CN107614682B - 核糖核酸的无细胞生成 - Google Patents
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Abstract
在一些方面,本文中提供了用于核糖核酸的无细胞生成的方法和组合物。
Description
相关申请
本申请要求2015年3月30日提交的美国临时申请号62/140,407的35 U.S.C.§119(e)下的优先权,其全部内容通过引用并入本文。
发明背景
RNA干扰(RNAi)是指使用基因的DNA序列使基因“关闭”的细胞机制-一种称为“沉默”的过程。在极其多种生物体(包括动物、植物、和真菌)中,RNAi由双链RNA(dsRNA)触发。已经在活细胞中和体外使用纯化的重组酶和纯化的核苷酸三磷酸生成双链RNA(例如治疗性dsRNA)(参见例如欧洲专利号1631675 A1和美国专利申请公开号US2014/0271559 A1)。然而,使用此类系统的dsRNA的大规模生产是挑战性的、低效的且昂贵的。
发明概述
本文中提供了用于RNA(包括dsRNA)的无细胞生成(也称为生物合成)的平台。本公开的方法、组合物(例如,细胞和细胞裂解物)、和系统基于涉及将聚合RNA(例如,mRNA、tRNA和/或rRNA)无细胞(例如,使用细胞裂解物)降解成单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体的方法。在RNA降解后,将单磷酸和二磷酸核糖核苷酸单体转化为核糖核苷酸三磷酸,然后将核糖核苷酸三磷酸聚合形成期望的RNA(例如dsRNA)。
因此,本公开提供了生成用于核糖核酸(RNA)的无细胞生成的细胞裂解物的方法。所述方法可以包括:(a)将细胞培养至期望的细胞密度,其中所述细胞包含至少一种工程化核酸,所述工程化核酸含有与编码核酸酶(例如,S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、或RNA酶R)的序列可操作连接的启动子,所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶(例如,RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、和/或RNA酶T)遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;(b)裂解步骤(a)中生成的细胞,从而生成第一细胞裂解物,并且(c)在导致RNA解聚和NMP和NDP磷酸化的条件下温育所述第一细胞裂解物,从而生成含有核苷酸5’-单磷酸(或核苷酸5’-单磷酸和核苷酸5’-二磷酸的混合物)的第一细胞裂解物。
在一些实施方案中,方法还包括(d)培养细胞,所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸,其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子,所述关联蛋白酶切割所述核酸酶或靶向性内源RNA酶的蛋白酶识别位点,其中所述关联蛋白酶(例如,人鼻病毒3C蛋白酶)与周质靶向序列连接,(ii)至少一种工程化核酸,其含有与编码核苷酸激酶(例如,尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、腺苷酸激酶、核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶)的序列可操作连接的启动子,(iii)至少一种工程化核酸,其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子,和(iv)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板,其含有与编码RNA转录物的序列可操作连接的启动子,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞,以生成第二细胞裂解物。
在一些实施方案中,方法还包括组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐和/或葡萄糖,从而生成混合物;并且在导致RNA(例如dsRNA)生成的条件下温育所述混合物。
在一些实施方案中,方法包括(a)将细胞培养至期望的细胞密度,其中所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸,所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子,所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接,和(ii)至少一种工程化核酸,所述工程化核酸含有与编码核苷酸激酶的序列可操作连接的启动子,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;(b)裂解步骤(a)中生成的细胞,从而生成第一细胞裂解物,并且(c)在导致RNA解聚的条件下在将所述第一细胞裂解物与多磷酸盐和/或葡萄糖一起温育,从而生成含有核苷酸5’-三磷酸的混合物的第一细胞裂解物。
在一些实施方案中,方法还包括(d)培养细胞,所述细胞包含(i)至少一种工程化核酸,其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子,所述关联蛋白酶切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点,其中所述关联蛋白酶与周质靶向序列连接,(ii)至少一种工程化核酸,其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子,和(iii)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板,所述工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板含有与编码RNA转录物的序列可操作连接的启动子,所述RNA转录物包含通过铰接域连接的互补域,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;并且(e)裂解步骤(d)中生成的培养细胞,以生成第二细胞裂解物。
在一些实施方案中,方法还包括组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐和/或葡萄糖,从而生成混合物;并且在导致RNA生成的条件下温育所述混合物。
本文中还提供了工程化细胞和细胞裂解物,其包含含有蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接的核酸酶、核苷酸激酶、和核苷酸5’-单磷酸和核苷酸5’-二磷酸的混合物。
本文中进一步提供了包含RNA聚合酶的工程化细胞和细胞裂解物,以及编码RNA的工程化DNA模板。
本公开的一些方面提供了生成核糖核酸(RNA)的无细胞方法,所述方法包括(a)将第一细胞裂解物与第二细胞裂解物组合,其中所述第一细胞裂解物包含(i)包含蛋白酶识别位点的核酸酶,和(ii)核苷酸5’-单磷酸,和所述第二细胞裂解物包含(iii)切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点的关联蛋白酶、(iv)核苷酸激酶、(v)RNA聚合酶、和(vi)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板,其含有与编码感兴趣的RNA的序列可操作连接的启动子,从而形成反应混合物;并且(b)在导致所述感兴趣的RNA(例如,感兴趣的双链RNA)生成的条件下温育所述反应混合物。
在一些实施方案中,方法包括(a)将第一细胞裂解物与第二细胞裂解物组合,其中所述第一细胞裂解物包含(i)包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接的核酸酶、(ii)核苷酸激酶和多磷酸盐和/或葡萄糖、和(iii)核苷酸5’-三磷酸,和所述第二细胞裂解物包含(iv)切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点的关联蛋白酶、(v)RNA聚合酶、和(vi)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板,所述工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板含有与编码感兴趣的RNA的序列可操作连接的启动子,从而形成反应混合物;并且(b)在导致所述感兴趣的RNA(例如,感兴趣的双链RNA)生成的条件下温育所述反应混合物。
