WO2010147111A1 - 無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 - Google Patents

無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法 Download PDF

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cell
free protein
solution
free
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幸寛 久寿米木
俊哉 川口
Original Assignee
トヨタ自動車株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a cell-free protein synthesis solution, also referred to as an in-vitro protein synthesis system, a cell-free protein synthesis kit, and a protein synthesis method for synthesizing a desired protein in a cell-free system (in-vitro).
  • a cell-free protein synthesis system (in-vitro protein synthesis system) is known as one of the techniques for protein synthesis.
  • a protein synthesis system is also known in which a gene encoding a desired protein is introduced into a living cell, and the protein synthesized in the cell or in the culture solution is separated and purified.
  • the latter protein synthesis system has a problem that it cannot synthesize proteins that inhibit the growth of the cells used.
  • the cell-free protein synthesis system has the advantage that even a protein that is toxic to living cells can be synthesized.
  • Patent Document 1 devises a method of maintaining an energy source in order to promote a cell-free protein synthesis reaction.
  • Patent Document 2 discloses a technique for changing a DNA (mRNA) sequence as a method for synthesizing a protein that is difficult to synthesize.
  • design is required for each protein, and there is a limit in versatility.
  • Patent Document 3 discloses a technique for increasing the amount of protein synthesis by including a large amount of template DNA in the reaction system, but this is not a technique that enables synthesis of difficult-to-synthesize proteins, It can be said that the effect of improving the amount of protein synthesis is also low.
  • JP 05-076381 Special Table 2006-508672 Publication JP 11-056363 A
  • the present invention provides a cell-free protein synthesis solution, a cell-free protein synthesis kit, and a protein with a low synthesis amount in a conventional cell-free protein synthesis system.
  • the object is to provide a protein synthesis method.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention contains one or more compounds among the compounds represented by the following structural formulas (I) to (V).
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention can have the same configuration as a conventionally known cell-free protein synthesis solution except that it contains the compound.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention is a composition containing one or more compounds among the compounds represented by the following structural formulas (I) to (V). Distinguishable from any solution called a synthetic system.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention includes a cell-free protein synthesis solution having protein synthesis ability and one or more compounds among the compounds represented by the following structural formulas (I) to (V). .
  • the compound may be mixed in advance with a cell-free protein synthesis solution.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention may contain a solution containing the above compound and a cell-free protein synthesis solution as independent solutions.
  • examples of the compound include one or more compounds selected from the group consisting of carnitine, sarcosine, and trimethylglycine.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention may further include an expression vector into which a gene encoding the protein to be synthesized can be introduced.
  • the method for synthesizing a protein according to the present invention comprises synthesizing a protein in a cell-free protein synthesis solution containing one or more compounds represented by the structural formulas (I) to (V) and having protein synthesis ability. Is what you do.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention contains one or more compounds among the compounds represented by the structural formulas (I) to (V).
  • a cell-free protein synthesis solution and a cell-free protein synthesis kit that can synthesize even a protein that has been difficult to synthesize in a conventional cell-free protein synthesis system and that can also improve the amount of protein synthesis. And a protein synthesis method can be provided.
  • the cell-free protein synthesis solution, the cell-free protein synthesis kit and the protein synthesis method according to the present invention it is possible to synthesize all kinds of proteins in large quantities without requiring complicated operations.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing the steps for constructing G.zeae-derived FDH (GzFDH) / pET23b (+).
  • FIG. 4 is a characteristic diagram showing the results of FDH synthesis performed in the presence or absence of betaine (trimethylglycine) in a commercially available cell-free protein synthesis reaction solution, and then the FDH activity was measured.
  • FDH synthesis was performed from the template cDNA in the presence or absence of different concentrations of betaine (trimethylglycine), and then the FDH activity was measured (bottom) and It is a characteristic view which shows the result (upper stage) of a Western blot.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention contains one or more compounds among the compounds represented by the following structural formulas (I) to (V).
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention includes a cell-free protein synthesis solution having protein synthesis ability and one or more compounds among the compounds represented by the following structural formulas (I) to (V). .
  • R 1 to R 3 are alkyl groups having 1 to 4, preferably 1 to 2, more preferably 1 carbon atoms. In particular, at least one of R 1 to R 3 is more preferably a methyl group.
  • R 4 is an amino acid side chain (excluding hydrogen).
  • R 4 is particularly preferably a glycine side chain, a serine side chain, a threonine side chain, an asparagine side chain, and a glutamine side chain. The reason is that the side chains of these amino acids are neutral and hydrophilic.
  • n in the structural formulas (I) and (IV) and n 1 and n 2 in the structural formula (II) is 1 to 4, preferably 1 to 2, and more preferably 1. If the value of n and the sum of n 1 and n 2 exceed the above range, it is difficult to dissolve in the cell-free protein synthesis solution.
  • the compounds represented by the above structural formulas (I) to (V) are present in a cell-free protein synthesis solution containing mRNA or cDNA encoding the protein to be synthesized, so that it is difficult to synthesize proteins that have been difficult to synthesize by conventional methods. And has the effect of improving the amount of protein synthesis.
  • examples of the compound represented by the structural formula (I) include trimethylglycine. Of these, trimethylglycine is preferably used as the compound represented by the structural formula (I).
  • Examples of the compound represented by the structural formula (II) include L-carnitine. Of these, L-carnitine is preferably used as the compound represented by the structural formula (II).
  • Examples of the compound represented by the structural formula (III) include trimethylserine, trimethylasparagine, trimethylthreonine, and trimethylglutamine.
  • Examples of the compound represented by the structural formula (IV) include sarcosine and the like. Among these, sarcosine is preferably used as the compound represented by the structural formula (IV).
  • the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above may be used singly or as a mixture of a plurality of types.
  • L-carnitine is preferably used as the compound represented by the structural formulas (I) to (V).
  • the amount of protein synthesis can be particularly remarkably improved.
  • Trimethylglycine contained in the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above is used in the reaction system when a GC-rich region is amplified by PCR (DNA polymerase reaction) as shown in US Pat. No. 5,545,539. When added, it is known to solve problems in annealing and extension reactions and prevent inaccurate amplification. However, the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above can contribute to protein synthesis in a cell-free protein synthesis system that is unrelated to the DNA polymerase reaction.
  • the concentration of the compounds represented by structural formulas (I) to (V) in the cell-free protein synthesis solution described later is not particularly limited, but can be, for example, 10 to 3000 mM, and preferably 100 to 2000 mM. 200 to 1000 mM is more preferable.
  • concentration of the compounds represented by structural formulas (I) to (V) is below the above range, it may be difficult to synthesize a protein that has been difficult to synthesize, or the amount of protein synthesis may not be improved.
  • the concentration of the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) exceeds the above range, workability due to a decrease in reactivity due to an inhibitory action on enzymes involved in protein synthesis or an increase in solution viscosity. There is a risk of inconvenience such as a decrease.
  • the cell-free protein synthesis solution means a solution capable of synthesizing the protein by adding mRNA or DNA of a gene encoding the protein to be synthesized.
  • the cell-free protein synthesis solution is not particularly limited, and any solution conventionally referred to as a cell-free protein synthesis system can be used.
  • cell-free protein synthesis systems use solutions in which nucleic acids, amino acids, energy sources, various ions, buffers and other additives are added to extracts of plants, bacteria, animal cells, insect cells, and the like.
  • the extract is an extract of plant tissue or plant cells, bacteria, animal cells, insect cells, or the like, and includes a protein synthesis mechanism such as ribosome.
  • the cell-free protein synthesis solution is meant to include an extract that can synthesize the protein by adding mRNA or DNA of a gene that encodes the protein of interest.
  • cell-free protein synthesis solution a cell-free protein synthesis solution prepared by a conventionally known method may be used, or a cell-free protein synthesis solution contained in a commercially available cell-free protein synthesis kit may be used.
