JP2003116590A - タンパク質の生産方法、タンパク質のスクリーニング方法、及びタンパク質の機能検索方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 無細胞系（ in vitro 転写・翻訳系）によっ
て、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する
タンパク質を効率的に生産できるタンパク質生産方法等
を提供する。 【解決手段】 鋳型遺伝子を添加した無細胞抽出液を用
い、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する
タンパク質を生産するタンパク質生産方法。分子間及び
／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質は、
より好ましくは抗体又は金属含有タンパク質である。こ
の方法において、より好ましくは、無細胞抽出液にシャ
ペロン機能を有するタンパク質を添加し、及び／又は、
無細胞抽出液から還元剤を排除する。上記タンパク質生
産システムを利用したタンパク質のスクリーニング方法
及びタンパク質の機能検索方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、無細胞タンパク質
合成系（ in vitro 転写・翻訳系）によって、特定の分
子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパ
ク質を効率的に生産するタンパク質の生産方法に関す
る。又、本発明は、前記タンパク質の生産方法を応用し
たタンパク質のスクリーニング方法に関する。更に、本
発明は、前記のタンパク質の生産方法を応用したタンパ
ク質の機能検索方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】〔関連技術の記載〕近年、例えばイネゲ
ノムやヒトゲノム等の塩基配列の解明のように、大規模
なＤＮＡ解析が活発に行われている。これらを可能にし
た大きな要因が、鋳型ＤＮＡを迅速かつ大量にクローニ
ングできるＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction）法の
開発であった。

【０００３】現在は「ポスト・ゲノムの時代」と呼ば
れ、ゲノム中に含まれる遺伝子が転写・翻訳されて発現
する各種の酵素、抗体等の機能性タンパク質の解析に大
きな関心が持たれている。機能性タンパク質の解析に
は、そのタンパク質を解析に供し得る程度に大量生産す
ることが望まれる。しかしタンパク質に関しては、ＤＮ
Ａにおける上記ＰＣＲ法のような、自己複製による大量
生産技術は存在しない。

【０００４】そこで、いわゆる無細胞タンパク質合成系
（in vitro転写・翻訳系）によるタンパク質の効率的生
産方法が注目される。この方法では、無細胞抽出液を利
用することによって、細胞内において鋳型遺伝子が転写
・翻訳されてタンパク質を発現するプロセスに必要な要
素を維持できる。しかも、細胞内部でタンパク質を生産
することに伴う多様な制約を解除できる。無細胞抽出液
としては、一定の理由から、例えば大腸菌や小麦胚芽細
胞等に由来する無細胞抽出液が好んで用いられている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ところで、細胞内にお
けるタンパク質生産プロセスの内容や、生物種毎のタン
パク質生産プロセスの相違等については、必ずしも詳細
に解明されてはいない。更に、無細胞系によるタンパク
質の生産方法と、元の細胞内における同じタンパク質の
生産プロセスとの相違点の有無や、相違点の内容につい
て、解明されていない点が多い。

【０００６】例えば、無細胞系により、活性型である特
定の機能性タンパク質の効率的生産に成功した事例が報
告された場合を仮定する。この場合、同一の無細胞系に
よって、その機能性タンパク質と同じファミリーを構成
する類似の機能性タンパク質を生産し得るであろう、と
の予測は可能である。しかし、前記の特定の機能性タン
パク質とは異種のタンパク質については、このような予
測は成立し難い。

【０００７】分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合
を有するタンパク質には、各種の抗体や、金属を含有す
る一定の機能性タンパク質（例えば、金属を含有する酵
素）等の非常に有用なタンパク質が含まれている。抗体
は、Ｌ鎖とＨ鎖との間で形成される分子間ジスルフィド
結合により、特有の空間的コンフォメーションを構成す
る機能性タンパク質である。分子間及び／又は分子内ジ
スルフィド結合を有し、かつ金属を含有する機能性タン
パク質のファミリーには、鉄（Fe）を含有する酵素であ
るペルオキシダーゼ、同じくFeを含有する酸素運搬タン
パク質であるヘモグロビン、銅（Cu）を含有する酸素運
搬タンパク質であるヘモシアニン、カルシウムと結合し
たシグナル伝達関連タンパク質であるカルモジュリン等
が包含される。