在本文中提供的任何一个实施方案中,细胞裂解物或反应混合物可以没有核酸酶活性。
在附图和详细描述中阐述了本发明的几个实施方案的细节。从说明书和权利要求书中,本发明的其它特征、目的和优点将是显而易见的。
附图简述
图1显示了双链核糖核酸(dsRNA)生物合成方法的实例的流程图。在该实例中,一个群体的细胞表达工程化的RNA特异性核酸酶(其在周质中隔绝),和至少一种工程化蛋白酶靶向性内源RNA酶。另一个群体的细胞表达工程化的DNA依赖性RNA聚合酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶(隔绝到周质的工程化位点特异性蛋白酶)、至少一种蛋白酶靶向性内源RNA酶、和编码期望的RNA的工程化DNA模板。
图2显示了多磷酸盐催化的将核苷酸单磷酸/二磷酸(NMP/NDP)转化为核苷酸三磷酸(NTP)的示意图。
图3显示了将工程化DNA模板转化为dsRNA产物的示意图。
图4显示了经由中间体单链RNA(ssRNA)将工程化DNA模板转化为dsRNA产物的示意图。
发明详述
在一些方面,在本文中提供了用于核糖核酸(RNA),如双链RNA(dsRNA)的无细胞生成的方法、组合物和系统。本文中提供的方法在构思上涉及三个主要过程:(1)将胞内聚合RNA降解为核苷酸单体-核苷酸单磷酸(NMP)和核苷酸二磷酸(NDP)的组合,(2)将NMP和NDP转化为核苷酸三磷酸(NTP),其充当用于形成聚合RNA的“构建块(building block)”,以及(3)将NTP聚合以生成RNA,包括dsRNA。在一些实施方案中,将一个群体的细胞工程化改造以生成对于该方法的步骤1和2所必需的产物,而将另一群体的细胞工程化改造以生成对于该方法的步骤3所必需的产物(例如酶和核酸模板)。然后,将从每个细胞群产生的细胞裂解物组合,用于RNA的无细胞生成。在其它实施方案中,将一个群体的细胞工程化改造以生成对于该方法的步骤1所必需的产物,而将另一个群体的细胞工程化改造以生成对于该方法的步骤2和3所必需的产物(例如酶和核酸模板)。然后,将从每个细胞群体产生的细胞裂解物组合,用于RNA的无细胞生成。
应当理解,虽然本文中所述的RNA制备方法在构思上在“步骤”中描述,但是该方法的步骤不需要分开进行(例如,在分开的细胞裂解物或分开的反应混合物中)。例如,对于该方法的步骤1所必需的产物可以由一个细胞群体表达,对于该方法的步骤2所必需的产物可以由另一个细胞群体表达,并且对于该方法的步骤3所必需的产物可以由又一个细胞群体表达。或者,对于该方法的步骤1和2所必需的产物可以由一个细胞群体表达,并且对于该方法的步骤3所必需的产物可以由另一个细胞群体表达。此外,对于该方法的步骤1所必需的产物可以由一个细胞群体表达,并且对于该方法的步骤2和3所必需的产物可以由另一个细胞群体表达。
还应当理解,步骤1、2和3不需要序贯进行。例如,表达用于一个或超过一个步骤的产物的细胞群体可以与不同细胞群体平行培养,所述不同细胞群体表达用于本公开的无细胞RNA生成方法的一个或超过一个步骤的产物。
步骤1:核苷酸5’-单磷酸(5’-NMP)和/或核苷酸5’-二磷酸(5’-NDP)的无细胞生成
本公开的一些方面提供了用于将胞内聚合RNA降解成核苷酸单体(核苷酸单磷酸(NMP)和核苷酸二磷酸(NDP)的组合)的方法和组合物。大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)细胞可含有按重量计多至25%的RNA。此RNA几乎完全以以下三种形式之一的寡聚状态存在:tRNA、rRNA和mRNA。可以解聚此RNA以产生可充当RNA生物合成的构建块的单体核糖核苷酸。
解聚的化学手段导致3’-NMP和5’-NMP的混合物的产生。3’-NMP不能用于dsRNA合成,因此,化学解聚降低了最终RNA产物的总产率。如本文中所述,RNA的化学解聚的备选是使用核酸酶的酶促解聚。可根据本公开使用的核酸酶的非限制性实例列于表1中。
表1:用于将RNA解聚为5’-NMP和5’-NDP的核酸酶实例
用于将RNA酶促解聚成5’-NMP的现有方法(如例如EP1587947B1,美国专利号3,223,592和美国专利号2,844,514中所述,其各自通过引用并入本文)通常涉及混合外源核酸酶和裂解的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞,并将混合物温育以产生单体NMP。这些NMP通常是终产物,并且例如用作食物产品中的调味添加剂。
相比之下,本公开包括酶促解聚,其中工程化细胞(例如,工程化大肠杆菌细胞)例如在细胞的周质中表达一种或多种核酸(例如参见表1)。周质核酸酶表达确保在细胞生长期间不发生细胞毒性RNA解聚。在细胞裂解时,周质表达的核酸酶从周质释放并接触细胞聚合RNA(例如,含有两个或更多个连续核糖核苷酸的RNA),从而将聚合RNA解聚成5’-NMP和/或5’-NDP。所得到的5’-NMP和/或5’-NDP(本文中称为“单体”)作为起始材料用于聚合感兴趣的特定的RNA(称为RNA产物),如例如dsRNA,无需(或无需重大)纯化或分离裂解物组分。然而,应当理解,如本文所提供,在RNA的生成之后,可以纯化RNA以用作治疗剂。
在一些实施方案中,本公开涵盖在RNA聚合中直接使用5’-NMP和/或5’-NDP单体。然而,在一些条件下,活性核酸酶的存在可以导致期望dsRNA产物的解聚。因此,本文提供了使细胞核酸酶(例如,过表达的核酸酶)功能失活的手段,以允许在随后的RNA聚合反应中使用单体作为底物,而不需要纯化单体。在一些实施方案中,可以通过靶向蛋白水解来实现RNA解聚后的核酸酶的功能失活,如2012年3月1日公布的美国公开号2012/0052547A1;和2015年2月12日公布的国际公开号WO 2015/021058 A2所述,其各自通过引用并入本文)。在本文中也涵盖靶向/诱导型蛋白质失活的其它手段。
步骤2:5’-NMP和5’-NDP至5’-NTP的无细胞转化
本公开的一些方面提供了用于将NMP和NDP转化为核苷三磷酸(NTP)的方法和组合物,所述核苷三磷酸充当用于形成聚合RNA的“构建块”。涉及用于将5’-NMP和5’-NDP转化为5’-NTP的纯化蛋白质或细胞提取物的方法是已知的(例如,美国专利号6,022,713,通过引用并入本文)。根据本公开可用于将5’-NMP转化为5’-NDP的NMP激酶的非限制性实例列于表2中。如本领域技术人员将理解的,任何酶或其它具有期望激酶活性的试剂可用于本发明。在一些实施方案中,腺苷三磷酸(ATP)或鸟苷三磷酸(GTP)是磷酸供体。
表2:NMP激酶实例
酶名称 | 宿主生物体 | EC# | 反应 |
尿苷酸激酶 | 大肠杆菌 | 2.7.4.22 | UMP+ATP→UDP+ADP |
胞苷酸激酶 | 大肠杆菌 | 2.7.4.25 | CMP+ATP→CDP+ADP |
鸟苷酸激酶 | 大肠杆菌 | 2.7.4.8 | GMP+ATP→GDP+ADP |
腺苷酸激酶 | 大肠杆菌 | 2.7.4.3 | AMP+ATP→2ADP |
根据本公开可以用于将NDP转化为NTP的NDP激酶的非限制性实例列在表3中。用于核苷二磷酸激酶(Ndk)的磷酸供体是ATP或GTP,用于丙酮酸激酶(Pyk)的磷酸供体是磷酸烯醇丙酮酸(PEP),并且用于多磷酸激酶(Ppk)的磷酸供体是多磷酸盐。关于本公开的多磷酸盐催化方法的例示,参见图2。如本领域技术人员将理解的,可以根据本发明使用具有期望激酶活性的任何酶或其它试剂。
表3:NDP激酶实例
本公开的细胞裂解物用于以下的无细胞酶促转化:(1)NMP到NDP,(2)NDP到NTP,和(3)NTP到dsRNA。在一些实施方案中,在细胞裂解物中消除/除去或失活降解NMP、NDP和/或NTP的酶是有利的。根据本公开可以缺失或失活的酶的非限制性实例列于表4中。因此,在一些实施方案中,本公开涵盖不表达表4中列出的至少一种(例如,1、2、3或4)酶或表达表4中列出的至少一种(例如,1、2、3或4)酶的无活性或可失活形式的工程化细胞。
表4:降解NMP、NDP、和NTP的酶的实例