  • the above extract is prepared.
  • cells typified by E. coli, plant seed germ, rabbit reticulocytes, insect-derived cells and the like are isolated and disrupted by a known technique. Thereafter, insoluble substances are removed by a technique such as centrifugation. Then, if necessary, endogenous DNA and RNA are decomposed by a known technique, and endogenous amino acids, nucleic acids, nucleosides and the like are removed by a technique such as dialysis, and pH and salt concentration are adjusted.
  • the obtained extract retains the ability to synthesize proteins containing ribosomes.
  • Escherichia coli the obtained extract may be referred to as an S30 extract.
  • Escherichia coli extracts are Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984) and the like.
  • a method for producing a wheat germ extract for example, Johnston, F. B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957), or Erickson, A. H. et al., (1996) Meth. In Enzymol ., 96, 38-50 etc. can be used.
  • the preparation method of the extract from a cell is not limited to the method mentioned above, Any method may be applied.
  • a cell-free protein synthesis solution can be prepared by adding components necessary for protein synthesis.
  • the components necessary for protein synthesis may be stored separately from the above extract and mixed at the time of use.
  • Components required for protein synthesis are not particularly limited, but include Tris-acetate, DTT, NTPs (ATP, CTP, GTP and UTP), RNA polymerase, phosphoenolpyruvate, pyruvate kinase, at least one amino acid (natural In addition to 20 types of amino acids, including their derivatives), polyethylene glycol (PEG), folic acid, cAMP, tRNA, ammonium acetate, potassium acetate, potassium glutamate, and magnesium acetate at the optimum concentration.
  • NTPs ATP, CTP, GTP, and UTP
  • RNA polymerase that are raw materials for mRNA are not required when protein synthesis is performed from separately prepared mRNA.
  • preservatives and other components may be included in addition to the components listed above.
  • a cell-free protein synthesis solution contained in a commercially available cell-free protein synthesis kit can also be used.
  • Examples of commercially available cell-free protein synthesis kits include TNTTT7 Insect Cell Extract Protein Expression System, TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems, TnT Coupled Wheat Germ Extract Systems, E. coli T7 S30 Exir System. Examples include coli S30 Extract System for Circular DNA and E. coli S30 Extract Sysytem for Linear Templates.
  • Examples of commercially available cell-free protein synthesis solutions include RTS® 500® Rapid® Translation System manufactured by Roche.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention includes the above-mentioned components except that it contains one or more compounds among the compounds represented by the structural formulas (I) to (V).
  • the composition can be the same as that of the cell protein synthesis solution.
  • the cell-free protein synthesis solution according to the present invention contains one or more compounds among the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above, so that it is difficult to synthesize in the above-described conventionally known cell-free protein synthesis solutions. It is possible to synthesize the protein.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention includes the above-described cell-free protein synthesis solution and one or more compounds among the compounds represented by the structural formulas (I) to (V).
  • the compound is added in advance to a solution (cell-free protein synthesis solution) conventionally referred to as a cell-free protein synthesis system described above (the cell-free protein synthesis solution according to the present invention described above). Or may be separately prepared so that the compound is added to the cell-free protein synthesis solution when used.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention means a kit comprising one or more solutions containing the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above and provided as an article.
  • the above-described cell-free protein synthesis solution may be a solution in which the above-described extract and the above-described components necessary for protein synthesis are mixed in advance. Or the component required for the protein synthesis mentioned above may be prepared separately so that it may mix with the extract mentioned above, when using. That is, the cell-free protein synthesis kit according to the present invention includes at least one compound among the above-described extract, the above-described components necessary for protein synthesis, and the above-described structural formulas (I) to (V). Are separately provided separately.
  • the protein for synthesis is not limited at all, and any protein may be used.
  • a protein that could not be synthesized by a conventional cell-free protein synthesis system can be synthesized.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention may be one in which a gene encoding a protein to be synthesized is added as DNA, or the gene may be added as mRNA.
  • the cell-free protein synthesis solution needs to have not only translation ability but also transcription ability, that is, a mechanism for synthesizing mRNA from the DNA.
  • transcription ability is not required as long as it has translation ability.
  • the cell-free protein synthesis kit according to the present invention may be provided with an expression vector for incorporating a DNA encoding a protein to be synthesized.
  • the expression vector is preferably one that functions in the cell from which the cell-free protein synthesis solution is derived. That is, when a cell-free protein synthesis solution is prepared from E. coli, any expression vector known to function in E. coli can be used. The same applies when plants, animal cells or insect cells are used.
  • a target protein is synthesized using the cell-free protein synthesis kit according to the present invention, one or more compounds among the compounds represented by the structural formulas (I) to (V) described above, a cell-free protein synthesis solution, After mixing with the DNA and / or mRNA encoding the protein, the incubation is not particularly limited, but it is usually incubated at a temperature of about 10 to 40 ° C, preferably about 30 to 37 ° C.
  • the synthesis time by incubation is not particularly limited, but is usually about 30 minutes to 24 hours. In addition, you may incubate, stirring and shaking.
  • the cell-free protein synthesis kit of the present invention it becomes possible to synthesize proteins that could not be synthesized in the conventional cell-free protein synthesis system, and when the conventional cell-free protein synthesis system is used A large amount of protein can be synthesized.
  • Example 1 when a formate dehydrogenase gene derived from Gibberella zeae was expressed in a cell-free protein synthesis system, the effect of promoting protein synthesis by a predetermined compound was examined.
  • KPB -Potassium phosphate buffer
  • KOD-Plus- KOD-Plus-Polymerase [1U / ⁇ l] (TOYOBO) 25 mM MgSO 4 , 2 mM dNTP, 10 ⁇ Buffer ⁇ Pfx Platinum Polymerase [2.5U / ⁇ l] (Invitrogen) 10Xbuffer, 10Xenhancer, 2.5mM dNTP, 50mM MgSO 4 ⁇ Pyrobest DNA polymerase (Takara Bio) ⁇ Triton X-100 ⁇ 100mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP (manufactured by Takara Bio Inc.) ⁇ RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN) ⁇ RNA PCR Kit (Takara Bio) ⁇ MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN) ⁇ MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) DH 2 O: DNase / RNase Free Distilled Water (Invitrogen) ⁇ Restriction enzyme
  • LB (Cm) liquid medium total composition is 48.3ml and the following composition
  • LB liquid medium LB Broth (Difco) 20g / l) 48ml 34 mg / ml chloramphenicol 28.16 ⁇ l
  • Growth medium for main culture
  • total composition total composition as 1L, composition below
  • Yeast extract 10g dH 2 O (added so that the solution is 1 L) 20 ⁇ g / ml chloramphenicol
  • 24 ml of 25% (W / V) glucose and 600 ⁇ l of 15 mg / ml thiamine were added.
  • a cDNA synthesis reaction was performed in a reaction cycle of 50 ° C. for 2 hours, then 99 ° C. for 5 minutes, and then 4 ° C.
  • PCR was performed using the synthesized cDNA as a template and Pyrobest DNA polymerase.
  • the component composition in 50 ⁇ l of the reaction solution is shown in Table 2.
  • the transcription reaction was performed at 37 ° C. for 3 hours. Thereafter, 1 ⁇ l of TURBO DNase was added to the reaction solution and maintained at 37 ° C. for 15 minutes. Thereafter, 9 ⁇ l of dH 2 O and 30 ⁇ l of Lithium chloride precipitation solution were added and maintained at ⁇ 20 ° C. for 30 minutes. Thereafter, centrifugation was performed at 13000 ⁇ G for 15 minutes, and the supernatant was removed. The precipitate was rinsed with 70% ethanol and then dissolved in 20 ⁇ l of dH 2 O.
