WO2006109751A1 - 無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 - Google Patents

無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法 Download PDF

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WO2006109751A1
WO2006109751A1 PCT/JP2006/307503 JP2006307503W WO2006109751A1 WO 2006109751 A1 WO2006109751 A1 WO 2006109751A1 JP 2006307503 W JP2006307503 W JP 2006307503W WO 2006109751 A1 WO2006109751 A1 WO 2006109751A1
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cell
protein
chia
reaction
sample
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PCT/JP2006/307503
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tadayuki Imanaka
Tamotsu Kanai
Haruyuki Atomi
Takashi Endoh
Original Assignee
Kyoto University
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein using a cell-free protein translation system or a cell-free protein transcription-translation system under high temperature conditions.
  • a cell-free protein synthesis system is a system that synthesizes a protein using a cell extract, and has a much simpler procedure for protein synthesis and purification than a system that uses living cells such as E. coli.
  • the demand has increased.
  • the system can be easily modified, so it is not only possible to obtain industrially useful cell-derived proteins.For example, proteins that are highly toxic to cells, proteins that have introduced the desired mutation, non- There is an advantage that a protein introduced with a natural amino acid can also be obtained.
  • Patent Document 1 a technique for adding a linear nucleic acid that does not become a type of protein synthesis to a synthesis reaction solution at a specific concentration (Patent Document 2) is disclosed.
  • the above cell-free protein synthesis system synthesizes proteins at room temperature. For example, it synthesizes proteins that are difficult to synthesize at room temperature, such as nuclease that degrades cage DNA.
  • a cell-free protein synthesis system that synthesizes proteins under low temperature conditions using an extract of a microorganism belonging to the genus Pseudomonas or Rhodococcus (Patent Document 3).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-175695
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-136971
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-290181
  • the present inventors focused on a Thermococcus kodakaraensis KODl strain, which is a kind of hyperthermophilic bacterium, in order to establish a cell-free protein synthesis system under high temperature conditions, and used a cell extract derived from the strain. As a result of diligent examination of reaction conditions suitable for protein synthesis using the reaction solution containing the present invention, the present invention has been completed.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a method for producing a protein using a cell-free protein translation system in which the mRNA encoding the target protein is translated under high temperature conditions in a cell-free protein translation system containing a cell extract derived from hyperthermophilic bacteria.
  • kits for producing a protein using a cell-free protein translation system comprises a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, mRNA, Mg 2+ and amino acids encoding the target protein.
  • a kit for producing a protein by translating the mRNA under high temperature conditions comprises a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, mRNA, Mg 2+ and amino acids encoding the target protein.
  • a method for producing a protein using a cell-free protein transcription / translation system which includes a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, and transcription of a plasmid encoding the target protein in the cell-free protein transcription / translation system
  • a method for producing a protein by performing translation under high temperature conditions which includes a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, and transcription of a plasmid encoding the target protein in the cell-free protein transcription / translation system
  • the transcription temperature is set to the optimum temperature for the RNA polymerase, and the translation temperature is set to [1] to [9].
  • the optimal temperature of the cell-free protein translation system described in The method according to any one of [11] to [14], wherein
  • Cell-free protein transcription / translation system for the production of proteins using cell-free protein transcription / translation systems, cell extracts from hyperthermophilic bacteria, plasmids encoding target proteins, A RNA containing RNA polymerase, Mg 2+ and amino acids, for producing a protein by performing transcription and translation of the plasmid under high temperature conditions,
  • the plasmid force encoding the target protein The kit according to any one of [16] to [18], comprising a promoter, a ribosome binding sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a base sequence encoding the target protein in order from upstream .
  • a protein can be produced under a high temperature condition in a cell-free protein translation system containing a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium.
  • a protein can be produced under high temperature conditions in a cell-free protein transcription / translation system containing a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of pTRCl and an outline of a method for preparing ChiA A 4 mRNA.
  • FIG. 2 The results of the synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using the samples shown in Table 2, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 4 The results are shown in Table 3. Samples 1 and 5-9 in Table 3 were used for ChiA ⁇ 4 synthesis reaction! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzed by Western plotting.
  • FIG. 5 shows the results of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 1 and 2 in Table 4, electrophoresing on polyacrylamide gel, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 6 The results are shown in Table 4. Samples 1 and 3 to 5 in Table 4 were used for ChiA ⁇ 4 synthesis reaction! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzed by Western plotting.
  • FIG. 7 The results are shown in Table 4. Samples 2 and 6-8 in Table 4 were used for ChiA ⁇ 4 synthesis reaction! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzed by Western plotting.
  • FIG. 8 shows the result of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 1 to 9 in Table 5! /, Polyacrylamide gel electrophoresis and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 9 is a diagram showing the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized after completion of the synthesis reaction when ChiA ⁇ 4 synthesis reaction was performed using samples 2 to 9 in Table 5.
  • FIG. 10 is a graph showing the change over time in the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized by carrying out a ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 5, 7 and 9 in Table 5.
  • FIG. 11 shows the results of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 1 to 3 in Table 6, performing polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 12 The results of the synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 4 to 6 in Table 6! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 13 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 3 and 9 in Table 7! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 14 The results are shown in Table 7. Samples 4 to 9 in Table 7 were subjected to ChiA ⁇ 4 synthesis reaction! /, Subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by Western plotting.
  • FIG. 15 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 and 9 in Table 8, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 16 shows the results of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 2, 3 and 9 in Table 8, conducting polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 17 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 4, 5 and 9 in Table 8, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 18 The results of the synthesis of ChiA ⁇ 4 using samples 6 and 9 in Table 8 were analyzed by Western blotting after polyacrylamide gel electrophoresis.
  • FIG. 19 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 7 in Table 9, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 20 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 8 and 9 in Table 10, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 21 shows the result of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using Sample 8 in Table 11, electrophoresing on polyacrylamide gel, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 22 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using Sample 8 in Table 12, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 23 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 4 in Table 13, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 24 This is a protocol that numbers and summarizes the procedures after culturing KOD1 strain among the procedures described in “2. Preparation of cell extract”.
  • FIG. 25 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 5 in Table 14! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 26 The results are shown in Table 15. Samples 1 to 4 in Table 15 were subjected to a ChiA ⁇ 4 synthesis reaction! /, Subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and analyzed by Western plotting.
  • FIG. 27 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 4 in Table 18, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 28 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 and 2 in Table 20, polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 29 is a protocol for preparation of S30FP-1G.
  • FIG. 30 shows the results of ChiA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 5 in Table 21, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 31 shows the result of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using Samples 6 to 10 in Table 22! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 32 shows the results of performing a synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 using samples 1 to 5 in Table 23, polyacrylamide gel electrophoresis, and analyzing by Western plotting.
  • FIG. 35 shows the results of CWA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 4 in Table 27! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 36 is a graph showing the relationship between the PEP concentration in the reaction solution and the synthesized CWA ⁇ 4 concentration.
  • FIG. 37 Sample 28 in Table 28: The results of CWA ⁇ 4 synthesis reaction using L1! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 38 is a graph showing the relationship between the Mg 2+ concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA A 4 concentration.
  • FIG. 39 shows the results of CWA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 6 in Table 29! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 40 is a graph showing the relationship between the NH + concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA A 4 concentration.
  • FIG. 41 shows the results of CWA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 8 in Table 30! /, Polyacrylamide gel electrophoresis, and analysis by Western plotting.
  • FIG. 42 shows the relationship between the amino acid concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA A 4 concentration.
  • FIG. 43 shows the results of a CWA ⁇ 4 synthesis reaction using samples 1 to 7 in Table 31, followed by polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 44 is a graph showing the relationship between the polyethylene glycol concentration in the reaction solution and the synthesized CWA ⁇ 4 concentration.
  • FIG. 45 Sample 32 in Table 32: CWA ⁇ 4 synthesis reaction was performed using L 1! /, The results of polyacrylamide gel electrophoresis and analysis by Western plotting.
  • FIG. 46 is a graph showing the relationship between the K + concentration in the reaction solution and the synthesized CWA ⁇ 4 concentration.
  • FIG. 47 is a diagram showing the amount of CWA ⁇ 4 synthesized after completion of the synthesis reaction when ChiA ⁇ 4 synthesis reaction was performed using samples 1 to 5 in Table 34.
  • the present invention relates to a method for producing a protein using a cell-free protein translation system, and in a cell-free protein translation system containing a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, translation of mRNA encoding the target protein is performed at a high temperature. Under the conditions And producing a protein.
  • the present invention also relates to a method for producing a protein using a cell-free protein transcription-translation system, wherein the target protein is encoded in a cell-free protein transcription 'translation system containing a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium. This is a method for producing a protein by performing transcription and translation of DNA (plasmid) under high temperature conditions.
  • the "high temperature condition” means a temperature higher than the optimum growth temperature of normal microorganisms, and 40 to 85 ° when protein is produced by a cell-free protein translation system. C, preferably 55 to 80 ° C, more preferably 57 to 78 ° C.
  • 40 to 85 ° C preferably 40 Refers to a temperature range of -80 ° C, more preferably 40-75 ° C.
  • Cell-free protein translation system refers to a cell extract derived from living cells and an mRNA that encodes the target protein (the mRNA is prepared separately from the cell extract). A system that synthesizes the protein through translation of the mRNA in the coexistence.
  • Cell-free protein transcription / translation system refers to a cell extract derived from living cells and a DNA encoding the target protein (the DNA is prepared separately from the cell extract). A system that synthesizes the protein through transcription and translation using the DNA as a saddle in the presence of coexistence. In the following explanation, cell-free protein translation system and cell-free protein transcription / translation system are not particularly distinguished!
  • hyperthermophilic bacterium used in the present invention refers to a thermophilic bacterium or thermophilic progenitor that grows at 60 ° C or higher, preferably 90 ° C or higher.
  • the hyperthermophilic bacterium applicable to the present invention is not particularly limited as long as it meets the above definition. At present, more than 100 types of hyperthermophilic bacteria have been isolated and identified, and any of these can be applied to the present invention. As such hyperthermophilic bacteria,
  • KODl strain Thermococcus kodakaraensi s KODl strain
  • Aeropyrum pernix Kl strain are used in Examples.
  • KOD1 stock has been deposited at the BioResource Center of the Institute of Science and Technology, and the deposit number is JCM 12380. Aeropyrum pernix K1 stock has also been deposited at the BioResource Center of the Institute of Science and Technology, and its deposit number is JCM 9820.
  • the protein that can be produced in the present invention is composed of a protein derived from a hyperthermophilic bacterium, a protein introduced with an unnatural amino acid, a protein introduced with a target mutation, and a plurality of amino acid residues. Including any peptide of any molecular weight. Proteins derived from hyperthermophilic bacteria generally have high heat resistance. For example, from the viewpoint of industrial use, heat-resistant enzymes derived from hyperthermophilic bacteria are suitable for the purpose of the present invention.
  • the cell extract refers to an extract of a hyperthermophilic bacterium containing components necessary for protein synthesis such as ribosome and tRNA.
  • This cell extract can be prepared by the method of Pratt et al. (Pratt, Transcription and ranslation—a practical approach, Henes, BD and Hig gins'S. J. ed., Pp.179-209, IRL Press, Oxford. , pp.179-209 (1984)). Specifically, it can be prepared by crushing with a French press or crushing with glass beads.
  • the cell-free protein translation system includes mRNA encoding the target protein, ATP regeneration system, energy sources such as ATP, GTP, CTP, UTP, buffers, salts, Stabilizers such as amino acids, RNase inhibitors, tRNA, dithiothreitol (DTT), spermine, supermidine, polyethylene glycol (for example, PEG8000), antibacterial agents and the like can be included.
  • the cell-free protein transcription / translation system includes a plasmid encoding the target protein instead of the mRNA encoding the target protein based on the above-described components, and can further include an RNA polymerase.
  • the mRNA encoding the target protein and the plasmid encoding the target protein refer to those prepared separately from those derived from the cell extract.
  • the ATP regeneration system is not particularly limited, and a known combination of a phosphate donor and a kinase can be used.
  • This combination includes, for example, a combination of phosphoenolpyruvate (PEP) and pyruvate kinase (PK), a combination of creatine phosphate (CP) and creatine kinase (CK), acetylyl phosphate (AP) and acetate.
  • PEP phosphoenolpyruvate
  • PK pyruvate kinase
  • CP creatine phosphate
  • CK creatine kinase
  • AP acetylyl phosphate
  • AK acetylyl phosphate
  • a combination of these ATP regeneration systems may be added to the cell-free protein synthesis system.
  • the above kinase is endogenous to the cell extract, only the above phosphate donor can be added to the cell-free protein synthesis system.
  • a buffer solution known in the art may be used.
  • examples thereof include Tris-acetic acid buffer solution, Tris-hydrochloric acid buffer solution, Hepes-KOH and the like.
  • salts that can be used include salts known in the art, such as acetates (magnesium acetate, ammonium acetate, potassium acetate, etc.), glutamates, and the like.
  • examples of the antibacterial agent include sodium azide and ampicillin.
  • a plasmid encoding the target protein a plasmid containing a promoter, a ribosome binding sequence (RBS) and a base sequence encoding the target protein in order from the upstream is preferable.
  • an appropriate terminator may be introduced downstream of the base sequence encoding the target protein in order to terminate the transcription reaction. If no terminator is introduced, a fragment obtained by treating with an appropriate restriction enzyme and cutting into fragments may be used (run off?).
  • the plasmid that can be used in the present invention is not particularly limited, and a known plasmid is used.
  • An appropriate promoter, RBS, or other terminator may be appropriately introduced and used by a known genetic engineering technique. Can do.
  • an endogenous promoter possessed by the hyperthermophile used in the preparation of the cell extract described above may be used, or an exogenous promoter may be used! ,.
  • the endogenous promoter is not particularly limited as long as a strong promoter capable of mass-producing the gene product encoded by the chromosomal DNA of the hyperthermophilic bacterium to be used is appropriately selected.
  • a GDH promoter that controls transcription of a thermostable glutamate dehydrogenase (GDH) gene can be used (R. NZARahman et al., Mol Gen Genet. 257.
  • an exogenous promoter an example of a promoter that satisfies the above-described force required to be able to act under high temperature conditions is, for example, the T7 promoter.
  • RBS endogenous RBS possessed by the hyperthermophilic bacterium used in the preparation of the cell extract described above can be appropriately selected and used.
  • the present inventors have heretofore derived from the KOD1 strain.
  • the consensus sequence of RBS of KOD1 strain is 5 '-GG (T / A) G (A / G) (T / G) -3 ′ (SEQ ID NO: 4). Therefore, when the KOD1 strain is used as a hyperthermophilic bacterium, RBS can be appropriately selected based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • RBS (5′-GGTGGT-3 ′, SEQ ID NO: 5) of the above-mentioned thermostable glutamate dehydrogenase (GDH) gene is used.
  • the target protein is not particularly limited as described above! However, in order to know the behavior of the cell-free protein synthesis system in the present invention, a protein whose characteristics are understood is coded. It is necessary to evaluate the efficiency of the system by expressing the reporter gene as a target gene. Therefore, the present inventors focused on chitinase (SEQ ID NO: 1) derived from K OD1 strain and encoded its partially deleted fragment (ChiA A4, SEQ ID NO: 2), as described in the Examples described later. We decided to use the gene to be used as a reporter gene.
  • the inventors of the present invention have conventionally isolated a large number of proteins derived from the KOD1 strain and analyzed their functions, of which chitinase has also been isolated and analyzed (JP-A-11 313688). .
  • the 910th Gly of SEQ ID NO: 1 was substituted with Met, and this was used as the N-terminus, and the partial deletion fragment (amino acid residues 911 to 1215) downstream thereof ( ChiA A 4, SEQ ID NO: 2) has extremely high thermal stability, such as a residual activity of 70% or more even after heat treatment at 100 ° C for 3 hours.
  • a gene encoding ChiA ⁇ 4 is selected as a reporter gene, and analysis of the synthesized ChiA ⁇ 4 is performed.
  • an endogenous terminator possessed by the hyperthermophilic bacteria used in the preparation of the cell extract described above may be used, or a known exogenous terminator may be used.
  • an exogenous terminator it can be appropriately selected in consideration of the combination with the promoter used.
  • T7 terminator can be selected as the exogenous terminator.
  • the mRNA encoding the target protein is preferably an mRNA having a ribosome binding sequence (RBS) upstream of the base sequence encoding the target protein.
  • the base sequence encoding the target protein and the ribosome binding sequence can be appropriately selected according to the same criteria as the plasmid encoding the target protein described above.
  • the mRNA used in the present invention can be prepared more easily than, for example, by first preparing the plasmid described above and then transferring the plasmid.
  • RNA polymerase those having an optimum temperature under high temperature conditions are suitable.
  • the “high temperature condition” means 40 ° C. or higher, preferably 50 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher.
  • RNA polymerase exhibiting the above properties RNA polymerase derived from hyperthermophilic bacteria used in the preparation of the cell extract described above, or exogenous RNA polymerase may be used. The RNA polymerase may be appropriately selected in consideration of the combination with the promoter described above.
  • T7 RNA polymerase for example, Thermo T7 RNA Polymerase, Toyo Fumigation Co., Ltd.
  • RNA polymerase for example, Thermo T7 RNA Polymerase, Toyo Fumigation Co., Ltd.
  • a reaction solution can be prepared by adding various components as described above in addition to a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium. If the cell extract, mRNA encoding the target protein, Mg 2+ and 20 kinds of amino acids are contained in the reaction solution, the target protein can be produced.
  • the target protein can be produced.
  • the expression level of the target protein can be increased.
  • concentration of each of the above components can be appropriately set according to the cell extract to be used, reaction temperature, reaction time, reaction scale, etc.
  • the cell extract derived from hyperthermophilic bacteria is displayed in the step of culturing the cells, the step of suspending the cultured cells in artificial seawater, the step of crushing the cell suspension, and the lysate after crushing. Step of incubation with pre-incubation mix described in 1 (hereinafter referred to as “pre-incubation”) And a subsequent dialysis step, etc., and can be prepared in substantially the same manner as the cell extract derived from E. coli.
  • pre-incubation pre-incubation mix described in 1
  • hypotonic solution with as low osmotic pressure as possible as a suspension of bacterial cells.
