이 베드의 3분의 2를 소모한 것이었다. 용해 고형물에서 초기 70%(w) 및 87%(w) N-아세틸글루코사민을 포함하는 샘플은 용해 고형물에서 각각 89%(w) 및 93%(w)의 최종 N-아세틸글루코사민 순도를 나타냈다.
< 실시예 40 >
본 실시예는 정제된 N-아세틸글루코사민의 안정화를 기술한다.
위에서 기술한 결정화에 의해 생성된 N-아세틸글루코사민(순도 98%) 샘플이 2시간째 105℃에서 밝은 갈색으로 변화하고 4.7% 중량을 상실하였다. 가열에 따른 색상의 변화 및 중량의 상실이 이소프로필 알코올(IPA)에 관련된 다음의 처리(이하에 기술함)에 따르는 하나를 사용하여 제거되었다. IPA(이소프로필 알코올)이 N-아세틸글루코사민의 침전 및 105℃에서 어두워지는 샘플의 제거에 유용한 시약이라는 것이 증명되어 있다. 그러나 본 기술분야의 당업자라면 아세토니트릴 또는 에탄올과 같은 물과 혼합하기 쉬운 다른 유기 용매를 선별하여 IPA를 대체할 수 있고 동일한 효과를 달성할 수 있다.
예열에 뒤이은 물/IPA 침전
샘플(0.30g)을 105℃에서 2.5시간동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후 0.7ml의 물을 첨가하여 황색 현탁물을 형성하였다. IPA(2.8ml)를 첨가하고 혼합물을 2시간동안 섞어주었다. 여과에 의해 침전물을 수집하고 IPA로 고형물 현탁에 의해 2회 세척하였다. 모액은 옅은 노랑이었다. 고형물을 중량이 일정할 때까지 진공에서 건조시켰다(0.18g, 60% 회수).
80:20 또는 85:15 IPA/물(v/v)에서의 적심 처리
샘플을 5 또는 12ml 용매 혼합물/그램 고형물에서 80:20 또는 85:15(v/v) IPA/물에서 3시간동안 또는 하룻밤동안 교반하였다. 회수(상기와 동일한 공정) 범위는 56 내지 67%였다.

IPA에 의한 용해 및 침전
샘플(0.50g)을 2.27ml 물에 용해시켰다. IPA(12.86ml, IPA/물=85:15 v/v)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 회수공정(56%)을 상기와 동일하게 수행하였다.
IPA에 의한 농축 및 침전에 따르는 물에서의 용해
샘플(89.6g)을 물에 용해시켜 20% 고형물(w/w)로 만들었다. 그것을 45-50℃에서 진공하에 농축하였다. 고형물의 농축이 약 42%(w/w)에 이르렀을 때 침전이 형성되기 시작하였다. 더 나아가 55% 고형물(농축 동안 고형물의 상실이 없다는 가정하에 총 샘플 중량에 기초하여 계산)까지 농축되었다. IPA를 첨가하고(IPA/물=85:15 v/v) 하룻밤 교반하였다. 상기 고형물을 여과에 의해 수집하고 고형물을 현탁함으로써 IPA로 2회 세척하였다. 모액을 13g 습윤 고형물을 제공하도록 농축하여 건조시키고 20ml 85:15 IPA/물(v/v)에서 계속하여 현탁하였다. 그것을 여과시키고 IPA로 2회 세척하였다. 습윤 고형물을 1차 여과 후에 얻은 고형물과 화합하였고 중량이 일정하게 될 때까지 진공에서 건조하였다(82.1g, 98% N-아세틸글루코사민, 92% 회수).
< 실시예 41 >
본 실시예는 IPA에 의한 N-아세틸글루코사민의 정제를 기술한다.
IPA는 더 높은 회수를 위해 N-아세틸글루코사민을 정제하는데 사용된다. IPA 및 물의 혼합물(대략 70:30에서 85:15 v/v 비율)을 사용하여 용액에 모든 불순물을 유지하면서 N-아세틸글루코사민을 침전시켰다. 이렇게 하여 얻어진 정제된 N-아세틸글루코사민은 105℃에서 어두워지지 않았다. 이 용매 혼합물의 필요량은 초기 샘플에서 불순물의 양 및 그 용해도에 의존한다.
< 실시예 42 >
본 실시예는 에탄올로 N-아세틸글루코사민을 정제하는 것을 기술한다. 95% 순도 NAG 샘플(40g)을 160-ml 물에 용해시켰다. 혼합물을 교반하면서 에탄올(640ml)을 천천히 가하였다. 현탁액을 실온에서 하룻밤 교반하였다. 고형물을 여과에 의해 수집하고 에탄올에서 현탁에 의해 2회 세척하였다. 진공하에서의 건조에 의해 16.12g의 백색 고형물이 생성되었다(98% NAG, NAG 회수 42%). 이 물질은 2시간 내에 105℃에서 어두워지지 않았다. 본 기술분야의 당업자라면 IPA, 아세토니트릴 또는 메타놀과 같은 다른 물과 혼합가능한 용매를 사용하여 에탄올을 대체할 수 있고 동일한 결과를 얻을 수 있을 것이다.
< 실시예 43 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민의 글루코사민으로의 화학적 가수분해 공정을 보여준다.
발효에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민은 회수될 수 있고 최종 생산물로서 N-아세틸글루코사민의 형태로 정제될 수 있다. 발효에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민은 화학적으로 분리 및 정제되기 전 또는 후에 글루코사민으로 전환될 수 있다. 간단한 안내 실험을 수행하여 N-아세틸글루코사민을 글루코사민으로 화학적 전환을 증명하였다. 첫 번째 실험에서 N-아세틸글루코사민(글루코오스가 없는 M9A 배지에서 10g/l)을 100℃에서 여러 양의 염산을 사용하여 가수분해하였다. 평행 실험에서 글루코사민을 동일하게 처리하여 가수분해 조건하에서 안정성을 관찰하였다. 결과를 도 21 및 22에 나타냈다.
N-아세틸글루코사민의 글루코사민으로의 전환을 가수분해 반응에 의해 생성된 글루코사민의 양을 모니터링함으로써 관찰하였다. Way et al.(Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 23:2861, 2000)에 의해 기술된 것에 기초한 HPLC 방법에 의해 글루코사민을 측정하였다. HPLC 방법의 몇 개의 특정 세부사항이 아래에 기술된다: 컬럼: Phenomenex prodigy ODS(3) C18-5㎛(Phenomenex, Torrance, CA로부터 이용가능함), 150 x 4.6mm; 유동상: 메탄올: 10mM 아세트산 나트륨, 10mM 옥탄황산 나트륨을 포함하는 수용액 버퍼(4:1, v:v), pH 5.1; 유속: 0.7ml/min; 디텍터: 30℃에서의 굴절지수 디텍터.
도 21은 충분히 낮은 pH(<1)에서 가열할 때 N-아세틸글루코사민의 글루코사민으로의 양적 전환을 보여준다. 더 높은 pH에서 가수분해가 일어나지 않거나 또는 형성된 글루코사민이 분해되었다. 도 22는 글루코사민이 1.0 또는 그 이하의 pH에서 열에 안정함을 보여주었다. 더 높은 pH에서 유의적인 양의 글루코사민이 상실되었다.
1.0N 염산(pH<1)을 사용하는 N-아세틸글루코사민의 산 가수분해가 여러 온도에서 조사되었다. 남은 N-아세틸글루코사민의 양 및 형성된 글루코사민의 양이 모니터링되었다. 표준 탄수화물 시스템을 사용하여 HPLC에 의해 N-아세틸글루코사민을 측정하였다. 특정한 세부내용이 아래에 기술된다: 컬럼: Bio-Rad HPX-87H, 7.8mm x 300mm; 유동상: H2O에서 0.1% HNO3: 유속: 0.8ml/min; 디텍터; 30℃에서 굴절 지수 디텍터. 글루코사민을 위에서 기술한 이온쌍 HPLC 컬럼을 사용하여 측정하였다. pH가 1 미만으로 1N 염산으로 산성화된 M9B 배지(이전에 기술함)에서 N-아세틸글루코사민(20g/l)을 35℃, 60℃ 또는 100℃에서 인큐베이션하였다. 그 결과를 도 23에 나타내었다. 100℃에서 2.5시간까지 전환은 완전하였다. 형성된 글루코사민의 어떠한 유의적인 분해도 관찰되지 않았다. 더 낮은 온도에서 약간의 가수분해가 관찰되었으나 이것이 훨씬 더 느렸다.
평행 실험에서 글루코사민(20g/l)을 상기 다른 온도에서 1N 염산으로 인큐베이션하였다. 접종 24시간 후 HPLC에 의해 측정된 바와 같이 어떠한 분해도 관찰되지 않았다(데이터 미기재).
요약해서 N-아세틸글루코사민은 글루코사민으로 화학적으로 용이하게 전환될 수 있고, 가수분해 산물인 글루코사민은 본 실험에서 사용된 가수분해 조건에서 매우 안정하다는 것이 명확하다.
N-아세틸글루코사민의 글루코사민으로의 산 가수분해는 전체 글루코사민 생산 공정에서 주요 단계이다. 따라서 가수분해 실험은 발효 또는 정제된 N-아세틸 글루코사민으로부터 결정화된 N-아세틸글루코사민 물질을 사용하여 수행하였다.
< 실시예 44 >
본 실시예는 높은 염산 농도 및 짧은 시간에서 N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화를 기술한다.
90℃에서의 N-아세틸글루코사민의 산 가수분해를 수행하였다. 염산(12% 및 16%- 37%로부터 부피에 의해 희석됨) 용액에서의 N-아세틸글루코사민(10% 및 20% w/v)을 사용하였다. 12-ml의 테플론으로 선이 그어진 스크류 캡이 장착된 유리 튜브 시리즈를 사용하였다. 각각의 튜브는 다른 시간(0, 15, 30, 45, 60, 90분)으로 표시되었고 각각 2ml의 N-아세틸글루코사민/염산 용액을 포함하였다. 튜브를 90℃에서 평형화된 가열 블록으로 가열하였다. 적절한 시간에 튜브를 제거하고 얼음물에서 신속하게 냉각시켰다. 적절하게 희석하고 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민에 대한 HPLC의 의해 샘플을 분석하였다. 도 24는 N-아세틸글루코사민이 사라지고 글루코사민이 형성되는 것을 나타낸다. N-아세틸글루코사민 소멸의 운동성은 본질적으로 모든 네 개의 용액에서 동일하였다. 가수분해는 90℃에서 매우 빠르게 이루어졌다. 30분까지 약 95%의 N-아세틸글루코사민이 4개의 모든 케이스에서 가수분해되었다. 45분 후 초기 농도의 1% 이하의 N-아세틸글루코사민이 잔류하였다. 60 또는 90분에서는 N-아세틸글루코사민이 관찰되지 않았다. 90℃에서 1시간 후 N-아세틸글루코사민은 20% N-아세틸글루코사민으로도 관찰되지 않았다. 도 24는 10% 글루코사민을 포함하는 튜브에서 글루코사민의 형성을 나타낸다. 90분 후에 글루코사민의 큰 손실이 관찰되었다.
< 실시예 45 >
본 실시예는 오랜 기간동안(24시간) 높은 염산 농도에서 N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화를 기술한다.
글루코사민 분해를 중량당 12% 및 20% 염산을 갖는 5% 및 10% 글루코사민 염화염(w/w)를 사용하여 90℃ 및 100℃에서 조사하였다. 샘플을 1-24시간 인큐베이션하고, 글루타메이트 탈수소효소를 사용하여 암모니아에 대해 효소적으로 분석하였다. 글루코사민은 글루코사민 염화염에 관계된다. 모든 백분율은 w/w이다. 글루코사민 분해는 암모니아 형성에 기초한다. 분해 백분율은 5% 및 10% 용액에 대해 본질적으로 동일하였다. 분해는 더 높은 산 농도에 따라 유의적으로 더 잘 수행되었다. 유사한 현상이 100℃ 실험에서도 관찰되었다. 10도의 온도 증가가 글루코사민 분해를 크게 증가시켰다.
< 실시예 46 >
본 실시예는 높은 염산 농도(30%)에서 N-아세틸글루코사민의 화학적 탈아세틸화를 기술한다.
N-아세틸글루코사민이 혼성화 오븐(hybridization oven)을 사용하여 90℃에서 글루코사민으로 가수분해되었다. 상기 반응을 스크류 캡이 장착된 유리 튜브 내부에서 수행하였다. 30% 염산(30g)을 90℃에서 1시간동안 전배양하였다. 이 10g 고형물 N-아세틸글루코사민을 첨가하고 신속하게 용해한 다음 T0 샘플을 얻었다. 샘플을 30분 간격으로 다음 3시간에 걸쳐서 채취하였다. 용액은 30분 안에 신속하게 어두운 오랜지색/갈색으로 변화하였다. 이 어두워짐은 더 낮은 산 농도에서 이전에 관찰된 것보다 현저하게 더 빨랐다. 45-60분까지 유의적인 고형물 글루코사민이 발견되어 혼합물을 염산에서 글루코사민 염화염 슬러리로 전환하였다. 샘플을 암모니아에 대해 효소적으로 분석하였다. 결과를 도 25에 나타냈다. 도 25는 90℃에서 낮은 농도의 염산을 사용하여 행해진 글루코사민 분해 실험으로부터의 데이터를 보여준다. N-아세틸글루코사민의 분해가 유의적이고, 암모니아의 양에 기초해서 3시간에 약 3.5%이다. 이것은 12% 또는 20%의 염산에서 글루코사민을 사용하여 관찰된 것보다 명확히 훨씬 높다.
< 실시예 47 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민의 효소적 탈아세틸화를 기술한다.
발효 액체배지에서 또는 그 회수 후 N-아세틸글루코사민을 가수분해 하는 효소 공정을 아래에 기술하였다. 3가지 유형의 효소가 지원자이다: N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제(EC 3.5.1.25, NagA), N-아세틸글루코사민 디아세틸라제(EC 3.5.1.3), 키틴 디아세틸라제 및 아크릴 트랜스퍼라제.