  • E. coli S30 fraction The preculture expression plasmid pG-KJE8 was introduced into E. coli BL21 (DE3) star strain.
  • the transformed E. coli was single colonized on an LB (Cm) plate, cultured in LB (Cm) liquid medium (150 ml / 500 ml flask), and then stored as a glycerol stock at ⁇ 80 ° C.
  • 88 ⁇ l of 34 mg / ml chloramphenicol was added, and then cultured at 37 ° C. overnight with shaking (130 rpm).
  • the main culture preculture 30ml was added to the Growth Medium 600 ml, (until A600 ⁇ 1.5) 37 °C for 3.5 h and incubated with shaking (130 rpm). Thereafter, IPTG for T7 RNA polymerase induction was added (per 600 ml / 2 L flask). Thereafter, 600 ⁇ l of 5 ⁇ g / ml tetracycline (final concentration 5 ng / ml) and 600 ⁇ l of 500 mg / ml L-arabinose (final concentration 500 ⁇ g / ml) were added (per 600 ml / 2 L flask) as chaperone induction reagents. Then, the cells were cultured at 30 ° C. for 1.5 hours (until A600 ⁇ 3 to 4) with shaking (130 rpm).
  • the culture solution was transferred to a 250 ml centrifuge tube, and the supernatant was removed by centrifugation (7000 rpm, 7 minutes, 4 ° C.) (BECKMAN JA-14).
  • the cells were suspended in 10 ml of Wash Buffer, and then the supernatant was removed by centrifugation (7000 rpm, 7 minutes, 4 ° C.) (BECKMAN JA-14).
  • a large amount of 10 g of disrupted bacteria was suspended in 9 ml of Lysis Buffer, and transferred to a disruption tube (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.).
  • a disruption tube manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.
  • 19 g of glass beads manufactured by Yasui Instruments Co., Ltd.
  • the cells were crushed by a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Instruments Co., Ltd., four cycles with On 60 seconds ⁇ Off 60 seconds as one cycle).
  • a dialysis membrane for preparing the S30 fraction by dialysis was prepared as follows. First, a dialysis membrane of about 15 cm was prepared for 10 ml of the S30 fraction (S30 fraction liquid volume [ml] + about 5 cm). The dialysis membrane soaked in dH 2 O in a range was boiled and stirred with a stirrer (more than 2 hours). Then, it was put in a Dialysis Buffer and stirred with a stirrer (more than 5 minutes).
  • Dialysis was performed as follows. First, 500 ml of Dialysis Buffer was placed in a 1 L plastic beaker, and the S30 fraction was placed in the dialysis membrane up to about the 7th minute and closed with a special clip. Thereafter, the mixture was stirred with a stirrer at 4 ° C. for 45 minutes (speed at which the dialysis membrane slowly rotated). afterwards, Dialysis Buffer 500 ml was replaced and collected in a 50 ml Corning tube. Then, after centrifugation (6900 rpm, 10 minutes, 4 ° C.) (BECKMAN JA-12), the supernatant was collected, dispensed 1 ml at a time, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • Transcend tRNA Promega was added to the reaction composition described above, and a translation reaction (or transcription / translation coupling reaction) was performed. 2 ⁇ l of the translation reaction solution was subjected to SDS-PAGE (reduction), and the synthesized product was detected by a blotting method using “Transcend® Non-Reactiove® Translation® Detection” System. The amount of synthesis was quantified with SigmaScanPro.
  • the yellow formazan can be quantified by measuring the absorbance at 430 nm with a plate reader (Spectrafluor Plus: manufactured by TECAN), and the FDH activity expressed in the cell-free protein synthesis system, that is, the synthesis amount of FDH can be evaluated.
  • results of SDS-PAGE in 3-4-2 performed using the template DNA prepared in 3-1 are shown in the upper part of FIG. 3, and the results of FDH activity measurement are shown in the lower part of FIG. Moreover, the result of having measured the protein synthesis amount from the result of SDS-PAGE is shown in FIG. In FIG. 4, the amount of protein synthesis is shown as a relative value where the amount of synthesis when trimethylglycine is not added is 1.
  • the FDH activity measurement results in 3-4-2 performed using the template mRNA prepared in 3-2 are shown in the upper part of FIG. 5, and the results of SDS-PAGE are shown in the lower part of FIG. Moreover, the result of having measured the protein synthesis amount from the result of SDS-PAGE is shown in FIG. In FIG. 6, the amount of protein synthesis is shown as a relative value where the amount of synthesis when trimethylglycine is not added is 1.
  • trimethylglycine has an effect of improving the translation efficiency of the gene encoding the target protein in the cell-free protein synthesis system.

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Abstract

　従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質についても合成することができ、且つ、タンパク質の合成量を向上させる。　特定の化合物、例えばトリメチルグリシン、L-カルニチン及びサルコシン等の化合物を含む無細胞タンパク質合成溶液において、無細胞タンパク質合成を行う。

Description

無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法
　本発明は、in vitroタンパク質合成系とも称される無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及び所望のタンパク質を無細胞系（in vitro）で合成するタンパク質合成方法に関する。
