JP2020533018A - 改善されたインビトロ転写/翻訳(txtl)システムおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第62/544,228号(2017年8月11日出願、その全ての開示全体は、参考として本明細書に援用される)の優先権および利益を主張する。
本発明は、米国国防高等研究計画局(DARPA)により授与された契約番号W911NF17C0008、および米国国立衛生研究所(NIH)によって授与された助成金番号1R43AT00952201の下で政府の支援を得て行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本開示は、無細胞組成物およびその使用、特に、無細胞(インビトロ)転写および翻訳を行うための改善された組成物に関する。
合成生物学は、生物学的制御の根底にある基本的原則を読み解く有用なアプローチとして出現した。近年の努力から、多くのシステムおよびアプローチが生み出され、どのようにして生物学的機能を操作し、合成経路を効率的に最適化するかということについて相当な見識がもたらされてきた。
本明細書で開示されるのは、改善されたインビトロの転写/翻訳(TXTL)システムおよびその使用である。
本明細書で開示される改善されたインビトロ転写/翻訳(TXTL)システムは、DNAから細胞機能への情報の流れをより効率的に触媒し得る。このシステムは、生物工学および生物学的発見(biodiscovery)に関するその有用性を拡げることによって、先行するシステムを改善するものである。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるシステムおよび組成物は、その派生生物の転写プロセス構成要素と翻訳プロセス構成要素との間の相乗効果を促進するようにデザインされる。組成の改変は、任意の生物に由来するインビトロシステムに関して実行され得る。ある種の実施形態において、そのシステムは、派生生物の単離された遺伝子発現装置を含み得、これは、インビボ代謝、細胞調節システム、および内因性DNA発現という負荷から自由であり得る。このようなシステムは、遺伝子発現、遺伝子生成物のアセンブリおよび機能を迅速に観察するために使用され得る。遺伝子発現を促進するその能力のために、本明細書で開示されるシステムおよび組成物は、インビトロ発現についての、今まで異種発現を制限していた障害、生成者である生物の培養不能性およびカップリング効率の変動性を克服する。
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるある種の用語は、ここにまとめられる。別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
インビトロ転写および翻訳システムは、細胞の状況の外側で転写および翻訳を行い得るシステムである。いくつかの実施形態において、このシステムは、「無細胞システム」、「無細胞転写および翻訳」、「TX−TL」、「TXTL」、「溶解物システム」、「インビトロシステム」、「ITT」、または「人工細胞」ともいわれる。インビトロ転写および翻訳システムは、宿主から作製されない精製タンパク質システムであるか、または「溶解物」として形成される、宿主系統から作製される精製タンパク質システムのいずれかであり得る。当業者は、インビトロ転写および翻訳が転写および翻訳が起こることを必要とし、従って、精製された酵素との反応を包含しないことを認識する。
いくつかの実施形態において、化学的添加剤は、インビトロ転写および翻訳を改善するために添加され得る。理論に拘束されることは望まないが、これらの添加剤は、DNAテンプレートおよびmRNAの二次構造を低減することによって作用し、その無細胞溶解物における転写装置の安定性を増強し、翻訳装置の安定化/増強によってその無細胞溶解物におけるタンパク質翻訳を増強し、翻訳されたタンパク質の折りたたみを促進し、そして/または翻訳されたタンパク質を安定化し、そして/または翻訳されたタンパク質のタンパク質溶解を低減する、と考えられる。
いくつかの実施形態において、低伸長速度ポリメラーゼは、インビトロ転写および翻訳の収量を改善するために利用され得る。低伸長速度ポリメラーゼは、それらの本来の対応物より遅くmRNAを生成する。これは、その利用されるポリメラーゼがファージ(これは、歴史的には、TXTL反応における転写の供給源である(例えば、T7、SP6))に由来する場合に、特に関連する。次に、これらのポリメラーゼは、典型的には、非常に処理能力が高く、高伸長速度を有する。