  • a cell extract suitable for increasing the expression level of the target protein can be prepared by adopting one or more of the preferred steps.
  • the pressure during pressing is 7,000 to 8,000 Op.
  • the preferred number of presses for si is 1 for the preferred suspension of cells.
  • Pre-incubation and dialysis are used for lysates after disruption in which S30 buffer is preferred as described in “2. Preparation of cell extract” below. It is preferable not to do this.
  • the target protein can be produced in a batch of 6 ⁇ gZml or more.
  • the expression level of the target protein can be further increased by using a reaction solution in which one to a plurality of component concentrations are optimized among the various additive components described above.
  • a suitable concentration of Mg 2+ is 0.5 to 6 mM, and more preferably 2 to 4 mM.
  • a suitable concentration of K + is 100 to 450 mM, more preferably 170 to 35 OmM.
  • a suitable concentration of NH 4+ is 50 to 120 mM, more preferably 65 to: LOO mM.
  • the preferred concentration of the 20 amino acids is 1-7 mM, more preferably 2-7 mM.
  • the preferred concentration of phosphoenolpyruvate is 2.5-25 mM, more preferably 5-20 mM.
  • the preferred concentration of polyethylene glycol is 0-2.5% (w / v).
  • concentration of each said component is a final density
  • a cell extract derived from the KOD1 strain is prepared, and each of the above components is added to a suitable concentration. If set, the target protein can be produced in 60 ⁇ gZml or more.
  • a reaction solution can be prepared by adding various components as described above in addition to a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium. If the reaction solution contains a cell extract, a plasmid encoding the target protein, RNA polymerase, Mg 2+ and 20 kinds of amino acids among the components, the target protein can be produced. it can. In addition to the above ingredients, NH +, K +, polyethylene group
  • the expression level of the target protein can be increased if at least one of the recall, soot regeneration system and energy source is contained in the reaction solution.
  • concentration of each of the above components can be appropriately set according to the cell extract to be used, reaction temperature, reaction time, reaction scale, and the like.
  • the reaction temperature is considered separately for the transcription reaction and the translation reaction.
  • a temperature suitable for the reaction can be set in the reaction (hereinafter referred to as “first temperature setting standard”).
  • the temperature setting of the transcription reaction can be set according to the optimum temperature of RNA polymerase in the reaction solution.
  • the temperature of the translation reaction is set at the temperature at which the translation reaction proceeds efficiently, that is, when the protein is expressed using the above-described cell-free protein translation system using the mRNA encoding the target protein.
  • Can be set according to the temperature at which can be efficiently expressed hereinafter, the temperature at which it is applied is referred to as the “optimum temperature for translation reaction”.
  • the optimum temperature for each of the transcription reaction and the translation reaction is usually 5 to 15 including the temperature at which the target protein can be expressed most efficiently (hereinafter referred to as “optimum temperature”). It has a temperature range of about ° C. Therefore, when the optimum temperatures for the transcription reaction and the translation reaction partially overlap, the reaction temperature is set to be the same for both the transcription reaction and the translation reaction (that is, the overlap temperature is set to the overlap temperature). ) By expressing the target protein.
  • the target protein can also be expressed by setting the reaction temperature to the same for the transcription reaction and the translation reaction without considering the reaction temperature separately for the transcription reaction and the translation reaction (hereinafter referred to as "the second reaction”). "Temperature setting standard”). In other words, even when there is an optimum temperature suitable for each reaction in each reaction and the optimum temperatures of the respective reactions do not overlap, if the intermediate temperature of the optimum temperature for each reaction is set, the transcription reaction can be performed at that temperature.
  • the target protein Can be expressed.
  • the optimal temperature of the thermostable RNA polymerase available at present is 45-50 ° C, and a cell-free protein translation system using a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium (eg, KOD1 strain)
  • the optimum temperature is 60-70 ° C. Therefore, in order to efficiently promote protein synthesis in the cell-free protein transcription-translation system in the present invention, the transcription temperature is set to 45 to 50 ° C. and translated based on the first temperature setting standard. Set the temperature to 60-70 ° C. Further, based on the second temperature setting standard, both the transfer temperature and the translation temperature may be set to about 50 ° C.
  • Protein synthesis by a cell-free protein synthesis system can be performed using a known batch method in which the above-described reaction solution is mixed in a single container.
  • a known method such as allowing the cell-free protein synthesis system to carry out the reaction by continuously supplying reaction substrates such as amino acids, ATP, and GTP through an ultrafiltration membrane.
  • reaction substrates such as amino acids, ATP, and GTP through an ultrafiltration membrane.
  • a concentrated cell extract can be used.
  • the present invention also includes a kit for producing a target protein by the method of the present invention described above.
  • the kit includes a kit for producing a protein by a cell-free protein translation system and a kit for producing a protein by a cell-free protein transcription / translation system.
  • the former kit contains at least a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, mRNA encoding the target protein, Mg 2+ and an amino acid.
  • the latter kit contains at least a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium, a plasmid encoding a target protein, RNA polymerase, Mg 2+ and amino acids.
  • these reagents may be provided in independent forms, or in a combination of two or more.
  • Purification of the protein produced by the method of the present invention can be performed relatively easily because the amount and type of contaminating substances are much smaller than the separation of viable cell force.
  • the purification method for example, conventionally known methods such as gel filtration, ion exchange chromatography, affinity chromatography, HPLC, and electrophoresis can be used singly or in appropriate combination.
  • thermostable chitinases derived from the KOD1 strain (SEQ ID NO: 1), the 910th Gly was replaced with Met, and this was used as the N-terminus, and downstream of 911-1215
  • the results of studying the method of the present invention using the partially deleted fragment (ChiA ⁇ 4, SEQ ID NO: 2) having the second amino acid residue force as the target protein will be described in detail, but the present invention is not limited to these examples. Is not to be done.
  • a plasmid (RBS) containing a T7 promoter and glutamate dehydrogenase (GDH) ribosome binding sequence (RBS) upstream of the gene encoding ChiA ⁇ 4 (pTRCl) was prepared.
  • the cell-free protein transcription plasmid (pTRCl) obtained above was transcribed to produce a cell-free protein translation mRNA (ChiA A 4 mRNA).
  • the restriction enzyme recognition sequence Xbal present in the plasmid PUC118 was removed. Specifically, PUC118 was first treated with Xbal, and then the Xbal cleavage fragment was blunted using the Blunting High kit (Toyobo Co., Ltd.) according to the instruction manual, and then the blunt ends obtained were bound. .
  • plasmid pET-21a (Novagen) was double-digested with Bglll and EcoRI to cut out a DNA fragment (SEQ ID NO: 3) containing the T7 promoter. Then, the PUC118 from which the Xbal recognition sequence had been removed was double-digested with BamHI and EcoRI and ligated with the DNA fragment containing the T7 promoter.
  • pT the obtained plasmid
  • a D ⁇ fragment containing the ribosome binding sequence (RBS) (SEQ ID NO: 5) of glutamate dehydrogenase (GDH)
  • RBS ribosome binding sequence
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • an oligo DNA (5, -AAAATCTAGACGCAGATTACCGAAATGAGGT-3 ', SEQ ID NO: 6) containing a recognition sequence of Xbal and an oligo DNA (5, -AAAACATATGTACCACCTCATTTC GGTAATCTGCG-3, SEQ ID NO: 7) containing a recognition sequence of Ndel
  • Each oligo DNA was used to prepare a DNA fragment (SEQ ID NO: 8) containing the RBS.
  • a DNA fragment containing ChiA A4 was prepared by amplifying the ChiA A4 gene by PCR using the chromosomal DNA of the KOD1 strain as a saddle and using two kinds of primers described later.
  • the method for preparing chromosomal DNA of KOD1 strain will be described first.
  • the sterilized medium was supplemented with 0.1% sulfur, and 100 ml of this medium was inoculated with KOD 1 strain and cultured. Incubation was performed anaerobically at 85 ° C for approximately 16 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifuging the culture solution at 8, OOOrpm for 10 minutes. After removing the supernatant from the collected cells, the cells were suspended in the artificial seawater and centrifuged at 8, OOOrpm for 10 minutes twice to wash the cells.
  • the mixture was centrifuged at 20,000 Xg for 10 minutes, and the aqueous layer portion was taken out. Then, the addition of PCI, centrifugation, and removal of the aqueous layer were performed again. To the removed aqueous layer (about 400 ⁇ 1), about 3 ml of ethanol and 40 ⁇ 1 of 3% sodium acetate solution were added and allowed to stand at ⁇ 20 ° C. for 30 minutes.
  • the stationary solution was centrifuged at 20,000 X g for 10 minutes to obtain a DNA precipitate.
  • 0.5 ml of 70% ethanol was added, and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. After removing the supernatant, the precipitate was dried, and chromosomal DNA was obtained by adding TE buffer B (10 mM Tris—HCl (pH 8.0), ImM EDTA) at 200 / zl.
  • Primer containing Ndel recognition sequence ChiA- Nd (5, -AAAACATATGCTTCCCGAGC ACTTCTTCGCCC—3, SEQ ID NO: 10) and primer ChiA-Tl (5,-AAAAGAATTCTCCAATTTCATTATGGAC— 3 ′, SEQ ID NO: 11) containing EcoRI recognition sequence
  • PCR was performed using the chromosomal DNA obtained above as a saddle type to amplify the DNA fragment of the ChiA ⁇ 4 gene. PCR was performed at 94 ° C for 180 seconds in a 50 ⁇ l reaction solution containing the chromosomal DNA (400 ng) prepared above, each primer 2 Opmol, and KOD-plus-DNA polymerase (Toyobo).
  • the plasmid pT obtained above was double digested with Xbal and EcoRI. Then, the obtained cleaved fragment, the above-described RBS fragment and ChiA ⁇ 4 fragment were mixed, and the respective DNA fragments were combined to prepare plasmid pTRCl encoding ChiA ⁇ 4.
  • a schematic diagram of the obtained pTRCl is shown in FIG. [0053] 1.5 Preparation of mRNA encoding ChiA ⁇ 4 (ChiA ⁇ 4 mRNA)
  • the cell extract was prepared by culturing the KOD1 strain, collecting and washing the resulting cells, and adding Pre-incubation Mix. Specifically, the medium prepared by adding 0.5% sodium pyruvate to the artificial seawater is placed in a 3 liter culture bottle and sterilized by autoclaving (12 1 ° C, 2atom, 20 minutes). I did it. The sterilized medium was inoculated with KOD1 strain and cultured. Incubation was performed anaerobically at 85 ° C for approximately 16 hours.
  • the cells were collected by centrifuging the obtained culture at 4 ° C, 6,000 X g for 10 minutes. Next, the collected cells were suspended in the artificial seawater described above, and the cells were washed by centrifuging for 5 minutes at 4 ° C. and 600,000 Xg. The washed cells are resuspended in human seawater, transferred to a centrifuge tube that has been weighed in advance, centrifuged at 4 ° C, 6,000 Xg for 10 minutes, and the supernatant is removed. The weight of the cells after the removal was measured (amount of cells 4.78 g). All subsequent operations were performed under RNase-free conditions.
  • the obtained bacterial cells were suspended in 1.27 mlZg artificial seawater and gently mixed with vortex. This suspension was transferred to a French press and pressed under the conditions of 10, OOOp.si, 3 times. Transfer the resulting lysate to a centrifuge tube and add 100 ml of 0.1 M DTT per 10 ml of the lysate 4. C, centrifuged at 30,000 Xg for 30 minutes. The supernatant was collected, and the collected supernatant was centrifuged at 4 ° C. and 30,000 ⁇ g for 30 minutes. Then, 80% of the supernatant was collected, and 0.3 ml of Pre-incubation Mix shown in Table 1 was added per 1 ml of the collected supernatant.
  • the cell-free protein synthesis reaction described below was carried out by mixing the cell extract and various reagents described below on ice to prepare a reaction solution, and maintaining the reaction temperature constant using a PCR device. Then, after a predetermined time had elapsed, the reaction solution was allowed to stand on ice to terminate the synthesis reaction, and the reaction results were analyzed by the Western plot method shown below. First, the solution after completion of the cell-free protein synthesis reaction was diluted 30-fold with milliQ water. The diluted solution was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to a conventional method (acrylamide concentration 12.5%).
  • the sample in the gel was transferred to a PVDF membrane (Hybond-P, Amersham Biosciences) using Holis Blot (Atoichi).
  • an anti-rabbit ChiA A4 antibody was placed on the PVDF membrane as a primary antibody and incubated at room temperature for 1 hour.
  • HRP-rec-ProteinG was prepared as a secondary antibody and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the PVDF membrane incubated with the secondary antibody was subjected to chemiluminescence using the ECL Advance Western Blot Detection Kit (Amersham Biosciences Neeri) according to the reaction conditions described in the instruction manual.
  • the target band was Hyperfilm.
  • the antibody was detected using ECL (Amersham Biosciences)
  • the anti-rabbit ChiA ⁇ 4 antibody was obtained using purified ChiA ⁇ 4 obtained according to the method described in JP-A-11-313688 as an antigen, Is a polyclonal antibody prepared according to a conventional method as an immunized animal.
  • the band of 33.8 kDa indicated by the arrow in Fig. 2 is ChiA ⁇ 4, and the band of ChiA ⁇ 4 was confirmed in all of Lanes 1 to 4.
  • the band of ChiA ⁇ 4 was observed in Lane C I could't. This indicates that ChiA A 4 mRNA is an essential component for synthesizing ChiA ⁇ 4. From the comparison of lanes 2, 3 and 4, the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized can be increased by increasing the concentration of ChiA ⁇ 4 mRNA. Was found to increase.
  • coli is crudely obtained by culturing Escherichia coli having a ChiA ⁇ 4 expression vector by heat treatment “collection * disruption” as described in JP-A-11-313688.
  • the enzyme solution was obtained, and then the crude enzyme solution was applied to an anion exchange column and a gel filtration column and purified until it was observed as a single band by SDS-PAGE.
  • the same ChiA ⁇ 4 from E.col oil was used in subsequent experiments.
  • Fig. 3 a band of ChiA ⁇ 4 is confirmed in all lanes 1, 3, and 4. From the comparison of each lane, the higher the reaction temperature, the more specifically, the higher the reaction temperature at 48 ° C than at 48 ° C. It was found that the amount of ⁇ 4 synthesis increased.
  • lane 9 (NH +: 80 mM) is more C than lane 2 (NH +: OmM).
  • the reaction solution contains pyruvate kinase (PK) derived from Pre-incubation Mix as described above. It is also known that PK exists in the KOD1 strain itself. Considering all these factors, PEP acts as a substrate for the ATP regeneration system, increasing the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized! ] It is necessary ingredient to let you know. In addition, the comparison of lanes 4 to 8 confirms that ATP is regenerated using PEP as the substrate for PK, and the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized tends to decrease if the concentration of ATP is too high. It can be said. The relationship between various energy sources and PEP will be examined again in 4.16 below.
  • PK pyruvate kinase
  • GCU mixture CTP and UTP (hereinafter referred to as “GCU mixture”) in the synthesis reaction of ChiA ⁇ 4 under the optimum temperature conditions. Then, cell-free protein translation reaction was carried out at 60 ° C for 90 minutes with the total volume of the reaction solution as 301. The results are shown in FIG. In FIG. 18, lane 6 and lane 9 correspond to the respective sample numbers in Table 8, and lane C shows E. coli-derived ChiA ⁇ 4 as a molecular weight marker. As shown in Fig. 18, there is no significant difference in the ChiA ⁇ 4 band in Lane 6 (GCU mixture: OmM) and Lane 9 (GCU mixture: 0.85 mM each). It was found that the GCU mixture did not affect the translation reaction.
  • the protein synthesis reaction using pTRCl was performed at 40 ° C. or 60 ° C. for 90 minutes with the total amount of the reaction solution as 30 1 using the reagents, compositions and final concentrations shown in Samples 8 and 9 in Table 10.
  • the reaction solution used in this test was the translation reaction system described above except that pTRC1 was used instead of ChiA A 4 mRNA in the translation reaction system described above and that T7 RNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.) was newly added. This is basically the same as the reaction solution in.
  • the pTRCl used was a fragment that had been treated with EcoRI in advance and cleaved from the EcoRI recognition site downstream of the ChiA ⁇ 4 gene.
  • the T7 RNA polymerase (trade name: Thermo T7 RNA Polymerase) has a maximum activity temperature of 50 ° C and has high thermal stability.
  • the results are shown in FIG.
  • lanes 8 and 9 correspond to the sample numbers in Table 10, and lane C shows E. coli-derived ChiA A 4 as a molecular weight marker.
  • no bands of ChiA A 4 were observed in the lane 8 (reaction temperature: 40 ° C) and lane 9 (reaction temperature: 60 ° C). For this reason, in this experimental system, even if the transcription'translation reaction is performed at the optimal temperature for either the transcription reaction or the translation reaction, the reaction does not proceed efficiently in either the transcription reaction or the translation reaction. The effect is small
  • Fig. 24 shows the results of culturing KOD1 strain among the procedures described in "2. Preparation of cell extract”. This is a protocol summarizing each subsequent procedure by numbering.
  • Step 9 of Figure 24 the force required to set the number of French presses to three is considered to increase the number of French presses, which may destroy the elements necessary for protein transcription (eg, RNA polymerase). It is done. Therefore, the effect of reducing the number of French presses on the amount of chiA A 4 synthesized was investigated. Specifically, out of each procedure in Fig. 24, a cell extract was prepared in the same procedure except that the number of French presses in step 9 was set to 1, 2 or 3 times, and samples 1 to 5 in Table 14 were prepared.
  • the cell-free protein translation reaction was carried out at 60 ° C for 90 minutes with the reagents, composition and final concentration shown in the above, with the total volume of the reaction solution being 301.
  • the S30 fraction indicates the cell extract used in the above “4. Cell-free protein translation system” and “5. Cell-free protein transcription / translation system”.
  • S30-FP1, S30-FP2 and S30-FP3 is a cell extract obtained by performing French press once, twice and three times, respectively.
  • the protein concentration of the cell extract is shown in a cross-cut.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 14, lane C shows ChiA A 4 derived from E.