【０００８】しかし、これらの分子間及び／又は分子内
ジスルフィド結合を有するタンパク質は一般的に無細胞
系によっては活性型の生産が困難であるとされている。

【０００９】例えば、抗体等の分子間ジスルフィド結合
を有するタンパク質の無細胞系による生産についての報
告例は全くない。因みに、本来はＨ鎖とＬ鎖を分子間ジ
スルフィド結合により架橋したものである Fab抗体を、
ペプチドリンカーにより連結された１本鎖としたもと
で、人工的な活性型の抗体を合成した例は報告されてい
る（Nat. Biotechnol. vol.15, p79, 1997）。しかし、
これは分子間ジスルフィド結合を有するタンパク質では
ない。

【００１０】組換え型ヘム含有タンパク質であるペルオ
キシダーゼについては、大腸菌による封入体での生産例
が報告されている。この場合、封入体を尿素等の変性剤
に溶解した後、ヘムを添加してリフォールディングさせ
る必要がある（Tienら，Biochem.Biophys.Research Com
m.;216,1013-1017;1995 ）。 Amoldらにより、ホースラ
ディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を大腸菌のペリ
プラズムにおいて活性型酵素として分泌させた例（Biot
echnol.Prog.;15,467-471;1999）や、ＨＲＰを酵母にお
いて発現及び分泌させた例（Protein Eng.;13,377-84;2
000 ）が報告されている。これらの場合、ヘムを作らせ
るためにヘム前駆体（δ−アミノレブリン酸）を培地中
に添加する必要がある。酵母においてＣｉＰ（Coprinus
cinereus ペルオキシダーゼ）を発現及び分泌させた例
（ Novo Nordisk 社；Nature biotechnol.;17,379-384;
1999）も報告されている。

【００１１】しかし、以上の金属含有タンパク質の生産
例は、いずれも無細胞系を利用したものではない。一般
的に、ヘム含有タンパク質等の金属含有タンパク質を大
腸菌封入体として生産する場合、不活性型のタンパク質
が得られる。そして、これを活性型にフォールディング
するためには、少なくとも数日程度の処理時間を要す
る、と言う不具合がある。酵母細胞を用いた発現系は、
酵母の増殖が遅いことから操作性が悪い、と言う不具合
がある。又、本来的に金属含有タンパク質を生産可能な
高等動植物の細胞内において金属含有タンパク質の生産
を図る場合でも、添加する大量の金属含有物質の毒性等
の理由から、一般的に金属含有タンパク質の大量発現は
困難であると考えられる。

【００１２】従って、分子間及び／又は分子内ジスルフ
ィド結合を有する活性型のタンパク質、特に(a) 活性型
の抗体や、(b) 活性型の金属含有タンパク質、を迅速に
かつ大量に生産できるタンパク質生産方法が求められて
いる。又、ポストゲノム時代の重要技術である、進化分
子工学においてスクリーニングにより新規な改変酵素等
を得る目的からも、このようなタンパク質生産方法が求
められている。更に、いわゆるバイオインフォーマティ
クスへの応用等を考えても、このようなタンパク質生産
方法が強く求められている。

【００１３】このような要求に対する有力な解決手段の
一つとして、無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・
翻訳系）による上記タンパク質の効率的生産方法を提供
することが期待されている。しかし、上記(a) ，(b) の
ようなタンパク質生産方法の成功例は未だ報告されてい
ない。

【００１４】今までのところ、無細胞系によって(a) ，
(b) のタンパク質を生産できるか、は不明である。無細
胞系によって(a) ，(b) の活性型タンパク質を生産でき
るかも不明である。大腸菌等に由来する汎用性の高い無
細胞系によって(a) ，(b) の活性型タンパク質を生産で
きるか、も不明である。更に無細胞系によって(a) ，
(b) の活性型タンパク質を効率的に大量生産できるか、
も不明である。

【００１５】〔本発明の概要〕本発明は、無細胞系によ
って、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有す
るタンパク質を効率的に生産できるタンパク質生産方法
を提供することを目的とする。これらのタンパク質は、
好ましくは抗体又は金属含有タンパク質である。又、本
発明は、無細胞系によって活性型の上記タンパク質を効
率的に生産できるタンパク質生産方法を提供することを
目的とする。又、本発明は、このタンパク質生産方法を
利用したこれらのタンパク質のスクリーニング方法を提
供することを目的とする。更に、本発明は、前記タンパ
ク質生産方法を利用したタンパク質の機能検索方法を提
供することを目的とする。