いくつかの実施形態において、リボソームは、転写および翻訳のカップリングならびにタンパク質収量をさらに促進するように、そのTXTL反応に補充され得る。転写および翻訳は密接に結びついていることから、その2つの間には、特に溶解物ベースのシステム(他の特性の中でも増殖条件、採取条件、採取方法からミスマッチが起こり得る)では、不均衡が存在し得る。これらのミスマッチは、(Siegal−Gaskins, Tuza, Kim, Noireaux, & Murray, 2014)に示され参考として援用されるように、無細胞反応において観察され得る。このミスマッチを軽減するために、リボソームは、例えば精製された形態で、外因的に供給され得る。理論に拘束されることは望まないが、このようにすることで、転写および翻訳の不均衡が軽減され得、カップリング(ポリメラーゼに対する臨界質量(critical mass)のリボソームの相互作用を含む)が促進され得ると考えられる。いくつかの実施形態において、添加される外因性リボソームとともに、マグネシウムおよび必要に応じてATPもまた、約1:100〜1:10000の間のモル比(添加されるリボソーム濃度:マグネシウムおよび必要に応じてATP)で添加され得る。
ジメチルスルホキシド(DMSO)は、プライマーにおける二次構造形成を回避するためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)においてしばしば使用される試薬であり、従って、それは、PCR収量を増大させる。さらに、DMSOは、mRNAの変性を助けることも示されている。DMSOの効果は、転写の際にある。
E.coli TXTLシステムにおいてベタインは、いくつかの遺伝的エレメントの発現を助ける
図4では、本発明者らはまた、400mM ベタインが、この量がTXTLに対して毒性レベル未満であるが発現効果を提供するには十分高いことから、sigma70−mcjCの発現を改善するように助けたことを示す。ベタインが作用する機構は、DMSOがsigma70−mcjC発現を助けないことから、DMSOとは異なる。
本発明者らはまた、ベタインがE.coliでないStreptomyces coelicolor TXTLシステムにおいてさらなる遺伝子の発現を改善することを示す。S.coelicolor TXTLシステムを、(Li, Wang, Kwon, & Jewett, 2017)に従って調製し、ここで代わりに増殖用にISP2培地を使用し、冷やしたWash Buffer 1(10mM HEPES−KOH pH7.5、10mM グルタミン酸マグネシウム、1M グルタミン酸カリウム、1mM DTT)中で2回、Wash Buffer 2(50mM HEPES−KOH pH7.5、10mM グルタミン酸マグネシウム、50mM グルタミン酸カリウム、1mM DTT)中で1回、Wash Buffer 3(50mM HEPES−KOH pH7.5、10mM グルタミン酸マグネシウム、50mM グルタミン酸カリウム、1mM DTT、10%(v/v) グリセロール)中で1回洗浄し、そして12,000 psiでフレンチプレスを使用して溶解を行った。エネルギーソリューションは、(Sun et al., 2013)に由来する。その設定条件は、以下である:30% eSC3 S.coelicolor溶解物、34% エネルギーソリューション緩衝液、1% FloroTectTM、および1%の使用濃度での添加剤DMSO、400mMのベタイン、または添加剤なし(陰性コントロール)。29℃で8時間より長い発現の後に、本発明者らは、各反応物のうちの2μLをロードした4〜12% SDS−PAGEゲルを走らせ、FloroTectTM蛍光を検出する。図6左では、本発明者らは、15nMの直線状DNA MBP構築物バリアント(1350,配列番号7)の発現をS.coelicolor TXTLにおいて示し、これは、ベタインなしよりベタインありでより多くのタンパク質を生成する。比較のために、異なるMBPバリアントを発現するE.coli TXTL反応を、参照のために提供する。本発明者らはまた、プレートリーダーを使用してGFP発現を追跡するために、上記のように、しかしDMSOの代わりに0〜800mMのベタインを利用し、0.1mg/mlの使用濃度のT7 RNAPを含めてTXTL反応を行う。図6右では、本発明者らは、GFPを発現する6nMの直線状DNA(配列番号14および配列番号15で増幅したAddgene 40019の直線状バージョンであるが、配列番号12のT7プロモーター配列を利用する)がまた、400mMのベタイン濃度においてより多くのGFPを生成することを示す。これは、ベタインの効果が多数の無細胞システムにわたって一般化可能であることを示す。
T7 ポリメラーゼは、より高い転写物生成にも拘わらず、本来のポリメラーゼより少ないタンパク質を生成する