  • Table 15 shows the chemiluminescence detector (Lumi Vision PRO 400EX, Aisin Precision) for the samples corresponding to each lane in FIG.
  • the amount of ChiA A 4 synthesized determined using the ChiA A for sample 3 (pressure: 8,400 psi) and sample 1 (pressure: 10,000 psi) (or sample 4 (pressure: 8,400 psi) and sample 2 (pressure: 10,000 psi)) Comparing the amount of synthesis of 4, sample 3 (or sample 4) was about 5 times higher. For this reason, it was found that setting the pressure of the French press as low as 10,000 ps is effective for increasing the amount of ChiA ⁇ 4 synthesized.
  • the S30 buffer is clearly lower. Therefore, we decided to investigate how the S30 buffer was used as a dispersion medium instead of artificial seawater during cell disruption to influence the amount of target protein synthesized. Specifically, among the procedures in Fig. 24, the artificial seawater in step 7 is replaced with the S30 buffer, and step 9 is followed. In other words, set the pressure to 1,500 psi, 5,000 psi, or 7,500 psi, and perform the incubation in step 16 at 60 ° C for 40 minutes. Thus, a cell extract was prepared. Then, by comparing the protein concentrations of the obtained cell extracts, the effect of using a hypotonic solution during cell disruption was evaluated.
  • S30FP-1A is the cell extract prepared in “6.2 Effect of French Press Pressure”. From the protein concentration of each cell extract shown in Table 16, the amount of protein obtained was sufficient even when the pressure of the French press was low by allowing the cells to permeate the hypotonic solution for a sufficient period of time.
  • Sample 1 is a reference sample using S30FP-1A prepared in “6.2 Effect of French Press Pressure” as a cell extract.
  • the protein concentration of the cell extract is shown in a cross-cut.
  • Figure 27 shows the results of analysis by the Western plot method.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 18.
  • lane 4 showed a larger band than lanes 2 and 3. For this reason, to increase the amount of ChiA A 4 synthesized, it is better to add pre-incubation and do not preincubate!
  • the ChiA ⁇ 4 band tended to increase from Lane 2 (ChiA A 4 mRNA: 0.33 mg / ml) to Lane 5 (ChiA A 4 mRNA: 0.58 mg / ml). From the above results, the preferred concentration of Ch iA A 4 mRNA is 0.40 to 0.60 mg Zml, and the vicinity of 0.50 mg Zml is most preferable.
  • Fig. 31 shows the results of Western blot analysis.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 22, and lane C shows E. coli-derived ChiA ⁇ 4 as a molecular weight marker. From FIG. 31, it was found that the preferred concentration of S30F P-1G was 12. 0-16. OmgZml.
  • the cell-free protein was set by setting ChiA A 4 mRNA to 0.48 mgZml and S30FP-1G to 13. Omg / ml.
  • a quality translation reaction was performed.
  • the amount of ChiA A 4 synthesized was quantified by activity measurement in the same manner as described in “4.7 Examination of Optimization of Reaction Temperature”. As a result, it was confirmed that the synthetic amount of ChiA ⁇ 4 was 6.2 g / ml, which is more than 6 times the maximum synthetic amount quantified by the above method 1.0 ⁇ gZml (see Fig. 9). The amount of synthesis was obtained.
  • the total amount of the reaction solution was 30 1, with the reagents, composition and final concentration shown in Table 27.
  • Cell-free protein at 65 ° C for 90 minutes A translation reaction was performed.
  • the PEP concentrations in each sample in Table 27 are OmM (sample 1), 10 mM (sample 2), 20 mM (sample 3), and 30 mM (sample 4).
  • Figure 35 shows the results of Western blot analysis. In Fig. 35, each lane corresponds to each sample number in Table 27.
  • FIG. 36 shows the relationship between the PEP concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA ⁇ 4 concentration. From FIG. 36, it was found that the preferred concentration of PEP is 2.5 to 25 mM, more preferably 5 to 20 mM, and the optimum is around 10 mM.
  • FIG. 38 is a graph showing the relationship between the Mg 2+ concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA ⁇ 4 concentration. From FIG. 38, it was found that the preferred concentration of Mg 2+ is 0.5 to 6 mM, more preferably 2 to 4 mM, and the optimum is around 3 mM.
  • Fig. 39 shows the results of Western blot analysis.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 29.
  • FIG. 40 is a diagram showing the relationship between the NH + concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA ⁇ 4 concentration. From Fig. 40, N
  • the preferred concentration of H + is 50-120 mM, more preferably 65-: LOOmM, 75 m
  • FIG. 42 is a graph showing the relationship between the amino acid concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA ⁇ 4 concentration. From FIG. 42, it was found that the preferred concentration of amino acid is 1 to 7 mM, more preferably 2 to 7 mM.
  • the cell-free protein translation reaction was carried out at 65 ° C for 90 minutes with the total amount of the reaction solution as 30 1 using the reagents, composition and final concentration shown in Table 31. I did it.
  • the polyethylene glycol concentration in each sample in Table 31 is 0% (w / v) (Sample 1), 1.0% (w / v) (Sample 2), 2.0% (w / v) ( Sample 3), 3.0% (w / v) (Sample 4), 4.0% (w / v) (Sample 5), 5.0% (w / v) (Sample 6), 6.0% (w IN) (Sample 7).
  • FIG. 43 shows the results of Western blot analysis.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 31.
  • FIG. 44 is a graph showing the relationship between the polyethylene glycol concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA A 4 concentration. From FIG. 44, it was found that the preferred concentration of polyethylene glycol is 0 to 2.5% (w / v), and the optimum concentration is around 2% (w / v).
  • the total volume of the reaction solution is 30 1, and cell-free protein translation reaction at 65 ° C for 90 minutes was done.
  • the K + concentrations in Table 32 are OmM (Sample 1), 50 mM (Sample 2), lOOmM (Sample 3), 150 mM (Sample 4), 200 mM (Sample 5), 250 mM (Sample 6), 300 mM (Sample 7). 350 mM (sample 8), 400 mM (sample 9), 450 mM (sample 10), and 5 OOmM (sample 11).
  • FIG. 45 shows the results of Western blot analysis.
  • each lane corresponds to each sample number in Table 32.
  • FIG. 46 shows the relationship between the K + concentration in the reaction solution and the synthesized ChiA ⁇ 4 concentration. From FIG. 46, it was found that the preferred concentration of K + is 100 to 450 mM, more preferably 170 to 350 mM, particularly preferably 210 to 320 mM, and the optimum is around 250 mM.
  • Table 33 summarizes the optimum concentration of each component obtained in “9.1 About Phosphoenolpyruvate” to “9.6 About Potassium Ion”. Therefore, cell-free protein translation reaction was carried out at 65 ° C for 90 minutes with the total amount of the reaction solution as 30 1 at the reagent, composition and final concentration shown in Table 33. What is the maximum amount of ChiA A 4 synthesized? We examined whether it becomes. As a result, the amount of ChiA A 4 synthesized was 65.5 gZml.
  • RNase inhibitor Cell-free protein translation system using cell extracts derived from A.pernix
  • the present invention can be widely used as a method for producing a protein under a high temperature condition in a cell-free protein synthesis system containing a cell extract derived from a hyperthermophilic bacterium.

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Abstract

【課題】　超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中または無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、高温条件下でタンパク質を製造する方法を提供すること。 【解決手段】　超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードするmRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する。超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写・翻訳系中で、目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する。

Description

明 細 書
無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、高温条件下で、無細胞タンパク質翻訳系または無細胞タンパク質転写- 翻訳系によりタンパク質を製造する方法に関する。
背景技術
[0002] 無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いてタンパク質を合成する系であり、 大腸菌などの生細胞を用いる系に比べ、タンパク質の合成および精製の操作が非常 に簡便であることから、近年その需要が高まっている。この系を用いれば、系を容易 に改変することができるので、産業上有用な細胞由来のタンパク質が得られるだけで なぐ例えば、細胞にとって毒性の高いタンパク質、 目的の変異を導入したタンパク 質、非天然アミノ酸を導入したタンパク質なども得られる利点がある。
[0003] 細胞抽出液としては、主として大腸菌、小麦胚およびゥサギ網赤血球由来のものが 使用されている。従来から、これらの細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質合成系は 、タンパク質の合成量が少ないという問題点が指摘されており、かかる問題点を解消 するため、例えば、濃縮した細胞抽出液を使用する（特許文献 1)、合成反応液中に タンパク質合成の铸型にならな!/ヽ直鎖状核酸を特定の濃度で添加する (特許文献 2) 、などの技術が開示されている。
[0004] また、上述した無細胞タンパク質合成系は常温でタンパク質の合成を行なうもので あるが、例えば、铸型 DNAを分解するヌクレアーゼなど常温で合成困難なタンパク質 を合成するため、低温で増殖可能なシユードモナス属微生物抽出液またはロドコッカ ス属微生物抽出液を用いて、低温条件下においてタンパク質を合成する無細胞タン パク質合成系が開示されて ヽる (特許文献 3)。
[0005] 特許文献 1 :特開 2000— 175695号公報
特許文献 2：特開 2001— 136971号公報
特許文献 3：特開 2004 - 290181号公報
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0006] 上述のように、大腸菌、小麦胚およびゥサギ網赤血球由来の細胞抽出液を用いる 常温での無細胞タンパク質合成系、前記大腸菌の近縁種由来の細胞抽出液を用 V、 る低温での無細胞タンパク質合成系が開発されている。し力しながら、これまでに高 温条件での無細胞タンパク質合成系は開示されて ヽな ヽ。
[0007] 仮に高温条件での無細胞タンパク質合成系が確立できれば、従来の無細胞タンパ ク質合成系に比べてタンパク質の生成速度が向上する、常温で反応が起こりにくい ため操作性が向上する、反応中に微生物が混入してもその影響が小さい、高温耐性 のあるタンパク質の合成が可能となる、変異 DNAライブラリーを導入することで高温耐 性のあるタンパク質のスクリーニングが可能となる、などの効果が期待できる。
課題を解決するための手段
[0008] そこで、本発明者らは、高温条件での無細胞タンパク質合成系を確立するために、 超好熱菌の一種である Thermococcus kodakaraensis KODl株に着目し、該菌株由来 の細胞抽出液を含む反応液を用いて、タンパク質合成に適した反応条件を鋭意検 討した結果、本発明を完成させるに至った。
[0009] すなわち、本発明の要旨は以下のとおりである。
〔1〕 無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌 由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、 目的タンパク質をコードす る mRNAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法、
〔2〕 無細胞タンパク質翻訳系中に、 目的タンパク質をコードする mRNA、Mg2+およ びアミノ酸が含有されている、〔1〕に記載の方法、
〔3〕 さらに NH +、 K+、ポリエチレングリコール、 ΑΤΡ再生系およびエネルギー源の
4
うち、少なくとも 1種以上の成分が含有されている、〔2〕に記載の方法、
〔4〕 細胞抽出液力 thermococcus kodakaraensis KODl株または該 KODl株より派生 する株由来のものである、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕 目的タンパク質をコードする mRNAが、 目的タンパク質をコードする塩基配列の 上流に配列番号 4に示すリボソーム結合配列を有する、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記 載の方法、 〔6〕 無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無 細胞タンパク質翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパク質をコード する mRNA、 Mg2+およびアミノ酸が含有されている、前記 mRNAの翻訳を高温条件 下で行なわせてタンパク質を製造するためのキット、
〔7〕 無細胞タンパク質翻訳系中に、さらに NH +、 K+、ポリエチレングリコール、 AT
4
P再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも 1種以上の成分が含有されている、〔6 〕に記載のキット、
〔8〕 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派生 する株由来のものである、〔6〕または〔7〕に記載のキット、
〔9〕 目的タンパク質をコードする mRNAが、 目的タンパク質をコードする塩基配列の 上流に配列番号 4に示すリボソーム結合配列を有する、〔6〕〜〔8〕のいずれかに記 載のキット、
〔10〕 無細胞タンパク質転写，翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超 好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写，翻訳系中で、 目的タンパク 質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を 製造する方法、
〔11〕 無細胞タンパク質転写，翻訳系中に、 目的タンパク質をコードするプラスミド、 RNAポリメラーゼ、 Mg2+およびアミノ酸が含有されている、〔10〕に記載の方法、 〔12〕 RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、〔11〕に記載 の方法、
〔13〕 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派 生する株由来のものである、〔10〕〜〔12〕のいずれかに記載の方法、
〔14〕 目的タンパク質をコードするプラスミド力 上流から順にプロモーター、配列番 号 4に示すリボソーム結合配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、 〔10〕〜〔13〕のいずれかに記載の方法、
〔15〕 目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行な わせるにあたり、転写温度を前記 RNAポリメラーゼの至適温度に設定するとともに、翻 訳温度を〔1〕〜〔9〕の 、ずれかに記載の無細胞タンパク質翻訳系の至適温度に設 定することを特徴とする、〔11〕〜〔14〕の 、ずれかに記載の方法、
〔16〕 無細胞タンパク質転写 ·翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであつ て、無細胞タンパク質転写，翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパ ク質をコードするプラスミド、 RNAポリメラーゼ、 Mg2+およびアミノ酸を含有する、前記 プラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するための やット、
〔17〕 RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、〔16〕に記載 のキット、
〔18〕 細胞抽出液力 SThermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派 生する株由来のものである、〔16〕または〔17〕に記載のキット、
〔19〕 目的タンパク質をコードするプラスミド力 上流から順にプロモーター、配列番 号 4に示すリボソーム結合配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、〔1 6〕〜〔18〕のいずれかに記載のキット。
発明の効果