在一些情况下,(1)NMP到NDP,(2)NDP到NTP,和(3)NTP到dsRNA的酶促转化需要高能量磷酸盐供体原料(例如,多磷酸盐)。在一些实施方案中,在细胞裂解物中消除/除去或失活降解多磷酸盐的酶是有利的。此类酶的非限制性实例是大肠杆菌外切聚磷酸酶(EC3.6.1.1.1;多磷酸盐n+H2O→多磷酸盐n-1+Pi)。因此,在一些实施方案中,本公开涵盖不表达外切聚磷酸酶或表达外切聚磷酸酶的无活性或可失活形式的工程化细胞。本公开还涵盖了其它磷酸酶的失活,例如通过蛋白酶靶向进行。
在一些实施方案中,通过从宿主的基因组中缺失关联基因(称为基因“敲除”),从细胞中消除酶(例如,核酸酶)的活性,条件是活性对于细胞存活力是非必需的。在一些实施方案中,使用例如靶向蛋白水解以可控的方式抑制或减少酶的活性,如2012年3月1日公布的美国公开号2012/0052547A1;和2015年2月12日公布的国际公开号WO 2015/021058 A2所述,其各自通过引用并入本文。在本文中也涵盖靶向酶失活的其它手段。
步骤3:核糖核酸(RNA)和/或双链RNA(dsRNA)的无细胞生成
本公开的一些方面提供用于聚合NTP以产生RNA(包括dsRNA)的方法和组合物。使用产生RNA转录物的RNA聚合酶将酶促衍生的5’-NTP聚合成RNA。可根据本公开使用的RNA聚合酶的非限制性实例列于表5中。
表5:用于将NTP转化为RNA的聚合酶的实例
使用DNA依赖性RNA聚合酶生成dsRNA。
本公开的一些方面涉及双链RNA(dsRNA)的无细胞生成。在一些实施方案中,dsRNA分子由DNA模板编码,所述DNA模板含有与编码RNA(例如,RNA转录物)的序列可操作连接的启动子。在一些实施方案中,RNA含有通过铰链域连接的两个互补域。参考图3所示的实例,当单链RNA(ssRNA)模板的互补域(域1和域3)彼此结合时,铰链域(域2)形成环样结构。
如果两个核酸域(例如,离散的核苷酸序列)通过Watson-Crick相互作用(也称为杂交)彼此碱基配对或结合以形成双链核酸分子,则它们是彼此“互补的”。如本文所用,“结合”是指在生理条件下由于例如静电、疏水、离子和/或氢键相互作用而在至少两个分子或相同分子的两个区域之间的缔合。在一些实施方案中,互补域具有4至1000个核苷酸或更长的长度。例如,互补域可以具有4至10、4至20、4至30、4至50、4至60、4至70、4至80、4至90、4至100、4至200、4至300、4至400、或4至500、或4至1000个核苷酸的长度。在一些实施方案中,互补域具有15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核苷酸的长度。在一些实施方案中,互补域具有4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸的长度。
在一些实施方案中,两个互补域之一是靶物特异性的,这里称为(+)互补域。也就是说,可以将互补域设计为与感兴趣的靶核酸互补(例如,相同)。因此,在一些实施方案中,将(+)互补域设计为与靶核酸互补,并且将(-)互补域设计为与(+)互补域互补。
“铰链域”在本公开的核酸的上下文中是指分开并且在“互补域”之间的单链区域。通常,铰链域是非特异性的,意味着它不是被设计成结合另一种核酸,如靶核酸。铰链域在结合互补域后形成环样结构以形成双链区域。在一些实施方案中,铰链域具有4至500个核苷酸或更长的长度。例如,铰链域可以具有4至10、4至20、4至30、4至50、4至60、4至70、4至80、4至90、4至100、4至200、4至300、4至400、或4至500个核苷酸的长度。在一些实施方案中,铰链域具有4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸的长度。
应当理解,本公开的“双链RNA”涵盖不含单链区域(例如,环或突出端)的完全双链分子以及部分双链分子,其含有双链区域和单链区域(例如,环或突出端)。认为图3底部所示的dsRNA产物是部分双链分子,而认为图4底部所示的dsRNA产物是完全双链分子。
在一些实施方案中,可以通过从T1基因编码的高度进行性的DNA依赖性T7RNA聚合酶催化RNA(包括dsRNA)的无细胞生成,尽管可以根据本公开使用其它DNA依赖性RNA聚合酶。因此,在一些实施方案中,工程化DNA模板包括与编码感兴趣的RNA分子的核苷酸序列可操作连接的T7特异性启动子。通常,启动子直接位于编码序列的5’。在一些实施方案中,工程化DNA模板包括T7特异性转录终止子。转录终止子通常直接位于编码序列的3’。如图3所示,编码域1、域2和域3的序列在每一末端侧翼有转录启动子和转录终止子。类似地,如图4所示,编码域1的序列在每一末端侧翼有转录启动子和转录终止子。
在一些实施方案中,DNA模板(例如含有5’启动子和3’终止子)位于表达载体上,所述表达载体含有编码区外部的内切核酸酶限制性位点。在此类实施方案中,可以将细胞工程化改造以表达关联限制性内切核酸酶,其切割载体的内切核酸酶限制性位点,导致DNA模板的线性化。线性化允许例如期望RNA分子的“失控转录”,从而改善总产率。在一些实施方案中,关联限制性内切核酸酶是I-SceI。其它限制性内切核酸酶是已知的并且可以根据本公开使用。非限制性实例包括EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、TaqI、NotI、HinFI、Sau3AI、PvuII、SmaI、HaeIII、HgaI、AluI、EcoRV、EcoP15I、KpnI、PstI、SacI、SalI、ScaI、SpeI、SphI、StuI、和XbaI、FokI、AscI、AsiAI、NotI、FseI、PacI、SdaI、SgfL、SfiI、PmeI。
使用RNA依赖性RNA聚合酶生成dsRNA。
在一些实施方案中,dsRNA分子由DNA模板编码,所述DNA模板含有与编码含有单一靶域(例如,与感兴趣的靶核酸互补的域)的信使RNA(mRNA)的序列可操作连接的启动子。参考图4所示的实例,在生成单链RNA(ssRNA)后,可以使用RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)来合成感兴趣的dsRNA。在一些实施方案中,使用从噬菌体Φ6分离的RdRP来合成dsRNA。噬菌体Φ6是感染假单胞菌属(Pseudomonas)成员的双链RNA病毒。噬菌体Φ6是研究得最好的dsRNA病毒之一。此噬菌体编码RdRP,其能够使用RNA模板合成RNA,产生dsRNA分子。Φ6RdRP能够在没有引物分子的情况下聚合RNA,因此聚合酶只需要模板RNA(Wright,S.et al,2012.Journal of Virology.Mar;86(5):2837-49;Van Dijk,AA.,et al,2004.J GenVirol.May;85(Pt 5),通过引用并入本文)。本文涵盖了其它病毒RdRP。
在一些实施方案中,使用DNA依赖性RNA聚合酶(如例如T7RNA聚合酶)转录编码含有单一靶域的RNA的DNA模板,然后得到的RNA转录物充当RNA依赖性RNA聚合酶(如例如噬菌体ΦRdRP的模板),以合成互补RNA分子,产生dsRNA(例如,图4)。
对宿主RNA聚合酶的抑制
如上所述的细胞核糖核酸的裂解和解聚通常产生5’-核糖核苷酸的合并物。在某些情况下,天然RNA聚合酶和异源T7RNA聚合酶和/或Φ6 RdRP之间对这些核苷酸合并物的竞争可降低期望RNA产物的产率。不过,RNA聚合酶对于完整细胞的存活力是必需的。因此,本文提供了用于破坏天然RNA聚合酶功能的至少两种方法。例如,如本文别处描述的靶向蛋白水解可用于破坏天然RNA聚合酶的至少一种关键组分的活性,导致RNA聚合酶活性的充分破坏。作为破坏天然RNA聚合酶功能的另一个实例,可以表达T7噬菌体蛋白Gp2。Gp2是T7噬菌体感染大肠杆菌后的第二种T7噬菌体蛋白。此蛋白质破坏宿主RNA聚合酶功能,从而消除了天然RNA聚合酶和噬菌体聚合酶之间的竞争(Bae,B.et al,2013.Proc Natl Acad Sci US A.Dec 3;110(49):19772-7)。
经由宿主核糖核酸酶的失活改善产物产率
RNA(例如dsRNA)的无细胞生成的一个方面是在合成期间和之后抑制/防止产物降解。在所有活的生物体中,切割和加工RNA分子的能力对存活力是必需的。许多天然的大肠杆菌酶(称为核糖核酸酶或RNA酶)以不同亲和力催化RNA分子的解聚。这些RNA酶中的一些,包括负责tRNA成熟的RNA酶D,具有高度的底物特异性,而其它RNA酶,包括RNA酶I能够解聚一大批RNA聚合物。RNA酶的非限制性实例以及它们的关联基因、提出的活性和实例序列示于表6中。