本発明者らは先ず、無細胞システムにおいてGFPを各々発現する、様々な強さのT7プロモーターのライブラリーを構築する。これらを、プラスミド(配列番号8)および直線状として、695:sigma70コントロールから、T7プロモーターバリアントとして、プラスミドおよび直線状として、688(配列番号9)、696(配列番号10)、697(配列番号11)、698(配列番号12)、699(配列番号13)まで番号付けする。ここで列挙している配列は、プロモーター領域を提供する。各プラスミドは、「GCAT」部位と「AAGC」部位との間の配列(配列番号8の1位〜69位)を、分子生物学の標準的な技術を使用してクローニングすることによって構築される。直線状DNAを、(Sun, Yeung, Hayes, Noireaux, & Murray, 2014)に記載され、参考として援用されるように、プライマー30810f(配列番号14)および30810r(配列番号15)を用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、プラスミドを生じる各ライゲーション生成物を増幅することによって作製する。
カップリングを促進するために、本発明者らは、転写速度と本来の翻訳速度とを適合させる低減した伸長速度を有するポリメラーゼを操作および/または供給する。
適切な低伸長速度ポリメラーゼを操作するために、本発明者らは、合理的デザインに依拠し得る。T7 RNAPという具体的な場合に、(Sousa et al., 1993)に記載され、参考として援用されるように、合理的変異は、酵素の活性部位において作製され、次いで、(Makarova et al., 1995)に記載されるように、伸長速度および処理性能に関してインビトロで試験される。さらに、各変異したT7 RNAPは、MBP−FlAsH、MBP、および他のFlAsHならびに非FlAsHタグ化遺伝子に関する高スループットなフォーマットで、本明細書で記載される方法において試験され得る。ここでその新たなT7 RNAPバリアントは、野生型コントロールに対して同様に試験される。本発明者らはさらに、指向性進化によってそのポリメラーゼを操作し得る。T7 RNAPの例で続けると、T7 RNAPは、(Esvelt et al., 2011)(参考として援用される)により、ファージを使う連続的進化法を使用して操作されることが示されている。より遅い伸長速度であるが、野生型に等しい処理性能に関する選択圧が適用され得、連続的進化法の多数のサイクルが所望の特性を有するT7 RNAPを生成するために行われ得る。例えば、(Renata et al., 2015)(参考として援用される)に記載されるような、他の指向性進化法が適用され得る。
リボソーム添加がTXTL反応を助けるかを示すために、本発明者らは、E.coli TXTLシステムへの精製70Sリボソームの添加を示す。本発明者らは、E.coli B株から精製したリボソーム(New England Biolabs, P0763S, 13.3μM)を利用する。これらのリボソームを、20mM HEPES−KOH pH7.6、10mM 酢酸Mg、30mM KCl、および7mM b−メルカプトエタノールの緩衝液中に貯蔵する。当業者は、その緩衝液が、TXTL反応へと大きな毒性効果を導入し得る(特に、E.coli TXTL反応の場合においてグリセロール)が、ここで列挙される化学物質は、内部試験および(Sun et al., 2014)(参考として援用される)におけるデータから、毒性でないことを認識する。発現を、(Sun et al., 2013)に記載される方法によって生成したE.coli TXTL eAC28およびbACn5と、0〜2μMの使用濃度のP0763S NEBリボソームおよび0〜2mMの使用濃度のグルタミン酸Mgとで行った。8nMのsigma70−GFPコントロールプラスミド(Addgene #40019)を供給し、発現を、12時間、蛍光によって動的に追跡した。ピーク翻訳速度を、各時点間の任意蛍光単位(afu)の傾きを得ることによって決定した(データを6分間隔で集めた)。ピーク翻訳速度は、観察された最高速度である。代表的には、その最高速度は、TXTL反応の早期に認められる。1分あたりのピーク翻訳速度をプロットする図11で示されるように、リボソームの増加(および相当するMg濃度の増加)とシグナルとの間には、添加リボソーム 0mMおよび添加したグルタミン酸Mg 0mMの場合を上回って、直接的な相関関係がある。これは、リボソームの追加が、タンパク質生成のピークを増大させ得、より良好な翻訳およびカップリングを促進し得ることを示す。ATPはまた、発現を改善するために、マグネシウムと等しいモル濃度で添加され得る。
参考文献
本開示は、とりわけ、無細胞システムおよびその使用を提供する。本開示の具体的な実施形態が考察されてきたが、上記の明細書は、例証であって限定ではない。本開示の多くのバリエーションは、本明細書を検討すれば当業者に明らかになる。本開示の全範囲は、請求項に加えてそれらの均等物の全範囲、および本明細書に加えてこのようなバリエーションへの言及によって決定されるべきである。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許および配列は、各個々の刊行物または特許が具体的にかつ個々に援用されることが示されるかのように、それらの全体において参考として援用される。