[0010] 本発明によれば、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中 で、高温条件下でタンパク質を製造することができる。また、本発明によれば、超好熱 菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写，翻訳系中で、高温条件下でタン ノ ク質を製造することができる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 l]pTRClの概略図および ChiA A 4mRNAの調製方法の概要を示す図である。
[図 2]表 2に示す試料を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な ヽ、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 3]表 3の試料 1, 3, 4および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリル アミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 4]表 3の試料 1および 5〜9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 5]表 4の試料 1と 2を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。 [図 6]表 4の試料 1および 3〜5を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 7]表 4の試料 2および 6〜8を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 8]表 5の試料 1〜9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 9]表 5の試料 2〜9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、合成反応終了後にお ける ChiA Δ 4の合成量を示す図である。
[図 10]表 5の試料 5, 7および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、該 ChiA Δ 4の 合成量の時間変化を示す図である。
[図 11]表 6の試料 1〜3を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 12]表 6の試料 4〜6を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 13]表 7の試料 1〜3および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリル アミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 14]表 7の試料 4〜9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 15]表 8の試料 1と 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 16]表 8の試料 2, 3および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 17]表 8の試料 4, 5および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリルァ ミドゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 18]表 8の試料 6および 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な ヽ、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 19]表 9の試料 1〜7を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。 [図 20]表 10の試料 8と 9を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 21]表 11の試料 8を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 22]表 12の試料 8を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲル 電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 23]表 13の試料 1〜4を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 24]「2.細胞抽出液の調製」に記載した各手順のうち、 KOD1株の培養以後の各 手順を番号付けしてまとめたプロトコールである。
[図 25]表 14の試料 1〜5を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 26]表 15の試料 1〜4を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 27]表 18の試料 1〜4を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 28]表 20の試料 1, 2を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 29]S30FP- 1Gの調製用プロトコールである。
[図 30]表 21の試料 1〜5を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行ない、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 31]表 22の試料 6〜 10を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 32]表 23の試料 1〜5を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 33]表 24の試料 1〜4を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 34]表 25の試料 1〜6を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 35]表 27の試料 1〜4を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 36]反応液中の PEP濃度と合成された CWA Δ 4濃度との関係を示した図である。
[図 37]表 28の試料 1〜： L 1を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 38]反応液中の Mg2+濃度と合成された ChiA A 4濃度との関係を示した図である。
[図 39]表 29の試料 1〜6を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 40]反応液中の NH +濃度と合成された ChiA A 4濃度との関係を示した図である
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[図 41]表 30の試料 1〜8を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 42]反応液中のアミノ酸濃度と合成された ChiA A 4濃度との関係を示した図である
[図 43]表 31の試料 1〜7を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な 、、ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 44]反応液中のポリエチレングリコール濃度と合成された CWA Δ 4濃度との関係を 示した図である。
[図 45]表 32の試料 1〜： L 1を用いて CWA Δ 4の合成反応を行な!/、、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動し、ウェスタンプロット法により分析した結果である。
[図 46]反応液中の K+濃度と合成された CWA Δ 4濃度との関係を示した図である。
[図 47]表 34の試料 1〜5を用いて ChiA Δ 4の合成反応を行な 、、合成反応終了後に おける CWA Δ 4の合成量を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明について詳細に説明する。本発明は、無細胞タンパク質翻訳系により タンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タン パク質翻訳系中で、目的タンパク質をコードする mRNAの翻訳を高温条件下で行な わせてタンパク質を製造する方法である。また、本発明は、無細胞タンパク質転写- 翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来の細胞抽出液を含 む無細胞タンパク質転写'翻訳系中で、 目的タンパク質をコードする DNA (プラスミド） の転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法である。
[0013] 本発明にお 、て「高温条件」とは、通常の微生物の至適増殖温度よりも高 、温度を いい、無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する場合には、 40〜85°C、 好ましくは 55〜80°C、より好ましくは 57〜78°Cの温度範囲をいい、無細胞タンパク 質転写'翻訳系によりタンパク質を製造する場合には、 40〜85°C、好ましくは 40〜8 0°C、より好ましくは 40〜75°Cの温度範囲をいう。
[0014] 「無細胞タンパク質翻訳系」とは、生細胞由来の細胞抽出液と、 目的タンパク質をコ ードする mRNA (該 mRNAは前記細胞抽出液由来のものではなぐ別途作製したもの） との共存下で、該 mRNAの翻訳を介して該タンパク質を合成する系をいう。「無細胞タ ンパク質転写，翻訳系」とは、生細胞由来の細胞抽出液と、 目的タンパク質をコードす る DNA (該 DNAは前記細胞抽出液由来のものではなぐ別途作製したもの）との共存 下で、該 DNAを铸型として転写および翻訳を介して、該タンパク質を合成する系をい う。以下の説明では、無細胞タンパク質翻訳系と無細胞タンパク質転写，翻訳系を特 に区別しな!、場合、まとめて「無細胞タンパク質合成系」 t ヽぅ。
[0015] 本発明において使用される「超好熱菌」とは、 60°C以上、好ましくは 90°C以上で生 育する好熱細菌または好熱始原菌をいう。本発明に適用可能な超好熱菌は前記定 義に該当する限り特に限定されない。現在 100種類以上の超好熱菌が分離 ·同定さ れており、これらはいずれも本発明に適用することができる。かかる超好熱菌としては
、 ί列 XJ¾、 Aquifex pyrophilus, geothermobacterium ferrireducens, Thermotoga marit ima, Thermotoga neopolitana, Thermotoga petrophila, Thermotoga naphtophila, Aci dianus infernus, Aeropyrum pernix, Archaeoglobus fulgidus, Archaeoglobus prolund us, Caldivirga maquilingensis, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobili s, Desulfurococcus mucosus, Ferroglobus placidus, Geoglobus ahangari, Hyperther mus butylicus, Ignicoccus islandicus, Ignicoccus pacificus, Methanococcus jannaschi l, ethanococcus fervens, Methanococcus igneus, Methanococcus infernus, Methan ygy,,, us ndroenoformans Clostridium acetobutlicum Clostridium cammitliermale lo
Figure imgf000010_0001
y,,, um occultum Prolobus fUmani marmus
yy,,, s !lorlkosllll woesei Proaictium Prodictium 13rock.ll
yg,,, dicumrobaculum oumense funosus〇〇〇〇u
s islan ,,, K-andlerl Methanotliermus fendus Met!lanotllermus sociabilis Paiaeococcu stridium cellulose, Clostridium isatidis, Clostridium stercorarium, Clostridium strami nisolvens, Clostridium thermoalcaliphilum, Clostridium thermobutyricum, Clostridiu m thermocellum, Clostridium thermopalmarium, Clostridium thermosuccinogenes, C oprothermobacter proteolyticus, Geobacillus kaustophilus, Geobacillus thermocaten ulatus, Geobacillus thermodenitrificans , Geobacillus thermoglucosidasius , Geobacill us stearothermophilus , Geobacillus thermoleovorans, Heliobacterium modesticaldum ， Moorella thermoacetica, Thermoanaerobacter acetoethylicus, Thermoanaerobacter brockii, Thermoanaerobacter ethanolicus, Thermoanaerobacter italicus, Thermoana erobacter keratinophilus, Thermoanaerobacter kivui, Thermoanaerobacter mathranii ， Thermoanaerobacter siderophilus, Thermoanaerobacter subterraneus, Thermoanae robacter sulfurigignens, Thermoanaerobacter sulfur ophilus, Thermoanaerobacter ten gcongensis, Thermoanaerobacter thermocopriae, Thermoanaerobacter thermohydro sulfuricus, Thermoanaerobacter wiegelii, Thermoanaerobacter yonseiensis, Thermoa naerobacterium aotearoense, Thermoanaerobacterium bryantii, Thermoanaerobacter ium polysaccharolyticum, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Thermoanaerob acterium thermosaccharolyticum, Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes , Ther moanaerobacterium xylanolyticum, Thermoanaerobacterium zeae, Thermovenabulum ferriorganovorum, Methylococcus capsulatus, Symbiobacterium thermophilum, Acid othermus cellulolyticus, Rubrobacter xylanophilus, Rubrobacter radiotolerans, Ther mobifida fusca, Thermosynechococcus elongatus, Thermus antranikianii, Thermus a quaticus, Thermus brockianus, Thermus caldophilus, Thermus filiformis, Thermus ig niterrae, Thermus kawarayensis, Thermus nonproteolyticus , Thermus oshimai, Ther mus rehai, Thermus scotoductus, Thermus thermophilus, Deinococcus geothermalis ， Persephonella marina, Sulfurihydrogenibium azorense, Dictyoglomus thermophilum ， Thermodesulfobacterium commune, Thermodesulfovibrio yellowstoniiなど; ^挙げら れる（例えば、跡見晴幸ら，生化学，第 75巻，第 7号， pp.561-575, 2003を参照)。 本発明では、上記の超好熱菌のうち、実施例において Thermococcus kodakaraensi s KODl株（以下、必要に応じて「KODl株」という）と Aeropyrum pernix Kl株が使用 されている。 KOD1株は、独立行政法人理ィ匕学研究所バイオリソースセンターに寄託 されており、その受託番号は、 JCM 12380である。また、 Aeropyrum pernix K1株も独 立行政法人理ィ匕学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号 は、 JCM 9820である。
[0017] 本発明において製造し得るタンパク質は、超好熱菌に由来するタンパク質の他、非 天然アミノ酸を導入したタンパク質、 目的の変異を導入したタンパク質、複数のァミノ 酸残基カゝら構成される任意の分子量のペプチドも含む。超好熱菌由来のタンパク質 は一般に耐熱性が高ぐ例えば、工業上の利用の点から、超好熱菌由来の耐熱性酵 素などは本発明の目的に適したものといえる。
[0018] 細胞抽出液とは、リボソーム、 tRNAなどのタンパク質合成に必要な成分を含む超好 熱菌の抽出液をいう。この細胞抽出液は、 Prattらの方法により調製することができる（ Pratt, Transcription and ranslation— a practical approach, Henes, B. D. and Hig gins'S. J. ed. , pp.179- 209, IRL Press, Oxford. , pp.179- 209 (1984) )。具体的には 、フレンチプレスによる破砕またはグラスビーズを用いた破砕などによって調製するこ とがでさる。
[0019] 無細胞タンパク質翻訳系には、上述した細胞抽出液の他に、 目的タンパク質をコー ドする mRNA、 ATP再生系、 ATP, GTP, CTP, UTPなどのエネルギー源、緩衝液、塩 類、アミノ酸、 RNァーゼ阻害剤、 tRNA、ジチオスレィトール（DTT) ,スペルミン，スぺ ルミジン，ポリエチレングリコール (例えば、 PEG8000など）などの安定剤、抗菌剤など を含むことができる。無細胞タンパク質転写 ·翻訳系には、上述した成分をベースとし て、 目的タンパク質をコードする mRNAに代えて目的タンパク質をコードするプラスミド を含み、さらに RNAポリメラーゼを含むことができる。ここで、本発明において目的タン ノ ク質をコードする mRNAおよび目的タンパク質をコードするプラスミドは、前記細胞 抽出液由来のものではなぐ別途作製したものをいう。
[0020] ATP再生系は特に限定されず、公知のリン酸ドナーおよびキナーゼの組合わせを 用いることができる。この組合わせとしては、例えば、ホスホェノールピルビン酸（PEP )とピルビン酸キナーゼ（PK)の組合わせ、クレアチンリン酸 (CP)とクレアチンキナー ゼ（CK)の組合わせ、ァセチルリン酸 (AP)とアセテートキナーゼ (AK)の組合わせな どが挙げられる。これらの組合わせカゝらなる ATP再生系を無細胞タンパク質合成系に 添加すればよい。また、上記のキナーゼが細胞抽出液に内在する場合、上記のリン 酸ドナーだけを無細胞タンパク質合成系に添加することもできる。
[0021] 緩衝液としては、当該技術分野で公知の緩衝液を用いればよぐ例えば、 Tris—酢 酸緩衝液、 Tris—塩酸緩衝液、 Hepes—KOHなどが挙げられる。塩類としては、当 該技術分野で公知の塩類を用いればよぐ例えば、酢酸塩 (酢酸マグネシウム、酢酸 アンモ-ゥム、酢酸カリウムなど）、グルタミン酸塩などが挙げられる。抗菌剤としては 、例えば、アジィ匕ナトリウム、アンピシリンなどが挙げられる。
[0022] 目的タンパク質をコードするプラスミドとしては、上流から順に、プロモーター、リボソ ーム結合配列（RBS)および目的タンパク質をコードする塩基配列を含むプラスミドが 好適である。また、 目的タンパク質をコードする塩基配列の下流には、転写反応を終 結させるため、適当なターミネータ一を導入してもよい。また、ターミネータ一を導入し ない場合は、あら力じめ適当な制限酵素で処理して切断断片としたものを用いてもよ い (run off?去)。本発明において使用し得るプラスミドは特に限定されず、公知のもの が用いられ、公知の遺伝子工学的手法により、適当なプロモーターや RBS、その他必 要に応じてターミネータ一などを適宜導入して用いることができる。
[0023] プロモーターとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有す る内在性のプロモーターを用いてもょ 、し、外来性のプロモーターを用いてもよ！、。 内在性のプロモーターとしては、用いる超好熱菌の染色体 DNAにコードされる遺伝 子産物が大量生産され得る強力なプロモーターを適宜選択すればよく特に限定され ない。超好熱菌として KOD1株を用いる場合は、例えば、耐熱性グルタミン酸デヒドロ ゲナーゼ (GDH)遺伝子の転写を制御する GDHプロモーターを用いることができる（R .N.Z.A.Rahman et al.,Mol Gen Genet. 257. pp.338- 449, (1998) ,特開 2000- 41680) 。また、外来性のプロモーターを用いる場合は、上述した高温条件下で作用し得るこ とが必要とされる力 かかる条件を満たすプロモーターとしては、例えば、 T7プロモー ターが挙げられる。
[0024] RBSとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有する内在性 の RBSを適宜選択して用いることができる。本発明者らは、従来から、 KOD1株に由来 する数多くの遺伝子の単離および機能解析を行なっており、該遺伝子の開始コドン の上流配列を数多く比較した結果、 KOD1株の RBSのコンセンサス配列は、 5' -GG( T/A)G(A/G)(T/G)-3' (配列番号 4)であると推定している。したがって、超好熱菌と して KOD1株を用いる場合は、配列番号 4の塩基配列に基づ ヽて RBSを適宜選択す ることがでさる。
後述する実施例では、上述した耐熱性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ (GDH)遺伝子 の RBS (5'— GGTGGT— 3' ,配列番号 5)を使用している。
[0025] 目的タンパク質は、上述したように特に限定されな!、が、本発明における無細胞タ ンパク質合成系の挙動を知るためには、その特性が理解されて ヽるタンパク質をコー ドするレポーター遺伝子を標的遺伝子として発現させて、当該系の効率などを評価 する必要がある。そこで、本発明者らは、後述する実施例において説明するように、 K OD1株由来のキチナーゼ (配列番号 1)に着目し、その部分欠失断片 (ChiA A 4,配 列番号 2)をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いることにした。本発明者 らは、従来から、 KOD1株由来の数多くのタンパク質を単離してその機能解析を行な つており、そのうちキチナーゼについても単離および機能解析を行なっている（特開 平 11 313688号)。そして、本発明者らの検討によれば、配列番号 1の 910番目の Glyを Metに置換し、これを N末端として、その下流の 911〜1215番目のアミノ酸残 基力 なる部分欠失断片（ChiA A 4,配列番号 2)は、 100°Cで 3時間の熱処理後に おいても 70%以上の残存活性を示すなど極めて高い熱安定性を有する。そこで、本 発明では、上述した高温条件下でタンパク質の合成を行なうことを考慮して、レポ一 ター遺伝子として ChiA Δ 4をコードする遺伝子を選択して、合成された ChiA Δ 4の分 析を通じて無細胞タンパク質合成系の効率を検討することにした。
[0026] ターミネータ一としては、上述した細胞抽出液の調製の際に用いる超好熱菌が有 する内在性のターミネータ一を用いてもよいし、外来性の公知のターミネータ一を用 いてもよい。外来性のターミネータ一を用いる場合は、使用するプロモーターとの組 合わせを考慮して適宜選択することができる。例えば、外来性のプロモーターとして T 7プロモーターを用いる場合、外来性のターミネータ一として T7ターミネータ一を選択 することができる。 [0027] 目的タンパク質をコードする mRNAとしては、 目的タンパク質をコードする塩基配列 の上流にリボソーム結合配列（RBS)を有する mRNAが好適である。ここで、 目的タン ノ ク質をコードする塩基配列およびリボソーム結合配列については、上述した目的タ ンパク質をコードするプラスミドと同様の基準で適宜選択することができる。本発明で 用いる mRNAは、例えば、まず、上述したプラスミドを作製し、その後該プラスミドを転 写させること〖こより容易〖こ作製することができる。