N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제 및 N-아세틸글루코사민 디아세틸라제
N-아세틸글루코사민을 탈아세틸화하는 효소가 알려져 있다. Roseman은 대장균, 바실러스 카다베리스(Bacillus cadaveris) 및 스트렙토코코스(Streptococcus)(Roseman S. 1957. J. Biol. Chem., 226:115-124)에서 N-아세틸글루코사민(EC 3.5.1.33)의 탈아세틸화를 촉진하는 효소의 활성을 보고하였다. 일본 그룹(Yamano, Fujishima et al, Osaka National Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology)은 키티나제 생산 박테리움 비브리오 콜레라(Vibrio cholera) non-O1 및 해양 박테리움 알테로모나스(Alteromonas)로부터 N-아세틸글루코사민 디아세틸라제를 연구하였다. 특정 천연 유기물로부터의 N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제 및 N-아세틸글루코사민 디아세틸라제의 제조, 특성 및 사용은 다음의 특허 및 문헌에 개시되어 있다: Fujishima S. et al., 1996, 발명의 명칭: N-아세틸글루코사민 6-포스페이트 디아세틸라제, JP9234064A2; Fujishima S. et al., 1997, 발명의 명칭: N-아세틸글루코사민 6-포스페이트 디아세틸라제를 생산하는 공정, US5744325; 및 Fujishima S. et al., 1996, 발명의 명칭: N-아세틸-D-글루코사민 6-포스페이트 디아세틸라제를 생산하는 공정, EP 0 732 400 B1, 여기서 그들 전체가 통합되어 참조된다.
Fujishima 등에 의해 기술된 상기 디아세틸라제는 N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제(EC 3.5.1.25, NagA)로 확인되었다. N-아세틸글루코사민 6-P를 갖는 친화도 및 효능은 N-아세틸글루코사민를 가질 때보다 훨씬 높았다. 그러나 대장균으로부터 정제된 N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제는 N-아세틸글루코사민에 작 용하지 않는다.
효소 N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제(EC 3.5.1.25, NagA)는 N-아세틸글루코사민, N-아세틸만노사민(N-acetylmannosamine) 및 뉴라미닉 산(neuraminic acid)의 세포 대사에서 필요한 단계인 N-아세틸글루코사민-6-P를 N-아세틸글루코사민으로 전환하는 역할로 잘 알려져 있다. 보통 재조합 대장균 NagA 단백질과 같은 이 효소는 비인산화된 N-아세틸글루코사민에 비활성적이다. N-아세틸글루코사민 6-P 디아세틸라제(nagA 유전자)에 대한 DNA 서열 코딩을 많은 여러 유기체에서 결정하였다. N-아세틸글루코사민에만(그리하여 NagA와 구별되는) 활성이 있는 디아세틸라제가 존재하는지는 알려져 있지 않다.
키틴 디아세틸라제
키틴 디아세틸라제(EC 3.5.1.41)은 키틴에서 N-아세틸글루코사민 단위의 탈아세틸화를 촉진하여 키토산을 생성한다. 키틴 디아세틸라제 활성은 보통 N-아세틸 그룹에서 방사성 표지된 글리코 키틴(부분적으로 O-히드록시에틸레이티드 키틴)을 기질로 사용함으로써 결정할 수 있다. 이 효소는 또한 미세결정 키틴 및 카복시메틸키틴(가용성 유도체)에 작용한다. 그러나 Mucor rouxii로부터의 키틴 디아세틸라제가 N-아세틸글루코사민 단량체 또는 2-3 올리고머를 탈아세틸화하지 않는다는 것이 보고되었다(Araki and Ito, 1975. Eur. J. Biochem. 55:71-78, 여기에서 전체의 참고에 의해 통합된다). 보통의 키틴 디아세틸라제가 글루코사민 단량체를 탈아세틸화하지 않지만 그러한 활성을 갖는 키틴 디아세틸라제 변이는 천연으로부 터 분리되거나 또는 생체외에서 생산될 수 있다.
N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화는 천연 디아세틸라제를 갖는 유기체 또는 재조합 디아세틸라제를 갖는 유기체내에 포함되거나 또는 그로부터 분리되는 디아세틸라제에 의해 수행될 수 있다. 재조합 디아세틸라제는 임의의 또는 유도된 돌연변이 유발에 의해 개선될 수 있다.
다음은 N-아세틸글루코사민 디아세틸라제 및/또는 N-아세틸글루코사민-6-P 디아세틸라제를 사용하는 N-아세틸글루코사민 가수분해 실험을 기술한다.
아실 트랜스퍼라제
다수의 아실 트랜스퍼라제가 기질로부터 아세틸 그룹을 제거할 수 있고, 그것을 또 다른 기질로 운송할 수 있다(Konecny, et al.). 그러한 효소가 N-아세틸글루코사민을 탈아세틸화할 수 있다는 징후는 없지만, 그러한 활성을 갖는 아실 트랜스퍼라제 변이는 천연으로부터 분리되거나 생체외에서 생성될 수 있다.
N-아세틸글루코사민의 탈아세틸화는 천연 아실 트랜스퍼라제를 갖는 유기체 또는 재조합 아실트랜스퍼라제를 갖는 유기체 내에 포함되거나 또는 그로부터 분리되는 아실트랜스퍼라제에 의해 수행될 수 있다. 재조합 아실트랜스퍼라제는 임의의 또는 직접적인 돌연변이 유발 및/또는 단백질 공학에 의해 개선될 수 있다.
한정적인 효소적 가수분해 조건
디아세틸라제를 발현하는 천연 또는 재조합 세포는 표준 조건 또는 최적화 조건에서 성장한다. N-아세틸글루코사민 가수분해는 전체 세포, 천연 효소 추출물 또는 정제된 효소를 촉매로 사용하여 수행된다. 먼저 0.3ml의 10% N-아세틸글루코사민 용액을 기질로서 200mM 포스페이트 버퍼 용액(pH 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0)의 0.1ml에 첨가하였다. 두 번째로 효소 용액 0.1ml를 첨가하였다. 반응 혼합물을 30, 60 및 120분 동안 25, 30, 35, 40, 45 및 50℃에서 인큐베이션하였다. 가수분해 생산물인 글루코사민의 형성을 HPLC 방법으로 관찰하였다. 남은 기질인 N-아세틸글루코사민을 다른 HPLC 방법에 의해 모니터링하였다. 양 HPLC 방법은 이전의 실시예에서 기술하였다.
발효에서 생산된 N-아세틸글루코사민의 가수분해
발효 액체배지의 또는 그 회수 후의 N-아세틸글루코사민을 천연 효소 추출물 또는 정제된 디아세틸라제를 위에서 규정한 조건하에서 촉매로서 사용하여 가수분해하였다. 글루코사민을 염산 용액에서 결정화에 의해 회수하였고 에탄올, 메탄올 또는 이스프로필 알코올에 의해 세척하였다.
< 실시예 48 >
본 실시예는 높은 순도의 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
본 시험의 장치는 가열 맨틀로 가열된 1 리터 원형 기저 베슬로 구성되었다. 상기 성분, 150g의 물, 21g의 98% N-아세틸글루코사민 및 238g의 36.7% 염산을 함께 혼합하고 반응 베슬에 첨가하였다. 교반 반응 혼합을 70℃까지 가열하였고 혼 합액이 비커에 운반되어 20℃로 냉각하는 3시간동안 혼합하였다. 결정은 거의 나타나지 않았다. 혼합물을 반응 베슬로 재운송하고 10g의 N-아세틸글루코사민을 첨가하였다. 반응기를 70℃로 재가열하고 3시간동안 반응시킨 다음 4℃로 하룻밤 냉각시켰다. 존재하는 결정을 여과시키고 에탄올로 세척하고 진공으로 건조한 다음 분석하였다(99.9%에서의 글루코사민 염화염 20g). 여과물을 반응 베슬로 재운송하고 10g의 N-아세틸글루코사민을 첨가하였다. 반응기를 70℃로 재가열하고 3시간동안 반응시키고 하룻밤동안 4℃로 냉각시키고 여과시킨 다음 에탄올로 세척하고, 진공으로 건조하여 분석하였다(99.6%에서의 글루코사민 염화염 16.1g). 여과물을 다시 반응기로 반송하고 41.5g을 첨가하고 반응사이클을 반복하였다. 33g의 글루코사민 염화염이 분석값 99.5%를 갖는 4번째 사이클로부터 생성되었다. 총 수율은 86%였고 모든 글루코사민 염화염은 99+의 분석값과 흰 색상을 나타냈다. 이 물질은 재결정화가 필요하지 않았다.
< 실시예 49 >
본 실시예는 낮은 순도 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
본 시험은 발효 액체배지로부터 농축되고 건조된 N-아세틸글루코사민을 사용하는 실시예 47의 조건을 반복하였다. 고형물은 52%의 N-아세틸글루코사민을 포함하였다. 세 사이클을 수행하였다. 생산된 글루코사민 염화염은 각각의 사이클에 따라 더 어두웠다. 처음 2 샘플은 99.7% 및 99.4%의 분석값을 가졌고 재결정화를 필요로하지 않았다. 세 번째 샘플은 97.7의 분석값을 가졌고 색상이 더 어두웠으 며 재결정화를 필요로 하였다. 전체 수율은 71%였다. 최종 여과물은 실시예 48의 최종 여과물의 투명한 밝은 갈색에 반대로 검갈색이었다.
< 실시예 50 >
본 실시예는 21.8% N-아세틸글루코사민으로 농축된 발효 액체배지의 가수분해를 기술한다.
본 시험을 위한 장치는 4리터의 유리로 덮힌 베슬로 구성된다. 물을 사용하여 반응 베슬을 필요한 온도까지 가열하였다. 218g/l N-아세틸글루코사민을 포함하는 2000ml의 농축된 발효 액체배지를 반응 베슬에 첨가하였다. 1500ml의 36.7% 염산을 첨가하였다. 반응 베슬을 진공하에서 교반하고 70℃까지 가열하였다 반응은 90분동안 계속되었고 310ml의 농축물이 수집되었다. 반응 혼합물을 4℃로 냉각시키고 여과시켰다. 상기 고형물을 265ml의 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 전환은 액체배지에서 N-아세틸글루코사민의 분석에 기초하였고 여과액은 89.5%였다. 세척된 글루코사민 염화염을 물에 용해시켜 1550ml의 용액을 만들었다. 15g의 Darco G-60 활성 탄소를 용액에 첨가하였다. 30분 동안의 혼합 후 용액을 여과하였다: 여과액은 무색을 나타냈다. 여과액을 50℃에서 55-cmHg의 진공으로 진공증발시켰다. 고형물을 에탄올로 세척하고 건조시켰다. 전체 산물은 82%였다.
< 실시예 51 >
본 실시예는 추가 세척 단계를 갖는 낮은 순도의 N-아세틸글루코사민의 가수 분해를 기술한다.
이 시험의 목적은 가수분해 후의 추가 세척단계가 높은 순도의 생산물을 생산하여 재결정화가 불필요하게 되는지 알아보기 위한 것이었다. 농축물 회수가 없는 실시예 49에서 사용된 장치를 사용하였다. 54% N-아세틸글루코사민을 갖는 건조된 발효 액체배지를 20% 염산에 첨가하였다. 산과 N-아세틸글루코사민의 비율은 2.5:1이었다. 이 시리즈에 대한 반응조건은 103분 동안 80℃였다. 여과 후 습윤 케이크를 500g의 물, 529g의 37% 산 및 407g의 에탄올로 세척하였다. 목표는 추가 세척이 재결정화를 필요로 하지 않은 생산물을 생산하는지 여부를 확인하는 것이였다. 글루코사민 염화염 결정은 여전히 조금 황갈색이었고 여전히 재결정화를 필요로 하였다. 전제 산물은 처음 물 세척 때문에 7%의 산물을 상실하여 70%였다. 산 세척은 에탄올이 1.6%를 상실시키는 반면 1%의 산물 상실을 유발하였다.
< 실시예 52 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민의 가수분해동안 탄소 처리를 기술한다.
활성 탄소를 가수분해 후 재결정화 전에 사용하여 불순물을 제거하였다. 이 시험은 활성 탄소를 반응 전의 가수분해 용액에 첨가하는 것과 관계되었다. 전체 34g의 Darco G-60 활성 탄소를 N-아세틸글루코사민 및 염산 반응 혼합물에 첨가하고 30분동안 혼합한 다음 여과하고 반응기에 첨가하였다. 활성 탄소의 1000g 물 세척을 반응기에 첨가하였다. 그 결과의 글루코사민 염화염은 더 밝았지만 여전히 재결정화를 필요로 하였다. 반응조건은 80℃에서 60분간이었다. 29%의 전체 산물 은 추가적인 물에 의한 반응 배지의 희석 때문에 낮았고 초기 염산 농도를 14%로 감소시켰다.
< 실시예 53 >
본 실시예는 낮은 순도 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
본 실시예에 사용된 반응 조건은 온도 90℃에 30분간이었다. 30% 염산과 N-아세틸글루코사민의 비율은 3:1을 사용하였다. 실시예 49에서 사용한 장치를 여기에서 사용하였다. 가수분해량은 86%였다. 원 글루코사민 염화염을 물에 재용해시키고 활성 탄소로 처리하고 여과시킨 다음 50℃ 및 60cm HG에서 진공 결정화시켰다. 최종 분석은 58%의 전체량을 갖는 99.7%였다.
< 실시예 54 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민의 가수분해 동안 탄소 처리를 기술한다.
가수분해 용액의 활성 탄소를 사용하는 2차 시험을 수행하였다. 반응 조건은 50g의 활성 탄소를 가수분해 혼합물에 첨가한 것을 제외하고 실시예 52와 동일하였고, 여과하고 1000g의 물로 활성 탄소를 세척하였다. 반응을 90℃에서 30분간 20% 염산과 N-아세틸글루코사민의 비율이 3:1이 되도록 하여 수행하였다. 실시예 52에 기술된 결과보다 색상의 향상이 명백하지는 않았다. 가수분해 전에 활성 탄소에 의한 이전 시험에서처럼 산을 여과 중 첨가하고 냉각시켜 용해도를 감소시키고 수율을 향상시켰다. 최종 수율은 98.4%의 분석값을 갖는 36%였다.