配列表:
Claims (16)
- インビトロ遺伝子発現のための組成物であって、
細菌、古細菌、植物または動物のような宿主細胞の1またはこれより多くに由来する処理された細胞溶解物;
遺伝子の転写および翻訳のための複数の補充物;
アデノシン三リン酸(ATP)を提供し再利用するためのエネルギー再利用システム;ならびに
極性非プロトン性溶媒、第四級アンモニウム塩、スルホン、エクトイン、グリコール、アミド、アミン、糖ポリマー、糖アルコール、低伸長速度RNAポリメラーゼ(RNAP)およびリボソームからなる群より選択される1またはこれより多くの外因性添加剤であって、ここで好ましくは該糖ポリマーおよび糖アルコールは、エネルギー源を提供するためではない、外因性添加剤、
を含む組成物。 - メタゲノム的に得られた遺伝子、経路を一緒に構成する複数の遺伝子、および/または合成タンパク質を発現することにおいて使用するための組成物であって、ここで好ましくは該経路は、天然生成物の合成のためにデザインされている、請求項1に記載の組成物。
- 前記遺伝子または経路は、インビトロ遺伝子発現のために最適化されていない、請求項2に記載の組成物。
- 前記複数の補充物は、マグネシウムおよびカリウムの塩、リボヌクレオチド、アミノ酸、出発エネルギー基質、およびpH緩衝化剤を含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記1またはこれより多くの添加剤は、核酸の二次構造を調節し、RNAPの処理性能および/もしくは安定性を改善し、RNAPの伸長速度に影響を及ぼし、リボソームのRNAPとの相乗効果および/もしくは安定性を改善し、そして/または合成中のポリペプチドの安定性を改善する、請求項1に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、前記宿主細胞と同種であり、RNA PolI、RNA PolII、RNA PolIII、および細菌RNAPなどである、、請求項1に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、前記宿主細胞に対して異種であり、SP6 RNAPバリアント、T7 RNAPバリアント、およびT3 RNAPバリアントなどである請求項1に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、好熱性生物または好低温性生物から供給される、請求項7に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、操作されたT7 RNAPバリアントおよび操作されたRNA PolIIバリアントのような合成RNAPである、請求項1に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、指向性進化および/または合理的デザインによって操作される、請求項9に記載の組成物。
- 前記低伸長速度RNAPは、精製されたタンパク質として、または前記低伸長速度RNAPをコードする核酸として提供される、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物において発現されるべき外因性核酸をさらに含み、ここで各外因性核酸は、前記低伸長速度RNAPによって認識されるプロモーターを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記リボソームは、前記宿主細胞から、または前記宿主細胞とは異なる生物から供給され、ここで好ましくは該リボソームは、0.1μM〜100μMの濃度において提供される、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物は、低伸長速度RNAPおよび外因性リボソームの両方を含み、ここで好ましくは該低伸長速度RNAPおよび該外因性リボソームはカップリングされ、必要に応じてこのようなカップリングは、前記宿主細胞に対して直交する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物を調製するための方法であって、該方法は、
前記処理された細胞溶解物、前記複数の補充物および前記エネルギー再利用システムを含むインビトロ転写/翻訳システムを提供する工程;ならびに
前記1またはこれより多くの外因性添加剤を供給する工程、
を包含する方法。 - インビトロ遺伝子発現の方法であって、該方法は、
請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物を提供する工程、ならびに
1またはこれより多くの発現されるべき核酸を提供する工程、
を包含する方法。
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