[0028] RNAポリメラーゼとしては、高温条件下で至適温度を有するものが好適である。ここ で、「高温条件」とは、 40°C以上、好ましくは 50°C以上、更に好ましくは 60°C以上を いう。上記特性を示す RNAポリメラーゼとしては、上述した細胞抽出液の調製の際に 用いる超好熱菌由来の RNAポリメラーゼを用いてもょ 、し、外来性の RNAポリメラー ゼを用いてもよい。 RNAポリメラーゼは、上述したプロモーターとの組合わせを考慮し て適宜選択すればよぐ例えば、プロモーターとして T7プロモーターを用いる場合は 、 RNAポリメラーゼとして T7RNAポリメラーゼ（例えば、 Thermo T7 RNA Polymerase, 東洋紛績社)を選択することができる。
[0029] 無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する場合、超好熱菌由来の細胞 抽出液の他に上述したように種々の成分を添加して反応液を調製することができる。 そして、該成分のうち、細胞抽出液、 目的タンパク質をコードする mRNA、 Mg2+およ び 20種のアミノ酸が反応液中に含まれて 、れば目的タンパク質を製造することがで きる。また、上記成分に加えて NH +、 K+、ポリエチレングリコール、 ΑΤΡ再生系およ
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びエネルギー源のうち、少なくとも 1種以上の成分が反応液中に含まれていれば、 目 的タンパク質の発現量を増加させることができる。上記各成分の濃度は、用いる細胞 抽出液、反応温度、反応時間、反応スケールなどに応じて適宜設定することができる
[0030] また、無細胞タンパク質翻訳系を用いて目的タンパク質の発現量を増加させるには 、それに適した細胞抽出液を調製することが好ましい。ここで、超好熱菌由来の細胞 抽出液は、菌体を培養する工程、培養した菌体を人工海水に懸濁する工程、該菌体 懸濁液の破砕工程、破砕後のライセートに表 1に記載の Pre-incubation mixを添カロし てインキュベーションを行なう工程（以下、該工程を「プレインキュベーション」という場 合がある)及びその後の透析工程等を含み、大腸菌由来の細胞抽出液と概ね同様 の方法で調製することができる。本発明では、上記の工程のうち、菌体の破砕手段と してフレンチプレスを用いる場合、菌体の破砕が効率よく行なわれる限りにお 、ては 、プレス時の圧力をできるだけ小さくすること、プレス回数をできるだけ少なくすること
、または菌体の懸濁液としてできるだけ浸透圧の低 、低張液を用いることが好ま ヽ
。また、破砕後のライセートにはプレインキュベーションおよび透析をしない方が好ま しい。本発明では、上記好ましいとされる工程のうち、 1ないし複数の工程を採用する ことにより、 目的タンパク質の発現量を増加させるのに適した細胞抽出液を調製する ことができる。
[0031] 具体的には、例えば、 KOD1株由来の細胞抽出液を調製するにあたり培養後の菌 体の破砕手段としてフレンチプレスを用いる場合、プレス時の圧力は 7, 000〜8, 00 Op.s.iが好ましぐプレス回数は 1回が好ましぐ菌体の懸濁液は後記「2.細胞抽出 液の調製」に記載の S30バッファーが好ましぐ破砕後のライセートにはプレインキュ ベーシヨンおよび透析をしない方が好ましい。そして、上記好ましい実施態様で KOD 1株由来の細胞抽出液を調製した場合、 目的タンパク質をバッチ式で 6 μ gZml以上 製造することができる。
[0032] さらに、本発明では上述した各種の添加成分のうち、 1ないし複数の成分濃度を好 適化した反応液を用いることにより、 目的タンパク質の発現量をさらに増カロさせること ができる。具体的には、 Mg2+の好適濃度は 0. 5〜6mMであり、さらに好ましくは 2 〜4mMである。 K+の好適濃度は 100〜450mMであり、さらに好ましくは 170〜35 OmMである。 NH4+の好適濃度は 50〜120mMであり、さらに好ましくは 65〜： LOO mMである。 20種のアミノ酸の好適濃度は l〜7mMであり、さらに好ましくは 2〜7m Mである。ホスホェノールピルビン酸の好適濃度は 2. 5〜25mMであり、さらに好ま しくは 5〜20mMである。ポリエチレングリコールの好適濃度は 0〜2. 5%(w/v)であ る。なお、上記各成分の濃度は反応液中の最終濃度である。
[0033] そして、本発明では、上述したように、 目的タンパク質の発現量を増加させるのに好 ま 、実施態様で KOD1株由来の細胞抽出液を調製し、かつ上記各成分を好適濃 度に設定した場合、 目的タンパク質を 60 μ gZml以上製造することができる。 [0034] 無細胞タンパク質転写 ·翻訳系によりタンパク質を製造する場合、超好熱菌由来の 細胞抽出液の他に上述したように種々の成分を添加して反応液を調製することがで きる。そして、該成分のうち、細胞抽出液、目的タンパク質をコードするプラスミド、 RN Aポリメラーゼ、 Mg2+および 20種のアミノ酸が反応液中に含まれていれば目的タン ノ ク質を製造することができる。また、上記成分に加えて NH +、 K+、ポリエチレング
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リコール、 ΑΤΡ再生系およびエネルギー源のうち、少なくとも 1種以上の成分が反応 液中に含まれていれば、目的タンパク質の発現量を増加させることができる。上記各 成分の濃度は、用いる細胞抽出液、反応温度、反応時間、反応スケールなどに応じ て適宜設定することができる。
[0035] 無細胞タンパク質転写 ·翻訳系は、転写と翻訳を組合わせた反応であるので、目的 タンパク質を効率的に発現させるには、転写反応と翻訳反応とで反応温度を分けて 考え、各反応において当該反応に適した温度を設定することができる（以下、「第 1の 温度設定基準」という）。転写反応の温度設定は、反応液中の RNAポリメラーゼの至 適温度に合わせて設定され得る。また、翻訳反応の温度設定は、翻訳反応が効率よ く進行する温度、すなわち、上述した無細胞タンパク質翻訳系により目的タンパク質 をコードする mRNAを用 V、てタンパク質を発現させたときに、該タンパク質が効率的に 発現し得る温度 (以下、力かる温度を「翻訳反応の至適温度」という）に合わせて設定 され得る。ここで、転写反応と翻訳反応のそれぞれの至適温度は、目的タンパク質を 最も効率的に発現し得る温度 (以下、力かる温度を「最適温度」という）を含めて、とも に通常 5〜15°C程度の温度幅を有する。したがって、転写反応と翻訳反応のそれぞ れの至適温度が部分的に重複する場合には、転写反応と翻訳反応とで反応温度を 同一に設定にして (すなわち、前記重複温度に設定して）目的タンパク質を発現させ ることちでさる。
[0036] また、転写反応と翻訳反応とで反応温度を分けて考えることなぐ転写反応と翻訳 反応とで反応温度を同一に設定して目的タンパク質を発現させることもできる（以下、 「第 2の温度設定基準」という）。すなわち、各反応において当該反応に適した至適温 度があり、かつ各反応の至適温度が重ならないときでも、各反応の至適温度の略中 間温度を設定すれば、該温度で転写反応と翻訳反応を行なわせて目的タンパク質 を発現させることができる。
[0037] 現状入手し得る耐熱性の RNAポリメラーゼの至適温度は 45〜50°Cであり、超好熱 菌（例えば、 KOD1株）由来の細胞抽出液を用いた場合の無細胞タンパク質翻訳系 の至適温度は 60〜70°Cである。このことから、本発明において無細胞タンパク質転 写-翻訳系におけるタンパク質合成を効率よく進めるには、第 1の温度設定基準に基 づけば、転写温度を 45〜50°Cに設定するとともに、翻訳温度を 60〜70°Cに設定す ればよい。また、第 2の温度設定基準に基づけば、転写温度と翻訳温度をともに約 5 0°Cに設定すればよい。
[0038] なお、無細胞タンパク質合成系によるタンパク質の合成は、上述した反応液を一つ の容器中に混合して行なう公知のバッチ法を用いることができる。また、タンパク質の 発現量を増やすには、前記無細胞タンパク質合成系に、アミノ酸、 ATP、 GTPなどの 反応基質を限外ろ過膜を介して連続的に供給することによって反応を行なわせるな どの公知の連続法を用いてもょ 、し、ある 、は濃縮した細胞抽出液を用いることもで きる。
[0039] 本発明は、上述した本発明の方法により目的タンパク質を製造するためのキットをも 包含する。該キットとしては、無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するた めのキットおよび無細胞タンパク質転写 ·翻訳系によりタンパク質を製造するためのキ ットが含まれる。前者のキットは、少なくとも超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパ ク質をコードする mRNA、 Mg2+およびアミノ酸を含有する。後者のキットは、少なくとも 超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパク質をコードするプラスミド、 RNAポリメラー ゼ、 Mg2+およびアミノ酸を含有する。さらに、これらの試薬はそれぞれ独立した形態 で供してもょ 、し、あるいは 2種以上組合わせた形態で供することもできる。
[0040] 本発明の方法により製造されたタンパク質の精製は、生細胞力 の分離と比べて混 在する汚染物質の量および種類が格段に少ないため、比較的容易に行なうことがで きる。精製法としては、例えば、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ-ティ 一クロマトグラフィー、 HPLC、電気泳動など従来公知のものを単独でまたは適宜組 合わせて用いることができる。
実施例 [0041] 以下、本発明の実施例として、 KOD1株由来の超耐熱性キチナーゼ (配列番号 1) のうち、 910番目の Glyを Metに置換し、これを N末端として、その下流の 911〜1215 番目のアミノ酸残基力もなる部分欠失断片 (ChiA Δ 4,配列番号 2)を目的タンパク質 として、本発明の方法について検討した結果を詳細に説明するが、本発明はこれら の実施例により何ら限定されるものではない。
[0042] 1. ChiA Δ 4をコードするプラスミドと mRNAの作製
無細胞タンパク質転写 ·翻訳系により ChiA Δ 4を合成するため、 ChiA Δ 4をコードす る遺伝子の上流に T7プロモーターとグルタミン酸脱水素酵素（GDH)のリボソーム結 合配列（RBS)を組み込んだプラスミド (pTRCl)を作製した。また、無細胞タンパク質 翻訳系により ChiA Δ 4を合成するため、上記で得られた無細胞タンパク質転写 '翻訳 用プラスミド (pTRCl)を転写させて無細胞タンパク質翻訳用 mRNA(ChiA A 4mRNA ) を作製した。
[0043] 1.1 T7プロモーターを組み込んだプラスミドの作製
プラスミド PUC118内に存在する制限酵素認識配列 Xbalを除去した。具体的には、 まず PUC118を Xbalで処理し、次いで Blunting Highキット（東洋紡績社)を用いて、使 用説明書にしたがって Xbal切断断片を平滑化し、その後得られた平滑末端を結合さ せた。
[0044] つぎに、プラスミド pET- 21a (Novagen社）を Bglllおよび EcoRIで二重消化して、 T7プ 口モーターを含む DNA断片（配列番号 3)を切り出した。そして、 Xbalの認識配列が除 去された前記 PUC118を BamHIおよび EcoRIで二重消化し、 T7プロモーターを含む前 記 DNA断片と結合させた。以下、得られたプラスミドを「pT」という。
[0045] 1.2 RBSを含む DNA断片の作製
グルタミン酸脱水素酵素（GDH)のリボソーム結合配列（RBS) (配列番号 5)を含む D ΝΑ断片を作製するため、以下のことを行なった。すなわち、 Xbalの認識配列を含む オリゴ DNA(5， -AAAATCTAGACGCAGATTACCGAAATGAGGT-3' ,配列番号 6)と Ndelの認識配列を含むオリゴ DNA(5， -AAAACATATGTACCACCTCATTTC GGTAATCTGCG— 3，，配列番号 7)を合成して、それぞれのオリゴ DNAをァユーリン グし、前記 RBSを含む DNA断片（配列番号 8)を作製した。その後、この DNA断片を P CRにより増幅し、得られた増幅断片を Xbalおよび Ndelで二重消化した。以下、得られ た切断断片 (配列番号 9)を「RBS断片」 t ヽぅ。
[0046] 1.3 ChiA A 4を含む DNA断片の作製
ChiA A 4を含む DNA断片は、 KOD1株の染色体 DNAを铸型として、後述する 2種類 のプライマーを用いて ChiA A 4遺伝子を PCRにより増幅させることにより作製した。以 下では、まず KOD1株の染色体 DNAの調製方法について説明する。
[0047] (KOD1株の染色体 DNAの調製）
人工海水（1. 6%NaCl、 0. 24%MgCl · 6Η 0、 0. 48%MgSO · 7Η 0、 0. 48
2 2 4 2
% (NH ) SO、 0. 08%NaHCO、 0. 016%CaCl - 2H 0、 0. 04%KC1、 0. 03
4 2 4 3 2 2
36%KH PO、 0. 004%NaBr、 0. 0016%SrCl - 6H 0、 0. 0008 %Fe (NH )
2 4 2 2 4 2
H (C H 0 ) )、0. 5%酵母エキス及び 0. 5%トリプトンからなる培地を 2リットル容の
6 5 7 2
培養ボトルに入れ、オートクレーブ（121°C、 2atom、 20分間）で滅菌処理を行なつ た。滅菌処理された前記培地に対して硫黄を 0. 1%添カ卩し、この培地 100mlに KOD 1株を接種して培養を行なった。培養は 85°Cで約 16時間嫌気的に行なった。培養終 了後、培養液を 8, OOOrpmで 10分間遠心分離することにより菌体を回収した。回収 した菌体から上清を除去した後、該菌体を前記人工海水に懸濁し、 8, OOOrpmで 1 0分間遠心分離する操作を 2回繰り返して菌体を洗浄した。
[0048] 洗浄後の菌体 5gを TE緩衝液 A(100mM Tris—HCl(pH8. 0) , 10mM EDTA) 1. 6mlに懸濁し、この懸濁液に 10%ドデシル硫酸ナトリウム 20 /z lとプロティナーゼ K 20 1を添カ卩し、 55°Cで 1時間反応させた。次に、前記懸濁液に中性フエノールを lml添加して 10分間混合した。得られた混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離し た後、上層にある水層部分を取り出した。取り出した水層と等量 (約 1. 5ml)の PCI ( フエノール Zクロ口ホルム Zイソプロピルアルコール）（50 :48 : 2 % (vZv) )を添カロし て 10分間混合し、得られた混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離し、次いで上層 にある水層部分を取り出した。取り出した水層にエタノール約 3mlと 3M酢酸ナトリウ ム溶液 150 1を添加し、— 20°Cで 30分間静置した。そして、静置後の混合液を 20 , 000 X gで 10分間遠心分離することにより核酸の沈殿を得た。
[0049] この沈殿に 70%エタノールを 5ml添カ卩し、 20, 000 X gで 10分間遠心分離を行つ て核酸をリンスした。上清を除去後、沈殿を乾燥させ、該乾燥した沈殿に TE緩衝液 B (10mM Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA)を 400 1添カ卩して核酸を溶解し た。次に、得られた核酸溶液 400 1にリボヌクレアーゼ（lmgZml)を 4 1添カ卩し、 3 7°Cで 1時間反応させた。反応終了後の核酸溶液に前記 PCIを 400 1添加して 5分 間混合した。この混合液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離し、水層部分を取り出し た。そして、前記 PCIの添加、遠心分離、水層部分の取り出し操作を再度行なった。 取り出した水層部分 (約 400 μ 1)にエタノール約 3mlと 3Μ酢酸ナトリウム溶液 40 μ 1 を添カ卩し、— 20°Cで 30分間静置した。
[0050] 静置処理した溶液を 20, 000 X gで 10分間遠心分離して DNAの沈殿を得た。この 沈殿に 70%エタノールを 0. 5ml添カ卩し、次いで 20, 000 X gで 10分間遠心分離を 行った。上清を除去した後、沈殿を乾燥させ、 TE緩衝液 B (10mM Tris— HCl (pH 8. 0) , ImM EDTA)を 200 /z l添カ卩することにより染色体 DNAを得た。
[0051] (ChiA Δ 4遺伝子の増幅）
Ndelの認識配列を含むプライマー ChiA- Nd (5， -AAAACATATGCTTCCCGAGC ACTTCTTCGCCC— 3，，配列番号 10)および EcoRIの認識配列を含むプライマー C hiA-Tl (5， - AAAAGAATTCTCCAATTTCATTATGGAC— 3 ' ,配列番号 11)を使 用して、上記で得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ない、 ChiA Δ 4遺伝子の D NA断片を増幅した。 PCRは、上記で調製した染色体 DNA(400ng)、各プライマー 2 Opmol及び KOD- plus- DNAポリメラーゼ（東洋紡績社製）を含む 50 μ 1の反応液中で 、まず 94°Cで 180秒間反応させ、 94°Cで 15秒間、 63°Cで 30秒間および 72°Cで 60 秒間のサイクルを 25回繰り返し、最後に 72°Cで 300秒間反応させた。続いて、得ら れた増幅断片を Ndelおよび EcoRIで二重消化した。以下、得られた切断断片を「Chi Α Δ 4断片」という。
[0052] 1.4 ChiA Δ 4をコードするプラスミド（pTRCl)の作製
上記で得られたプラスミド pTを Xbalおよび EcoRIで二重消化した。そして、得られた 切断断片、上述した RBS断片および ChiA Δ 4断片をそれぞれ混合し、それぞれの D NA断片を結合することにより、 ChiA Δ 4をコードするプラスミド pTRClを作製した。得 られた pTRClの概略図を図 1に示す。 [0053] 1.5 ChiA Δ 4をコードする mRNA (ChiA Δ 4mRNA)の作製
上述した pTRClを EcoRIで処理して、得られた EcoRI処理断片を铸型として T7 RNA 合成キット (T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System (Pr omega社 ) )を使用して、付属のプロトコールにしたがって pTRClの転写産物である ChiA Δ 4m RNAを作製した。 ChiA A mRNAの調製方法の概要を図 1に示す。
[0054] 2.細胞抽出液の調製
細胞抽出液は、 KOD1株を培養し、得られた菌体を回収 ·洗浄し、 Pre-incubation Mixを添加すること等により調製した。具体的には、前記の人工海水に 0. 5%ピルビ ン酸ナトリウムを添カ卩した培地を 3リットル容の培養ボトルに入れ、オートクレーブ（12 1°C、 2atom、 20分間）で滅菌処理を行なった。滅菌処理された前記培地に対して K OD1株を接種して培養を行なった。培養は 85°Cで約 16時間嫌気的に行なった。
[0055] 培養終了後、得られた培養物を、 4°C、 6, 000 X gで 10分間遠心分離を行なうこと で菌体を集菌した。つぎに、集菌した菌体を上述した人工海水に懸濁し、 4°C、 6, 0 00 X gで 5分間遠心分離を行なうことで菌体を洗浄した。そして、洗浄した菌体を人 ェ海水に再度懸濁し、あらかじめ重量を測定しておいた遠沈管に移し、 4°C、 6, 000 X gで 10分間遠心分離を行な 、、上清を除去した後の菌体の重量を測定した (菌体 量 4. 78g)。これ以降の操作は全て RNase-freeの条件で行なった。得られた菌体を 1 . 27mlZgの人工海水で懸濁し、 vortexで緩やかに混合した。そして、この懸濁液を フレンチプレスに移し、 10, OOOp.s.i, 3回の条件でプレスした。得られたライセートを 遠心チューブに移し、該ライセート 10mlあたり 0. 1Mの DTTを 100mlカ卩えてから、 4 。C、 30, 000 X gで 30分間遠心分離した。上清を分取し、該分取した上清を 4°C、 30 , 000 X gで 30分間遠心分離した。そして、上清の 80%を分取し、該分取した上清 1 mlあたり表 1に示す Pre-incubation Mixを 0. 3ml添カ卩した。この混合物を 37°Cで 80 分間インキュベーションし、進行中の mRNAの翻訳を終了させた。インキュベーション 終了後、前記混合物を S30バッファー（lOmM Tris—酢酸（pH7. 4) , 1. OmM D TT, 14mM酢酸マグネシウム， 60mM酢酸カリウム）で透析した（45分間、 3回）。 透析後の混合物を 4, 000 X gで 10分間遠心分離し、上清を分取し、これを本発明 に使用する細胞抽出液とした (タンパク濃度： 34mgZml)。 [0056] [表 1]
0.3M Tris-酢酸 (pH 7.4)
9.3mM酢酸マグネシウム
13mM ATP (pH 7)
84mM phosphoenolpyruvate
4.4mM DTT
Amino acid suspension (各 0.04mM)
1.3 units/ml pyruvate kinase (rabbit muscle 由来)
[0057] 3.無細胞タンパク質合成反応およびその解析
後述する無細胞タンパク質合成反応は、上記細胞抽出液と後述する各種試薬を氷 上にて混合して反応液を調製し、 PCR装置を用いて反応温度を一定に保持すること により行なった。そして、所定時間経過後、反応液を氷上にて静置することにより合成 反応を終了させ、反応結果を次に示すウェスタンプロット法により解析した。まず、無 細胞タンパク質合成反応終了後の溶液をミリ Q水を用いて 30倍に希釈した。希釈後 の溶液につ 、て、常法にしたがって SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なつ た (アクリルアミド濃度 12. 5%)。泳動終了後、ホラィズブロット (アト一社)を用いてゲ ル中の試料を PVDF膜（Hybond— P、 Amersham Biosciences社）に転写した。次に、 この PVDF膜に、一次抗体として抗ゥサギ ChiA A 4抗体をカ卩え、室温で 1時間インキ ュペートした。ついで二次抗体として HRP—rec— ProteinG (Zymed社）をカ卩え、室温 で 1時間インキュベートした。そして、二次抗体をインキュベートした PVDF膜に、 EC L Advance Western Blot Detection Kit (Amersham Biosciencesネエリを使用して、使用 説明書に記載の反応条件にしたがって化学発光を行なわせた。 目的バンドは Hyperf ilm ECL (Amersham Biosciences社）を使用して検出した。なお、前記抗ゥサギ ChiA Δ 4抗体は、特開平 11— 313688号公報に記載の方法にしたがって得られた精製 C hiA Δ 4を抗原とし、ゥサギを免疫動物として常法にしたがって作製したポリクローナル 抗体である。
[0058] 4.無細胞タンパク質翻訳系
4.1 ChiA A 4mRNAの影響 ChiA A 4mRNAを用いたタンパク質翻訳反応は、表 2に示す試薬，組成および終濃 度の試料を用いて、反応液の全量を 30 1として、 48°Cで 90分間行なった。なお、 表 2の T.kodakaraensis tRNAは、まず KOD1株を上述した方法で培養し、得られた培 養液から回収した菌体を、 Nucleobond AX (Macherey-Nagel社）を使用して、付属の プロトコールにしたがって単離したものである。また、 T.kodakaraensis tRNAは以後の 実験でも同じものを使用した。結果を図 2に示す。図 2においてレーン 1〜4および C ( 対照試料）は表 2の各試料番号に対応している。図 2において矢印で示した 33. 8kD aのバンドは ChiA Δ 4であり、レーン 1〜4のすベてに ChiA Δ 4のバンドが確認された 力 レーン Cには ChiA Δ 4のバンドが認められなかった。このことから、 ChiA A 4mRNA は ChiA Δ 4を合成するための必須成分であることがわかり、レーン 2, 3および 4の比 較から、 ChiA Δ 4mRNAの濃度を増やすことにより ChiA Δ 4の合成量が増加することが わかった。
[0059] [表 2]
Figure imgf000024_0001
* 1 · GCU mix: GTP、 CTP and UTP
*2. ChiA A 4 mRNA濃度： 2250 g ml
*3. Ύ, kodakaraensis tRNA濃度： 104(^g ml
注：反応系 total volume 30μ1
[0060] 4.2 反応温度の影響
ChiA Δ 4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表 3の試料 1, 3, 4 に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 48°Cまたは 68°C で 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料 9は、 ChiA A 4mRNAを 添カ卩していない対照試料である。結果を図 3に示す。図 3においてレーン 1, 3, 4およ びレーン 9は表 3の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E scherichia coli由来の ChiA A 4を示す。なお、この E.coli由来の ChiA A 4は、特開平 1 1?313688号公報に記載されて 、るように、 ChiA Δ 4発現ベクターを有する大腸菌を 培養'集菌*破砕'熱処理して粗酵素液を取得し、次いで該粗酵素液を陰イオン交換 カラムおよびゲル濾過カラムにかけるとともに、 SDS-PAGEで単一バンドとして観察さ れるまで精製したものである。また、 E.col油来の ChiA Δ 4は以後の実験でも同じもの を使用した。図 3においてレーン 1, 3, 4のすべてに ChiA Δ 4のバンドが確認され、各 レーンの比較から、反応温度が高くなるほど、具体的には 48°Cよりも 68°Cの方が Chi A Δ 4の合成量が増加することがわかった。また、レーン 1において ChiA Δ 4の合成が 確認されたこと、さらに、レーン 3とレーン 4の ChiA Δ 4のバンド量が同等であることか ら、 tRNA (本実験では、 T.kodakaraensis tRNA)は ChiA Δ 4の翻訳反応に影響を及ぼ さないといえる。