< 실시예 55 >
본 실시예는 높은 순도를 갖는 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
본 실시예의 목적은 90℃에서 높은 질의 글루코사민이 양질의 N-아세틸글루코사민으로부터의 재결정 필요 없이 생산될 수 있는지를 결정하는 것이었다. 실시예 49의 장치를 사용하여 320g의 N-아세틸글루코사민을 941g의 30% w/w 염산으로 혼합하였다. 상기 혼합물을 덮인 베슬에 첨가하고 90℃로 가열하였다. 가열 시간 및 90℃를 유지하는 추가적인 47분 동안 상기 반응이 일어나도록 하였다. 20℃로 냉각한 다음 습윤 케이크를 여과하고 에탄올로 세척하고 50℃에서 진공으로 건조하였다. 전체 수율은 71%로 가수분해액의 단독 사용과 일치하였다. 생산된 글루코사민 염화염은 검은 담색을 갖는 백색이었고 재결정을 필요로 하였다.
< 실시예 56 >
본 실시예는 순도가 낮은 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
발효 액체배지로부터 분리된 고형물 N-아세틸글루코사민을 사용하여 실시예 54에 기술한 것과 동일한 공정을 수행하였다. N-아세틸글루코사민 고형물의 순도는 48%였다. 1411g의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 혼합물을 4236g의 30% w/w 염산으로 70℃에서 3시간 동안 반응시키고 20℃로 냉각시켰다. 여과 후 습윤 케이크를 에탄올로 세척하고 50℃에서 진공건조하였다. 전체 수율은 90%였다.
< 실시예 57 >
본 실시예는 높은 순도의 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
36.7%의 염산과 순수한 N-아세틸글루코사민의 비율을 2:1로 사용하여 가수분해를 수행하였다. 실시예 49의 장치를 사용하여 2004g의 N-아세틸글루코사민을 4009g의 36.7% w/w 염산과 80℃에서 58분동안 반응시키고 20℃로 냉각하였다. 여과 후 습윤 케이크를 세척하지 않고 실온에서 하룻밤 건조하도록 방치하였다. 최종 케이크는 6%의 염산 및 75.2%의 글루코사민 염화염을 포함하였다. 반응 혼합물은 반응기의 측면에 검은 고형물을 갖는 점성을 나타냈다. 전체 수율은 70%였다.
< 실시예 58 >
본 실시예는 리사이클된 염산을 사용하여 높은 순도의 N-아세틸글루코사민의 가수분해를 기술한다.
전체 회수된 글루코사민 염화염 수율을 증가시키는 방법 중의 하나는 가수분해 모액을 리사이클하는 것이다. 가수분해 반응 후 혼합물을 냉각시키고 여과하였다. 여과물의 중량을 달고 반응기로 다시 리사이클시켰다. 새로운 36.7% 염산을 첨가하여 초기 산 중량과 복귀한 여과물 사이의 중량의 차이를 구성하였다. 이 시리즈는 80℃에서 60분동안 2.5:1 비율의 36.7%의 염산과 N-아세틸글루코사민을 반응시키는 것과 관계되었다. 염산을 순수한 고형물 N-아세틸글루코사민을 포함하는 74℃ 반응기에 첨가하였다. 반응 혼합물을 온도까지 가열하고 60분동안 반응시키고 20℃로 냉각한 다음 여과하였다. 글루코사민 염화염 고형물을 처음 염산의 사 용 후 여과에 의해 회수하고, 수율은 88%로 측정되었다. 여과물의 중량을 재고 반응기에 복귀시켰다. 2차 및 동등한 양의 N-아세틸글루코사민을 충분한 36.7% 염산으로 첨가하여 처음 반응 사이클의 수준으로 산의 중량을 복귀시켰다. 산의 이 2차 사용을 위해 동일한 시간 및 온도로 반응을 반복하였다. 냉각과 여과 후 회수된 수율은 105%이어서 1차 산 사이클로부터 용액에 잔류한 약간의 글루코사민 염화염가 2차 사이클 여과동안 회수되었음을 암시하였다. 3차 사이클을 2차와 동일한 방법으로 수행하였고 회수된 수율은 60%였다. 3회의 사이클 동안 회수된 전체 수율은 87%였다. 이 3차 사이클로부터의 여과물을 다음의 사이클을 위해 저장하였다.
< 실시예 59 >
본 실시예는 N-아세틸글루코사민의 크로마토그래피적 정제를 기술한다.
N-아세틸글루코사민을 정제하기 위해 DOWEXTM Monosphere 99/ K 수지를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 이 수지를 사용하여 2.6 x 23 cm 컬럼을 채워 넣었다. 컬럼 베드 부피는 약 120ml였고 빈 공간 부피는 35ml로 측정되었다(주사기를 사용하여 컬럼으로부터 용액을 누출시켜 측정함). 이 실험에서 양이온 및 음이온 수지로 처리하여 탈이온화된 액체배지를 사용하였다. 이 입력 물질은 N-아세틸글루코사민 약 75.7g/l, 전체 고형물 약 83.4g/l의 농도를 나타내어 약 91%의 순도를 나타냈다. 전도도는 약 0.1mS/cm였다.
처음 실험에서 2ml/min으로 30ml의 샘플을 컬럼을 통해 펌핑하였다. N-아세틸글루코사민이 수지를 갖는 어떤 방법으로 상호작용한다는 것은 명백하였다. N-아세틸글루코사민은 약 60ml까지 발견되지 않았고 빈 부피를 훨씬 지나 90ml에서 매우 넓은 피크로 농축되어 용리되었다. N-아세틸글루코사민 순도는 또한 매우 다양하여 최대값은 90ml에서 약 94.5%의 N-아세틸글루코사민이였다. 이 좁은 영역에서 측정된 순도는 입력 물질의 것보다 더 높았다. 얻어진 분산값은 약 2-3%였다. 더 낮은 농도의 N-아세틸글루코사민을 포함하는 분획에서 순도는 125ml 이상 및 75ml 이하로 빠르게 하강하였다.
동일한 컬럼을 사용하여 2차 실험을 수행하였다. 여기서는 더 작은 5ml 샘플을 더 작은 유속 1ml/min에 적용하였다. 결과는 더 큰 샘플에서 더 빠른 속도일 때와 유사하였다. 단지 하나의 차이점은 N-아세틸글루코사민 중심의 피크가 90ml라기 보다는 80ml였다는 것이다.
총 고형물의 백분율로 측정된 N-아세틸글루코사민 순도는 실험 중 유의적으로 변화하였다. 이것은 어떤 수지와 다른 추측할 수 있는 비이온성 화합물과의 사이에서 N-아세틸글루코사민으로부터의 상호작용에 크로마토그래피적 분리 또는 차이점이 존재한다는 것을 암시하였다. 다른 화합물이 N-아세틸글루코사민와 동일한 방법으로 수지와 상호작용한다면 N-아세틸글루코사민은 N-아세틸글루코사민을 포함하는 모든 분획에서 동일한 수준의 순도를 나타내야 하지만 이 경우에서는 그렇지 않았다.
본 실시예에서 사용된 수지는 본 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 칼슘의 형태로 전환되고 위에서 개설한 바와 같이 동일한 공정이 사용된다.
< 실시예 60 >
본 실시예는 동시에 발생하는 고순도 N-아세틸글루코사민의 가수분해 및 아세테이트의 제거를 기술한다.
N-아세틸글루코사민의 액상 염산 가수분해로부터의 주요한 상호생산물은 아세트산으로 높은 끓는점을 갖고 가수분해 단계동안 쉽게 제거되지 않았다. 가수분해 단계 중 에탄올이나 메탄올과 같은 알코올을 제공하는 것은 아세트산의 에스테르화를 유발하여 에틸 또는 메틸 아세테이트를 각각 감소된 끓는점 때문에 더욱 쉽게 제거되는 상호 생산물로서 형성하였다. 소비된 가수분해물에 존재하는 중요한 불순물인 상호 생산물의 제거로 가수분해 용액에서 염산의 재사용 횟수가 증가하였다.
173g의 메탄올, 189.4g의 36.7% 액상 염산 및 201g의 N-아세틸글루코사민의 혼합물을 교반되고 가열된 유리 베슬에 첨가하고 65℃에서 재유입하에 혼합하였다. 샘플을 1시간에 채취하였다. 적정에 의한 분석에서 8.3%의 글루코사민 염화염, 11.6%의 염산 및 비 유의적인 양의 아세트 산이 나타났다. 2시간 후 반응을 정지하고 20℃로 냉각하였다. 고형물을 메탄올로 세척하고 건조시켰다. 초기 글루코사민 염화염의 수율은 25.6%였다. 가수분해물을 4℃에서 하룻밤 동안 냉각시키고 여과시켰다. 또 다른 10%의 글루코사민 염화염이 산출되었다. 초기 고형물의 순도는 85%였다. 여과에서 아세트 산은 존재하지 않았다.
본 발명의 다양한 실시예가 상세히 기술되어 있지만 당업계에서 본 실시예의 변형 및 응용이 가능함은 명백하다. 그러나 상기 그러한 변형 및 응용은 이하의 청구항에 기재된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 이해되어야 한다.
<110> DENG, Ming-De ANGERER, J. David CYRON, Don GRUND, Alan JERRELL JR., Thomas LEANNA, Candice MATHRE, Owen ROSSON, Reinhardt RUNNING, Jeff SEVERSON, Dave SONG, Linsheng WASSINK, Sarah <120> Process and Materials for Production of Glucosamine and N-Acetyle Glucosamine <150> US 60/393,348 <151> 2002-07-01 <160> 137 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1830 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1827) <400> 1 atg tgt gga att gtt ggc gcg atc gcg caa cgt gat gta gca gaa atc 48 Met Cys Gly Ile Val Gly Ala Ile Ala Gln Arg Asp Val Ala Glu Ile 1 5 10 15 ctt ctt gaa ggt tta cgt cgt ctg gaa tac cgc gga tat gac tct gcc 96 Leu Leu Glu Gly Leu Arg Arg Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Ala 20 25 30 ggt ctg gcc gtt gtt gat gca gaa ggt cat atg acc cgc ctg cgt cgc 144 Gly Leu Ala Val Val Asp Ala Glu Gly His Met Thr Arg Leu Arg Arg 35 40 45 ctc ggt aaa gtc cag atg ctg gca cag gca gcg gaa gaa cat cct ctg 192 Leu Gly Lys Val Gln Met Leu Ala Gln Ala Ala Glu Glu His Pro Leu 50 55 60 cat ggc ggc act ggt att gct cac act cgc tgg gcg acc cac ggt gaa 240 His Gly Gly Thr Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Glu 65 70 75 80 cct tca gaa gtg aat gcg cat ccg cat gtt tct gaa cac att gtg gtg 288 Pro Ser Glu Val Asn Ala His Pro His Val Ser Glu His Ile Val Val 85 90 95 gtg cat aac ggc atc atc gaa aac cat gaa ccg ctg cgt gaa gag cta 336 Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn His Glu Pro Leu Arg Glu Glu Leu 100 105 110 aaa gcg cgt ggc tat acc ttc gtt tct gaa acc gac acc gaa gtg att 384 Lys Ala Arg Gly Tyr Thr Phe Val Ser Glu Thr Asp Thr Glu Val Ile 115 120 125 gcc cat ctg gtg aac tgg gag ctg aaa caa ggc ggg act ctg cgt gag 432 Ala His Leu Val Asn Trp Glu Leu Lys Gln Gly Gly Thr Leu Arg Glu 130 135 140 gcc gtt ctg cgt gct atc ccg cag ctg cgt ggt gcg tac ggt aca gtg 480 Ala Val Leu Arg Ala Ile Pro Gln Leu Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Val 145 150 155 160 atc atg gac tcc cgt cac ccg gat acc ctg ctg gcg gca cgt tct ggt 528 Ile Met Asp Ser Arg His Pro Asp Thr Leu Leu Ala Ala Arg Ser Gly 165 170 175 agt ccg ctg gtg att ggc ctg 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gtt gag cat att cag atc ctc gcc tgt ggt act tct 912 Leu Leu Ser Lys Val Glu His Ile Gln Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser 290 295 300 tat aac tcc ggt atg gtt tcc cgc tac tgg ttt gaa tcg cta gca ggt 960 Tyr Asn Ser Gly Met Val Ser Arg Tyr Trp Phe Glu Ser Leu Ala Gly 305 310 315 320 att ccg tgc gac gtc gaa atc gcc tct gaa ttc cgc tat cgc aaa tct 1008 Ile Pro Cys Asp Val Glu Ile Ala Ser Glu Phe Arg Tyr Arg Lys Ser 325 330 335 gcc gtg cgt cgt aac agc ctg atg atc acc ttg tca cag tct ggc gaa 1056 Ala Val Arg Arg Asn Ser Leu Met Ile Thr Leu Ser Gln Ser Gly Glu 340 345 350 acc gcg gat acc ctg gct ggc ctg cgt ctg tcg aaa gag ctg ggt tac 1104 Thr Ala Asp Thr Leu Ala Gly Leu Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gly Tyr 355 360 365 ctt ggt tca ctg gca atc tgt aac gtt ccg ggt tct tct ctg gtg cgc 1152 Leu Gly Ser Leu Ala Ile Cys Asn Val Pro Gly Ser Ser Leu Val Arg 370 375 380 gaa tcc gat ctg gcg cta atg acc aac gcg ggt aca gaa atc ggc gtg 1200 Glu Ser Asp Leu Ala Leu Met Thr Asn Ala Gly Thr Glu Ile Gly Val 385 390 395 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Leu Glu Met Glu Leu Ala Gln Ile Met Lys Gly Pro Tyr 340 345 350 gac cat ttt atg caa aag gaa atc tat gag caa cca gaa tct act ttc 1104 Asp His Phe Met Gln Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Pro Glu Ser Thr Phe 355 360 365 aat act atg aga ggt aga atc gac tat gaa aat aat aaa gtg ata ttg 1152 Asn Thr Met Arg Gly Arg Ile Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Val Ile Leu 370 375 380 ggt ggt tta aag gca tgg tta cca gtt gtc aga aga gca cgg aga ctg 1200 Gly Gly Leu Lys Ala Trp Leu Pro Val Val Arg Arg Ala Arg Arg Leu 385 390 395 400 atc atg atc gca tgc ggt act tct tat cat tca tgt ttg gct act cgt 1248 Ile Met Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ser Cys Leu Ala Thr Arg 405 410 415 gct atc ttc gaa gaa tta tca gat atc cca gtt agt gtg gaa tta gcg 1296 Ala Ile Phe Glu Glu Leu Ser Asp Ile Pro Val Ser Val Glu Leu Ala 420 425 430 tct gac ttt ctg gac aga aaa tgc cct gtc ttc aga gac gat gta tgc 1344 Ser Asp Phe Leu Asp Arg Lys Cys Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys 435 440 445 gtg ttt gtt tca caa agt ggt gaa act gcg gat acc atg ctg gct 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aaa tct cta ttg tta ttg ggt 1728 Leu Cys Ala Thr Glu Leu Lys Asp Gln Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly 565 570 575 aga ggt tac caa ttt gct gct gct ctg gaa ggt gct ttg aag atc aaa 1776 Arg Gly Tyr Gln Phe Ala Ala Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys 580 585 590 gaa att tct tat atg cat tct gaa ggt gtt ttg gca ggt gag ttg aag 1824 Glu Ile Ser Tyr Met His Ser Glu Gly Val Leu Ala Gly Glu Leu Lys 595 600 605 cac ggt gtc ttg gcc ttg gtg gac gaa aac ttg cca atc att gct ttt 1872 His Gly Val Leu Ala Leu Val Asp Glu Asn Leu Pro Ile Ile Ala Phe 610 615 620 ggt acc aga gac tct cta ttc cct aaa gta gtt tcc tct att gag caa 1920 Gly Thr Arg Asp Ser Leu Phe Pro Lys Val Val Ser Ser Ile Glu Gln 625 630 635 640 gtt act gca aga aag ggc cat cca att att att tgt aac gaa aat gat 1968 Val Thr Ala Arg Lys Gly His Pro Ile Ile Ile Cys Asn Glu Asn Asp 645 650 655 gaa gtg tgg gcg caa aaa tct aaa tca atc gac ctg caa acc tta gaa 2016 Glu Val Trp Ala Gln Lys Ser Lys Ser Ile Asp Leu Gln Thr Leu Glu 660 665 670 gtt cca caa act gtt gat tgt tta caa ggt cta att aat att att cca 2064 Val Pro Gln Thr Val Asp Cys Leu Gln Gly Leu Ile Asn Ile Ile Pro 675 680 685 tta caa cta atg tca tat tgg ttg gct gtt aat aaa ggg att gat gtt 2112 Leu Gln Leu Met Ser Tyr Trp Leu Ala Val Asn Lys Gly Ile Asp Val 690 695 700 gat ttt cca aga aac ttg gct aaa tct gtt acc gtc gaa taa 2154 Asp Phe Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 705 710 715 <210> 18 <211> 717 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 18 Met Cys Gly Ile Phe Gly Tyr Cys Asn Tyr Leu Val Glu Arg Ser Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Asp Thr Leu Val Asp Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr 20 25 30 Arg Gly Tyr Asp Ser Thr Gly Ile Ala Ile Asp Gly Asp Glu Ala Asp 35 40 45 Ser Thr Phe Ile Tyr Lys Gln Ile Gly Lys Val Ser Ala Leu Lys Glu 50 55 60 Glu Ile Thr Lys Gln Asn Pro Asn Arg Asp Val Thr Phe Val Ser His 65 70 75 80 Cys Gly Ile Ala His Thr Arg Trp Ala Thr His Gly Arg Pro Glu Gln 85 90 95 Val Asn Cys His Pro Gln Arg Ser Asp Pro Glu Asp Gln Phe Val Val 100 105 110 Val His Asn Gly Ile Ile Thr Asn Phe Arg Glu Leu Lys Thr Leu Leu 115 120 125 Ile Asn Lys Gly Tyr Lys Phe Glu Ser Asp Thr Asp Thr Glu Cys Ile 130 135 140 Ala Lys Leu Tyr Leu His Leu Tyr Asn Thr Asn