在一些实施方案中,将细胞工程化改造为使得在从工程化细胞产生的细胞裂解物中灭活或删除内源核糖核酸酶(RNA酶)活性的50%至100%(例如,50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%),所述内源核糖核酸酶(RNA酶)活性将解聚或以其它方式降解感兴趣的RNA产物。这可以通过本领域已知的任何手段来实现。在一些实施方案中,这通过编码RNA酶的内源基因的染色体缺失来实现,条件是RNA酶不是细胞存活力必需的。可以从细胞基因组中缺失的基因的实例列于表6中。在一些实施方案中,如果RNA酶对于细胞存活力是必需的,则可以将细胞工程化改造以含有工程化改造为对靶向蛋白水解降解敏感的内源RNA酶(例如,从其天然/内源启动子表达)。如本文所提供的可以被蛋白酶靶向的核糖RNA酶/核酸酶的实例列于表7中。在一些实施方案中,使用前述方法的组合。或者或另外,可以使用核酸酶抑制剂(例如,加入细胞裂解物或反应混合物)。应当注意,pnp和rnb的同时缺失对细胞是致死的。因此,本公开还涵盖编码的酶之一或两者的蛋白酶靶向。
表6:活性的实例,所述活性的破坏可以导致dsRNA生成菌株中改善的dsRNA产率
表7:可以经由靶向蛋白水解降解失活的核糖核酸酶的实例。
大肠杆菌RNA酶III酶优先切割dsRNA以及一些单链mRNA分子(Robertson,HD andJ.J.Dunn.1974.J Biol Chem.Apr 25;250(8):3050-6.;Lybecker,M.et al.2014.Thedouble-stranded transcriptome of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci U SA.Feb 25;111(8):3134-9,其各自通过引用并入本文)。此酶在无细胞系统中的存在可以限制积累高浓度dsRNA的能力,因为产物将容易被切割。编码RNA酶III的基因rnc对于细胞存活力不是必需的,因此,在一些实施方案中,本公开内容涵盖了在感兴趣的RNA的无细胞生成前的工程化细胞中rnc的染色体缺失/突变,或RNA酶III的蛋白酶靶向(Takiff,H.E.etal.1989.J Bacteriol.May;171(5):2581-90,其各自通过引用并入本文)。
类似地,宽底物外切核糖核酸酶RNA酶I对于大肠杆菌的存活力不是必需的。RNA酶I(其定位于完整大肠杆菌细胞中的周质空间)催化包括rRNA、mRNA和tRNA在内的极其多种RNA分子的解聚(Neu,H.C.and L.A.Heppel.1964.J Biol Chem.Nov;239:3893-900)。在生理条件下,此酶的周质定位意味着酶对细胞内的RNA稳定性具有很小的影响。然而,本公开的无细胞方法中周质和细胞质的混合允许RNA酶I接近细胞RNA。其存在可以通过ssRNA中间体的降解显著降低产物输出。因此,在一些实施方案中,本公开涵盖了rna(编码RNA酶I的基因)的染色体缺失/突变,或RNA酶I的蛋白酶靶向(Kaplan,R.and D.Apirion.1974.J BiolChem.Jan 10;249(1):149-51,通过引用并入本文)。
两种其它宽底物外切核糖核酸酶RNA酶R和RNA酶T催化dsRNA、rRNA、tRNA和mRNA以及小的非结构化RNA分子的解聚(Cheng and Deutscher.2002;Cheng andDeutscher.2005;Vincent and Deutscher.2009;Viswanathan et al.,1998)。分别编码RNA酶R和RNA酶T的基因rnr和rnt不是细胞存活力所必需的。因此,在一些实施方案中,本公开涉及rnr和/或rnt的染色体缺失/突变,或RNA酶R和/或RNA酶的蛋白酶靶向。
活的大肠杆菌细胞中RNA周转(特别是mRNA)的中心成分是称为降解体的一组酶(Bandyra,K.and B.F.Luisi,2013.RNA Biol.Apr;10(4):627-35;A.J.Carpousis,2002.Biochem Soc Trans.Apr;30(2):150-5,其各自通过引用并入本文)。这种降解体含有两种核糖核酸酶RNA酶E和PNP酶、RNA解旋酶和其它几种在RNA降解中起作用的蛋白质。RNA酶E作为调节rRNA成熟以及mRNA周转的内切核糖核酸酶发挥功能。不受理论限制,RNA酶E可以与外切核糖核酸酶(如PNP酶和RNA酶II)协同起作用,以不断周转细胞mRNA合并物。在此模型中,RNA酶E首先在内部切割靶RNA分子,然后将较小的RNA片段解聚为单体。对编码RNA酶E的基因rne的破坏在大肠杆菌中是致死的(Goldblum,K.and D.Apririon,1981.JBacteriol.Apr;146(1):128-32,通过引用并入本文)。因此,在一些实施方案中,本公开涵盖RNA酶R和/或RNA酶的蛋白酶靶向。在一些实施方案中,本公开涵盖仅PNP酶和RNA酶II之一的蛋白酶靶向。
如上所述,由pnp基因编码的大肠杆菌PNP酶与降解体相关,其中它充当具有3’→5’持续性的外切核糖核酸酶(A.J.Carpousis,2002)。PNP酶在mRNA降解以及tRNA成熟和周转中起作用。类似地,由rnb基因编码的RNA酶II在3’→5’方向上解聚mRNA和tRNA两者。虽然这两种基因都不是必需的,但同时对两者的破坏是综合上致死的。因此,在一些实施方案中,本公开涵盖PNP酶和RNA酶II的蛋白酶靶向。
工程化细胞和核酸
本公开的“工程化细胞”是包含至少一种工程化(例如重组或合成)核酸,或者以其它方式修饰,使得它们在结构上和/或功能上与其天然存在的对应物不同的细胞。在一些实施方案中,工程化细胞包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、或至少10种工程化核酸。在一些实施方案中,工程化细胞包含2至5、2至10或2至20种工程化核酸。在一些实施方案中,工程化细胞包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20种工程化核酸。应当理解,认为含有工程化核酸的细胞是“工程化细胞”。
在一些实施方案中,“细胞”或“工程化细胞”的培养物含有细胞的同质群体或异质群体。例如,细胞培养物可以含有超过一类细胞,每类细胞表达本公开的至少一种工程化核酸。
术语“核酸”指共价连接在一起的至少两个核苷酸,并且在一些情况下可以含有磷酸二酯键(例如,磷酸二酯“主链”)。核酸(例如,核酸的组分或部分)可以是天然存在的或工程化的。“天然存在的”核酸存在于自然界中在没有人为干预的情况下存在的细胞中。“工程化核酸”包括重组核酸和合成核酸。“重组核酸”指通过连接核酸分子(例如,来自相同物种或来自不同物种)构建并且通常可以在活细胞中复制的分子。“合成核酸”指以化学方式或通过其它手段合成或扩增的分子,包括以化学方式或以其它方式修饰但可与天然存在的核酸分子碱基配对的那些分子。重组和合成核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。应当理解,工程化核酸可以含有天然存在的核酸的部分,但是作为整体,工程化核酸不天然存在并且需要人为干预。在一些实施方案中,编码本公开的产物的核酸是重组核酸或合成核酸。在其它实施方案中,编码产物的核酸是天然存在的。
编码本文提供的产物(例如,蛋白质或核酸)的工程化核酸与“启动子”可操作连接,所述启动子是控制核酸的剩余部分的转录启动和速率的核酸控制区。启动子驱动其调节的核酸的表达或驱动该核酸的转录。
启动子可以是天然与基因或序列相关的启动子,如可以通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5’非编码序列获得的。此类启动子可以称为“内源性”。
在一些实施方案中,编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下,所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与编码序列相关的启动子。此类启动子可以包括其它基因的启动子;任何其它细胞分离的启动子;以及不是“天然存在”的合成启动子或增强子,如例如含有不同转录调控区的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程化方法改变表达的突变的那些。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列之外,可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括聚合酶链反应(PCR))产生序列。