[0061] 4.3 マグネシウムイオンの影響
ChiA Δ 4の合成反応におけるマグネシウムイオン濃度の影響を検討するため、表 3の 試料 1および 5〜8に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として 、 48°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料 9は ChiA A 4mR NAを添カ卩していない対照試料である。結果を図 4に示す。図 4においてレーン 1, 5 〜8は表 3の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli 由来の ChiA Δ 4を示す。図 4においてレーン 1, 5〜7には ChiA Δ 4のバンドが確認さ れたが、レーン 8には ChiA Δ 4のバンドが確認されなかった。このことから、マグネシゥ ムイオン濃度が増加すると ChiA Δ 4の合成量が増加すること、その好適な濃度は 5〜 10mMであるが、 25mMを超えると翻訳反応が阻害され ChiA Δ 4が合成されな!、こ とがわかった。
[0062] [表 3] 反応液組成 最終濃度 試料 1 3 4 5 6 7 8 9
1.4M Mg(OAc)2 5-25mM 0.34 0.34 0.34 0.11 0.22 0.44 0.55 0.34
6.0 NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(Oac) 230mM 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15
2.2M Ins Acetate 56.2mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0M Phosphoenolp ruvate 33m 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 2% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 2m each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A4 mRNA*2 - 8.10 8.10 8.10 8.10 8.10 8.10 8.10 -
T. kodakaraensis tRNA J - - - - - - - 細胞抽出液 - 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20
R ase-free water - 7.21 7.21 2.31 7.44 7.33 7.11 7.00 15.31
Mg2+最終濃度 (mM) 16 16 16 着^ k Hi 20 16 反応温度 C) 、 48 48 48 48 68
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： 2250μ¾ ιη1 反応系 total volume 30μ1
*3. T. kodakaraensis tRNA溶液濃度： 1040 g/ml
[0063] 4.4 ポリエチレングリコールの影響 1
ChiA Δ 4の合成反応におけるポリエチレングリコールの影響を検討するため、表 4の 試料 1， 2に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 /z lとして、 68°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 5に示す。図 5においてレ ーン 1とレーン 2は表 4の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとし ての E.coli由来の ChiA A 4を示す。図 5においてレーン 1 (PEG8000 : O%)に比べてレ ーン 2 (PEG8000： 2%)の方力 SCWA Δ 4の合成量が増えて 、ることから、ポリエチレン グリコールを添加すると、 ChiA Δ 4の合成量が増加することがわかった。
[0064] 4.5 スペルミン、スペルミジンの影響
ChiA Δ 4の合成反応におけるスペルミンとスペルミジンの影響を検討するため、表 4 の試料 1および 3〜5に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1とし て、 68°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 6に示す。図 6 においてレーン 1, 3〜5は表 4の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マー カーとしての E.coli由来の ChiA A 4を示す。図 6において、レーン 3〜5における ChiA Δ 4のバンドに有意差が認められないことから、スペルミンまたはスペルミジンは翻訳 反応に影響を及ぼさな 、ことがわ力つた。
[0065] 4.6 ナトリウムイオンの影響
CWA Δ 4の合成反応におけるナトリウムイオンの影響を検討するため、表 4の試料 2 および 6〜8に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 68°C で 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 7に示す。図 7において レーン 2, 6〜8は表 4の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとし ての E.coli由来の CWA Δ 4を示す。図 7にお!/、てレーン 2 (Na+： OmM)に比べてレー ン 6 (Na+： lOOmM)、レーン 7 (NaT： 300mM)、レーン 8 (Na+： 500mM)の方が C hiA Δ 4の合成量が少なレ、ことから、ナトリウムイオンは翻訳反応に正の影響を及ぼさ ないことがわかった。
[0066] [表 4]
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
GCU mix: GTP、 CIV and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA A 4 mRNA溶液濃度： 225(^g ml 反応系 total volume 30μ1
4.7 反応温度の最適化の検討
ChiA A 4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表 5の試料 1〜9に 示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 /x lとして、 30〜80°Cで 90分 間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、試料 1は、 ChiA A 4mRNAを添加し ていない対照試料である。結果を図 8に示す。図 8においてレーン 1〜9は表 5の各 試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA A 4 を示す。図 8にお!/、てレーン 3〜8 (反応温度： 40〜75°C)では ChiA Δ 4のバンドが明 確に確認された力 レーン 2 (反応温度： 30°C)とレーン 9 (反応温度： 80°C)には Chi A Δ 4のバンドが確認されなかった。
[0068] [表 5]
Figure imgf000028_0001
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： 25(K g/ml 反応系 total volume 30μ1
*3. タンパク濃度： 25mg/ml
[0069] 上記の結果を詳細に検討するため、上記の各温度で 90分間反応させた合成終了 時点の ChiA Δ 4の量を活性測定により定量した。 ChiA Δ 4の活性測定法を以下に述 ベる。 0. 1M酢酸緩衝液 (pH5. 0)に溶解した蛍光基質 GlcNAc—4ーメチルゥンベリ
2
フエロン (0. 02mM)500 μ 1、精製水 480 μ 1、および反応液 20 μ 1を 80。Cで 10〜30 分間反応させた。反応終了後、反応液 1を 1の氷冷 lOOmMグリシン—N aOH (pHl l)に添加して酵素反応を停止した。この試料の 350nmにおける励起光 および 440nmにおける蛍光を分光蛍光光度計を使用して測定し、 ChiA Δ 4の比活 性値を用いて、翻訳反応により合成された ChiA Δ 4の量を算出した。結果を図 9に示 す。図 9より、表 5の試料 2〜9のすベてについて ChiA Δ 4が合成され、その合成量は 60〜70°Cで最大となることがわかった。このこと力ら、本実験系では 60〜70°Cが最 適温度といえる。そこで、以後の実験では反応温度を最適温度範囲に位置する 60 °Cに設定して、各種成分の影響を検討することにした。
[0070] また、表 5の試料 5, 7および 9のそれぞれ【こつ!ヽて、反応後 5, 15, 30, 60, 90, 1 20分でサンプリングし、上記と同様の方法により分析して、 ChiA Δ 4の発現量の時間 依存性を検討した。結果を図 10に示す。図 10より、 70°Cでは反応開始後 30分程度 で ChiA Δ 4の合成量がほぼ飽和して!/、ること、 ChiA Δ 4の合成量は最大で 0. 8 μ & mlに達することが判明した。
[0071] 4.8 カリウムィ才ンの影響
ChiA Δ 4の合成反応におけるカリウムイオンの影響を最適温度条件で検討するた め、表 6の試料 1〜3に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1とし て、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 11に示す。図 1 1においてレーン 1〜3は表 6の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マー カーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 11にお!/、てレーン 1 (K+： lOOmM)か らレーン 3 (K+： 700mM)に!、くにしたがって、 ChiA Δ 4のバンドが小さくなつており、 このことから ChiA Δ 4の合成量を増カロさせるには、カリウムイオンの濃度を低くすること が効果的といえる。
[0072] 4.9 ポリエチレングリコールの影響 2
ChiA Δ 4の合成反応におけるポリエチレングリコールの影響を最適温度条件で検 討するため、表 6の試料 4〜6に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 3 0 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 12に 示す。図 12においてレーン 4〜6は表 6の各試料番号に対応しており、レーン Cは分 子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 12〖こお!/、てレーン 4 (PEG800 0： 1 %)力 レーン 6 (PEG8000： 5%)に!、くにしたがって ChiA Δ 4のバンドが大きくな つており、このことから ChiA Δ 4の合成量を増加させるには、ポリエチレングリコールの 濃度を高くすることが効果的であると 、える。
[0073] [表 6] 反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6
1.4M Mg(OAc)2 7.5mM 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16
6.0M N¾(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) 100-700mM 3,50 ' 1.15 1.15 1.15
2.2M Tris Acetate 56.2mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.OM Phosphoenolp ruvate 33mM 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 1-5% 1.50 1.50 1.50 ΰ.75 囊暴彦暴
20 Amino acids(55mM each) 2mM each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A 4 mRNA*2 - 8.10 8.10 8.10 8.10 8.10 8.10 細胞抽出液 - 7.20， 7.20 1 7.20 7.20 7.20 7.20
R ase-free water - 8.04 6.59 5.04 8.14 6.64 5.14
K+最終濃度 (mM) 100 400 700 230 230 230
PEG最終濃度 (％) 2.00 2.00 2.00 1.00 3.00 5.00 反応温度 60 60 60 60 60 60
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
'2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： 250(^g ml 反) J:糸 total volume 30μ1
[0074] 4.10 各種無機イオンの影響
ChiA Δ 4の合成に及ぼすマグネシウムイオン、アンモ-ゥムイオンおよびカリウムィ オンの影響を最適温度条件で検討するため、表 7の試料 1〜3および 9に示す試薬， 組成および終濃度で、反応液の全量を 30 IX 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク 質翻訳反応を行なった。結果を図 13に示す。図 13においてレーン 1〜3および 9は 表 7の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 13にお!/、てレーン 1 (Mg2+： OmM)には ChiA Δ 4のバンドが確認 されなかったのに対し、レーン 9 (Mg2+ : 7. 5mM)には ChiA Δ 4のバンドが確認され た。このこと力ら、マグネシウムイオンは ChiA Δ 4を合成するための必須成分であると いえる。
[0075] 図 13にお 、てレーン 2 (NH +： OmM)に比べてレーン 9 (NH +： 80mM)の方が C
4 4
hiA A 4のバンドが大きいことが確認された。このことから、アンモ-ゥムイオンは ChiA Δ 4を合成するための必須成分ではなレ、が、 ChiA Δ 4の合成量を増加させるのに必 要な成分であると 、える。また、レーン 3 (K+： OmM)に比べてレーン 9 (K+： lOOmM )の方が ChiA Δ 4のバンドが大きいことが確認された。このこと力 、カリウムイオンは C hiA Δ 4を合成するための必須成分ではな!/、が、 ChiA Δ 4の合成量を増加させるのに ある程度必要な成分であると 、える。
[0076] 4.11 ホスホェノールピルビン酸の影響
ChiA Δ 4の合成反応におけるホスホェノールピルビン酸 (PEP)の影響を最適温度 条件で検討するため、表 7の試料 4〜9に示す試薬，組成および終濃度で、反応液 の全量を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果 を図 14に示す。図 14においてレーン 4〜9は表 7の各試料番号に対応しており、レ ーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 14にお!/、てレーン 6 (PEP： OmM)に比べてレーン 9 (PEP： 33mM)の方が ChiA Δ 4のバンドが大き!/ヽ ことが確認された。ここで、本反応液には、上述したように Pre-incubation Mixに由来 するピルビン酸キナーゼ (PK)が含有されて ヽる。また KOD1株自体にも PKが存在し ていることが判明している。これらのことを併せて考えると、 PEPは ATP再生系のため の基質として作用し、 ChiA Δ 4の合成量を増力！]させるのに必要な成分であると 、える 。また、レーン 4〜8の比較から、 PEPを PKの基質として ATPが再生していることが確 認されるとともに、 ATPの濃度を高くしすぎると ChiA Δ 4の合成量が減少する傾向にあ るといえる。各種エネルギー源と PEPの関係は、後記 4.16で再び検討を行う。
[0077] [表 7]
Figure imgf000032_0001
*1. GCU mix: GTP CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は
*2. ChiA A4 mRNA溶液濃度： 250(^g ml BO'd total volume 30μ1
[0078] 4.12 トリスー酢酸緩衝液の影響
ChiA A 4の合成反応におけるトリスー酢酸緩衝液の影響を最適温度条件で検討す るため、表 8の試料 1と 9に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1と して、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 15に示す。 図 15においてレーン 1と 9は表 8の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マ 一力一としての E.coli由来の ChiA A 4を示す。図 15においてレーン 1 (トリス酢酸： Om M)とレーン 9 (トリス酢酸： 56. 2mM)はほぼ同サイズのバンドを示した。このことから 、トリス一酢酸緩衝液は、 ChiA A 4の合成反応において影響を及ぼさないことがわか つた o
[0079] 4.13 アミノ酸の影響
ChiA Δ 4の合成反応における 20種のアミノ酸の影響を最適温度条件で検討するた め、表 8の試料 2, 3および 9に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 16に示 す。図 16においてレーン 2, 3および 9は表 8の各試料番号に対応しており、レーン C は分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 16にお!/、てレーン 2 (各 アミノ酸： OmM)には ChiA Δ 4のバンドが確認されなかったのに対し、レーン 3 (各アミ ノ酸： 4mM)と 9 (各アミノ酸： 2mM)には ChiA Δ 4のバンドが確認された。このことから 、 20種類のアミノ酸は ChiA Δ 4を合成するための必須成分であると 、える。
[0080] 4.14 スペルミジンの影響 2
ChiA Δ 4の合成反応におけるスペルミジンの影響を最適温度条件で検討するため 、表 8の試料 4, 5および 9に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1 として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 17に示す。 図 17においてレーン 4, 5および 9は表 8の各試料番号に対応しており、レーン Cは分 子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 17において、レーン 4 (スペル ミジン： 0. 5mM) , 5 (スペルミジン： ImM)および 9 (スペルミジン： OmM)における C hiA Δ 4のバンドには有意差が特に認められな 、ことから、スペルミジンは翻訳反応に 影響を及ぼさな 、ことがわ力つた。
[0081] 4.15 GTP, CTPおよび UTPの影響
ChiA Δ 4の合成反応における GTP, CTPおよび UTP (以下、「GCU混合物」という。） の影響を最適温度条件で検討するため、表 8の試料 6および 9に示す試薬、組成お よび終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳 反応を行なった。結果を図 18に示す。図 18においてレーン 6およびレーン 9は表 8の 各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 18にお!/、てレーン 6 (GCU混合物： OmM)およびレーン 9 (GCU混合物： 0. 85mM each)における ChiA Δ 4のバンドには有意差が特に認められないことから 、エネルギー源としての GCU混合物は翻訳反応に影響を及ぼさな 、ことがわかった。
[0082] [表 8]
反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6 9
1.4M Mg(OAc)2 7.5mM 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16
6.0M N¾(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2.2M Tris Acetate 0-56.2mM - 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0-0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 iSBiliiS 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0M Phosphoenolp ruvate 33mM 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 lOOmM Spermidine 0-1. OmM - - - .15 讀 - -
20 Amino acids(55mM each) 0-4mM each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A4 mR A'2 - 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 細胞抽出液 - 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20
RNase-free water - 8.91 9.23 7.05 7.99 7.84 10.97 8.14 反応温度 60 60 60 60 60 60 60
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA A4 mRNA溶液濃度： 2500 g/ml 反応液 total volume 30ul 4.16 各種エネルギー源と PEPの関係
ChiA Δ 4の合成反応における GCU混合物 ZATPと PEPとの関係を最適温度条件 で検討するため、表 9の試料 1〜7に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全 量を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。結果を図 1 9に示す。図 19においてレーン 1〜7は表 9の各試料番号に対応しており、レーン C は分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。まず ATPおよび GCU混合 物が共に存在して 、な 、レーン 4 (PEPのみ）にお!/、ても ChiA Δ 4のバンドが確認さ れた。翻訳反応に必要なエネルギー物質は ATPと GTPであるので、細胞抽出液にこ れらの物質が存在する力、もしくはそれらの前駆体である ADPと GDPが存在し PEPに より再生され使用されていることがわかる。 PEPが存在しない条件であるレーン 5 (AT Pのみ）およびレーン 6 (GCU混合物のみ）では ChiA Δ 4のバンドが見られな!/、一方で 、両者を混合させたレーン 1 (ATPおよび GCU混合物）ではバンドが確認できた。 ATP と GTPは菌体内酵素（nucleoside-diphosphate kinase)により相互変換が可能である ので、この場合の相乗効果はエネルギー再生物質である PEPが存在しな 、条件下 でエネルギー物質を単純に増量した結果であると考えられる。また PEP存在下で AT P (レーン 3)または GCU混合物（レーン 2)をカ卩えると、相乗的に CWA Δ 4の合成量が 増加して ヽることから、 ATPまたは GCU混合物の ヽずれか一方と PEPが存在すれば ChiA A 4の合成に必要なエネルギーを効率的に得ることが可能であるといえる。
[¾9]
Figure imgf000035_0001
* 1. GCU mix: GTP CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΙ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： 2500 g/ml 反応液 total volume 30μ1
*3.RNase inhibitor
5.無細胞タンパク質転写，翻訳系
5.1 反応温度の影響 1
pTRClを用いたタンパク質合成反応は、表 10の試料 8および 9に示す試薬、組成 および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 40°Cまたは 60°Cで 90分間行なった 。本試験で用いた反応液は、上述した翻訳反応系における ChiA A 4mRNAに代えて p TRC1を用いた点、および T7RNAポリメラーゼ (東洋紡績社)を新たに添加した点を除 き上述した翻訳反応系における反応液と基本的に同一である。なお、 pTRClは、あら かじめ EcoRIで処理しておき、 ChiA Δ 4遺伝子の下流にある EcoRI認識部位を切断し た切断断片としたものを用いた。また、前記 T7RNAポリメラーゼ（商品名： Thermo T7 RNA Polymerase)は、活性上限温度が 50°Cであり、高い熱安定性を有するものであ る。結果を図 20に示す。図 20においてレーン 8およびレーン 9は表 10の各試料番号 に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA A 4を示す。図 20におレ、て、レーン 8 (反応温度： 40°C)およびレーン 9 (反応温度： 60°C)のレ、ずれ にも ChiA A 4のバンドは確認されなかった。このこと力ら、本実験系では、転写反応と 翻訳反応のいずれかの最適温度に設定して転写'翻訳反応を行なっても、転写反応 または翻訳反応のいずれかで反応が効率的に進まず、効果が小さいことがわ力つた