Leu Gln Asn Gly His 145 150 155 160 Asp Leu Asp Phe His Glu Leu Thr Lys Leu Val Leu Leu Glu Leu Glu 165 170 175 Gly Ser Tyr Gly Leu Leu Cys Lys Ser Cys His Tyr Pro Asn Glu Val 180 185 190 Ile Ala Thr Arg Lys Gly Ser Pro Leu Leu Ile Gly Val Lys Ser Glu 195 200 205 Lys Lys Leu Lys Val Asp Phe Val Asp Val Glu Phe Pro Glu Glu Asn 210 215 220 Ala Gly Gln Pro Glu Ile Pro Leu Lys Ser Asn Asn Lys Ser Phe Gly 225 230 235 240 Leu Gly Pro Lys Lys Ala Arg Glu Phe Glu Ala Gly Ser Gln Asn Ala 245 250 255 Asn Leu Leu Pro Ile Ala Ala Asn Glu Phe Asn Leu Arg His Ser Gln 260 265 270 Ser Arg Ala Phe Leu Ser Glu Asp Gly Ser Pro Thr Pro Val Glu Phe 275 280 285 Phe Val Ser Ser Asp Ala Ala Ser Val Val Lys His Thr Lys Lys Val 290 295 300 Leu Phe Leu Glu Asp Asp Asp Leu Ala His Ile Tyr Asp Gly Glu Leu 305 310 315 320 His Ile His Arg Ser Arg Arg Glu Val Gly Ala Ser Met Thr Arg Ser 325 330 335 Ile Gln Thr Leu Glu Met Glu Leu Ala Gln Ile Met Lys Gly Pro Tyr 340 345 350 Asp His Phe Met Gln Lys Glu Ile Tyr Glu Gln Pro Glu Ser Thr Phe 355 360 365 Asn Thr Met Arg Gly Arg Ile Asp Tyr Glu Asn Asn Lys Val Ile Leu 370 375 380 Gly Gly Leu Lys Ala Trp Leu Pro Val Val Arg Arg Ala Arg Arg Leu 385 390 395 400 Ile Met Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ser Cys Leu Ala Thr Arg 405 410 415 Ala Ile Phe Glu Glu Leu Ser Asp Ile Pro Val Ser Val Glu Leu Ala 420 425 430 Ser Asp Phe Leu Asp Arg Lys Cys Pro Val Phe Arg Asp Asp Val Cys 435 440 445 Val Phe Val Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr Met Leu Ala Leu 450 455 460 Asn Tyr Cys Leu Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Val Asn Ser 465 470 475 480 Val Gly Ser Ser Ile Ser Arg Val Thr His Cys Gly Val His Ile Asn 485 490 495 Ala Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln 500 505 510 Tyr Ile Ala Leu Val Met Phe Ala Leu Ser Leu Ser Asp Asp Arg Val 515 520 525 Ser Lys Ile Asp Arg Arg Ile Glu Ile Ile Gln Gly Leu Lys Leu Ile 530 535 540 Pro Gly Gln Ile Lys Gln Val Leu Lys Leu Glu Pro Arg Ile Lys Lys 545 550 555 560 Leu Cys Ala Thr Glu Leu Lys Asp Gln Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly 565 570 575 Arg Gly Tyr Gln Phe Ala Ala Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys 580 585 590 Glu Ile Ser Tyr Met His Ser Glu Gly Val Leu Ala Gly Glu Leu Lys 595 600 605 His Gly Val Leu Ala Leu Val Asp Glu Asn Leu Pro Ile Ile Ala Phe 610 615 620 Gly Thr Arg Asp Ser Leu Phe Pro Lys Val Val Ser Ser Ile Glu Gln 625 630 635 640 Val Thr Ala Arg Lys Gly His Pro Ile Ile Ile Cys Asn Glu Asn Asp 645 650 655 Glu Val Trp Ala Gln Lys Ser Lys Ser Ile Asp Leu Gln Thr Leu Glu 660 665 670 Val Pro Gln Thr Val Asp Cys Leu Gln Gly Leu Ile Asn Ile Ile Pro 675 680 685 Leu Gln Leu Met Ser Tyr Trp Leu Ala Val Asn Lys Gly Ile Asp Val 690 695 700 Asp Phe Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 705 710 715 <210> 19 <211> 2142 <212> DNA <213> Candida albicans <220> <221> CDS <222> (1)..(2139) <400> 19 atg tgt ggt att ttt ggt tac gtc aat ttc ttg gtc gac aag agt aga 48 Met Cys Gly Ile Phe Gly Tyr Val Asn Phe Leu Val Asp Lys Ser Arg 1 5 10 15 ggt gaa atc att gat aat tta att gaa ggt ttg caa cga tta gaa tat 96 Gly Glu Ile Ile Asp Asn Leu Ile Glu Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr 20 25 30 aga ggt tat gat tca gca ggc att gct gtt gat ggg aaa tta act aaa 144 Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Ile Ala Val Asp Gly Lys Leu Thr Lys 35 40 45 gat cct tct aat ggt gat gaa gaa tat atg gat tct att att gtt aaa 192 Asp Pro Ser Asn Gly Asp Glu Glu Tyr Met Asp Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 act act ggt aaa gtt aaa gtt ttg aaa caa aaa atc att gat gat caa 240 Thr Thr Gly Lys Val Lys Val Leu Lys Gln Lys Ile Ile Asp Asp Gln 65 70 75 80 atc gat aga tcg gcc att ttt gat aat cat gtt ggt att gct cat act 288 Ile Asp Arg Ser Ala Ile Phe Asp Asn His Val Gly Ile Ala His Thr 85 90 95 aga tgg gct aca cat ggt caa cca aaa act gaa aat tgt cat cct cat 336 Arg Trp Ala Thr His Gly Gln Pro Lys Thr Glu Asn Cys His Pro His 100 105 110 aaa tca gat cca aag ggg gaa ttc att gtt gtt cat aat ggt att att 384 Lys Ser Asp Pro Lys Gly Glu Phe Ile Val Val His Asn Gly Ile Ile 115 120 125 act aat tat gct gct tta aga aaa tat ctt tta tca aaa gga cat gtt 432 Thr Asn Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Gly His Val 130 135 140 ttt gaa agt gaa act gat act gaa tgt att gct aaa tta ttt aaa cat 480 Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Cys Ile Ala Lys Leu Phe Lys His 145 150 155 160 ttt tat gat ttg aat gtt aaa gct ggt gtt ttc cct gat ctt aat gaa 528 Phe Tyr Asp Leu Asn Val Lys Ala Gly Val Phe Pro Asp Leu Asn Glu 165 170 175 ttg act aaa caa gtt ttg cat gaa tta gaa ggt tct tat ggg tta tta 576 Leu Thr Lys Gln Val Leu His Glu Leu Glu Gly Ser Tyr Gly Leu Leu 180 185 190 gtt aaa tct tat cat tat cct gga gaa gtt tgt ggt act aga aaa ggt 624 Val Lys Ser Tyr His Tyr Pro Gly Glu Val Cys Gly Thr Arg Lys Gly 195 200 205 tct cca tta ttg gtt ggt gtt aaa act gat aag aaa tta aaa gtt gat 672 Ser Pro Leu Leu Val Gly Val Lys Thr Asp Lys Lys Leu Lys Val Asp 210 215 220 ttt gtt gac gtt gaa ttt gaa gct caa cag caa cat cga cca caa caa 720 Phe Val Asp Val Glu Phe Glu Ala Gln Gln Gln His Arg Pro Gln Gln 225 230 235 240 cca caa atc aat cat aat ggt gcc act tca gct gct gaa ttg ggc ttt 768 Pro Gln Ile Asn His Asn Gly Ala Thr Ser Ala Ala Glu Leu Gly Phe 245 250 255 atc cca gtg gct cca ggt gaa caa aat tta aga act tct caa tca aga 816 Ile Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Asn Leu Arg Thr Ser Gln Ser Arg 260 265 270 gct ttc ctt tct gaa gat gat tta cct atg cca gtt gaa ttc ttt tta 864 Ala Phe Leu Ser Glu Asp Asp Leu Pro Met Pro Val Glu Phe Phe Leu 275 280 285 tct tct gat cct gca tca gtg gtt caa cac acc aaa aaa gtt tta ttt 912 Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Val Gln His Thr Lys Lys Val Leu Phe 290 295 300 tta gaa gat gat gat att gct cat atc tat gat ggg gaa tta cgt att 960 Leu Glu Asp Asp Asp Ile Ala His Ile Tyr Asp Gly Glu Leu Arg Ile 305 310 315 320 cat aga gct tcg act aaa tct gct ggg gaa tct act gtt aga cca att 1008 His Arg Ala Ser Thr Lys Ser Ala Gly Glu Ser Thr Val Arg Pro Ile 325 330 335 caa act tta gaa atg gaa ttg aat gaa att atg aaa ggc ccc tat aaa 1056 Gln Thr Leu Glu Met Glu Leu Asn Glu Ile Met Lys Gly Pro Tyr Lys 340 345 350 cat ttt atg caa aaa gaa att ttc gaa caa cca gat tct gct ttt aat 1104 His Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Asp Ser Ala Phe Asn 355 360 365 act atg aga ggt aga att gat ttt gaa aat tgt gtt gtt acc ctt ggt 1152 Thr Met Arg Gly Arg Ile Asp Phe Glu Asn Cys Val Val Thr Leu Gly 370 375 380 gga tta aaa tca tgg tta tct aca att aga aga tgt aga aga atc att 1200 Gly Leu Lys Ser Trp Leu Ser Thr Ile Arg Arg Cys Arg Arg Ile Ile 385 390 395 400 atg att gct tgt ggt act tca tat cat tca tgt tta gcc acg aga tca 1248 Met Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ser Cys Leu Ala Thr Arg Ser 405 410 415 att ttt gaa gaa ttg aca gaa atc ccc gtt tcg gtt gaa tta gct tct 1296 Ile Phe Glu Glu Leu Thr Glu Ile Pro Val Ser Val Glu Leu Ala Ser 420 425 430 gat ttc ttg gat aga aga tct cca gtt ttc aga gat gat act tgt gta 1344 Asp Phe Leu Asp Arg Arg Ser Pro Val Phe Arg Asp Asp Thr Cys Val 435 440 445 ttt gtt tct caa tcg ggt gaa act gcc gac tcc att ttg gct tta caa 1392 Phe Val Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Ser Ile Leu Ala Leu Gln 450 455 460 tat tgt ttg gaa aga gga gct tta act gtt ggt atc gtt aac tct gtt 1440 Tyr Cys Leu Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Val Asn Ser Val 465 470 475 480 ggt tct tca atg tct aga caa acc cat tgt ggg gtt cat att aat gct 1488 Gly Ser Ser Met Ser Arg Gln Thr His Cys Gly Val His Ile Asn Ala 485 490 495 ggg cca gaa att ggt gtt gcc tca act aaa gct tac aca tct caa tat 1536 Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Tyr 500 505 510 att gcc ttg gtg atg ttt gcc ctt tct tta tct aat gat tct att tcc 1584 Ile Ala Leu Val Met Phe Ala Leu Ser Leu Ser Asn Asp Ser Ile Ser 515 520 525 aga aag gga aga cat gaa gaa att att aaa ggt tta caa aaa atc cct 1632 Arg Lys Gly Arg His Glu Glu Ile Ile Lys Gly Leu Gln Lys Ile Pro 530 535 540 gaa caa att aaa caa gtt ttg aaa tta gaa aac aag atc aaa gat tta 1680 Glu Gln Ile Lys Gln Val Leu Lys Leu Glu Asn Lys Ile Lys Asp Leu 545 550 555 560 tgt aat agt tca ttg aat gat caa aaa tct tta tta tta tta ggt aga 1728 Cys Asn Ser Ser Leu Asn Asp Gln Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Arg 565 570 575 ggt tat caa ttt gct act gct tta gaa ggg gct tta aaa att aaa gaa 1776 Gly Tyr Gln Phe Ala Thr Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu 580 585 590 att tct tat atg cat tct gaa ggg gta tta gct ggt gaa tta aaa cat 1824 Ile Ser Tyr Met His Ser Glu Gly Val Leu Ala Gly Glu Leu Lys His 595 600 605 ggt ata tta gca tta gtc gat gaa gat tta cca att att gcc ttt gcc 1872 Gly Ile Leu Ala Leu Val Asp Glu Asp Leu Pro Ile Ile Ala Phe Ala 610 615 620 act aga gat tca tta ttt cct aaa gtt atg tcc gct att gaa caa gtc 1920 Thr Arg Asp Ser Leu Phe Pro Lys Val Met Ser Ala Ile Glu Gln Val 625 630 635 640 act gct aga gat ggt aga cca att gtt att tgt aat gaa ggt gat gct 1968 Thr Ala Arg Asp Gly Arg Pro Ile Val Ile Cys Asn Glu Gly Asp Ala 645 650 655 att att tct aat gat aaa gtt cat act act tta gaa gtt cca gaa acc 2016 Ile Ile Ser Asn Asp Lys Val His Thr Thr Leu Glu Val Pro Glu Thr 660 665 670 gtt gat tgt tta caa ggg tta tta aat gtt att cca tta caa ttg att 2064 Val Asp Cys Leu Gln Gly Leu Leu Asn Val Ile Pro Leu Gln Leu Ile 675 680 685 agt tat tgg ttg gct gtg aat aga ggt att gat gtt gat ttc cct cgt 2112 Ser Tyr Trp Leu Ala Val Asn Arg Gly Ile Asp Val Asp Phe Pro Arg 690 695 700 aac ttg gct aaa tca gtt act gtt gag t aa 2142 Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 705 710 <210> 20 <211> 713 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 20 Met Cys Gly Ile Phe Gly Tyr Val Asn Phe Leu Val Asp Lys Ser Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Asp Asn Leu Ile Glu Gly Leu Gln Arg Leu Glu Tyr 20 25 30 Arg Gly Tyr Asp Ser Ala Gly Ile Ala Val Asp Gly Lys Leu Thr Lys 35 40 45 Asp Pro Ser Asn Gly Asp Glu Glu Tyr Met Asp Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Thr Thr Gly Lys Val Lys Val Leu Lys Gln Lys Ile Ile Asp Asp Gln 65 70 75 80 Ile Asp Arg Ser Ala Ile Phe Asp Asn His Val Gly Ile Ala His Thr 85 90 95 Arg Trp Ala Thr His Gly Gln Pro Lys Thr Glu Asn Cys His Pro His 100 105 110 Lys Ser Asp Pro Lys Gly Glu Phe Ile Val Val His Asn Gly Ile Ile 115 120 125 Thr Asn Tyr Ala Ala Leu Arg Lys Tyr Leu Leu Ser Lys Gly His Val 130 135 140 Phe Glu Ser Glu Thr Asp Thr Glu Cys Ile Ala Lys Leu Phe Lys His 145 150 155 160 Phe Tyr Asp Leu Asn Val Lys Ala Gly Val Phe Pro Asp Leu Asn Glu 165 170 175 Leu Thr Lys Gln Val Leu His Glu Leu Glu Gly Ser Tyr Gly Leu Leu 180 185 190 Val Lys Ser Tyr His Tyr Pro Gly Glu Val Cys Gly Thr Arg Lys Gly 195 200 205 Ser Pro Leu