当启动子相对于其调节的核酸处于正确功能位置和取向以控制(“驱动”)该核酸的转录起始和/或表达时,认为它是“可操作地连接的”。
本公开的工程化核酸可以含有组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是指在细胞中始终有活性的启动子。“诱导型启动子”是指在诱导剂或诱导试剂的存在下、受诱导剂或诱导试剂影响或由诱导剂或诱导试剂接触时引发或增强转录活性的启动子。根据本公开使用的诱导型启动子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括但不限于化学/生物化学调节的和物理调节的启动子,如醇调节的启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、发病机制调节的启动子、温度/诱导型和光调控的启动子。
诱导剂或诱导试剂可以是内源的或通常外源性条件(例如光)、化合物(例如化学或非化学化合物)或蛋白质,其以下述的方式与诱导型启动子接触,使得在调节来自诱导型启动子的转录活性中有活性。因此,“调节核酸转录的信号”是指作用于诱导型启动子的诱导物信号。根据所使用的调节物系统,调节转录的信号可以使转录激活或失活。转录激活可以涉及直接作用于启动子以驱动转录或间接作用于启动子上,其通过将防止启动子驱动转录的阻遏物失活实现。相反,转录失活可以涉及直接作用于启动子防止转录或者通过激活然后作用于启动子的阻遏物间接作用于启动子。
本公开的工程化核酸可以含有转录终止子。“转录终止子”是引起转录停止的核酸序列。终止子可以是单向的或双向的。它由参与通过RNA聚合酶得到的RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。终止子序列防止上游启动子对下游核酸序列的转录激活。因此,在某些实施方案中,涵盖终止RNA转录物的产生的终止子。最常用的终止子类型是正向终止子。当置于通常转录的核酸序列的下游时,正向转录终止子将引起转录中止。在一些实施方案中,提供双向转录终止子,其通常引起转录在正向和反向链两者上终止。在一些实施方案中,提供了逆转录终止子,其通常仅在反向链上终止转录。在原核系统中,终止子通常落入两类中:(1)不依赖于rho的终止子和(2)rho依赖性终止子。不依赖于rho的终止子通常由回文序列组成,所述回文序列形成富含G-C碱基对,随后是一串尿嘧啶碱基的茎环。
根据本公开使用的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的转录终止子。终止子的非限制性实例包括基因的终止序列,如例如牛生长激素终止子,和病毒终止序列,如例如T0终止子、TE终止子、细菌系统中找到的λT1和T1T2终止子。在一些实施方案中,终止信号可以是不能被转录或翻译的序列,如源自序列截短的序列。
本公开的酶可以由核酸编码,所述核酸是基因组定位的(称为“基因组定位的核酸”)或以附加体定位(称为“附加体定位的核酸”)。细胞中基因组定位的核酸是位于细胞基因组中的核酸。细胞中附加体定位的核酸是位于细胞中的自主复制附加体(如质粒)上的核酸。基因组定位的核酸和附加体定位的核酸可以是细胞内源的(例如,源自细胞内)或细胞外源的(例如,源自细胞外)。通常,外源核酸是工程化核酸(例如,重组或合成的)。
可以使用本领域已知的任何手段将工程化核酸导入宿主细胞中,包括但不限于转化、转染(例如,化学(例如,磷酸钙、阳离子聚合物或脂质体)或非化学(例如电穿孔、声穿孔、impalefection、光转染、水动力学))和转导(例如,病毒转导)。
在一些实施方案中,工程化细胞表达选择标志物。选择标志物通常用于选择工程化细胞,所述工程化细胞在转染细胞后(或在用于将外来核酸导入细胞中的其它程序后)已经摄取并表达工程化核酸。因此,编码产物的核酸也可以编码选择标志物。选择标志物的实例包括但不限于编码蛋白质的基因,所述蛋白质增加或降低对抗生素(例如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因和氯霉素抗性基因)或其它化合物的抗性或敏感性。可以根据本公开使用其它选择标志物。
如果在细胞中产生由核酸(例如,工程化核酸)编码的产物,则工程化细胞“表达”产物。本领域中公知的是,基因表达是指以核酸形式的遗传指令用于合成产物如蛋白质(例如酶)的过程。
在一些实施方案中,本公开的蛋白质(例如,核酸酶)可以工程化改造为包含如本文所提供的蛋白酶识别序列和/或周质靶向序列。
由天然存在的核酸编码的酶或其它蛋白质可以称为“内源酶”或“内源蛋白”。
工程化细胞可以是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中,工程化细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其它类型的细胞。
本公开的工程化细菌细胞包括但不限于工程化的埃希氏菌属种(Escherichiaspp.)、链霉菌属种(Streptomyces spp.)、Zymonas spp.,醋杆菌属种(Acetobacterspp.)、柠檬酸杆菌属种(Citrobacter spp.)、集胞藻属种(Synechocystis spp.)、根瘤菌属种(Rhizobium spp.)、梭菌属种(Clostridium spp.)、棒状杆菌属种(Corynebacteriumspp.)、链球菌属种(Streptococcus spp.),黄单胞菌属种(Xanthomonas spp.)、乳杆菌属种(Lactobacillus spp.)、乳杆菌属种(Lactococcus spp.)、芽孢杆菌属种(Bacillusspp.)、产碱杆菌属种(Alcaligenes spp.)、假单胞菌属种(Pseudomonas spp.)、气单胞菌属种(Aeromonas spp.)、固氮菌属种(Azotobacter spp.)、丛毛平胞菌属种(Comamonasspp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium spp.)、红球菌属种(Rhodococcus spp.)、葡糖杆菌属种(Gluconobacter spp.)、罗尔斯通氏菌属种(Ralstonia spp.)、酸硫杆状菌属种(Acidithiobacillus spp.)、小月菌属种(Microlunatus spp.),地杆菌属种(Geobacterspp.)、土芽孢杆菌属种(Geobacillus spp.)、节杆菌属种(Arthrobacter spp.)、黄杆菌属种(Flavobacterium spp.)、沙雷菌属种(Serratia spp.)、糖多孢菌属种(Saccharopolyspora spp.)、栖热菌属种(Thermus spp.)、狭长平胞属种(Stenotrophomonas spp.)、色杆菌属种(Chromobacterium spp.)、大豆根瘤菌属种(Sinorhizobium spp.)、糖多孢菌属种(Saccharopolyspora spp.)、土壤杆菌属种(Agrobacterium spp.)、和泛菌属种(Pantoea spp.)。
本公开的工程化酵母细胞包括但不限于工程化酵母属种(Saccharomyces spp.)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。
在一些实施方案中,本公开的工程化细胞是工程化的大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)细胞、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)细胞或短乳杆菌(Lactobacillus brevis)细胞。在一些实施方案中,本公开的工程化细胞是工程化的大肠杆菌细胞。
细胞培养
通常,培养工程化细胞。“培养”是指细胞在受控条件下培养的过程,通常在其自然环境之外。例如,可以在液体营养肉汤(也称为液体“培养基”)中以细胞悬浮液培养工程化细胞(如工程化细菌细胞)。