[表 10]
Figure imgf000036_0001
*1. GCU mix: GTP, CTP and UTP
*2. pTRCl濃度： 500 g/ml
*3. T7RNA polymerase濃度： 1000 units/μΐ
注：溶液混合量の単位は μΐ
反 、液 total volume 30μ1 5.2 反応温度の影響 2
ChiA Δ 4の合成反応における反応温度の影響を検討するため、表 11の試料 8に示 す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 40°Cで 60分間反応さ せた後、 60°Cで 90分間反応させた。結果を図 21に示す。なお、図 21においてレー ン 8は表 11の試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由 来の CWA Δ 4を示すものである。図 21におレ、てレーン 8には微量ではある力 SCWA Δ 4 のバンドが確認された。このことから、本実験系における転写'翻訳反応を効率的に 行なわせるには、転写反応時と翻訳反応時に、それぞれの反応における最適温度に 温度設定することが効果的であると 、える。
11]
Figure imgf000037_0001
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP
*2. pTRCl濃度： 500 g ml
*3. T7R A polymerase濃度： 1000 units/μΐ
注：溶液混合量の単位は μΐ
反 J心液 total volume 30μ1
5.3 RNァーゼ阻害剤の影響
ChiA Δ 4の合成反応における RNァーゼの影響を検討するため、表 12の試料 8に示 す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 40°Cで 60分間反応さ せた後、 60°Cで 90分間反応させた。結果を図 22に示す。なお、図 22においてレー ン 8は表 12の試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由 来の ChiA A 4を示すものである。レーン 8には、上述した RNァーゼ阻害剤を添カ卩しな い実験系（図 21を参照のこと）に比べて、 ChiA A 4のバンドが明確に確認された。こ のことから、本実験系における転写 ·翻訳反応を効率的に行なわせるには、 RNァー ゼ阻害剤を添加することが効果的であると 、える。
[表 12]
Figure imgf000038_0001
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. pTRCl濃度： 500 g/ml
*3. T7RN A polymerase濃度： 1000 units/μΐ
.R ase inhibitor
反'心 total volume 30μ1
5.4 RNAポリメラーゼの影響
ChiA Δ 4の合成反応における RNAポリメラーゼの添加量の影響を検討するため、表 13の試料 1〜4に示す試薬、組成および終濃度で、反応液の全量を 30 μ 1として、 4 0°Cで 60分間反応させた後、 60°Cで 90分間反応させた。結果を図 23に示す。なお 、図 23においてレーン 1〜4は表 13の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子 量マーカーとしての E.coli由来の CWA Δ 4を示すものである。図 23にお!/、てレーン 3 力もレーン 1にいくにしたがって、 ChiA A 4のパンドが大きくなつている。このことから、 本実験系では、 T7 RNAポリメラーゼの濃度が高すぎると、転写反応を阻害するとい える。また、レーン 3とレーン 4の比較から、本実験系では、 RNァーゼ阻害剤が機能し て!、ることが再確認された。
[表 13]
Figure imgf000039_0001
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2.RNase inhibitor 反)心液 total volume 30μ1
6.無細胞タンパク質翻訳系 2 (目的タンパク質の合成量増加を目的とした細胞抽出 液の好適な調製方法の検討）
6.1 フレンチプレスの回数の影響
図 24は前記「2.細胞抽出液の調製」に記載した各手順のうち、 KOD1株の培養以 後の各手順を番号付けしてまとめたプロトコールである。図 24の手順 9では、フレン チプレスの回数を 3回としている力 フレンチプレスの回数が増加するとタンパク質の 転写 '翻訳に必要な要素（例えば、 RNAポリメラーゼなど）が破壊される可能性がある と考えられる。そこで、フレンチプレスの回数を少なくして chiA A 4の合成量に与える 影響を検討した。具体的には、図 24の各手順のうち、手順 9におけるフレンチプレス の回数を 1回、 2回または 3回とした以外は同じ手順で細胞抽出液を調製し、表 14の 試料 1〜5に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。表 14のうち、 S30画分は前記「4.無 細胞タンパク質翻訳系」および「 5.無細胞タンパク質転写 ·翻訳系」で用 、た細胞抽 出液を示し、 S30-FP1, S30-FP2および S30-FP3は、それぞれフレンチプレスを 1回 , 2回および 3回行なって得られた細胞抽出液である。なお、各々の細胞抽出液の後 には、該細胞抽出液のタンパク濃度をカツコ書きで示している。図 25において各レー ンは表 14の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由 来の ChiA A 4を示し、レーン 1は ChiA A 4mRNAを添カ卩していない対照試料である。レ ーン 2〜5のうち、 ChiA A 4のバンドを比較すると、レーン 3 (フレンチプレス 1回）のバ ンドが最も大きかった。このことから、フレンチプレスの回数を減らすことで ChiA A 4の 合成量が増加することが分かるとともに、フレンチプレスの回数は 1回で十分であるこ とが分力つた。
[表 14]
Figure imgf000041_0001
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： 250(^g tnl 反応液 total volume 30μ1
6.2 フレンチプレスの圧力の影響
フレンチプレスの圧力が目的タンパク質の合成量にどのように影響する力検討する ため、図 24の各手順のうち、手順 9におけるフレンチプレスの回数を 1回とし、圧力を 8, 400 p.s.iと低くした以外は同じ手順で細胞抽出液を調製し (この細胞抽出液を「S 30FP-1A」という）、表 15の試料 1〜4に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の 全量を 30 μ 1として、 65°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、 表 15の試料 1と 2は、前記「6.1 フレンチプレスの回数の影響」で調製した S30FP - 1を 細胞抽出液として用いた試料である。図 26にウェスタンブロット法による分析結果を 示す。図 26において各レーンは表 15の各試料番号に対応しており、レーン Cは分子 量マーカーとしての E.coli由来の ChiA A 4を示す。また、表 15には図 26の各レーンに 対応する試料について、化学発光検出装置（Lumi Vision PRO 400EX,アイシン精 機）を用いて求めた ChiA A 4の合成量を示した。試料 3 (圧力： 8, 400 p.s.i)と試料 1 (圧力： 10, 000 p.s.i) (または試料 4 (圧力： 8, 400 p.s.i)と試料 2 (圧力： 10, 000 p .s.i) )について ChiA A 4の合成量を比べると、試料 3 (または試料 4)の方が約 5倍多 い値を示した。このこと力ら、フレンチプレスの圧力を従来の 10, 000 p.s.はり低く設 定することは、 ChiA Δ 4の合成量増加に有効であることが分力つた。
[表 15]
Figure imgf000042_0001
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP
*2. ChiA A 4 mRNA溶液濃度： 2500μ§/ηι1
注：溶液混合量の単位は μΐ
反応液 total volume 30μ1
6.3 低張液の影響
上述した人工海水と S30バッファーの浸透圧を比べると、 S30バッファーの方が明 らカに低い。そこで、細胞破砕時に人工海水に代えて S30バッファーを分散媒とした ときに目的タンパク質の合成量にどのように影響する力検討することにした。具体的 には、図 24の各手順のうち、手順 7の人工海水を S30バッファーに代え、手順 9のう ち、フレンチプレスの回数を 1回とし、圧力を 2, 500 p.s.i、 5, 000 p.s.iまたは 7, 50 0 p.s.iに設定するとともに、手順 16のインキュベーションを 60°C、 40分の条件で行な うことで細胞抽出液を調製した。そして、得られた細胞抽出液のタンパク濃度を比較 することで、細胞破砕時に低張液を用いた場合の効果を評価した。結果を表 16に示 す。なお、表 16中、 S30FP-1Aは前記「6.2 フレンチプレスの圧力の影響」で調製し た細胞抽出液である。表 16に示した各細胞抽出液のタンパク濃度から、細胞を低張 液に十分な時間浸透させることによりフレンチプレスの圧力が低くても得られるタンパ ク量は十分なものであった。
[表 16]
Figure imgf000043_0001
表 1 5の細胞抽出液と同一である
6.4 プレインキュベーションの影響
プレインキュベーションの有無により、 目的タンパク質の合成量がどのように増減す るカゝ検討した。具体的には、図 24の各手順のうち、手順 7の人工海水を S30バッファ 一に代え、手順 9のうち、フレンチプレスの回数を 1回とし、圧力を 7, 500 p.s.iに設定 するとともに、手順 15および手順 16を表 17に示す条件で行なうことで 3種類の細胞 抽出液を調製した。次いで、得られた細胞抽出液 (S30FP-1E、 S30FP-1F, S30FP-1 G)を用いて、表 18の試料 2, 3, 4に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量 を 30 1として、 60°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 18 のうち、試料 1は、前記「6.2 フレンチプレスの圧力の影響」で調製した S30FP-1Aを 細胞抽出液として用いた参照試料である。なお、各々の細胞抽出液の後には、該細 胞抽出液のタンパク濃度をカツコ書きで示している。図 27にウェスタンプロット法によ る分析結果を示す。図 27において各レーンは表 18の各試料番号に対応している。 図 27のレーン 2〜4のうち、 ChiA A 4のバンドを比べると、レーン 4はレーン 2, 3に比 ベて大きなバンドを示した。このこと力ら、 ChiA A 4の合成量を増加させるには、 Pre-I ncubationを添加せず、かつプレインキュベーションをしな!、方が好まし 、ことが分か つ 7こ。
[表 17]
Figure imgf000044_0001
表 1 5の細胞抽出液と同一である [表 18]
Figure imgf000045_0001
* 1. GCU mix: GTP CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA A 4 mRNA溶液濃度： 250(^g/ml 反応液 total volume 30μ1
6.5 透析の影響
透析の有無により、目的タンパク質の合成量がどのように増減するか検討した。具 体的には、図 24の各手順のうち、手順 7の人工海水を S30バッファーに代え、手順 9 のうち、フレンチプレスの回数を 1回とし、圧力を 7 500 p.s.iに設定するとともに、手 順 17の透析を行なって、または行なわずに細胞抽出液を調製した (表 19参照)。次 いで、得られた細胞抽出液（S30FP-1H S30FP-1I)を用いて、表 20の試料 1, 2に示 す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 /z lとして、 60°Cで 90分間無細胞 タンパク質翻訳反応を行なった。図 28にウェスタンプロット法による分析結果を示す。 レーン 1と 2のうち、 ChiA A 4のバンドを比べると、レーン 2のバンドの方がやや大きか つた。このことから、 ChiA A 4の合成量を増加するためには、透析をしない方が好まし いといえる。 [0103] [表 19]
Figure imgf000046_0001
[0104] [表 20]
Figure imgf000046_0002
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP
*2. ChiA A4 mRNA溶液濃度： 2500 g/ml
注：溶液混合量の単位は μΐ
反;' 液 total volume 30μ1
[0105] 7.無細胞タンパク質翻訳系 3 (mRNAと細胞抽出液について、 目的タンパク質の合成 量増加に適した濃度の検討）
前記「6.無細胞タンパク質翻訳系 2」では、 目的タンパク質の合成量増加に適した 細胞抽出液の調製方法について検討した。次に、該細胞抽出液を用いて無細胞タ ンパク質翻訳反応を行なうにあたり、 ChiA A 4の合成量を増加させることを目的として 、反応液中の mRNAと細胞抽出液の好適濃度を検討することにした。以下の実験で は、細胞抽出液として、前記「6.4 プレインキュベーションの影響」で調製した S30FP -1G (タンパク濃度： 35.3 gZ 1)を用いることにした。図 29は S30FP-1Gの調製 用プロトコールである。
[0106] 7.1 mRNAの好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応における ChiA Δ 4mRNAの好適濃度を検討するため、表 21の 試料 1〜5に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 21の各試料中の ChiA Δ 4m RNA濃度は、 OmgZml (試料 1)、 0. 33mgZml (試料 2)、 0. 42mgZml (試料 3)、 0. 50mgZml (試料 4)、 0. 58mgZml (試料 5)である。図 30にウェスタンブロット法 による分析結果を示す。図 30において各レーンは表 21の各試料番号に対応してお り、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 30より、レー ン 2 (ChiA A 4mRNA: 0. 33mg/ml)からレーン 5 (ChiA A 4mRNA: 0. 58mg/ml) にいくにしたがって ChiA Δ 4のバンドが大きくなる傾向を示した。以上の結果から、 Ch iA A 4mRNAの好適濃度は 0. 40〜0. 60mgZmlであり、 0. 50mgZml付近が最も 好ましいといえる。
[0107] [表 21]
反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5
1.4M Mg(OAc)2 7.5mM 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16
6.0M NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2.2M Tns Acetate 56.2mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0M Phosphoenolpyruvate 66mM 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 2mM each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A 4 mR A*2 0.33-0.58mg/ml -： ； 1議 は 15.00 .†'.50
S30FP-1G 8.0mg/ml 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8
R ase-free water - 17.54 7.54 5.04 2.54 0.04 反応条件 65で /90min
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
'2. ChiA A 4 mRNA溶液濃度： lOOO g/ml 反 液 total volume 30μ1
[0108] 7.2 細胞抽出液の好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応における S30FP-1Gの好適濃度を検討するため、表 22の試料 6〜10に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90 分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 22の各試料中の S30FP-1G濃 度は、 10. OmgZml (試料 6)、 12. OmgZml (試料 7)、 14. OmgZml (試料 8)、 1 6. OmgZml (試料 9)、 18. OmgZml (試料 10)である。図 31にウェスタンブロット法 による分析結果を示す。図 31において各レーンは表 22の各試料番号に対応してお り、レーン Cは分子量マーカーとしての E.coli由来の ChiA Δ 4を示す。図 31より、 S30F P-1Gの好適濃度は 12. 0-16. OmgZmlであることが分かった。
[0109] [表 22] 反応液組成 最終濃度 試料 6 7 8 9 10
1 .4M Mg(OAc)2 7.5mM 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16
6.0M NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2.2M Tris Acetate 56.2mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*' 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0 Phosphoenolp ravate 66m M 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 2mM each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A 4 mRNA*2 0.33mg/ml 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 10.0-18.0mg ml 7.20 匪 0 9.60 I 10.80
RNase-free water - 6.34 5.14 3.94 2.74 1.54 反応条件 65°C/90min
. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： lOOO g ml 反応液 to 1 volume 30μ1
[0110] 7.3 ChiA Δ 4の合成量の確認
前記「7.1 mRNAの好適濃度」と「7.2 細胞抽出液の好適濃度」の結果を受けて、 C hiA A 4mRNAを 0. 48mgZml、 S30FP- 1Gを 13. Omg/mlに設定して無細胞タンパ ク質翻訳反応を行なった。 ChiA A 4の合成量は、前記「4.7 反応温度の最適化の検 討」で説明したのと同様に活性測定により定量した。その結果、 ChiA Δ 4の合成量は 6. 2 g/mlであることが確認され、これまでに上記方法で定量した最大合成量 1. 0 μ gZml (図 9参照）に比べて 6倍以上の合成量が得られた。
[0111] 8.無細胞タンパク質翻訳系 4 (目的タンパク質の合成量増加に適した反応液各成分 の好適濃度の検討）
前記「6.無細胞タンパク質翻訳系 2 (目的タンパク質の合成量増加を目的とした細 胞抽出液の好適な調製方法) Jと「7.無細胞タンパク質翻訳系 3 (mRNAと細胞抽出 液にっ 、て、 目的タンパク質の合成量増加に適した濃度の検討)」で得られた結果を 踏まえて、さらに ChiA Δ 4の合成量を増加させるため、反応液各成分の好適濃度を 検討した。 [0112] 8.1 マグネシウムイオンの好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるマグネシウムイオンの好適濃度を検討するため、表 2 3に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間 無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 23の各試料中の Mg2+濃度は、 1. 87mM (試料 1)、 3. 73mM (試料 2)、 5. 60mM (試料 3)、 7. 47mM (試料 4)、 9. 33mM (試料 5)である。図 32にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 32に おいて各レーンは表 23の各試料番号に対応している。図 32より、マグネシウムイオン の好適濃度は 1. 87-3. 73mMであることが分かった。
[0113] [表 23]
Figure imgf000050_0001
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： lOOO g/ml 反応液 total volume 30μ1
8.2 ホスホェノールピルビン酸の好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるホスホェノールピルビン酸の好適濃度を検討するた め、表 24に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 24の各試料中の PEP濃度 は、 8. 33mM (試料 1)、 16. 7mM (試料 2)、 25. ImM (試料 3)、 33. 3mM (試料 4)である。図 33にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 33において各レー ンは表 24の各試料番号に対応している。図 33より、 PEPの好適濃度は 8. 33 ImMであることが分かった。
[0115] [表 24]
Figure imgf000051_0001
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： lOOO g/ml 反応液 total volume 30μ1
[0116] 8.3 アミノ酸の好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応における 20種のアミノ酸の好適濃度を検討するため、表 25に 示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細 胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 25の各試料中のアミノ酸濃度は、各 2. 4mM (試料 1)、各 2. OmM (試料 2)、各 1. 6mM (試料 3)、各 1. 2mM (試料 4)、 各 0. 8mM (試料 5)、各 0. 4mM (試料 6)である。図 34にウェスタンブロット法による 分析結果を示す。図 34において各レーンは表 25の各試料番号に対応している。図 34より、他のレーンに比べてレーン 1のパンドが特に大きいことから、アミノ酸の好適 濃度は約 2. 4mM eachであることが分かった。
[0117] [表 25] 反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6
1.4M Mg(OAc)2 7.5mM 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16
6.0M NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2.^ Tns Acetate 56.2mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0M Phosphoenolpyruvate 66mM 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 0.4 -2.4mM each 继' 1 09 0.87 0.65 θ|44 ：: ¾
ChiA A 4 mRNA*2 0.33mg ml 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 14.0mg/ml 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40
RNase-free water - 3.72 3.94 4.16 4.38 4.59 4.81 反応条件 65 :/90min
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ4 mRNA溶液濃度： lOOO g/ml 反応液 total volume 30μ1
[0118] 9.無細胞タンパク質翻訳系 5 (目的タンパク質の合成量増加を目的とした反応液各 成分の好適濃度の検討）