Leu Val Gly Val Lys Thr Asp Lys Lys Leu Lys Val Asp 210 215 220 Phe Val Asp Val Glu Phe Glu Ala Gln Gln Gln His Arg Pro Gln Gln 225 230 235 240 Pro Gln Ile Asn His Asn Gly Ala Thr Ser Ala Ala Glu Leu Gly Phe 245 250 255 Ile Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Asn Leu Arg Thr Ser Gln Ser Arg 260 265 270 Ala Phe Leu Ser Glu Asp Asp Leu Pro Met Pro Val Glu Phe Phe Leu 275 280 285 Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Val Gln His Thr Lys Lys Val Leu Phe 290 295 300 Leu Glu Asp Asp Asp Ile Ala His Ile Tyr Asp Gly Glu Leu Arg Ile 305 310 315 320 His Arg Ala Ser Thr Lys Ser Ala Gly Glu Ser Thr Val Arg Pro Ile 325 330 335 Gln Thr Leu Glu Met Glu Leu Asn Glu Ile Met Lys Gly Pro Tyr Lys 340 345 350 His Phe Met Gln Lys Glu Ile Phe Glu Gln Pro Asp Ser Ala Phe Asn 355 360 365 Thr Met Arg Gly Arg Ile Asp Phe Glu Asn Cys Val Val Thr Leu Gly 370 375 380 Gly Leu Lys Ser Trp Leu Ser Thr Ile Arg Arg Cys Arg Arg Ile Ile 385 390 395 400 Met Ile Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His Ser Cys Leu Ala Thr Arg Ser 405 410 415 Ile Phe Glu Glu Leu Thr Glu Ile Pro Val Ser Val Glu Leu Ala Ser 420 425 430 Asp Phe Leu Asp Arg Arg Ser Pro Val Phe Arg Asp Asp Thr Cys Val 435 440 445 Phe Val Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Ser Ile Leu Ala Leu Gln 450 455 460 Tyr Cys Leu Glu Arg Gly Ala Leu Thr Val Gly Ile Val Asn Ser Val 465 470 475 480 Gly Ser Ser Met Ser Arg Gln Thr His Cys Gly Val His Ile Asn Ala 485 490 495 Gly Pro Glu Ile Gly Val Ala Ser Thr Lys Ala Tyr Thr Ser Gln Tyr 500 505 510 Ile Ala Leu Val Met Phe Ala Leu Ser Leu Ser Asn Asp Ser Ile Ser 515 520 525 Arg Lys Gly Arg His Glu Glu Ile Ile Lys Gly Leu Gln Lys Ile Pro 530 535 540 Glu Gln Ile Lys Gln Val Leu Lys Leu Glu Asn Lys Ile Lys Asp Leu 545 550 555 560 Cys Asn Ser Ser Leu Asn Asp Gln Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Arg 565 570 575 Gly Tyr Gln Phe Ala Thr Ala Leu Glu Gly Ala Leu Lys Ile Lys Glu 580 585 590 Ile Ser Tyr Met His Ser Glu Gly Val Leu Ala Gly Glu Leu Lys His 595 600 605 Gly Ile Leu Ala Leu Val Asp Glu Asp Leu Pro Ile Ile Ala Phe Ala 610 615 620 Thr Arg Asp Ser Leu Phe Pro Lys Val Met Ser Ala Ile Glu Gln Val 625 630 635 640 Thr Ala Arg Asp Gly Arg Pro Ile Val Ile Cys Asn Glu Gly Asp Ala 645 650 655 Ile Ile Ser Asn Asp Lys Val His Thr Thr Leu Glu Val Pro Glu Thr 660 665 670 Val Asp Cys Leu Gln Gly Leu Leu Asn Val Ile Pro Leu Gln Leu Ile 675 680 685 Ser Tyr Trp Leu Ala Val Asn Arg Gly Ile Asp Val Asp Phe Pro Arg 690 695 700 Asn Leu Ala Lys Ser Val Thr Val Glu 705 710 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gatcggtctc gcatgtgtgg aatcgtaggt tatatcggtc 40 <210> 22 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gatcctcgag ttactccaca gtaacactct tcgcaaggtt acg 43 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gatcggtctc gcatgtgtgg tatctttggt tac 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gatcgaattc ttattcgacg gtaacagatt tag 33 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gatcggtctc gcatgtgtgg tatttttggt tacgtc 36 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatcctcgag ttactcaaca gtaactgatt tagcc 35 <210> 27 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcgggtaccc atatgtgtgg tatttttggt tacgt 35 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcgggatcct tactcaacag taactgattt agcca 35 <210> 29 <211> 480 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(477) <400> 29 atg agc tta ccc gat gga ttt tat ata agg cga atg gaa gag ggg gat 48 Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp 1 5 10 15 ttg gaa cag gtc act gag acg cta aag gtt ttg acc acc gtg ggc act 96 Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr 20 25 30 att acc ccc gaa tcc ttc agc aaa ctc ata aaa tac tgg aat gaa gcc 144 Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala 35 40 45 aca gta tgg aat gat aac gaa gat aaa aaa ata atg caa tat aac ccc 192 Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro 50 55 60 atg gtg att gtg gac aag cgc acc gag acg gtt gcc gct acg ggg aat 240 Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn 65 70 75 80 atc atc atc gaa aga aag atc att cat gaa ctg ggg cta tgt ggc cac 288 Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His 85 90 95 atc gag gac att gca gta aac tcc aag tat cag ggc caa ggt ttg ggc 336 Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly 100 105 110 aag ctc ttg att gat caa ttg gta act atc ggc ttt gac tac ggt tgt 384 Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys 115 120 125 tat aag att att tta gat tgc gat gag aaa aat gtc aaa ttc tat gaa 432 Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu 130 135 140 aaa tgt ggg ttt agc aac gca ggc gtg gaa atg caa att aga aaa tag 480 Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys 145 150 155 <210> 30 <211> 159 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 30 Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp 1 5 10 15 Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr 20 25 30 Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala 35 40 45 Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro 50 55 60 Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn 65 70 75 80 Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His 85 90 95 Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly 100 105 110 Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys 115 120 125 Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu 130 135 140 Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys 145 150 155 <210> 31 <211> 450 <212> DNA <213> Candida albicans <220> <221> CDS <222> (1)..(447) <400> 31 atg atg tta cca caa ggt tat aca ttc aga aaa cta aaa ctt act gat 48 Met Met Leu Pro Gln Gly Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Lys Leu Thr Asp 1 5 10 15 tat gat aat caa tat tta gaa act tta aaa gtt ttg acg aca gtt ggt 96 Tyr Asp Asn Gln Tyr Leu Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly 20 25 30 gaa att tcc aaa gaa gat ttc act gaa ttg tat aat cat tgg tct tca 144 Glu Ile Ser Lys Glu Asp Phe Thr Glu Leu Tyr Asn His Trp Ser Ser 35 40 45 ttg cca tct att tat cat cca tat gta atc acc aat gca tca ggt ata 192 Leu Pro Ser Ile Tyr His Pro Tyr Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Ile 50 55 60 gtg gta gcc acg ggg atg tta ttt gtg gag aaa aaa ttg att cat gaa 240 Val Val Ala Thr Gly Met Leu Phe Val Glu Lys Lys Leu Ile His Glu 65 70 75 80 tgt ggt aaa gtt ggt cat att gaa gat att tca gtt gct aaa tct gaa 288 Cys Gly Lys Val Gly His Ile Glu Asp Ile Ser Val Ala Lys Ser Glu 85 90 95 caa ggt aaa aaa ttg gga tat tat tta gtc act tca tta acc aaa gtt 336 Gln Gly Lys Lys Leu Gly Tyr Tyr Leu Val Thr Ser Leu Thr Lys Val 100 105 110 gct caa gag aat gat tgt tac aaa gtc att tta gat tgt tct cct gaa 384 Ala Gln Glu Asn Asp Cys Tyr Lys Val Ile Leu Asp Cys Ser Pro Glu 115 120 125 aat gtt ggc ttt tat gaa aaa tgt ggt tat aaa gat ggt ggt gtt gaa 432 Asn Val Gly Phe Tyr Glu Lys Cys Gly Tyr Lys Asp Gly Gly Val Glu 130 135 140 atg gta tgt aga ttc tag 450 Met Val Cys Arg Phe 145 <210> 32 <211> 149 <212> PRT <213> Candida albicans <400> 32 Met Met Leu Pro Gln Gly Tyr Thr Phe Arg Lys Leu Lys Leu Thr Asp 1 5 10 15 Tyr Asp Asn Gln Tyr Leu Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly 20 25 30 Glu Ile Ser Lys Glu Asp Phe Thr Glu Leu Tyr Asn His Trp Ser Ser 35 40 45 Leu Pro Ser Ile Tyr His Pro Tyr Val Ile Thr Asn Ala Ser Gly Ile 50 55 60 Val Val Ala Thr Gly Met Leu Phe Val Glu Lys Lys Leu Ile His Glu 65 70 75 80 Cys Gly Lys Val Gly His Ile Glu Asp Ile Ser Val Ala Lys Ser Glu 85 90 95 Gln Gly Lys Lys Leu Gly Tyr Tyr Leu Val Thr Ser Leu Thr Lys Val 100 105 110 Ala Gln Glu Asn Asp Cys Tyr Lys Val Ile Leu Asp Cys Ser Pro Glu 115 120 125 Asn Val Gly Phe Tyr Glu Lys Cys Gly Tyr Lys Asp Gly Gly Val Glu 130 135 140 Met Val Cys Arg Phe 145 <210> 33 <211> 450 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220> <221> CDS <222> (1)..(447) <400> 33 atg gct gag aca ttc aag atc cga aaa ctg gag atc tcc gat aag aga 48 Met Ala Glu Thr Phe Lys Ile Arg Lys Leu Glu Ile Ser Asp Lys Arg 1 5 10 15 aaa gga ttc atc gag ctt cta ggt caa cta acc gtc acc gga tca gta 96 Lys Gly Phe Ile Glu Leu Leu Gly Gln Leu Thr Val Thr Gly Ser Val 20 25 30 aca gac gaa gaa ttc gat cgg cga ttc gaa gaa atc aga tcg tat ggt 144 Thr Asp Glu Glu Phe Asp Arg Arg Phe Glu Glu Ile Arg Ser Tyr Gly 35 40 45 gac gac cac gtg atc tgc gtg atc gaa gaa gaa act tcg gga aaa atc 192 Asp Asp His Val Ile Cys Val Ile Glu Glu Glu Thr Ser Gly Lys Ile 50 55 60 gct gct acg ggt agt gtg atg ata gag aag aag ttt ctg agg aat tgc 240 Ala Ala Thr Gly Ser Val Met Ile Glu Lys Lys Phe Leu Arg Asn Cys 65 70 75 80 ggt aaa gct ggg cac att gaa gac gtt gtt gtg gat tca agg ttt cgc 288 Gly Lys Ala Gly His Ile Glu Asp Val Val Val Asp Ser Arg Phe Arg 85 90 95 ggg aaa cag ctg ggg aag aaa gtt gtt gag ttt ctt atg gat cat tgc 336 Gly Lys Gln Leu Gly Lys Lys Val Val Glu Phe Leu Met Asp His Cys 100 105 110 aaa tca atg ggt tgc tat aag gtg att cta gat tgt agt gtg gag aac 384 Lys Ser Met Gly Cys Tyr Lys Val Ile Leu Asp Cys Ser Val Glu Asn 115 120 125 aaa gtg ttc tat gag aaa tgt ggg atg agt aat aaa tcg att caa atg 432 Lys Val Phe Tyr Glu Lys Cys Gly Met Ser Asn Lys Ser Ile Gln Met 130 135 140 tct aag tac ttc gat taa 450 Ser Lys Tyr Phe Asp 145 <210> 34 <211> 149 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 34 Met Ala Glu Thr Phe Lys Ile Arg Lys Leu Glu Ile Ser Asp Lys 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accacaaggt tatac 35 <210> 38 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gatcctcgag ctagaatcta cataccattt caac 34 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 gatggtctcg catggctgag acattcaaga tc 32 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gatcctcgag ttaatcgaag tacttagaca tttgaatc 38 <210> 41 <211> 801 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(798) <400> 41 atg aga ctg atc ccc ctg act acc gct gaa cag gtc ggc aaa tgg gct 48 Met Arg Leu Ile Pro Leu Thr Thr Ala Glu Gln Val Gly Lys Trp Ala 1 5 10 15 gct cgc cat atc gtc aat cgt atc aat gcg ttc aaa ccg act gcc gat 96 Ala Arg His Ile Val Asn Arg Ile Asn Ala Phe Lys Pro Thr Ala Asp 20 25 30 cgt ccg ttt gta ctg ggc ctg ccg act ggc ggc acg ccg atg acc acc 144 Arg Pro Phe Val Leu Gly Leu Pro Thr Gly Gly Thr Pro Met Thr Thr 35 40 45 tat aaa gcg tta gtc gaa atg cat aaa gca ggc cag gtc agc ttt aag 192 Tyr Lys Ala Leu Val Glu Met His Lys Ala Gly Gln Val Ser Phe Lys 50 55 60 cac gtt gtc acc ttc aac atg gac gaa tat gtc ggt ctg ccg aaa gag 240 His Val Val Thr Phe Asn Met Asp Glu Tyr Val Gly Leu Pro Lys Glu 65 70 75 80 cat ccg gaa agc tac tac agc ttt atg cac cgt aat ttc ttc gat cac 288 His Pro Glu Ser Tyr Tyr Ser Phe Met His Arg Asn Phe Phe Asp His 85 90 95 gtt gat att cca gca gaa aac atc aac ctt ctc aac ggc aac gcc ccg 336 Val Asp Ile Pro Ala Glu Asn Ile Asn Leu Leu Asn Gly