常用的细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括但不限于LB(Luria Bertani)Miller肉汤(1%NaCl):1%胨、0.5%酵母提取物、和1%NaCl;LB(Luria Bertani)Lennox肉汤(0.5%NaCl):1%胨、0.5%酵母提取物、和0.5%NaCl;SOB培养基(Super Optimal Broth):2%胨、0.5%酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4;SOC培养基(具有分解代谢阻抑物的Super Optimal肉汤):SOB+20mM葡萄糖;2x YT肉汤(2x酵母提取物和胰蛋白胨):1.6%胨、1%酵母提取物、和0.5%NaCl;TB(Terrific Broth)培养基:1.2%胨、2.4%酵母提取物、72mM K2HPO4、17mM KH2PO4和0.4%甘油;和SB(Super Broth)培养基:3.2%胨、2%酵母提取物、和0.5%NaCl。
高密度细菌大肠杆菌生长培养基的实例包括DNAGroTM培养基、ProGroTM培养基、AutoXTM培养基、DetoXTM培养基、InduXTM培养基、和SecProTM培养基。
在一些实施方案中,在导致产物(例如蛋白质和/或核酸)表达的条件下培养工程化细胞。此类培养条件可以取决于所表达的特定产品和期望的产物量。
在一些实施方案中,在30℃至40℃的温度培养工程化细胞。例如,可以在30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度培养工程化细胞。通常,在37℃的温度培养工程化细胞,如工程化细菌细胞。
在一些实施方案中,将工程化细胞培养12小时至72小时或更长的时间段。例如,可以将工程化细胞培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时的时间段。通常,将工程化细胞,如工程化细菌细胞培养12至24小时的时间段。在一些实施方案中,将工程化细胞在37℃的温度培养12至24小时。
在一些实施方案中,将工程化细胞(例如,在液体细胞培养基中)培养至在波长600nm(OD 600)下测量的光密度5至25。在一些实施方案中,将工程化细胞培养至5、10、15、20或25的OD600。
在一些实施方案中,将工程化细胞培养至1x104至1x108个活细胞/ml细胞培养基的密度。在一些实施方案中,将工程化细胞培养至1x104、2x104、3x104、4x104、5x104、6x104、7x104、8x104、9x104、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、或1x108个活细胞/ml的密度。在一些实施方案中,将工程化细胞培养至2x105至3x107个活细胞/ml的密度。
在一些实施方案中,将工程化细胞在生物反应器中培养。生物反应器仅指培养细胞的容器,如可以单次使用(一次性)、可高压灭菌或可灭菌的培养瓶、皿或袋。生物反应器可以由玻璃制成,或者它可以是基于聚合物的,或者可以由其它材料制成。
生物反应器的实例包括但不限于搅拌罐(例如,良好混合的)生物反应器和管状(例如,活塞流)生物反应器、空气提升生物反应器、膜搅拌罐、旋转过滤搅拌槽、振动混合器(vibromixer)、流化床反应器和膜生物反应器。操作生物反应器的方式可以是分批或连续过程,并且将取决于所培养的工程化细胞。当连续补料并且从系统取出进料和产物流时,生物反应器是连续的。分批生物反应器可以具有连续的再循环流动,但是无营养物或产物收获物的连续补料。对于间歇-收获和补料分批(或分批补料)培养物,将细胞以较低的活细胞密度在培养基中接种,所述培养基在组成上类似于分批培养基。允许细胞在基本上没有外部操作的情况下指数生长,直到营养物略微耗尽并且细胞接近稳定的生长期。在此点时,为了间歇-收获分批-补料过程,可以收获细胞和产物的部分,并用新鲜培养基补充取出的培养基。可以将此过程重复几次。为了生成重组蛋白和抗体,可以使用补料分批方法。虽然细胞以指数生长,但营养物质正在耗尽,连续或间歇地添加浓缩的补料培养基(例如,10-15倍浓缩的基础培养基)以提供额外的营养物,允许细胞浓度和生产阶段长度的进一步增加。可以在不取出培养基(肉汤)的情况下与细胞浓度成比例添加新鲜培养基。为了容纳培养基添加,以比生物反应器的全容量(例如,最大体积的约40%至50%)低得多的体积开始补料分批培养。
本公开的一些方法涉及dsRNA的大规模生产。对于大规模生产方法,可以在液体培养基中以5升(L)至50L或更多的体积培养工程化细胞。在一些实施方案中,可以以大于(或等于)10L的体积在液体培养基中培养工程化细胞。在一些实施方案中,在液体培养基中在5L、10L、15L、20L、25L、30L、35L、40L、45L或50L或更多的体积中培养工程化细胞。在一些实施方案中,可以在液体培养基中在5L至10L、5L至15L、5L至20L、5L至25L、5L至30L、5L至35L、5L至40L、5L至45L、10L至15L、10L至20L、10L至25L、20L至30L、10L至35L、10L至40L、10L至45L、10L至50L、15L至20L、15L至25L、15L至30L、15L至35L、15L至40L、15L至45L、或15至50L的体积中培养工程化细胞。
细胞裂解物
通常,工程化细胞的培养继之以裂解细胞。“裂解”是指例如通过病毒、酶促、机械或渗透机制破坏细胞的过程。“细胞裂解物”是指含有裂解细胞(例如裂解工程化细胞)的内容物的流体,包括例如细胞器、膜脂质、蛋白质和核酸。可以通过裂解任何工程化细胞群体来产生本公开的细胞裂解物,如本文所提供的。
称为“裂解”的细胞裂解方法是本领域已知的,其中任一种可根据本公开使用。此类细胞裂解方法包括但不限于物理裂解和化学(例如,基于去污剂的)裂解。
细胞裂解可以扰乱精心控制的细胞环境,导致蛋白质降解和由不受调节的内源蛋白酶和磷酸酶的修饰。因此,在一些实施方案中,可以将蛋白酶抑制剂和/或磷酸酶抑制剂添加到裂解试剂中,或者可以通过基因失活或蛋白酶靶向除去这些活性。
在一些实施方案中,细胞裂解物可以与至少一种营养物组合。例如,细胞裂解物可以与Na2HPO4、KH2PO4、NH4Cl、NaCl、MgSO4、CaCl2组合。其它营养物的实例包括但不限于硫酸镁、氯化镁、乳清酸镁、柠檬酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、硫酸铵、氯化铵、氢氧化铵。
在一些实施方案中,细胞裂解物可以与至少一种辅因子组合。例如,细胞裂解液可以与腺苷二磷酸(ADP)、腺苷三磷酸(ATP)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或对于酶活性所需要的其它非蛋白质化学化合物(例如无机离子和辅酶)组合。
在一些实施方案中,在导致RNA解聚的条件下温育细胞裂解物。在一些实施方案中,在导致dsRNA产生的条件下温育细胞裂解物。
本公开的方法包括在导致RNA解聚和/或dsRNA产生的条件下温育(至少一种)细胞裂解物。细胞裂解物可以在4℃至45℃或更高的温度温育。例如,可以于4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、或45℃的温度温育工程化细胞。在一些实施方案中,于4-6℃、25℃、或37℃的温度温育细胞裂解物。在一些实施方案中,于15℃至45℃的温度温育细胞裂解物。
在一些实施方案中,将细胞裂解物温育30分钟(min)至48小时(hr)或更长的时间段。例如,可以将工程化细胞培养30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、或48小时的时间段。在一些实施方案中,将细胞裂解物温育2小时至48小时的时间段。在一些实施方案中,于37℃的温度将细胞裂解物温育24小时。
用于单一反应的细胞裂解物的体积可以变化。在一些实施方案中,细胞裂解物的体积是1至150m3。例如,细胞裂解物的体积可以是1m3、5m3、10m3、15m3、20m3、25m3、30m3、35m3、40m3、45m3、50m3、55m3、60m3、65m3、70m3、75m3、80m3、85m3、90m3、95m3、100m3、105m3、110m3、115m3、120m3、125m3、130m3、135m3、140m3、145m3、或150m3。在一些实施方案中,细胞裂解物的体积是25m3至150m3、50m3至150m3、或100m3至150m3。