　従来、タンパク質を合成する技術の一つとして無細胞タンパク質合成系（in vitroタンパク質合成系）が知られている。一方、生細胞に所望のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、細胞内或いは培養液中に合成されたタンパク質を分離精製するタンパク質合成系も知られている。ところが、後者のタンパク質合成系においては、使用する細胞の生育を阻害するタンパク質等の合成ができないといった問題がある。これに対して、無細胞タンパク質合成系では、生細胞に対して毒性を有するようなタンパク質であっても合成することができるといった利点がある。
　しかしながら、無細胞タンパク質合成系においても、合成することが困難なタンパク質、十分な合成量が得られないタンパク質があることが知られている。特許文献１には、無細胞タンパク質合成反応を促進するためにエネルギー源を維持する方法が考案されているが、合成困難なタンパク質については必ずしも奏功するとは限らない。合成困難なタンパク質を合成するための方法として特許文献２には、DNA（mRNA）配列を変更する技術が開示されるが、タンパク質ごとに設計が必要となり汎用性の面では限界がある。また特許文献３には、反応系に鋳型DNA量を多く含ませることで、タンパク質の合成量を増やす技術が開示されているが、合成困難なタンパク質について合成を可能とする技術ではなく、また、タンパク質の合成量の向上効果も低いと言える。
特開平05-076381号公報 特表2006-508672号公報 特開平11-056363号公報
　以上のように、無細胞タンパク質合成系において、十分なタンパク質合成量を達成できるような技術は知られていなかった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、従来の無細胞タンパク質合成系において合成量が低いタンパク質について、その合成量を向上させることができる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法を提供することを目的としている。
　上述した目的を達成するため、本発明者が鋭意検討した結果、タンパク質の合成量を顕著に向上させることができる化合物群を見いだし、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含むものである。本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、当該化合物を含む以外は従来公知の無細胞タンパク質合成溶液と同様の構成とすることができる。なお、本明細書において、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液という場合、下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含む組成であり、従来、無細胞タンパク質合成系と称される如何なる溶液とも区別される。
　一方、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　本発明に係る無細胞タンパク質合成キットにおいて、上記化合物は、無細胞タンパク質合成溶液に予め混合されていてもよい。また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、上記化合物を含む溶液と、無細胞タンパク質合成溶液とそれぞれ独立した溶液として含んでいてもよい。
　本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液及び無細胞タンパク質合成キットにおいて、上記化合物としては、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物を挙げることができる。
　また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成対象のタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる発現ベクターをさらに含むものであってもよい。
　一方、本発明に係るタンパク質の合成方法は、上記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含み、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液中でタンパク質合成を行うものである。
　また、本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含んでいる。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-142368号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質でも合成することができ、且つ、タンパク質の合成量も向上させることができる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法を提供することができる。本発明にかかる無細胞タンパク質合成溶液、無細胞タンパク質合成キット及びタンパク質合成方法によれば、煩雑な操作を必要とせず、あらゆる種類のタンパク質を大量に合成することができる。
G.zeae由来FDH(GzFDH)/pET23b(+)の構築の工程を示す模式図である。 市販の無細胞タンパク質合成反応液において、ベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下でFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果を示す特性図である。 大腸菌由来S30画分を用いた無細胞タンパク質合成反応液において、異なる濃度のベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下で鋳型cDNAからFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果（下段）及びウェスタンブロットの結果（上段）を示す特性図である。 図３に示したウェスタンブロットの結果を用いてFDH合成量を定量した結果を示す特性図である。 大腸菌由来S30画分を用いた無細胞タンパク質合成キットにおいて、異なる濃度のベタイン（トリメチルグリシン）の存在若しくは非存在下で鋳型mRNAからFDH合成を行い、その後FDH活性を測定した結果（上段）及びウェスタンブロットの結果（下段）を示す特性図である。 図５に示したウェスタンブロットの結果を用いてFDH合成量を定量した結果を示す特性図である。 トリメチルグリシン、L-カルニチン、サルコシン及びコリンについてタンパク質合成促進能を比較した結果を示す特性図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
構造式(I)～(V)で示される化合物
　本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含んでいる。また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　ここで、上記構造式(I)～(V)においてR1～R3は炭素数１～４、好ましくは１～２、より好ましくは１のアルキル基である。特にR1～R3のうち少なくとも１つがメチル基であることがより好ましい。また、上記構造式(III)及び(V)においてR4はアミノ酸の側鎖（水素を除く）である。R4としては、特に、グリシンの側鎖、セリンの側鎖、スレオニンの側鎖、アスパラギンの側鎖及びグルタミンの側鎖であることが好ましい。その理由は、これらアミノ酸の側鎖は中性且つ親水性であるからである。
　また、上記構造式(I)及び(IV)におけるｎ並びに上記構造式(II)におけるn1とn2の和は１～４、好ましくは１～２、より好ましくは１である。ｎの値及びn1とn2の和が上記範囲を上回ると無細胞タンパク質合成溶液中へ溶解しがたくなり好ましくない。
　上記構造式(I)～(V)で示される化合物は、合成対象のタンパク質をコードするmRNA若しくはcDNAを含む無細胞タンパク質合成溶液に存在することで、従来方法では合成困難であったタンパク質の合成を可能とし、且つ、タンパク質の合成量を向上させるといった効果を奏する。
　ここで、上記構造式(I)に示される化合物としては、トリメチルグリシン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(I)で示される化合物としてはトリメチルグリシンを使用することが好ましい。
　上記構造式(II)に示される化合物としては、L-カルニチン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(II)で示される化合物としてはL-カルニチンを使用することが好ましい。
　上記構造式(III)に示される化合物としては、トリメチルセリン、トリメチルアスパラギン、トリメチルスレオニン及びトリメチルグルタミン等を挙げることができる。
　上記構造式(IV)に示される化合物としては、サルコシン等を挙げることができる。なかでも、上記構造式(IV)で示される化合物としてはサルコシンを使用することが好ましい。
　また、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物は、単独で使用されても良いし、複数種類を混合して使用しても良い。特に、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物としては、L-カルニチンを使用することが好ましい。L-カルニチンを使用した場合には、タンパク質の合成量を特に顕著に向上させることができる。
　なお、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物に含まれるトリメチルグリシンは、US 5,545,539に示されるように、GCリッチの領域をPCR（DNAポリメラーゼ反応）によって増幅する際に反応系に添加されると、アニールや伸長反応における問題を解決して不正確な増幅を防止することが知られている。しかしながら、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物は、DNAポリメラーゼ反応とは無関係である無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成に貢献することができる。特に、合成対象のタンパク質をコードするmRNAをタンパク質合成溶液に添加してタンパク質合成を行う場合（すなわち、転写反応を行わない系）であっても、合成困難であったタンパク質の合成を可能とし、且つ、タンパク質の合成量を向上させるといった効果を奏する。
　また、後述する無細胞タンパク質合成溶液における、構造式(I)～(V)に示す化合物の濃度は、特に限定されないが、例えば10～3000mMとすることができ、100～2000mMとすることが好ましく、200～1000mMとすることがより好ましい。構造式(I)～(V)に示す化合物の濃度が上記範囲を下回る場合には、合成困難であったタンパク質の合成が困難となるか、又は、タンパク質の合成量を向上できない虞がある。また、構造式(I)～(V)に示す化合物の濃度が上記範囲を上回る場合には、タンパク質合成に関与する酵素群への阻害作用による反応性の低下や溶液粘度の上昇による作業性の低下といった不都合が生じる虞がある。
無細胞タンパク質合成溶液