Asn Ala Pro 100 105 110 gat atc gac gcc gag tgc cgc cag tat gaa gaa aaa atc cgt tct tac 384 Asp Ile Asp Ala Glu Cys Arg Gln Tyr Glu Glu Lys Ile Arg Ser Tyr 115 120 125 gga aaa att cat ctg ttt atg ggc ggt gta ggt aac gac ggt cat att 432 Gly Lys Ile His Leu Phe Met Gly Gly Val Gly Asn Asp Gly His Ile 130 135 140 gca ttt aac gaa ccg gcg tct tct ctg gct tct cgt act cgt atc aaa 480 Ala Phe Asn Glu Pro Ala Ser Ser Leu Ala Ser Arg Thr Arg Ile Lys 145 150 155 160 acc ctg act cat gac act cgc gtc gca aac tct cgt ttc ttt gat aac 528 Thr Leu Thr His Asp Thr Arg Val Ala Asn Ser Arg Phe Phe Asp Asn 165 170 175 gat gtt aat cag gtg cca aaa tat gcc ctg act gtc ggt gtt ggt aca 576 Asp Val Asn Gln Val Pro Lys Tyr Ala Leu Thr Val Gly Val Gly Thr 180 185 190 ctg ctg gat gcc gaa gaa gtg atg att ctg gtg ctg ggt agc cag aaa 624 Leu Leu Asp Ala Glu Glu Val Met Ile Leu Val Leu Gly Ser Gln Lys 195 200 205 gca ctg gcg ctg cag gcc gcc gtt gaa ggt tgc gtg aac cat atg tgg 672 Ala Leu Ala Leu Gln Ala Ala Val Glu Gly Cys Val Asn His Met Trp 210 215 220 acc atc agc tgt ctg caa ctg cat ccg aaa gcg atc atg gtg tgc gat 720 Thr Ile Ser Cys Leu Gln Leu His Pro Lys Ala Ile Met Val Cys Asp 225 230 235 240 gaa cct tcc acc atg gag ctg aaa gtt aag act tta aga tat ttc aat 768 Glu Pro Ser Thr Met Glu Leu Lys Val Lys Thr Leu Arg Tyr Phe Asn 245 250 255 gaa tta gaa gca gaa aat atc aaa ggt ctg ta a 801 Glu Leu Glu Ala Glu Asn Ile Lys Gly Leu 260 265 <210> 42 <211> 266 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 42 Met Arg Leu Ile Pro Leu Thr Thr Ala Glu Gln Val Gly Lys 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Thr Ile Ser Cys Leu Gln Leu His Pro Lys Ala Ile Met Val Cys Asp 225 230 235 240 Glu Pro Ser Thr Met Glu Leu Lys Val Lys Thr Leu Arg Tyr Phe Asn 245 250 255 Glu Leu Glu Ala Glu Asn Ile Lys Gly Leu 260 265 <210> 43 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gatggtctcg catgagactg atccccctga c 31 <210> 44 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatcctcgag ttacagacct ttgatatttt ctgcttctaa ttc 43 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gatcctcgag ttacagacct ttgatatttt ctgcttctaa ttc 43 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 gatcctgcag tcatgctgct aataatctat cc 32 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gatctacgta agcaaccgca cctgtggc 28 <210> 48 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gatccaattg atccggatat agttcctcct ttcagc 36 <210> 49 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gatgcggccg catgttgaat aatgctatga gcgtagtgat c 41 <210> 50 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gatcgtcgac ttagtacagc ggcttaccgc tactgtc 37 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gatgcggccg catggcaatg acttaccacc tggac 35 <210> 52 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 cgtacccagc tgctctgcct gaagcaccc 29 <210> 53 <211> 1338 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1335) <400> 53 atg agt aat cgt aaa tat ttc ggt acc gat ggg att cgt ggt cgt gta 48 Met Ser Asn Arg Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Gly Arg Val 1 5 10 15 ggg gat gcg ccg atc aca cct gat ttt gtg ctt aag ctg ggt tgg gcc 96 Gly Asp Ala Pro Ile Thr Pro Asp Phe Val Leu Lys Leu Gly Trp Ala 20 25 30 gcg ggt aaa gtg ctg gcg cgc cac ggc tcc cgt aag att att att ggt 144 Ala Gly Lys Val Leu Ala Arg His Gly Ser Arg Lys Ile Ile Ile Gly 35 40 45 aaa gac acg cgt att tct ggc tat atg ctg gag tca gca ctg gaa gcg 192 Lys Asp Thr Arg Ile Ser Gly Tyr Met Leu Glu Ser Ala Leu Glu Ala 50 55 60 ggt ctg gcg gca gcg ggc ctt tcc gca ctc ttc act ggc ccg atg cca 240 Gly Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Ala Leu Phe Thr Gly Pro Met Pro 65 70 75 80 aca ccg gcc gtg gct tat ctg acg cgt acc ttc cgc gca gag gcc gga 288 Thr Pro Ala Val Ala Tyr Leu Thr Arg Thr Phe Arg Ala Glu Ala Gly 85 90 95 att gtg ata tct gca tcg cat aac ccg ttc tac gat aat ggc att aaa 336 Ile Val Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Phe Tyr Asp Asn Gly Ile Lys 100 105 110 ttc ttc tct atc gac ggc acc aaa ctg ccg gat gcg gta gaa gag gcc 384 Phe Phe Ser Ile Asp Gly Thr Lys Leu Pro Asp Ala Val Glu Glu Ala 115 120 125 atc gaa gcg gaa atg gaa aag gag atc agc tgc gtt gat tcg gca gaa 432 Ile Glu Ala Glu Met Glu Lys Glu Ile Ser Cys Val Asp Ser Ala Glu 130 135 140 ctg ggt aaa gcc agc cgt atc gtt gat gcc gcg ggt cgc tat atc gag 480 Leu Gly Lys Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Ala Gly Arg Tyr Ile Glu 145 150 155 160 ttt tgc aaa gcc acg ttc ccg aac gaa ctt agc ctc agt gaa ctg aag 528 Phe Cys Lys Ala Thr Phe Pro Asn Glu Leu Ser Leu Ser Glu Leu Lys 165 170 175 att gtg gtg gat tgt gca aac ggt gcg act tat cac atc gcg ccg aac 576 Ile Val Val Asp Cys Ala Asn Gly Ala Thr Tyr His Ile Ala Pro Asn 180 185 190 gtg ctg cgc gaa ctg ggg gcg aac gtt atc gct atc ggt tgt gag cca 624 Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Asn Val Ile Ala Ile Gly Cys Glu Pro 195 200 205 aac ggt gta aac atc aat gcc gaa gtg ggg gct acc gac gtt cgc gcg 672 Asn Gly Val Asn Ile Asn Ala Glu Val Gly Ala Thr Asp Val Arg Ala 210 215 220 ctc cag gct cgt gtg ctg gct gaa aaa gcg gat ctc ggt att gcc ttc 720 Leu Gln Ala Arg Val Leu Ala Glu Lys Ala Asp Leu Gly Ile Ala Phe 225 230 235 240 gac ggc gat ggc gat cgc gtg att atg gtt gac cat gaa ggc aat aaa 768 Asp Gly Asp Gly Asp Arg Val Ile Met Val Asp His Glu Gly Asn Lys 245 250 255 gtc gat ggc gat cag atc atg tat atc atc gcg cgt gaa ggt ctt cgt 816 Val Asp Gly Asp Gln Ile Met Tyr Ile Ile Ala Arg Glu Gly Leu Arg 260 265 270 cag ggc 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tat tcc gat ctt ccg aaa gtg ctg cat acc ctt gcc ggg 96 Thr Arg Met Tyr Ser Asp Leu Pro Lys Val Leu His Thr Leu Ala Gly 20 25 30 aaa gcg atg gtt cag cat gtc att gat gct gcg aat gaa tta ggc gca 144 Lys Ala Met Val Gln His Val Ile Asp Ala Ala Asn Glu Leu Gly Ala 35 40 45 gcg cac gtt cac ctg gtg tac ggt cac ggc ggc gat ctg cta aaa cag 192 Ala His Val His Leu Val Tyr Gly His Gly Gly Asp Leu Leu Lys Gln 50 55 60 gcg ctg aaa gac gac aac ctt aac tgg gtg ctt cag gca gag cag ctg 240 Ala Leu Lys Asp Asp Asn Leu Asn Trp Val Leu Gln Ala Glu Gln Leu 65 70 75 80 ggt acg ggt cat gca atg cag cag gcc gca cct ttc ttt gcc gat gat 288 Gly Thr Gly His Ala Met Gln Gln Ala Ala Pro Phe Phe Ala Asp Asp 85 90 95 gaa gac att tta atg ctc tac ggc gac gtg ccg ctg atc tct gtc gaa 336 Glu Asp Ile Leu Met Leu Tyr Gly Asp Val Pro Leu Ile Ser Val Glu 100 105 110 aca ctc cag cgt ctg cgt gat gct aaa ccg cag ggt ggc att ggt ctg 384 Thr Leu Gln Arg Leu Arg Asp Ala Lys Pro Gln Gly Gly Ile Gly Leu 115 120 125 ctg acg gtg aaa ctg gat gat ccg acc ggt tat gga cgt atc acc cgt 432 Leu Thr Val Lys Leu Asp Asp Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Ile Thr Arg 130 135 140 gaa aac ggc aaa gtt acc ggc att gtt gag cac aaa gat gcc acc gac 480 Glu Asn Gly Lys Val Thr Gly Ile Val Glu His Lys Asp Ala Thr Asp 145 150 155 160 gag cag cgt cag att cag gag atc aac acc ggc att ctg att gcc aac 528 Glu Gln Arg Gln Ile Gln Glu Ile Asn Thr Gly Ile Leu Ile Ala Asn 165 170 175 ggc gca gat atg aaa cgc tgg ctg gcg aag ctg acc aac aat aat gct 576 Gly Ala Asp Met Lys Arg Trp Leu Ala Lys Leu Thr Asn Asn Asn Ala 180 185 190 cag ggc gaa tac tac atc acc gac att att gcg ctg gcg tat cag gaa 624 Gln Gly Glu Tyr Tyr Ile Thr Asp Ile Ile Ala Leu Ala Tyr Gln Glu 195 200 205 ggg cgt gaa atc gtc gcc gtt cat ccg caa cgt tta agc gaa gta gaa 672 Gly Arg Glu Ile Val Ala Val His Pro Gln Arg Leu Ser Glu Val Glu 210 215 220 ggc gtg aat aac cgc ctg caa ctc tcc cgt ctg gag cgt gtt tat cag 720 Gly Val Asn Asn Arg Leu Gln Leu Ser Arg Leu Glu Arg Val Tyr Gln 225 230 235 240 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Ala Leu Phe Val Arg Arg Asp Glu Val Glu Glu Ala Trp Lys Trp 435 440 445 Val Asp Ser Ile Thr Glu Ala Trp Ala Met Asp Asn Asp Ala Pro Lys 450 455 460 Pro Tyr Gln Ala Gly Thr Trp Gly Pro Val Ala Ser Val Ala Met Ile 465 470 475 480 Thr Arg Asp Gly Arg Ser Trp Asn Glu Phe Glu 485 490 <210> 96 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 gatcggtctc gcatggcggt aacgcaaaca gc 32 <210> 97 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 gatcctcgag ttactcaaac tcattccagg aacgacc 37 <210> 98 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 cgaatatcac gcggtgacca gttaaac 27 <210> 99 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 cacagtgtgc cgatgatttt gacc 24 <210> 100 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 gaccaatggc ctaatggagc aaccgcacct gtggc 35 <210> 101 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 101 gatcagcgct atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccc 46 <210> 102 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 102 gatgctagct aaccggagct catagggc 28 <210> 103 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 103 gatttcgaat gatcagtgtc agatttttac cc 32 <210> 104 <211> 1650 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1647) <400> 104 atg aaa aac atc aat cca acg cag acc gct gcc tgg cag gca cta cag 48 Met Lys Asn Ile Asn Pro Thr Gln Thr Ala Ala Trp Gln Ala Leu Gln 1 5 10 15 aaa cac ttc gat gaa atg aaa gac gtt acg atc gcc gat ctt ttt gct 96 Lys His Phe Asp Glu Met Lys Asp Val Thr Ile Ala Asp Leu Phe Ala 20 25 30 aaa gac ggc gat cgt ttt tct aag ttc tcc gca acc ttc gac gat cag 144 Lys Asp Gly Asp Arg Phe Ser Lys Phe Ser Ala Thr Phe Asp Asp Gln 35 40 45 atg ctg gtg gat tac tcc aaa aac cgc atc act gaa gag acg ctg gcg 192 Met Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Arg Ile Thr Glu Glu Thr Leu Ala 50 55 60 aaa tta cag gat ctg gcg aaa gag tgc gat ctg gcg ggc gcg att aag 240 Lys Leu Gln Asp Leu Ala Lys Glu Cys Asp Leu Ala Gly Ala Ile Lys 65 70 75 80 tcg atg ttc tct ggc gag aag atc aac cgc act gaa aac cgc gcc gtg 288 Ser Met Phe Ser Gly Glu Lys Ile Asn Arg Thr Glu Asn Arg Ala Val 85 90 95 ctg cac gta gcg ctg cgt aac cgt agc aat acc ccg att ttg gtt gat 336 Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu Val Asp 100 105 110 ggc aaa gac gta atg ccg gaa gtc aac gcg gtg ctg gag aag atg aaa 384 Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Ala Val Leu Glu Lys Met Lys 115 120 125 acc ttc tca gaa gcg att att tcc ggt gag tgg aaa ggt tat acc ggc 432 Thr Phe Ser Glu Ala Ile Ile Ser Gly Glu Trp Lys Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 aaa gca atc act gac gta gtg aac atc ggg atc ggc ggt tct gac ctc 480 Lys Ala Ile Thr Asp Val Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu 145 150 155 160 ggc cca tac atg gtg acc gaa gct ctg cgt ccg tac aaa aac cac ctg 528 Gly Pro Tyr Met Val Thr Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Lys Asn His Leu 165 170 175 aac atg cac ttt gtt tct aac gtc gat ggg act cac atc gcg gaa gtg 576 Asn Met His Phe Val Ser Asn Val Asp Gly Thr His Ile Ala Glu Val 180 185 190 ctg aaa aaa gta aac ccg gaa acc acg ctg ttc ttg gta gca tct aaa 624 Leu Lys Lys Val Asn Pro Glu