在一些实施方案中,细胞裂解物或反应混合物没有核酸酶(例如核糖核酸酶)活性。如果细胞裂解物或反应混合物没有核酸酶或如果细胞裂解物或反应中的核酸酶活性的量通过用于检测蛋白质(例如酶)活性的标准测定法检测不到,则认为细胞裂解物或反应混合物“没有核酸酶活性”。酶测定法的非限制性实例包括连续测定法(例如分光光度、荧光测定、量热、化学发光、光散射和微量热迁移)和不连续测定法(例如辐射测定和层析)。本文涵盖了其它酶测定法。
蛋白酶靶向
本公开的工程化细胞可以表达(例如,内源表达)对于RNA解聚必需的核酸酶,其继而可以降解期望的RNA产物。为了防止或减少由本文提供的方法产生的RNA的降解,可以修饰内源和/或工程化的核酸酶,以在其蛋白质序列中包括位点特异性蛋白酶识别序列,使得核酸酶可以被“靶向”并切割以在RNA生成期间失活(参见例如2012年3月1日公布的美国公开号2012/0052547 A1;和2015年2月12日公布的国际公开号WO 2015/021058A2,其中每一篇通过引用并入本文)。含有位点特异性蛋白酶识别序列的核酸酶称为“蛋白酶靶向性核酸酶”。在核酸酶与细胞裂解物中的关联位点特异性蛋白酶接触后导致蛋白酶靶向性核酸酶的切割。因此,特定群体的工程化细胞可以包含编码蛋白酶靶向性核酸酶的工程化核酸或其它蛋白酶靶向性核糖核酸酶。在本文中也涵盖其它酶的蛋白酶靶向。
如下文更详细地描述的,本公开的蛋白酶靶向性核酸(例如,核酸酶或其它核糖核酸酶,如表1、表6和表7中所述的那些)可以也包含周质靶向序列。在细胞生长阶段期间将蛋白酶靶向性核酸酶隔离到周质防止核酸酶降解细胞生长所需的细胞RNA。
在一些实施方案中,本公开的细胞含有编码关联蛋白酶的工程化核酸。在一些实施方案中,关联蛋白酶包含周质靶向序列,如下所讨论。在一些实施方案中,(例如,第一培养物的)一个群体的细胞含有编码蛋白酶靶向性核酸酶的工程化核酸,并且(例如,第二培养物的)不同群体的细胞含有编码关联蛋白酶的工程化核酸,所述关联蛋白酶切割核酸酶的蛋白酶识别序列。
可以根据本公开使用的蛋白酶的实例包括但不限于丙氨酸羧肽酶、蜜环菌(Armillaria mellea)、虾红素(astacin)、细菌亮氨酰氨肽酶、癌症前凝血剂(cancerprocoagulant)、组织蛋白酶B、梭菌蛋白酶(clostripain)、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、弹性蛋白酶、内蛋白酶Brg-C、肠激酶、胃亚蛋白酶(gastricsin)、明胶酶,Gly-X羧肽酶、甘氨酰内肽酶、人鼻病毒3C蛋白酶、hypodermin C、Iga特异性丝氨酸内肽酶、亮氨酰氨肽酶、亮氨酰内肽酶、lysC、溶酶体pro-X羧肽酶、赖氨酰氨肽酶、甲硫氨酰氨肽酶、粘球菌(myxobacter)、nardilysin、胰腺内肽酶E、picornain 2B、picornain 3C、内肽酶原(endopeptidase)、脯氨酰氨肽酶、前蛋白转化酶I、前蛋白转化酶II、russellysin、糖胃蛋白酶(saccharopepsin)、精液琼脂酶(semenogelase)、T-纤溶酶原激活物、凝血酶、组织激肽释放酶、烟草蚀刻病毒(TEV)、togavirin、色氨酰氨肽酶、U-纤溶酶原激活物、V8、腹蛇毒素(venombin)B、腹蛇毒素BB和Xaa-pro氨肽酶。
周质靶向
在一些实施方案中,工程化细胞的核酸酶(例如,核糖核酸酶)或其它酶(例如蛋白酶)含有负责将核酸酶或其它酶隔绝到细胞周质的周质靶向序列。“周质靶向序列”是下述氨基酸序列,该氨基酸序列将与它连接的蛋白质靶向到细胞周质。与周质靶向序列连接的蛋白质将在表达蛋白质的细胞的周质中隔绝。
例如,周质靶向序列可以衍生自细菌分泌蛋白的N端。序列长度从约15至约70个氨基酸变化。周质靶序列的一级氨基酸序列有所变化,但通常具有共同的结构,包括以下组分:(i)N端部分具有可变长度,并且通常携带净正电荷;(ii)接着是约6至约15个氨基酸的中心疏水核心;和(iii)最终组分包含限定信号肽酶切割位点的4至6个氨基酸。
在一些实施方案中,本公开的周质靶向序列可以衍生自在革兰氏阴性细菌中分泌的蛋白质。分泌性蛋白质可以由细菌或感染细菌的噬菌体编码。分泌性蛋白质的革兰氏阴性细菌来源的实例包括但不限于埃希氏菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)、柄杆菌属(Caulobacter)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、醋杆菌属(Acetobacter)、无色杆菌属(Achromobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、固氮菌属(Azotobacter)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、丛毛平胞菌属(Comamonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、根瘤菌属(Rhizobium)、弧菌属(Vibrio)和黄单胞菌属(Xanthomonas)。
根据本公开使用的周质靶向序列的实例包括但不限于选自以下的序列:
MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA(SEQ ID NO:1);
MKQSTIALALLPLLFTPVTKA(SEQ ID NO:2);
MMITLRKLPLAVAVAAGVMSAQAMA(SEQ ID NO:3);MNKKVLTLSAVMASMLFGAAAHA(SEQ IDNO:4);
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA(SEQ ID NO:5);
MKKIWLALAGLVLAFSASA(SEQ ID NO:6);
MMTKIKLLMLIIFYLIISASAHA(SEQ ID NO:7);
MKQALRVAFGFLILWASVLHA(SEQ ID NO:8);
MRVLLFLLLSLFMLPAFS(SEQ ID NO:9);和
MANNDLFQASRRRFLAQLGGLTVAGMLGPSLLTPRRATA(SEQ ID NO:10)。
实施例
第一群体的工程化细胞表达蛋白酶靶向性核酸酶,包括但不限于表1所列的那些蛋白酶靶向性核酸酶,其定位于周质。第二群体的工程化细胞表达至少一种NMP和/或NDP激酶、DNA依赖性RNA聚合酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶、以及定位于周质的位点特异性蛋白酶。另外,第二群体的细胞含有编码感兴趣的dsRNA的DNA模板,其中DNA模板侧翼有调节DNA模板转录的遗传元件(例如5’启动子,3’终止子)。将每个群体的细胞工程化改造为含有失活或蛋白酶靶向的RNA酶,包括但不限于表6和表7所列的那些RNA酶,或编码此类RNA酶的基因的染色体缺失。
使用具有葡萄糖和/或其它糖或充当碳源和能源的基于碳的分子的常规发酵手段将第一群体的细胞培养至高细胞密度。在达到适当的细胞密度时,通过添加诱导剂分子或通过其它手段诱导核酸酶的表达。允许蛋白质诱导持续直到达到足够的蛋白质表达水平。生长和诱导后,必要时将生物量浓缩。随后裂解生物量,允许核酸酶接近细胞寡聚RNA分子。将此物质优选在37℃温育,直至发生适当的RNA解聚(例如2小时至24小时)。
以与第一群体的细胞相似的方式培养、诱导和浓缩第二群体的细胞。将所得的生物量裂解并与来自第一群体的细胞的裂解物混合。细胞裂解物的混合允许蛋白水解失活第一群体的细胞中表达的核酸酶以及来自这两个细胞群体的各种靶向性RNA酶。从第一群体的细胞中的寡聚RNA的核酸酶介导的解聚产生的单体NMP和/或NDP随后通过表2和表3中列出的至少一种核苷酸激酶的活性转化为NTP。将多磷酸盐添加到反应以产生对于通过多磷酸激酶磷酸化NMP和NDP所需要的ATP。使用前述染色体外DNA分子作为模板,通过DNA依赖性RNA聚合酶和/或RNA依赖性RNA聚合酶的作用使所得的NTP寡聚化,产生期望的序列特异性dsRNA分子。
其它实施方案
在权利要求书中,冠词“一个”、“一种”和“所述/该”可以表示一个/种或超过一个/种,除非相反指示或根据上下文另外明显的。如果一个、超过一个、或所有的组成员在给定的产品或过程中存在、采用或以其它方式相关,则认为满足在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述,除非相反指示或根据上下文另外明显的。本发明包括组的正好一个成员在给定的产品或过程中存在、采用或与给定的产品或过程以其它方式相关的实施方案。本发明包括超过一个或所有的组成员在给定的产品或方法中存在、采用或与给定的产品或过程以其它方式相关的实施方案。