　無細胞タンパク質合成溶液とは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子のmRNAやDNAを加えることで、当該タンパク質を合成することができる溶液を意味する。本発明において、無細胞タンパク質合成溶液としては、特に限定されず、従来、無細胞タンパク質合成系と称される如何なる溶液でも使用することができる。一般に、無細胞タンパク質合成系は、植物、細菌、動物細胞若しくは昆虫細胞等の抽出液に、核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液及びその他の添加剤を加えた溶液が使用されている。特に抽出液としては、植物組織若しくは植物細胞、細菌、動物細胞若しくは昆虫細胞等の抽出液であって、リボソーム等のタンパク質合成機構を含む抽出液である。換言すれば、無細胞タンパク質合成溶液とは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子のmRNA若しくはDNAを添加することで、当該タンパク質を合成できる抽出液を含む意味である。
　無細胞タンパク質合成溶液は、従来公知の手法によって調製したものを使用しても良いし、市販の無細胞タンパク質合成キットに含まれる無細胞タンパク質合成溶液を使用しても良い。
　無細胞タンパク質合成溶液を作製する際には、例えば、先ず上記抽出液を準備する。抽出液を得るには、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球、昆虫由来細胞等に代表される細胞を単離し、これを公知の手法によって破砕する。その後、遠心分離等の手法によって不溶物質を除去する。そして、必要に応じて内在性のDNA及びRNAを公知の手法によって分解し、透析等の手法によって内在性のアミノ酸、核酸、ヌクレオシド等を除去したり、pHや塩濃度を調整したりする。得られた抽出液は、リボソームを含むタンパク質合成能を保持している。なお、大腸菌を使用した場合、得られた抽出液はS30抽出物と称される場合もある。
　なお、具体的には大腸菌の抽出液は、Pratt, J. M. et al., Transcription and Translation, Hames, 179-209, B. D. & Higgins, S. J., eds, IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。コムギ胚芽抽出液の作製法としては、例えばJohnston, F. B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957)、あるいはErickson, A. H. et al., (1996) Meth. In Enzymol., 96, 38-50等に記載の方法を用いることができる。なお、細胞からの抽出液の作製方法は、上述した手法に限定されず、如何なる手法を適用しても良い。
　上述のように抽出液を準備した後、タンパク質合成に必要な成分を添加することで無細胞タンパク質合成溶液を調製することができる。なお、タンパク質合成に必要な成分は、上記抽出液と別に保存しておき、使用の際に混合しても良い。タンパク質合成に必要な成分としては、特に限定されないが、Tris-酢酸、DTT、NTPs（ATP、CTP、GTP及びUTP）、RNAポリメラーゼ、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ、少なくとも一種のアミノ酸（天然の２０種類のアミノ酸の外それらの誘導体を含む）、ポリエチレングリコール（PEG）、葉酸、cAMP、tRNA、酢酸アンモニウム、酢酸カリウム、グルタミン酸カリウム及び至適濃度の酢酸マグネシウム等を挙げることができる。なお、別途準備したmRNAからタンパク質の合成を行う場合、mRNAの原料となるNTPs（ATP、CTP、GTP及びUTP）やRNAポリメラーゼは必要ないことに留意する。なお、タンパク質合成に必要な成分としては、上記で列挙した成分以外にも防腐剤やその他の成分が含まれていても良い。
　一方、市販の無細胞タンパク質合成キットに含まれる無細胞タンパク質合成溶液を使用することもできる。市販の無細胞タンパク質合成キットとしては、例えばPromega社製のTNT T7 Insect Cell Extract Protein Expression System、TNT Coupled Reticulocyte Lysate Systems、TnT Coupled Wheat Germ Extract Systems、E. coli T7 S30 Extract System for Circular DNA、E. coli S30 Extract System for Circular DNA、E. coli S30 Extract Sysytem for Linear Templates等を挙げることができる。また、市販の無細胞タンパク質合成溶液としては、例えばRoche社製のRTS 500 Rapid Translation System等を挙げることができる。
無細胞タンパク質合成溶液、キット及びタンパク質合成方法
　本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物のうち１以上の化合物を含む以外は、上述した無細胞タンパク質合成溶液と同様な組成とすることができる。本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液は、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物のうち１以上の化合物を含むことで、上述した従来公知の無細胞タンパク質合成溶液において合成困難であったタンパク質を合成することができる。
　また、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、上述した無細胞タンパク質合成溶液と上述した構造式(I)～(V)に示す化合物のうち１以上の化合物とを含んでいる。無細胞タンパク質合成キットにおいて、当該化合物は、上述した従来、無細胞タンパク質合成系と称される溶液（無細胞タンパク質合成溶液）に予め添加された状態（上述した本発明に係る無細胞タンパク質合成溶液と同義）であっても良いし、使用する際に当該化合物を無細胞タンパク質合成溶液に添加するように別途準備されていても良い。すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットとは、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物を含む１以上の溶液から構成され、物品として提供されるものを意味する。
　また、無細胞タンパク質合成キットにおいて、上述した無細胞タンパク質合成溶液は、上述した抽出液と、上述したタンパク質合成に必要な成分とを予め混合した溶液としても良い。若しくは、上述したタンパク質合成に必要な成分は、使用する際に上述した抽出液と混合するように別途準備されていても良い。すなわち、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットには、上述した抽出液と、上述したタンパク質合成に必要な成分と、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物のうち１以上の化合物とが別途独立して提供される形態も含まれる。
　合成目的のタンパク質としては、なんら限定されず、いかなるタンパク質であっても良い。特に、従来の無細胞タンパク質合成系において合成困難であったタンパク質を合成対象とすることが好ましい。例えば、ステムループ等の二次構造を形成するために、従来の無細胞タンパク質合成系では合成できなかったタンパク質を合成対象とすることができる。
　本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成目的のタンパク質をコードする遺伝子をDNAとして添加するものであっても良いし、当該遺伝子をmRNAとして添加するものであっても良い。
　当該遺伝子をDNAとして添加する場合には、無細胞タンパク質合成溶液は翻訳能のみならず転写能、すなわち当該DNAからmRNAを合成するための機構を保持している必要がある。一方、当該遺伝子をmRNAとして添加する場合には、転写能は必要ではなく翻訳能を有していれば良い。
　なお、本発明に係る無細胞タンパク質合成キットは、合成目的のタンパク質をコードするDNAを組み込むための発現ベクターを備えるものであっても良い。発現ベクターとしては、無細胞タンパク質合成溶液が由来する細胞において機能するものが好ましい。すなわち、大腸菌から無細胞タンパク質合成溶液を調製した場合、大腸菌において機能することが知られているあらゆる発現ベクターを使用することができる。植物、動物細胞又は昆虫細胞を使用した場合も同様である。
　本発明に係る無細胞系タンパク質合成キットを使用して目的タンパク質を合成する際には、上述した構造式(I)～(V)に示す化合物のうち１以上の化合物と無細胞タンパク質合成溶液と当該タンパク質をコードするDNA及び/又はmRNAと混合した後、特に限定されないが、通常、１０～４０℃程度、好ましくは３０℃～３７℃程度の温度下でインキュベートする。インキュベートによる合成時間は、特に限定されないが、通常、３０分～２４時間程度とする。なお、攪拌や振とうしながらインキュベートしてもよい。
　本発明に係る無細胞タンパク質合成キットによれば、従来の無細胞タンパク質合成系において合成することができなかったタンパク質を合成することが可能となり、また、従来の無細胞タンパク質合成系を使用した場合と比較して大量のタンパク質を合成することができる。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
　本実施例では、ジベレラ菌（Gibberella zeae）由来のギ酸脱水素酵素遺伝子を無細胞タンパク質合成系で発現させる際に、所定の化合物によるタンパク質合成促進効果を検討した。
（１）試薬
　試薬は、特に記載の無い場合ナカライテスク社製を使用した。
・リン酸カリウム緩衝液（KPB） pH7.5
　　＜SolutionA＞0.5M　KH2PO4　13.6g/200ml
　　＜SolutionB＞0.5M　K2HPO4　26.13g/300ml
　　0.5M KPB pH7.5は16mlのSolutionAと84mlのSolutionBを混合した。
・Expressway Plus expression system（Invitrogen社製）
・1.62M ギ酸ナトリウム（ギ酸Na）
　　5.5g/50ml 0.5M KPB pH7.5
・16.2mM NAD
　　581mg/50mlとなるように0.5M KPB pH7.5に溶解した。
・mPMS（DOJINDO社製）　methoxy PMS 0.5mg/ml
・WST1（DOJINDO社製）　8mg/ml
・PD培地
　　Potato dextrose broth(Difco社製) 24g/L。pH7に調整後オートクレーブして使用した。
・100mM MgCl2
　　MgCl2・6H2O 2.03g/100ml。オートクレーブして使用した。
・KOD-Plus-：KOD-Plus-Polymerase [1U/μl]（TOYOBO社製）
　　25mM MgSO4、2mM dNTP、10×Buffer
・Pfx Platinum Polymerase [2.5U/μl](Invitrogen社製)
　　10Xbuffer、10Xenhancer、2.5mM dNTP、50mM MgSO4
・Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）
・Triton X-100
・100mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP（タカラバイオ社製）
・RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）
・RNA PCR Kit（タカラバイオ社製）
・MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）
・MinElute PCR Purification Kit（QIAGEN社製）
・dH2O：DNase/RNase Free Distilled Water(Invitrogen社製)
・制限酵素NdeI/EcoRI（タカラバイオ社製）
・DNA Ligation kit ver2.1、solutionI（タカラバイオ社製）
・JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）
・pET-23b(+) vector （Novagen社製）
・pT7 Blue T-vector（Novagen製）
・大腸菌ワンショットBL21（Star）コンピテントセル（invitrogen社製）
・シャペロン発現用プラスミド
　　TaKaRa Chaperone Plasmid Set（TaKaRa社製）
　　Plasmid　pG-KJE8 
　　Chaperone　 dnaK-dnaJ-grpE-groES-groEL
・破砕用ガラスビーズ YGBLA-01低アルカリ(0.1)（安井機械社製）
・透析膜（三光純薬株式会社製）透析膜サイズ：18/32
・Transcend tRNA（Promega社製）
・Transcend Non-Reactiove Translation Detection System（Promega社製）
・25%（W/V）グルコース（Wako社製）
・34mg/ml クロラムフェニコール（エタノールに溶解）
・15mg/ml チアミン（Wako社製）
・1M IPTG
・5μg/ml テトラサイクリン
・2.2ｍM Tris-acetate(pH8.2)（SIGMA社製）　滅菌して使用した。
・1M 酢酸マグネシウム(pH7.0) 
・3.6M 酢酸カリウム(pH7.0) 
・1M DTT（Wako社製）
・50μg/ml PMSF（エタノールに）
・50mM NTP　200mM ATP,CTP,GTP,CTPをそれぞれ等量ずつ混和。
　　200ｍM　ATP（ヤマサ醤油社製）
　　200mM　CTP（Roche社製）
　　200mM　UTP（Roche社製）
　　200mM　GTP
・1M　Hepes-KOH （pH7.5）
・3M　グルタミン酸カリウム
・2M　酢酸アンモニウム
・20mg/ml　E.coli ｔRNA（Roche社製） 
・1mg/ml 　リファンピシン（Wako社製）
・5M　クレアチンリン酸（Wako社製）
・12mg/ml クレアチンキナーゼ（Wako社製）
　　12.12g/1.01ml(165 units/mg、2000 units使用)
・アミノ酸ミックス（totalを1mlとして下記組成）
　　RPM1 1640 50×（SIGMA社製）　　　800μl
　　50mM グルタミン（協和発酵工業社製）100μl
　　50mM アラニン（協和発酵工業社製）　100μl
・5.7M ベタイントリメチルグリシン（Fluka社製）
・60% PEG6000（W/V）
・LB（Cm）プレート（totalを200mlとして下記組成）
　　LB Broth,Lennox （Difco社製） 　4g
　　34mg/ml　クロラムフェニコール　 117.6μｌ
　　Agar,Powder（Wako社製）　　　　3g
　　dH2O　　　　　　　　　　　　　　200ml
　　オートクレーブ滅菌後にクロラムフェニコールを添加しプレートに分注した。
・LB（Cm)液体培地（totalを48.3mlとして下記組成）
　　LB液体培地（LB Broth (Difco社製) 20g/l） 48ml
　　34mg/ml　クロラムフェニコール　28.16μl
・Growth培地（本培養用）（totalを1Lとして下記組成）
　　KH2PO4　　　　　　　　　5.6g
　　K2HPO4　　　　　　　　　28.9g
　　Yeast extract（Difco社製）10g
　　ｄH2O（溶液が1Lになるように添加）
　　20μg/ml　クロラムフェニコール　
　培地600mlに対して25%(W/V) グルコースを24ml、15mg/ml チアミンを600μl添加した。
・Wash buffer
　　10mM Tris-acetate(pH 8.2)
　　12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
　　60mM KCl
　　1mM DTT
　　50μg/ml PMSF
・Lysis buffer
　　10mM Tris-acetate(pH 8.2)
　　12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
　　60mM 酢酸カリウム(pH7.0)
　　1mM DTT　
・Preincubation buffer
　　1.2M Tris-acetate(pH 8.2) 
　　47mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
　　15mM DTT
　　アミノ酸ミックス
　　12mM ATP
　　100mM クレアチンリン酸
　　0.4mg/ml クレアチンキナーゼ
・ Dialysis buffer
　　10mM Tris-acetate(pH 8.2)
　　12mM 酢酸マグネシウム(pH7.0)
　　60mM 酢酸カリウム(pH7.0)
　　1mM DTT
　　50μg/ml PMSF
（２）Gibberella zeae FDH遺伝子のクローニング
（２－１）　微生物株
Gibberella zeaeは独立行政法人製品評価技術基盤機構の関連機関であるNITE Biological Resource Center（以下NBRCと記載）に保存されている株（NBRC No. 4474）を購入し、指定される方法で復元したものをPD（Potato Dextrose）培地を用いて培養した。
（２－２） ギ酸脱水素酵素遺伝子の単離
（２－２－１） ギ酸脱水素酵素遺伝子の増幅
　２－１の方法で培養して得た菌体をRNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてTotal RNA（mRNA、rRNA及びtRNA等を含む）を調製した。まず、RNA PCR Kit（タカラバイオ社製）を用いてTotal RNAを鋳型としたcDNA合成をおこなった。表１に反応液組成を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記組成の反応液を用いて、50℃で2時間、その後99℃で5分間、その後4℃とする反応サイクルでcDNAの合成反応を行った。
　次に、合成されたcDNAを鋳型とし、Pyrobest DNA polymeraseを用いてPCRをおこなった。反応液50μl中の成分組成を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　上記組成の反応液を用いて、95℃で1分、その後、95℃で30秒、60℃で30秒及び72℃で1分を１サイクルとして２５サイクル繰り返し、その後72℃で10分、その後4℃とする反応サイクルでPCRを行った。なお、本PCRにおいては、一対のプライマーとしてGib FDH1-F-NdeI（forward）：CGC CAT ATG GTC AAG GTT CTT GCA GTT C（配列番号１）及びGib FDH1-R(reverse)：CTA TTT CTT CTC ACG CTG ACC（配列番号２）を使用した。
（２－２－２） ギ酸脱水素酵素遺伝子のクローニング及び構造解析
　アガロースゲル電気泳動により得られた各種PCR産物のサイズを確認後、MinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いてアガロースゲルより精製したPCR産物をpT7 Blue T-vector（Novagen製）、JM109 competent cells（タカラバイオ社製）を用いてサブクローニングした（GzFDH/pT7）（図１参照）。単離したギ酸脱水素酵素遺伝子配列（配列番号３）はデータベース上に公開されている配列（Genbank No. XP_386303）とアミノ酸レベルで１００％の一致を示していた。なお、単離したギ酸脱水素酵素遺伝子がコードするギ酸脱水素酵素のアミノ酸配列を配列番号４に示した。
（２－２－３） ギ酸脱水素酵素遺伝子発現用ベクターの作製
　２－２－２で作製されたプラスミド（FDH/pT7）を制限酵素NdeI/EcoRIで処理した。表３に反応液組成を示す。制限酵素処理の反応条件としては37℃で2時間とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　反応後の溶液を0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、NdeI/EcoRI断片としてベクターから切り出されたギ酸脱水素酵素遺伝子（約1.1kb）をMinElute Gel Extraction Kit（QIAGEN製）を用いて精製した。次にFDH/pT7と同様に制限酵素処理した遺伝子発現用ベクターpET23b(+)（Novagen社製）のNdeI/EcoRI部位にDNA Ligation kit Ver.2.1（タカラバイオ社製）を用いて上記ギ酸脱水素酵素遺伝子断片を導入後、JM109 competent cells（タカラバイオ社製）によるサブクローニングを行った（FDH/pET23b(+)）（図１参照）。
（３） 無細胞タンパク質合成
（３－１） 鋳型DNAの調製
　前項（２）で取得したジベレラ由来FDH遺伝子導入ベクターを鋳型とし、以下の条件でPCRを行った。反応液50μl中の成分組成を表４に示す。なお、本PCRにおいては、一対のプライマーとしてSingle-F：CGATCCCGCGAAATTAATACGACT（配列番号５）及びSingle-R1：TCCGGATATAGTTCCTCCTTTCAG（配列番号６）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　上記組成の反応液を用いて、94℃で2分、その後、94℃で15秒及び60℃で1分30秒を１サイクルとして３０サイクル繰り返し、その後68℃で2分、その後4℃とする反応サイクルでPCRを行った。増幅された約1.4kbpの断片をMinElute PCR Purification Kitで精製し翻訳反応に使用した。
（３－２） 鋳型mRNAの調製
　前項３－１で取得したジベレラ由来FDH遺伝子およびT7プロモーター／ターミネーターを含むDNA断片を鋳型とし以下の条件で転写反応を行った。転写反応にはMEGAscript kit（Ambion社製）を用いた。反応液20μl中の成分組成を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記転写反応は、37℃で3時間行った。その後、反応液にTURBO DNase 1μlを添加し、37℃で15分間維持した。その後、dH2Oを9μl及びLithium chloride precipitation solutionを30μl添加し、-20℃で30分間維持した。その後、13000 xGで遠心分離を15分間実施し、上清を除去した。沈殿物を70％エタノールでリンスした後、dH2O 20μlに溶解した。
（３－３）大腸菌S30画分の調製