Thr Thr Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys 195 200 205 acc ttc acc act cag gaa act atg acc aac gcc cat agc gcg cgt gac 672 Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Met Thr Asn Ala His Ser Ala Arg Asp 210 215 220 tgg ttc ctg aaa gcg gca ggt gat gaa aaa cac gtt gca aaa cac ttt 720 Trp Phe Leu Lys Ala Ala Gly Asp Glu Lys His Val Ala Lys His Phe 225 230 235 240 gcg gcg ctt tcc acc aat gcc aaa gcc gtt ggc gag ttt ggt att gat 768 Ala Ala Leu Ser Thr Asn Ala Lys Ala Val Gly Glu Phe Gly Ile Asp 245 250 255 act gcc aac atg ttc gag ttc tgg gac tgg gtt ggc ggc cgt tac tct 816 Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser 260 265 270 ttg tgg tca gcg att ggc ctg tcg att gtt ctc tcc atc ggc ttt gat 864 Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Ile Gly Phe Asp 275 280 285 aac ttc gtt gaa ctg ctt tcc ggc gca cac gcg atg gac aag cat ttc 912 Asn Phe Val Glu Leu Leu Ser Gly Ala His Ala Met Asp Lys His Phe 290 295 300 tcc acc acg cct gcc gag aaa aac ctg cct gta ctg ctg gcg ctg att 960 Ser Thr Thr Pro Ala Glu Lys Asn Leu Pro Val Leu Leu Ala Leu Ile 305 310 315 320 ggc atc tgg tac aac aat ttc ttt ggt gcg gaa act gaa gcg att ctg 1008 Gly Ile Trp Tyr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Glu Thr Glu Ala Ile Leu 325 330 335 ccg tat gac cag tat atg cac cgt ttc gcg gcg tac ttc cag cag ggc 1056 Pro Tyr Asp Gln Tyr Met His Arg Phe Ala Ala Tyr Phe Gln Gln Gly 340 345 350 aat atg gag tcc aac ggt aag tat gtt gac cgt aac ggt aac gtt gtg 1104 Asn Met Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Val Asp Arg Asn Gly Asn Val Val 355 360 365 gat tac cag act ggc ccg att atc tgg ggt gaa cca ggc act aac ggt 1152 Asp Tyr Gln Thr Gly Pro Ile Ile Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly 370 375 380 cag cac gcg ttc tac cag ctg atc cac cag gga acc aaa atg gta ccg 1200 Gln His Ala Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly Thr Lys Met Val Pro 385 390 395 400 tgc gat ttc atc gct ccg gct atc acc cat aac ccg ctc tct gat cat 1248 Cys Asp Phe Ile Ala Pro Ala Ile Thr His Asn Pro Leu Ser Asp His 405 410 415 cac cag aaa ctg ctg tct aac ttc ttc gcc cag acc gaa gcg ctg gcg 1296 His Gln Lys Leu Leu Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Glu Ala Leu Ala 420 425 430 ttt ggt aaa tcc cgc gaa gtg gtt gag cag gaa tat cgt gat cag ggt 1344 Phe Gly Lys Ser Arg Glu Val Val Glu Gln Glu Tyr Arg Asp Gln Gly 435 440 445 aaa gat ccg gca acg ctt gac tac gtg gtg ccg ttc aaa gta ttc gaa 1392 Lys Asp Pro Ala Thr Leu Asp Tyr Val Val Pro Phe Lys Val Phe Glu 450 455 460 ggt aac cgc ccg acc aac tcc atc ctg ctg cgt gaa atc act ccg ttc 1440 Gly Asn Arg Pro Thr Asn Ser Ile Leu Leu Arg Glu Ile Thr Pro Phe 465 470 475 480 agc ctg ggt gcg ttg att gcg ctg tat gag cac aaa atc ttt act cag 1488 Ser Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Lys Ile Phe Thr Gln 485 490 495 ggc gtg atc ctg aac atc ttc acc ttc gac cag tgg ggc gtg gaa ctg 1536 Gly Val Ile Leu Asn Ile Phe Thr Phe Asp Gln Trp Gly Val Glu Leu 500 505 510 ggt aaa cag ctg gcg aac cgt att ctg cca gag ctg aaa gat gat aaa 1584 Gly Lys Gln Leu Ala Asn Arg Ile Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Lys 515 520 525 gaa atc agc agc cac gat agc tcg acc aat ggt ctg att aac cgc tat 1632 Glu Ile Ser Ser His Asp Ser Ser Thr Asn Gly Leu Ile Asn Arg Tyr 530 535 540 aaa gcg tgg cgc ggt taa 1650 Lys Ala Trp Arg Gly 545 <210> 105 <211> 549 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 105 Met Lys Asn Ile Asn Pro Thr Gln Thr Ala Ala Trp Gln Ala Leu Gln 1 5 10 15 Lys His Phe Asp Glu Met Lys Asp Val Thr Ile Ala Asp Leu Phe Ala 20 25 30 Lys Asp Gly Asp Arg Phe Ser Lys Phe Ser Ala Thr Phe Asp Asp Gln 35 40 45 Met Leu Val Asp Tyr Ser Lys Asn Arg Ile Thr Glu Glu Thr Leu Ala 50 55 60 Lys Leu Gln Asp Leu Ala Lys Glu Cys Asp Leu Ala Gly Ala Ile Lys 65 70 75 80 Ser Met Phe Ser Gly Glu Lys Ile Asn Arg Thr Glu Asn Arg Ala Val 85 90 95 Leu His Val Ala Leu Arg Asn Arg Ser Asn Thr Pro Ile Leu Val Asp 100 105 110 Gly Lys Asp Val Met Pro Glu Val Asn Ala Val Leu Glu Lys Met Lys 115 120 125 Thr Phe Ser Glu Ala Ile Ile Ser Gly Glu Trp Lys Gly Tyr Thr Gly 130 135 140 Lys Ala Ile Thr Asp Val Val Asn Ile Gly Ile Gly Gly Ser Asp Leu 145 150 155 160 Gly Pro Tyr Met Val Thr Glu Ala Leu Arg Pro Tyr Lys Asn His Leu 165 170 175 Asn Met His Phe Val Ser Asn Val Asp Gly Thr His Ile Ala Glu Val 180 185 190 Leu Lys Lys Val Asn Pro Glu Thr Thr Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys 195 200 205 Thr Phe Thr Thr Gln Glu Thr Met Thr Asn Ala His Ser Ala Arg Asp 210 215 220 Trp Phe Leu Lys Ala Ala Gly Asp Glu Lys His Val Ala Lys His Phe 225 230 235 240 Ala Ala Leu Ser Thr Asn Ala Lys Ala Val Gly Glu Phe Gly Ile Asp 245 250 255 Thr Ala Asn Met Phe Glu Phe Trp Asp Trp Val Gly Gly Arg Tyr Ser 260 265 270 Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Ser Ile Val Leu Ser Ile Gly Phe Asp 275 280 285 Asn Phe Val Glu Leu Leu Ser Gly Ala His Ala Met Asp Lys His Phe 290 295 300 Ser Thr Thr Pro Ala Glu Lys Asn Leu Pro Val Leu Leu Ala Leu Ile 305 310 315 320 Gly Ile Trp Tyr Asn Asn Phe Phe Gly Ala Glu Thr Glu Ala Ile Leu 325 330 335 Pro Tyr Asp Gln Tyr Met His Arg Phe Ala Ala Tyr Phe Gln Gln Gly 340 345 350 Asn Met Glu Ser Asn Gly Lys Tyr Val Asp Arg Asn Gly Asn Val Val 355 360 365 Asp Tyr Gln Thr Gly Pro Ile Ile Trp Gly Glu Pro Gly Thr Asn Gly 370 375 380 Gln His Ala Phe Tyr Gln Leu Ile His Gln Gly Thr Lys Met Val Pro 385 390 395 400 Cys Asp Phe Ile Ala Pro Ala Ile Thr His Asn Pro Leu Ser Asp His 405 410 415 His Gln Lys Leu Leu Ser Asn Phe Phe Ala Gln Thr Glu Ala Leu Ala 420 425 430 Phe Gly Lys Ser Arg Glu Val Val Glu Gln Glu Tyr Arg Asp Gln Gly 435 440 445 Lys Asp Pro Ala Thr Leu Asp Tyr Val Val Pro Phe Lys Val Phe Glu 450 455 460 Gly Asn Arg Pro Thr Asn Ser Ile Leu Leu Arg Glu Ile Thr Pro Phe 465 470 475 480 Ser Leu Gly Ala Leu Ile Ala Leu Tyr Glu His Lys Ile Phe Thr Gln 485 490 495 Gly Val Ile Leu Asn Ile Phe Thr Phe Asp Gln Trp Gly Val Glu Leu 500 505 510 Gly Lys Gln Leu Ala Asn Arg Ile Leu Pro Glu Leu Lys Asp Asp Lys 515 520 525 Glu Ile Ser Ser His Asp Ser Ser Thr Asn Gly Leu Ile Asn Arg Tyr 530 535 540 Lys Ala Trp Arg Gly 545 <210> 106 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 106 gatcggtctc gcatgaaaaa catcaatcca acgcagac 38 <210> 107 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 107 gatcctcgag ttaaccgcgc cacgctttat agc 33 <210> 108 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 108 ggatcctacc tgacgctttt tatcgcaact c 31 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 109 cggacgcaca tcggcctcgt agac 24 <210> 110 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 110 gattccggaa gcaaccgcac ctgtggc 27 <210> 111 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 111 gatcacctgg ttatagttcc tcctttcagc aaaaaaccc 39 <210> 112 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 112 gagtcatccg gatacagtac gcga 24 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 113 ataaaccagc cgggcaaatg g 21 <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 114 cgccaagctt ggtaccg 17 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 115 ccctctagat gcatgctcga g 21 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 116 attgtgcgct cagtatagga agg 23 <210> 117 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 117 cgatactgac gggctccag 19 <210> 118 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 118 gcaaaacctt tcgcggtcac ccatgatagc gcccg 35 <210> 119 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 119 cgggcgctat catgggtgac cgcgaaaggt tttgc 35 <210> 120 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 120 cacaggaaac acatatgacc atgattacgg 30 <210> 121 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 121 ccaccatgat attcggcaag cag 23 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 122 cctttcgcgg tcaccagcaa a 21 <210> 123 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 123 ccgtaatcat ggtcatatgt gtttcctgtg 30 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 124 gacgaagcgg ccgcgtaaac g 21 <210> 125 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 125 cacacaggaa acagctatga ccatgattac ggattcactg g 41 <210> 126 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 126 ccagtgaatc cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt g 41 <210> 127 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 127 gatcccggga acggacgatt agagatcacc 30 <210> 128 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 128 gtcagagaag tcgttcttag cgatg 25 <210> 129 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 129 ggatctaaac ctcagtagcg accggtctag aactagtg 38 <210> 130 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 130 ccctcgcccc tctagagcat ttaaattcag tcaattac 38 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 131 cacgcaggca ggctttacct tcttc 25 <210> 132 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 132 cggaagaaca agcgacggaa ggac 24 <210> 133 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 133 cacgataaac ggtgaagcca tgtc 24 <210> 134 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 134 cgtccatttt cttgaacgct tcatccc 27 <210> 135 <211> 698 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 135 cctttcgcgg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc 60 gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg 120 aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg 180 agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc 240 gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg 300 ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc 360 tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg 420 gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc 480 aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 540 gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 600 ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 660 caatttcaca caggaaacac atatgaccat gattacgg 698 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 ggcggcttaa aatgtcctga atg 23 <210> 137 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 cgaaatcatc gttgccagta actttacg 28

Claims (212)

  1. a) 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시킨 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 미생물을 발효 배지에서 배양하는 단계; 및