前記「6.無細胞タンパク質翻訳系 2 (目的タンパク質の合成量増加を目的とした細 胞抽出液の好適な調製方法)」、「7.無細胞タンパク質翻訳系 3 (mRNAと細胞抽出 液について、 目的タンパク質の合成量増加に適した濃度の検討)」および「8.無細胞 タンパク質翻訳系 4 (目的タンパク質の合成量増加に適した反応液各成分の好適濃 度の検討)」で得られた結果を踏まえて、さらに ChiA Δ 4の合成量を増加させるため、 反応液各成分の好適濃度を検討した。具体的には、表 26に示す反応液組成をべ一 スにして、各成分濃度を変化させて無細胞タンパク質翻訳反応を行ない、ウェスタン ブロット解析を行なった後、合成された ChiA Δ 4を、 Lumi Vision Analyzer (アイシン精 機)を用いて定量化することで各成分の好適濃度を検討した。
[0119] [表 26] 反応液組成 最終濃度
1.4M Mg(OAc)2 2.0mM
6崖 NH,(OAc) 80mM
6.0M K(OAc) lOOmM
2.2 Tns Acetate 56mM
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each
38mM ATP 1.2mM
1.0M Phosphoenolpyruvate 15mM
40% PEG8000 2.0%
20 Amino acids(55mM each) 2.0mM each
ChiA A4 mRNA*2 0.33mg ml
S30FP-1G 14mg ml
RNAsecure ' +
注：溶液混合量の単位は μΐ
反応液 total volume 30μ1
* 1 · GCU mix: GTP、 CTP and UTP
*2. ChiA Δ4 mR A溶液濃度： 250(^g/ml
*3. RNase inhibitor
[0120] 9.1 ホスホェノールピルビン酸の好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるホスホェノールピルビン酸の好適濃度を検討するた め、表 27に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 27の各試料中の PEP濃度 は、 OmM (試料 1)、 10mM (試料 2)、 20mM (試料 3)、 30mM (試料 4)である。図 3 5にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 35において各レーンは表 27の各 試料番号に対応している。また、図 36は、反応液中の PEP濃度と合成された ChiA Δ 4濃度との関係を示した図である。図 36より、 PEPの好適濃度は 2. 5〜25mMであり 、さらに好ましくは 5〜20mMであり、 10mM付近が最適であることが分かった。
[0121] [表 27] 反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4
0.1 M Mg(OAc)2 2.0mM 0.60 0.60 0.60 0.60
6.0M NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50
2.2M Tns Acetate 56mM 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95
1.0M Phosphoenolpyruvate 0-30mM 6*0ひ 0.60 tM
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 2.0mM each 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A 4 mRNA*2 0.33mg/ml 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 14mg/ml 8.40 8.40 8.40 8.40
R ase-free water - 4.50 3.90 3.30 2.70
反応条件 65。C/90min
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mRNA溶液濃度： lOOO g/ml 反応液 total volume 30μ1
[0122] 9.2 マグネシウムイオンの好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるマグネシウムイオンの好適濃度を検討するため、表 2 8に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで ： 90分間 無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 28の各試料中の Mg2+濃度は、 Om M (試料 1)、 1. OmM (試料 2)、 2. OmM (試料 3)、 3. OmM (試料 4)、 4. OmM (試 料 5)、 5. OmM (試料 6)、 6. OmM (試料 7)、 7. OmM (試料 8)、 8. OmM (試料 9) 、 9. OmM (試料 10)、 10. OmM (試料 11)である。図 37にウェスタンブロット法によ る分析結果を示す。図 37にお 、て各レーンは表 28の各試料番号に対応して ヽる。 また、図 38は、反応液中の Mg2+濃度と合成された ChiA Δ 4濃度との関係を示した図 である。図 38より、 Mg2+の好適濃度は 0. 5〜6mMであり、さらに好ましくは 2〜4m Mであり、 3mM付近が最適であることが分かった。
[0123] [表 28]
Figure imgf000055_0001
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ4 m NA溶液濃度： ΙΟΟΟμ^ηιΙ 汉 糸 total volume 30μ1
[0124] 9.3 アンモ-ゥムイオンの好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるアンモ-ゥムイオンの好適濃度を検討するため、表 2 9に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間 無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 29の各試料中の NH
4 +濃度は、 0 mM (試料 1)、 25mM (試料 2)、 50mM (試料 3)、 75mM (試料 4)、 lOOmM (試料 5)、 125mM (試料 6)である。図 39にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 39において各レーンは表 29の各試料番号に対応している。また、図 40は、反応液 中の NH +濃度と合成された ChiA Δ 4濃度との関係を示した図である。図 40より、 N
4
H +の好適濃度は 50〜120mMであり、さらに好ましくは 65〜： LOOmMであり、 75m
4
M付近が最適であることが分力つた。
[0125] [表 29]
反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6
0. lM Mg(OAc)2 3. OmM 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
3.0M NH4(OAc) 0-125mM 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
6.0M (OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
2.z Tns Acetate 56mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
0.5M Phosphoenolpyruvate 15mM 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 2mM each 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A 4 mRNA*2 0.33mg/ml 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 14mg/ml 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40
R ase-free water - 3.70 3.45 3.20 2.95 2.70 2.45 反応条件 65¾/90ηιϊη
* 1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 mR A溶液濃度： lOOO g/ml 反応系 total volume 30μ1
[0126] 9.4 アミノ酸の好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応における 20種のアミノ酸の好適濃度を検討するため、表 30に 示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 μ ΐとして、 65°Cで 90分間無細 胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 30の各試料中のアミノ酸濃度は、 OmM (試料 1)、 1. OmM (試料 2)、 2. OmM (試料 3)、 3. OmM (試料 4)、 4. OmM (試料 5)、 5. OmM (試料 6)、 6. OmM (試料 7)、 7. OmM (試料 8)である。図 41にウェス タンプロット法による分析結果を示す。図 41において各レーンは表 30の各試料番号 に対応している。また、図 42は、反応液中のアミノ酸濃度と合成された ChiA Δ 4濃度 との関係を示した図である。図 42より、アミノ酸の好適濃度は l〜7mMであり、さらに 好ましくは 2〜7mMであることが分かった。
[0127] [表 30]
Figure imgf000057_0001
"1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA A4 mRNA溶液濃度： lOOO g ml 反応系 total volume 30μ1
[0128] 9.5 ポリエチレングリコールの好適濃度
CWA Δ 4の合成反応におけるポリエチレングリコールの好適濃度を検討するため、 表 31に示す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90 分間無細胞タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 31の各試料中のポリエチレン グリコール濃度は、 0% (w/v) (試料 1)、 1. 0% (w/v) (試料 2)、 2. 0% (w/v) (試料 3 )、 3. 0% (w/v) (試料 4)、 4. 0% (w/v) (試料 5)、 5. 0% (w/v) (試料 6)、 6. 0% (w IN) (試料 7)である。図 43にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 43におい て各レーンは表 31の各試料番号に対応している。また、図 44は、反応液中のポリェ チレングリコール濃度と合成された ChiA A 4濃度との関係を示した図である。図 44よ り、ポリエチレングリコールの好適濃度は 0〜2. 5% (w/v)であり、 2% (w/v)付近が 最適であることが分力つた。
[0129] [表 31] 反応液組成 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6 7
0.1 M Mg(OAc)2 3. OmM 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
6.0M NH4(OAc) 80mM 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6崖 K(OAc) lOOmM 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 z.2M ins Acetate 56mM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
0.5M Phosphoenol pyruvate 15mM 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90
40% PEG8000 0-6.0% 0.?5 urn ： 3.W 細
20 Amino acids(55mM each) 2mM each 1.09 1,09 1.09 1.09 1.09 1.09 1.09
ChiA A4 mRNA*2 0.33mg/ml 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 1 mg/ml 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40
RNase-free water - 4.80 4.05 3.30 2.55 1.80 1.05 0.30 反応条件 65で /90min
M . GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA A 4 mRNA溶液濃度： 1000μ§/ιη1 反 ft、糸 total volume 30μ1
[0130] 9.6 カリウムイオンの好適濃度
ChiA Δ 4の合成反応におけるカリウムイオンの好適濃度を検討するため、表 32に示 す試薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細胞 タンパク質翻訳反応を行なった。なお、表 32の K+濃度は、 OmM (試料 1)、 50mM ( 試料 2)、 lOOmM (試料 3)、 150mM (試料 4)、 200mM (試料 5)、 250mM (試料 6 )、 300mM (試料 7)、 350mM (試料 8)、 400mM (試料 9)、 450mM (試料 10)、 5 OOmM (試料 11)である。図 45にウェスタンブロット法による分析結果を示す。図 45 において各レーンは表 32の各試料番号に対応している。また、図 46は、反応液中の K+濃度と合成された ChiA Δ 4濃度との関係を示した図である。図 46より、 K+の好適 濃度 ίま 100〜450mMであり、さら【こ好ましく ίま 170〜350mMであり、特【こ好ましく は 210〜320mMであり、 250mM付近が最適であることが分かった。
[0131] [表 32] 反応液組成 1 最終濃度 試料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
0.1M Mg(OAc)2 2.0mM 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60
6.0M H4(OAc) 80mM 0-40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40
6.0M K(OAc) 0-500m 025 0S& 0 75 誠 L25 1 50 1 75 ： ί :: z.2M Tns Acetate ！ 5omM 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77 0.77
GCU ix(88mM each)'1 ！ 0.85m each 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29 0.29
38mM ATP 1.2mM 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
0.5M Phosphoenolpyruvate lOmM 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60
40% PEG8000 2.0% 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50
20 Amino acids(55mM each) 3.0mM each 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1.64 1,64 1.64 1.64
ChiAi 4 mR A*2 0.33mg/ml 10.00 10,00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00 10.00
S30FP-1G 14mg ml 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40 8.40
R asc-frcc water ； - 3.85 3.60 3.35 3.10 2.85 2.60 2.35 2.10 1.85 1.60 1.35 反応条件 65""C/90min
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ΟιίΑ Δ4 mRNA溶液濃度： ΙΟΟΟμ^ηιΙ 反応系 total volume 30μΙ
[0132] 9.7 ChiA A 4の最大合成量
表 33は、前記「9.1 ホスホェノールピルビン酸について」〜「9.6 カリウムイオンに ついて」で得られた各成分の最適濃度をまとめたものである。そこで、表 33に示す試 薬，組成および終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 65°Cで 90分間無細胞タン パク質翻訳反応を行ない、 ChiA A 4の最大合成量がどの程度になるか検討した。結 果、 ChiA A 4の合成量は 65. 5 gZmlとなった。
[0133] [表 33]
反応液組成 最終濃度
1.4M Mg(OAc)2 3.0mM
6.0M N (OAc) 75mM
6.0M K(OAc) 250mM
2.2M Tris Acetate 56mM
GCU Mix(88mM each)*1 0.85mM each
38mM ATP 1.2mM
1.0M Phosphoenolpyruvate lOmM
40% PEG8000 2.0%(w/v)
20 Amino acids(55mM each) 3.0mM each
ChiA A4 mRNA*2 0.33mg/ml
S30FP-1G 14mg/ml
R Asecure一 +
注：溶液混合量の単位は μΐ
反応液 total volume 30μ1
*l. GCU mix: GTP, CTP and UTP
*2. ChiA Δ4 mR A溶液濃度： 2500 g/ml
*3. RNase inhibitor 10. A.pernix由来の細胞抽出液を用いた無細胞タンパク質翻訳系
10.1 菌体の培養と細胞抽出液の調製
人工海水（2. 2%NaCl、 l%MgCl · 6Η 0、 0. 14%CaCl · 2Η 0、 0. 37%Na
2 2 2 2
SO、 0. 063%KC1、 0. 018%NaHCO、 0. 009%KBr、 0. 0036 %NaB O - 1
4 3 4 7
OH 0、 0. 0013%SrCl、 0. 0003%NaF、 0. 0001%LiCl、 0. 000007%KI、 0
2 2
. 00000008%MnCl -4H 0、 0. 00000002%CoCl - 6H 0、 0. 0000008% A
2 2 2 2
1C1 - 6H 0、 0. 0000005%FeCl - 6H 0、 0. 00000002%Na W04- 2H 0、 0
3 2 3 2 2 2
. 000002% (NH ) 6Mo O -4H 0)、 0. 2%酵母エキス、 0. 4%卜リプトン及びチ
4 7 24 2
ォ硫酸ナトリウム 5水和物（Na S O · 5Η 0)からなる培地 300mlを ρΗ7. 0に調製後
2 2 3 2
、 500mlの坂口フラスコに入れシリコ栓を付け、オートクレーブ（121°C、 2atom、 20 分間）で滅菌処理を行なった。この培地に A.pernix K1株を接種し、坂口フラスコを 9 0°Cで約 38時間振盪培養を行なった (振盪速度 150回 Z分)。培養終了後の培養液 の吸光度（660nm)は 0. 656であった。以降の細胞抽出液の調製は、図 24の方法 に従って行った。得られた細胞抽出液のタンパク濃度は 13. 5mgZmlであった。
[0135] 10.2 無細胞タンパク質翻訳反応
A.pernix由来の細胞抽出液を用いて、表 34の試料 1〜5に示す試薬、組成および 終濃度で、反応液の全量を 30 1として、 60〜80°Cで 60分間無細胞タンパク質翻 訳反応を行なった。反応終了後、生成した Chi Δ 4の量を、蛍光基質を用いた活性測 定により定量した。その結果を図 47に示す。図 47より、表 34の試料 1〜5のすべてに つ!、て CWA Δ 4が合成され、その合成量は 60〜65°Cで最大となることがわかった（ 反応温度 65°Cの合成量： 1. 52mgZml)。以上のことより、 T.kodakaraensisとは別種 の超好熱菌を用いた場合においても、図 24と同様のプロトコールにより細胞抽出液 を調製すれば、高温での無細胞タンパク質翻訳系が確立できることが判明した。
[0136] [表 34]
Figure imgf000061_0001
*1. GCU mix: GTP、 CTP and UTP 注：溶液混合量の単位は μΐ
*2. ChiA Δ 4 m NA溶液濃度： lOOO g/ml 反応系 total volume 30μ1
*3. RNase inhibitor 産業上の利用可能性 本発明は、超好熱菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系中で、高 温条件下におけるタンパク質の製造方法として広く利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱菌由来 の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質翻訳系中で、 目的タンパク質をコードする mR NAの翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造する方法。
[2] 無細胞タンパク質翻訳系中に、 目的タンパク質をコードする mRNA、 Mg2+およびァ ミノ酸が含有されている、請求項 1に記載の方法。
[3] さらに NH +、 K+、ポリエチレングリコール、 ΑΤΡ再生系およびエネルギー源のうち
4
、少なくとも 1種以上の成分が含有されている、請求項 2に記載の方法。
[4] 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派生す る株由来のものである、請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[5] 目的タンパク質をコードする mRNA力 目的タンパク質をコードする塩基配列の上流 に配列番号 4に示すリボソーム結合配列を有する、請求項 1〜4のいずれかに記載の 方法。
[6] 無細胞タンパク質翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、無細胞 タンパク質翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパク質をコードする mRNA、 Mg2+およびアミノ酸が含有されている、前記 mRNAの翻訳を高温条件下で 行なわせてタンパク質を製造するためのキット。
[7] 無細胞タンパク質翻訳系中に、さらに NH +、 K+、ポリエチレングリコール、 ΑΤΡ再
4
生系およびエネルギー源のうち、少なくとも 1種以上の成分が含有されている、請求 項 6に記載のキット。
[8] 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派生す る株由来のものである、請求項 6または 7に記載のキット。
[9] 目的タンパク質をコードする mRNA力 目的タンパク質をコードする塩基配列の上流 に配列番号 4に示すリボソーム結合配列を有する、請求項 6〜8のいずれかに記載の やット。
[10] 無細胞タンパク質転写'翻訳系によりタンパク質を製造する方法であって、超好熱 菌由来の細胞抽出液を含む無細胞タンパク質転写，翻訳系中で、 目的タンパク質を コードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造 する方法。
[11] 無細胞タンパク質転写，翻訳系中に、 目的タンパク質をコードするプラスミド、 RNA ポリメラーゼ、 Mg2+およびアミノ酸が含有されている、請求項 10に記載の方法。
[12] RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、請求項 11に記載 の方法。
[13] 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派生す る株由来のものである、請求項 10〜 12の 、ずれかに記載の方法。
[14] 目的タンパク質をコードするプラスミド力 上流から順にプロモーター、配列番号 4 に示すリボソーム結合配列および目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、請求 項 10〜 13のいずれかに記載の方法。
[15] 目的タンパク質をコードするプラスミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせ るにあたり、転写温度を前記 RNAポリメラーゼの至適温度に設定するとともに、翻訳 温度を請求項 1〜9のいずれかに記載の無細胞タンパク質翻訳系の至適温度に設 定することを特徴とする、請求項 11〜14のいずれかに記載の方法。
[16] 無細胞タンパク質転写 ·翻訳系によりタンパク質を製造するためのキットであって、 無細胞タンパク質転写，翻訳系として、超好熱菌由来の細胞抽出液、 目的タンパク質 をコードするプラスミド、 RNAポリメラーゼ、 Mg2+およびアミノ酸を含有する、前記ブラ スミドの転写および翻訳を高温条件下で行なわせてタンパク質を製造するためのキッ
[17] RNAポリメラーゼが高温条件下で至適温度を有するものである、請求項 16に記載 のキット。
[18] 細胞抽出液力Thermococcus kodakaraensis KOD1株または該 KOD1株より派生す る株由来のものである、請求項 16または 17に記載のキット。
[19] 目的タンパク質をコードするプラスミド力 上流から順にプロモーター、配列番号 4 に示すリボソーム結合配列及び目的タンパク質をコードする塩基配列を含む、請求 項 16〜18のいずれかに記載のキット。
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