前培養
　発現プラスミドpG-KJE8を大腸菌BL21(DE3)star株に導入した。形質転換した大腸菌はLB（Cm）プレートでシングルコロニー化し、LB(Cm)液体培地（150ml/500ml フラスコ）で培養した後にグリセロールストックにして-80℃で保存した。なお、前培養では、34mg/ml クロラムフェニコールを88μl添加した後、37℃で終夜振とう（130rpm）しながら培養した。
本培養
　前培養液30mlをGrowth培地600mlに添加し、37℃で3.5時間（A600≒1.5となるまで）振とう（130rpm）しながら培養した。その後、T7 RNAポリメラーゼ誘導用のIPTGを添加（600ml/2L フラスコ1本あたり）した。その後、シャペロン誘導用試薬として5μg/mlのテトラサイクリン600μl（終濃度5ｎg/ml）及び500mg/mlのL-アラビノース600μl（終濃度500μg/ml）を添加（600ml/2Lフラスコ1本あたり）した。そして、30℃で1.5時間（A600≒3～4となるまで）振とう（130rpm）しながら培養した。
集菌及び洗浄
　培養終了後、250ml遠心管に培養液を移し、遠心分離（7000rpm、7分、4℃）（BECKMAN JA-14）により上清を除去した。菌体を10mlのWash Bufferに懸濁した後、遠心分離（7000rpm、7分、4℃）（BECKMAN JA-14）により上清を除去した。
破砕
　菌大量10gを9mlのLysis Bufferに懸濁して、破砕チューブ（安井機器社製）に移した。ここに、ガラスビーズ（安井機器社製）19gを追加し、安井機器社製マルチビーズショッカー（On 60秒→Off 60秒を１サイクルとして４サイクル）により菌体を破砕した。
超延伸（S30の調製）
　得られた破砕液を遠心分離（6000rpm、10分、4℃）（BECKMAN JA-12）し、上清を回収した。さらに、２回の超遠心（16000rpm（30900G）で25分（4℃）、その後、17000rpm（34957G）で35分（4℃））（BECKMAN JA-20）し、上清を回収した。
プレインキュベーション
　超遠心で得られた上清（S30画分）の15%量のPreincubation Bufferを加え、28℃で1.5時間保温した。
透析
　透析によりS30画分を調製するための透析膜を以下のように準備した。まず、S30画分10mlに対して15cm程度の透析膜を準備（S30画分液量[ml]＋5cm程度）した。レンジでdH2Oに浸した透析膜を沸騰させスタラーで攪拌（2時間以上）した。その後、Dialysis Bufferに入れてスタラーで攪拌（5分以上）した。
　透析は以下のように行った。先ず、1L プラスチックビーカーにDialysis Buffer 500mlを入れ、S30画分を透析膜に7分目くらいまで入れ、専用クリップで閉じた。その後、45分、4℃でスタラーで攪拌（透析膜がゆっくり回転する程度のスピード）した。その後、
Dialysis Buffer500mlを交換し、50mlコーニングチューブに回収した。そして、遠心（6900rpm、10分、4℃）（BECKMAN JA-12） した後、上清を回収し、1mlずつ分注して-80℃保存した。
（３－４） 無細胞翻訳反応
（３－４－１）　Expressway plus expression system(Invitrogen社製)による翻訳反応
　３－１及び３－２で調製した鋳型DNAまたは鋳型mRNA断片と、Expressway cell-free E.coli expression systemを用い翻訳反応（転写／翻訳共役反応）を行った。反応液10μl中の反応組成を表６に示す。なお反応温度を25℃とし、反応時間を2時間とした。なお、表６に示した組成と、更に0.5Mトリメチルグリシンを加えた組成の２通りで反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
（３－４－２）　S30画分による翻訳反応
　３－１および３－２で調製した鋳型DNAまたは鋳型mRNA断片と、３－３で調製した大腸菌由来S30画分を用い翻訳反応（または転写／翻訳共役反応）を行った。反応液11.12μl中の反応組成を表７に示す。なお反応温度を25℃とし、反応時間を1.5時間とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　なお、上記反応液組成において、ベタイン（トリメチルグリシン）は終濃度を～0.5Mとなるように調整し、Mg(OAc)2は終濃度を10mMとなるように調整した。また、上記反応液組成において、鋳型としてmRNAを使用する場合、その量を1μgとした。
　また、上述した反応組成に0.2μｌ Transcend tRNA（Promega社製）を加え、翻訳反応（または転写／翻訳共役反応）を行った。翻訳反応液2μｌをSDS-PAGE（還元）に供し、 Transcend Non-Reactiove Translation Detection Systemを用いたブロッティング法によって合成産物を検出した。また合成量をSigmaScanProにより定量した。
（４） 合成タンパク質の検出
　ギ酸脱水素酵素遺伝子の発現強度を、ギ酸脱水素酵素活性（FDH活性）を測定することで評価した。なお、FDHによるギ酸分解反応は次式で示される。
　　HCOO- ＋ NAD+ → CO2 ＋ NADH
　ここに電子伝達物質であるMethoxy PMS（mPMS）と、酸化還元発色指示薬であるWST1（共にDOJINDO社製）を加えることで次式のように反応が進むため、波長438nmの吸光度で黄色ホルマザンを測定することで、ギ酸分解量の定量が可能となる。なお黄色ホルマザンの吸光係数はNADHの約６倍であり、NADHの直接測定よりも高感度での定量が可能となる。
　　NADH ＋ mPMS → NAD+ ＋ mPMS（還元型）
　　mPMS（還元型） ＋ WST1 → mPMS ＋ 黄色ホルマザン（37000/M・cm、438nm）
　そして、プレートリーダー（Spectrafluor Plus：TECAN社製）で吸光度430nmを測定することで黄色ホルマザンを定量し、無細胞タンパク質合成系において発現したFDH活性、すなわちFDHの合成量を評価することができる。
（４－１）FDH活性測定
　表８に示す組成の反応液を用いてFDH活性を測定した。反応条件は、サーマルサイクラー37℃で加熱（30分程度）し、その後、チューブを取り出し氷につけて反応停止させた。その後、プレートリーダー（Spectrafluor Plus：TECAN社製）で吸光度430nmを測定することでFDH活性を検出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　３－１で調製した鋳型DNAを用いて行った３－４－１の結果を図２に示す。図２に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合には、トリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性が大幅に向上しており、タンパク質の合成量が増加していることが確認された。
　また、３－１で調製した鋳型DNAを用いて行った３－４－２におけるSDS-PAGEの結果を図３上段に示し、FDH活性測定結果を図３下段に示す。また、SDS-PAGEの結果からタンパク質合成量を測定した結果を図４に示す。なお、図４においては、タンパク質の合成量を、トリメチルグリシンを添加しない場合の合成量を１とする相対値で示している。
　図３及び４に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合にはトリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性及びFDH合成量が大幅に向上しており、また、トリメチルグリシン濃度に依存してFDH活性及びFDH合成量が向上していた。
　さらに、３－２で調製した鋳型mRNAを用いて行った３－４－２におけるFDH活性測定結果を図５上段に示し、SDS-PAGEの結果を図５下段に示す。また、SDS-PAGEの結果からタンパク質合成量を測定した結果を図６に示す。なお、図６においては、タンパク質の合成量を、トリメチルグリシンを添加しない場合の合成量を１とする相対値で示している。
　図５及び６に示すように、トリメチルグリシン存在下で無細胞タンパク質合成を行った場合にはトリメチルグリシン非存在下と比較してFDH活性及びFDH合成量が大幅に向上しており、また、トリメチルグリシン濃度に依存してFDH活性及びFDH合成量が向上していた。
　以上の結果から、無細胞タンパク質合成系においてトリメチルグリシンは、目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を向上させる作用を示すことが確認された。
　さらに、３－２で調製した鋳型ｍRNAを用いて行った３－４－２において、トリメチルグリシンに代えてL-カルニチン（Car）、サルコシン（Sar）及びコリン（Chol、 (CH3)3N+CH2CH2OH Cl）を用いてタンパク質合成を行った結果を図７に示す。図７に示した結果から、L-カルニチン、サルコシン及びコリンのうちいずれかの化合物を存在させることによって、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成能が向上することが明らかとなった。特に、L-カルニチンを使用した場合には、無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成能が顕著に優れていることが確認できた。この結果から、無細胞タンパク質合成系においてL-カルニチン、サルコシン及びコリンは、トリメチルグリシンと同様に、目的タンパク質をコードする遺伝子の翻訳効率を向上させる作用を示すことが確認できた。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (10)

  1. 　下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含む無細胞タンパク質合成溶液。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  2. 　上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項１記載の無細胞タンパク質合成溶液。
  3. 　タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液と、
    　下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物とを含む無細胞タンパク質合成キット。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  4. 　上記化合物は、上記無細胞タンパク質合成溶液に混合されていることを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
  5. 　上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
  6. 　合成対象のタンパク質をコードする遺伝子を導入することができる発現ベクターをさらに含むことを特徴とする請求項３記載の無細胞タンパク質合成キット。