此外,本发明涵盖将一个或多个所列权利要求中的一个或多个限制、元件、条款和描述性术语引入另一个权利要求中的所有变化、组合和排列。例如,从属于另一个权利要求的任何权利要求可修改为包括从属于相同基础权利要求的任何其它权利要求中找到的一个或多个限制。在元件以列表呈现,例如以马库什组形式呈现的情况下,也公开了元件的每个亚组,并且可以从组中除去任何元件。应当理解,一般而言,在本发明或本发明的各方面称为包括特定元件和/或特征的情况下,本发明的某些实施方案或本发明的方面由此类元件和/或特征组成,或基本上由此类元件和/或特征组成。为了简单起见,那些实施方案在本文中没有具体阐述。还应注意,术语“包含”和“含有”旨在是开放的并且允许包括附加元件或步骤。在给定范围的情况下,包括端点。此外,除非另有指示或根据上下文和本领域普通技术人员的理解另外明显,否则表示为范围的值可以采取在本发明的不同实施方案中的所述范围内的任何具体值或子范围,到范围下限单位的十分之一,除非上下文另有明确规定。
本申请引用各种公告的专利、公开的专利申请、期刊文章和其它出版物,所有这些通过引用并入本文。如果任何并入的参考文献和本说明书之间存在冲突,则以本说明书为准。此外,落入现有技术内的本发明的任何具体实施方案可以明确地从任何一个或多个权利要求中排除。由于这些实施方案认为是本领域普通技术人员已知的,因此即使未在本文中明确阐述排除,也可以排除它们。无论是否与现有技术的存在有关,本发明的任何具体实施方案可以出于任何原因而从任何权利要求中排除。
本领域技术人员将认识到或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的具体实施方案的许多等同方案。本文所描述的本实施方案的范围不旨在限于上述描述,而是如所附权利要求书中所阐述的。本领域普通技术人员将理解,在不脱离如所附权利要求书所限定的本发明的精神或范围的情况下,可对本说明书进行各种改变和修改。
Claims (29)
1.生成RNA的方法,所述方法包括:
(a) 将第一细胞群体培养至期望的细胞密度,其中所述细胞包含至少一种工程化核酸,所述工程化核酸含有与编码核酸酶的序列可操作连接的启动子,所述核酸酶包含蛋白酶识别位点并且与周质靶向序列连接,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;
(b) 裂解步骤(a)中生成的细胞,从而生成第一细胞裂解物;
(c) 在导致RNA解聚的条件下温育所述第一细胞裂解物,从而生成含有核苷酸5’-单磷酸的第一细胞裂解物;
(d) 培养包含以下项的细胞的第二群体:(i)至少一种工程化核酸,其含有与编码关联蛋白酶的序列可操作连接的启动子,所述关联蛋白酶切割所述核酸酶的蛋白酶识别位点,其中所述关联蛋白酶与周质靶向序列连接,(ii)至少一种工程化核酸,其含有与编码核苷酸激酶的序列可操作连接的启动子,(iii)至少一种工程化核酸,其含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子,和(iv)工程化脱氧核糖核酸(DNA)模板,其含有与编码RNA的序列可操作连接的启动子,其中在所述细胞中将至少一种内源核糖核酸酶遗传失活或经由靶向蛋白水解失活;
(e) 裂解步骤(d)中生成的培养细胞,以生成第二细胞裂解物;
(f)组合步骤(b)中生成的所述第一细胞裂解物、步骤(e)中生成的所述第二细胞裂解物、和多磷酸盐,从而生成混合物;并且
在导致RNA生成的条件下温育所述混合物。
2.权利要求1的方法,其中所述与编码核酸酶的序列可操作连接的步骤(a)的启动子是诱导型的。
3.权利要求1的方法,其中步骤(d)(i)、(d)(ii)或(d)(iii)中任一项的所述启动子中的至少一种是诱导型的。
4.权利要求1-3中任一项的方法,其中步骤(a)的所述核酸酶选自下组:S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、和RNA酶R。
5.权利要求1-3中任一项的方法,其中步骤(a)和/或(d)的所述细胞含有至少一种蛋白酶靶向性内源核糖核酸酶和/或编码内源核糖核酸酶的基因中的至少一种染色体缺失。
6.权利要求5的方法,其中步骤(a)的至少一种内源核糖核酸酶选自下组:RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、RNA酶T、RNA酶E及其组合。
7.权利要求1-3中任一项的方法,其中步骤(d)(ii)的所述核苷酸激酶是核苷酸单磷酸激酶。
8.权利要求7的方法,其中所述核苷酸单磷酸激酶选自下组:尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鸟苷酸激酶、和腺苷酸激酶。
9.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述核苷酸激酶是核苷酸二磷酸激酶。
10.权利要求9的方法,其中所述核苷酸二磷酸激酶选自下组:核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶。
11.权利要求1-3中任一项的方法,其中在所述细胞中使至少一种降解多磷酸盐的步骤(a)和/或(d)的内源酶遗传失活。
12.权利要求11的方法,其中所述降解多磷酸盐的内源酶中的至少一种选自下组:核苷单磷酸酶、核苷二磷酸酶、核苷三磷酸酶、核苷三磷酸磷酸水解酶、和外切聚磷酸酶。
13.权利要求11的方法,其中步骤(a)和/或(d)的所述细胞含有至少一种降解多磷酸盐的蛋白酶靶向性酶和/或编码降解多磷酸盐的酶的基因中的至少一种染色体缺失。
14.权利要求1或3中任一项的方法,其中步骤(d)(iii)的所述RNA聚合酶是DNA依赖性RNA聚合酶。
15.权利要求14的方法,其中步骤(d)(iv)的所述DNA依赖性RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶。
16.权利要求14的方法,其中所述工程化DNA模板的序列编码含有通过铰接域连接的互补域的mRNA。
17.权利要求16的方法,其中步骤(d)(iv)的所述工程化DNA模板的所述启动子是T7启动子,并且其中T7转录终止子位于序列的3’端,所述序列编码所述含有通过铰接域连接的互补域的mRNA。
18.权利要求1或3的方法,其中步骤(d) (iii)的所述细胞包含至少两种工程化核酸,各自含有与编码RNA聚合酶的序列可操作连接的启动子,其中所述工程化核酸之一编码DNA依赖性RNA聚合酶,并且所述工程化核酸之一编码RNA依赖性RNA聚合酶。
19.权利要求18的方法,其中所述DNA依赖性RNA聚合酶是T7 RNA聚合酶,并且所述RNA依赖性RNA聚合酶是Φ6 RdRP。
20.权利要求19的方法,其中步骤(d)(iv)的所述工程化DNA模板的序列含有与序列可操作连接的启动子,所述序列编码含有单一靶域的mRNA。
21.权利要求20的方法,其中所述启动子是T7启动子,并且T7转录终止子位于所述序列的3’端,所述序列编码所述含有单一靶域的mRNA。
22.权利要求17的方法,其中步骤(d)(iv)的所述工程化DNA模板位于含有内切核酸酶切割位点的表达载体上。
23.权利要求22的方法,其中所述内切核酸酶切割位点是I-SceI内切核酸酶切割位点。
24.权利要求22的方法,其中步骤(d)的所述细胞进一步包含编码内切核酸酶的核酸,所述内切核酸酶切割所述内切核酸酶切割位点。
25.权利要求1-3中任一项的方法,其中步骤(a)和/或(d)的所述细胞含有至少一种蛋白酶靶向性内源RNA聚合酶和/或编码内源RNA聚合酶的基因中的至少一种染色体缺失。
26.权利要求1-3中任一项的方法,其中步骤(a)和/或步骤(d)的所述细胞还包含工程化核酸,所述工程化核酸含有与编码T7噬菌体Gp2蛋白的序列可操作连接的诱导型启动子。
27.权利要求1-3中任一项的方法,其中在存在糖的情况下培养步骤(a)和/或步骤(d)的所述细胞。
28.权利要求27的方法,其中所述糖是葡萄糖。
29.权利要求1-3中任一项的方法,其中所述RNA是双链RNA (dsRNA)。
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