    b) 상기 배양 단계로부터 생산된 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생산물을 수집하는 단계를 포함하는, 발효에 의한 글루코사민 또는 N-아세틸글루코사민의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 감소된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산 억제; 및 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로 이루어진 군으로부터 선택되는 결과를 제공하는 것인 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것인 제조방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열은 글루코오스-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 효소 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 갖는 것인 제조방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 3항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자의 발현이 유도될 수 있는 것인 제조방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 재조합 핵산 분자의 발현이 락토오스에 의해 유도될 수 있는 것인 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 미생물은 락토오스에 의한 전사 유도의 억제를 감소시키는 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 유전적 변형은 LacI 리프레서 단백질을 암호화하는 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함하는 제조방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것인 제조방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제 14항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 아미노산 서열은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 16, 서열번호 18 및 서열번호 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  19. 제 14항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 신타제는 야생형 글루코사민-6-포스페이트 신타제와 비교했을 때 글루코사민-6-포스페이트 신타제에 대한 생산물의 억제를 감소시키는 유전적 변형을 갖는 것인 제조방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 아미노산 서열은 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10, 서열번호 12 및 서열번호 14로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인 제조방법.
  21. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시킨 적어도 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함하는 제조방법.
  23. 제 13항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 유전적 변형은 미생물의 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제를 암호화하는 내인성 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 포함하는 제조방법.
  25. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 발효 배지 중 탄소원을 0.5 (중량/부피)% 내지 5 (중량/부피)% 농도로 유지하는 단계를 포함하는 제조방법.
  26. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 효모 추출물을 포함하는 발효 배지에서 수행하는 제조방법.
  27. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 글루코오스, 프룩토오스, 오탄당, 락토오스 및 글루콘산으로 이루어진 군으로부터 선택된 탄소원을 포함하는 발효 배지에서 수행되는 제조방법.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 오탄당은 리보오스, 크실로오스 및 아라비노스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  29. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 글루코오스 및 리보오스를 포함하는 발효 배지에서 수행되는 제조방법.
  30. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 글루코오스 및 글루콘산을 포함하는 발효 배지에서 수행되는 제조방법.
  31. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 25℃ 내지 45℃의 온도에서 수행되는 제조방법.
  32. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 37℃에서 수행되는 제조방법.
  33. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 pH 4 내지 pH 7.5의 pH에서 수행되는 제조방법.
  34. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 pH 6.7 내지 pH 7.5의 pH에서 수행되는 제조방법.
  35. 제 1항에 있어서, 상기 배양 단계는 pH 4.5 내지 pH 5의 pH에서 수행되는 제조방법.
  36. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아 및 곰팡이로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  37. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 박테리아 및 효모로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  38. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아(Escherichia), 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속 유래의 박테리아인 제조방법.
  39. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종 유래의 박테리아인 제조방법.
  40. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 및 파피아(Phaffia)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속 유래의 효모인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  41. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 카나덴시스(P. canadensis), 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 및 파피라 로도지마(Phaffia rhodozyma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종 유래의 효모인 제조방법.
  42. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(Aspergillus), 압시디아(Absidia), 리조푸스(Rhizopus), 크리소스포리움(Chrysosporium), 뉴로스포라(Neurospora) 및 트리코더마(Trichoderma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속 유래의 곰팡이인 제조방법.
  43. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 니둘안스(A. nidulans), 압시디아 코에룰레아(Absidia coerulea), 리조푸스 오리자에(Rhizopus oryzae), 크리소스포리움 룩크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 뉴로스포라 인터메디아(N. intermedia) 및 트리코덤 레세이(Trichoderm reesei)로 이루어진 군으로부터 선택되는 종 유래의 곰팡이인 제조방법.
  44. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 미생물의 포스포글루코이소머라제 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 미생물은 포스포글루코이소머라제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것인 제조방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 포스포글루코이소머라제는 서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 제조방법.
  47. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 미생물의 포스포프룩토키나제의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 추가로 포함하는 제조방법.
  48. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 글루타민 신테타제의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 미생물은 글루타민 신테타제를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것인 제조방법.
  50. 제 48항에 있어서, 상기 글루타민 신테타제의 아미노산 서열은 서열번호 89의 서열인 제조방법.
  51. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 추가로 포함하는 제조방법.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 미생물은 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산 분자로 형질전환된 것인 제조방법.
  53. 제 51항에 있어서, 상기 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소의 아미노산 서열은 서열번호 95의 서열인 제조방법.
  54. 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 미생물의 글리코겐 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 부분적 또는 완전한 결실 또는 불활성화를 추가로 포함하는 제조방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 글리코겐 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자는 ADP-글루코오스 피로포스포릴라아제, 글리코겐 신타제 및 분지 효소를 포함하는 제조방법.
  56. 제 1항에 있어서, 상기 유전적 변형은 갈락토오스를 대사하는 미생물의 능력을 억제하지 않는 제조방법.
  57. 제 1항에 있어서, 상기 수집 단계는 미생물로부터 세포내의 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민 및 글루코사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포내 생산물을 회수하거나, 발효 배지로부터 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 세포외 생산물을 회수하는 것을 포함하는 제조방법.
  58. 제 1항에 있어서, a) 발효 배지로부터 글루코사민 및 N-아세틸글루코사민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생산물을 정제하는 단계;
    b) 미생물로부터 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 ns으로부터 선택되는 생산물을 회수하는 단계;
    c) 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 생산물을 탈인산화하여 글루코사민을 제조하는 단계; 및
    d) N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 생산물을 탈인산화하여 N-아세틸글루코사민을 제조하는 단계;
    e) N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 생산물을 처리하여 글루코사민, 글루코사민-6-포스페이트 및 글루코사민-1-포스페이로 이루어진 군으로부터 선택되는 글루코사민 생산물을 제조하는 단계로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 한 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
  59. 제 54항에 있어서, 상기 단계 (e)는 N-아세틸글루코사민, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 생산물을 산 및 가열 조건에서, 또는 효소에 의한 탈아세틸화에 의해 가수분해하는 것을 포함하는 제조방법.
  60. 제 1항에 있어서, 상기 발효 방법에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민은 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 침전시킴으로써 회수하는 것인 제조방법.
  61. 제 1항에 있어서, 상기 발효 방법에 의해 생산된 N-아세틸글루코사민은 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 결정화함으로써 회수하는 것인 제조방법.
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  116. 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 포함하는 유전적으로 변형된 미생물로서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성을 증가시키기 위한 유전적 변형은, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 효소 활성; 미생물에 의한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 과잉 발현; 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 감소된 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 생산 억제; 및 글루코사민-6-포스페이트에 대한 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 증가된 친화력으로 구성되는 군으로부터 선택되는 결과를 제공하는 것인 유전적으로 변형된 미생물.
  117. 제 116항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 신타제의 활성을 증가시키는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 미생물.
  118. 제 116항에 있어서, 상기 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제의 활성을 감소시키는 하나 이상의 유전적 변형을 추가로 포함하는 유전적으로 변형된 미생물.
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  128. a) 발효 공정의 생산물인 용해된 N-아세틸글루코사민을 포함하는 발효액을 수득하는 단계; 및
    b) 상기 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 단계를 포함하는 N-아세틸글루코사민의 제조방법.
  129. 제 128항에 있어서, 상기 발효액으로부터 세포 물질을 제거하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  130. 제 128항에 있어서, 발효액을 탈색하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  131. 제 130항에 있어서, 상기 탈색 단계는 다수의 N-아세틸글루코사민 결정화, 활성 탄소 처리 및 크로마토그래피에 의한 탈색으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  132. 제 128항에 있어서, 발효액을 이온 교환 수지와 접촉하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법.
  133. 제 132항에 있어서, 상기 발효액과 이온 교환 수지의 접촉 단계는 발효액을 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지와 접촉시키는 것을 포함하는 제조방법.
  134. 제 133항에 있어서, 상기 발효액을 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지와 접촉시키는 단계는 발효액을 음이온 및 양이온 교환 수지의 혼합 베드와 접촉시키는 것인 제조방법.
  135. 제 128항에 있어서, 상기 회수 단계는 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 침전시키는 것을 포함하는 제조방법.
  136. 제 128항에 있어서, 상기 회수 단계는 발효액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 결정화하는 것을 포함하는 제조방법.
  137. 제 128항에 있어서, 상기 회수 단계는 용해된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 발효액을 농축하는 것을 포함하는 제조방법.
  138. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 대기압 이하의 압력에서 수행하는 제조방법.
  139. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 막 분리에 의해 수행하는 제조방법.
  140. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 40℃ 내지 75℃의 온도에서 수행되는 제조방법.
  141. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 45℃ 내지 55℃의 온도에서 수행되는 제조방법.
  142. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 발효액 중 적어도 30% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행되는 제조방법.
  143. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 발효액 중 적어도 40% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행되는 제조방법.
  144. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계는 발효액 중 적어도 45% 이상의 고형물 함량을 달성하도록 수행되는 제조방법.
  145. 제 137항에 있어서, 상기 농축 단계 후에 발효액을 냉각하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  146. 제 145항에 있어서, 상기 발효액은 -5℃ 내지 45℃까지 냉각하는 제조방법.
  147. 제 145항에 있어서, 상기 발효액은 -5℃ 내지 실온까지 냉각하는 제조방법.
  148. 제 145항에 있어서, 상기 발효액은 실온까지 냉각하는 제조방법.
  149. 제 145항에 있어서, 상기 발효액을 N-아세틸글루코사민의 결정으로 접종하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  150. 제 149항에 있어서, 상기 접종용 N-아세틸글루코사민 결정은 발효액에서 핵형성에 의해 형성된 N-아세틸글루코사민 결정 및 외부에서 제공된 N-아세틸글루코사민 결정으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  151. 제 128항에 있어서, 상기 회수 단계는 N-아세틸글루코사민을 수혼용성 용매와 접촉시키는 것을 포함하는 제조방법.
  152. 제 151항에 있어서, 상기 수혼용성 용매는 이소프로필 알코올(IPA), 에탄올, 메탄올, 아세톤, 테트라하이드로퓨란, 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드, 디옥산 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택되는 제조방법.
  153. 제 128항에 있어서, 회수된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 건조시키는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  154. 제 153항에 있어서, 상기 건조된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 수혼용성 용매로 세정하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  155. 제 128항에 있어서, 회수된 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 용해하여 N-아세틸글루코사민 용액을 형성하고, 이 용액으로부터 N-아세틸글루코사민을 함유하는 고형물을 회수하는 것을 추가로 포함하는 제조방법.
  156. 제 128항에 있어서, 박테리아의 내독소를 제거하기 위해 발효액을 추가로 여과하는 제조방법.
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