  7. 　下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を含み、タンパク質合成能を有する無細胞タンパク質合成溶液中でタンパク質合成を行う、タンパク質の合成方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  8. 　上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項７記載のタンパク質合成方法。
  9. 　下記構造式(I)～(V)で示される化合物のうち１以上の化合物を無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成の促進剤として使用する方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  10. 　上記化合物は、カルニチン、サルコシン及びトリメチルグリシンからなる群から選ばれる１以上の化合物であることを特徴とする請求項９記載の方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471914A4 (en) * 2009-08-03 2013-03-20 Toyota Motor Co Ltd MUTANT FORMIATE DEHYDROGENASE, GENE ENCODING SAME, AND METHOD FOR PRODUCING NADH
WO2016079981A1 (ja) * 2014-11-18 2016-05-26 和光純薬工業株式会社 検体の破砕装置およびその方法
JP2020533018A (ja) * 2017-08-11 2020-11-19 シンビトロバイオ， インコーポレイテッド 改善されたインビトロ転写／翻訳（ｔｘｔｌ）システムおよびその使用

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9937239B2 (en) 2014-05-21 2018-04-10 The Johns Hopkins University Preservation and reconstitution of cell-free protein expression systems
US11898187B2 (en) 2017-08-15 2024-02-13 Northwestern University Protein glycosylation sites by rapid expression and characterization of N-glycosyltransferases
WO2019094859A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Northwestern University Cell-free protein synthesis platform derived from cellular extracts of vibrio natriegens
US11725224B2 (en) 2018-04-16 2023-08-15 Northwestern University Methods for co-activating in vitro non-standard amino acid (nsAA) incorporation and glycosylation in crude cell lysates
US11814621B2 (en) 2018-06-01 2023-11-14 Northwestern University Expanding the chemical substrates for genetic code reprogramming

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0576381A (ja) 1991-09-19 1993-03-30 Hitachi Ltd ポリペプチド合成方法
US5545539A (en) 1994-10-18 1996-08-13 Genzyme Corporation Method for nucleotide sequence amplification
JPH1156363A (ja) 1997-08-19 1999-03-02 Nippon Flour Mills Co Ltd タンパクの製造方法
JP2003116590A (ja) * 2001-08-06 2003-04-22 Toyota Central Res & Dev Lab Inc タンパク質の生産方法、タンパク質のスクリーニング方法、及びタンパク質の機能検索方法
JP2005160446A (ja) * 2003-12-05 2005-06-23 Toyobo Co Ltd 改良されたｒｎａ合成用反応組成物
JP2006061080A (ja) * 2004-08-27 2006-03-09 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 無細胞タンパク質合成系のための媒体
JP2006508672A (ja) 2002-12-09 2006-03-16 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー 最適化タンパク質合成

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207378B1 (en) 1997-08-19 2001-03-27 Nippon Flour Mills Co., Ltd. Method for amplifying nucleic acid molecules and method for synthesizing proteins
ITRM20010337A1 (it) * 2001-06-14 2002-12-16 Sigma Tau Ind Farmaceuti Soluzione per la conservazione e perfuzione di organi in attesa che vengano trapiantati.
US20030113835A1 (en) 2001-08-06 2003-06-19 Kabushiki Kaisha Toyota Chuo Kenkyusho Methods for protein synthesis, protein screening and retrieval of protein function
JP4300321B2 (ja) 2002-10-25 2009-07-22 東洋紡績株式会社 Ｄｎａ合成反応を促進する方法、およびそのための組成物
ATE427992T1 (de) 2001-11-14 2009-04-15 Toyo Boseki Dna-synthesepromotoren, mit dna-polymerase assoziierte faktoren und nutzung davon
WO2003097829A1 (en) * 2002-05-22 2003-11-27 Riken Process for producing protein in cell-free protein synthesis system using thioredoxin fused protein expression vector
US7563598B2 (en) * 2004-07-30 2009-07-21 Ambergen, Inc. Detection of truncation mutations by mass spectrometry
WO2006039622A2 (en) 2004-10-01 2006-04-13 Invitrogen Corporation Feeding buffers, systems, and methods for in vitro synthesis of biomolecules
WO2006078821A2 (en) * 2005-01-21 2006-07-27 Invitrogen Corporation Products and processes for in vitro synthesis of biomolecules

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0576381A (ja) 1991-09-19 1993-03-30 Hitachi Ltd ポリペプチド合成方法
US5545539A (en) 1994-10-18 1996-08-13 Genzyme Corporation Method for nucleotide sequence amplification
JPH1156363A (ja) 1997-08-19 1999-03-02 Nippon Flour Mills Co Ltd タンパクの製造方法
JP2003116590A (ja) * 2001-08-06 2003-04-22 Toyota Central Res & Dev Lab Inc タンパク質の生産方法、タンパク質のスクリーニング方法、及びタンパク質の機能検索方法
JP2006508672A (ja) 2002-12-09 2006-03-16 エフ．ホフマン−ラ　ロシュ　アーゲー 最適化タンパク質合成
JP2005160446A (ja) * 2003-12-05 2005-06-23 Toyobo Co Ltd 改良されたｒｎａ合成用反応組成物
JP2006061080A (ja) * 2004-08-27 2006-03-09 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 無細胞タンパク質合成系のための媒体

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ERICKSON, A. H. ET AL., METH. IN ENZYMOL., vol. 96, 1996, pages 38 - 50
JOHNSTON, F. B. ET AL., NATURE, vol. 179, 1957, pages 160 - 161
PRATT, J. M. ET AL.: "Transcription and Translation, Hames", 1984, IRL PRESS, pages: 179 - 209
See also references of EP2447365A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2471914A4 (en) * 2009-08-03 2013-03-20 Toyota Motor Co Ltd MUTANT FORMIATE DEHYDROGENASE, GENE ENCODING SAME, AND METHOD FOR PRODUCING NADH
WO2016079981A1 (ja) * 2014-11-18 2016-05-26 和光純薬工業株式会社 検体の破砕装置およびその方法
US10760115B2 (en) 2014-11-18 2020-09-01 Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation Specimen disrupting method and specimen disrupting apparatus
JP2020533018A (ja) * 2017-08-11 2020-11-19 シンビトロバイオ， インコーポレイテッド 改善されたインビトロ転写／翻訳（ｔｘｔｌ）システムおよびその使用

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