【００１６】

【課題を解決するための手段】（第１発明）本願の第１
発明（第１アスペクト）は、分子間及び／又は分子内ジ
スルフィド結合を有するタンパク質の鋳型遺伝子を無細
胞抽出液に添加するプロセスと、この無細胞抽出液を用
いて前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有
するタンパク質を生産するプロセスと、を含むタンパク
質の生産方法である。

【００１７】本願発明者は、第１発明のように、無細胞
抽出液に対して所定の鋳型遺伝子を添加することによ
り、無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳系）
による分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有す
るタンパク質の生産に初めて成功した。

【００１８】又、第１発明は無細胞抽出液を利用するの
で、細胞内において鋳型遺伝子が転写・翻訳されるプロ
セスに必要な要素を維持しつつ、細胞内部でタンパク質
を生産することに伴う多様な制約から開放される。その
ため、目的とするタンパク質をより迅速かつ大量に生産
することができる。

【００１９】（第２発明）本願の第２発明（第２アスペ
クト）においては、上記の第１発明における前記無細胞
抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に１種又は２種以
上のシャペロン機能を有するタンパク質を添加する。

【００２０】本願発明において特に注目すべき点の一つ
は、第２発明のように、無細胞抽出液に対して鋳型遺伝
子と共にシャペロン機能を有するタンパク質を添加する
ことである。このことにより、分子間及び／又は分子内
ジスルフィド結合を有する活性型のタンパク質の生産量
が著しく向上する。

【００２１】即ち、従来は、分子間及び／又は分子内ジ
スルフィド結合を有する活性型タンパク質の無細胞系に
よる合成の成功例はなかったが、これが可能であること
が、第２発明によって初めて示された。無細胞抽出液に
対して鋳型遺伝子と共にシャペロン機能を有するタンパ
ク質を添加することにより、鋳型遺伝子に基づくペプチ
ド鎖合成と同時にその折りたたみが正確に行われ、活性
型タンパク質への変換が効率的に進行するのである。

【００２２】（第３発明）本願の第３発明（第３アスペ
クト）においては、上記の第２発明における前記シャペ
ロン機能を有するタンパク質がプロテイン・ジスルフィ
ド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）である。

【００２３】本願発明で用いるシャペロン機能を有する
タンパク質としては、第３発明に係るＰＤＩがとりわけ
好ましい。

【００２４】（第４発明）本願の第４発明（第４アスペ
クト）においては、上記の第２発明における前記シャペ
ロン機能を有するタンパク質が、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、
ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、ＧｒｅｐＥ又はチオレドキシ
ン（Ｔｘ）である。

【００２５】本願発明で用いるシャペロン機能を有する
タンパク質として、第４発明に係る各種のタンパク質も
好ましく用いることができる。

【００２６】（第５発明）本願の第５発明（第５アスペ
クト）においては、上記の第１発明〜第４発明における
前記無細胞抽出液からは還元剤が排除されている。

【００２７】本願発明において特に注目すべき点の一つ
は、無細胞抽出液に常套的に添加されているＤＴＴ（ジ
チオスレイトール）等の還元剤に着目したことである。
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタン
パク質においては、その機能の発現のために特定パター
ンの分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を
必要とする。ところが、本願発明者は、無細胞抽出液を
還元状態とすることにより、このような特定パターンの
ジスルフィド結合が確定的に形成され難くなることを見
出した。従って、機能の発現のために分子間及び／又は
分子内ジスルフィド結合の形成を必要とする各種のタン
パク質を活性型として生産するに当たり、無細胞抽出液
から還元剤を排除しておくことは非常に有効である。

【００２８】なお、無細胞抽出液に前記のシャペロン機
能を有するタンパク質を添加し、かつ無細胞抽出液から
還元剤を排除することにより、分子間及び／又は分子内
ジスルフィド結合を有する活性型のタンパク質の生産量
が一層著しく向上する。

【００２９】（第６発明）本願の第６発明（第６アスペ
クト）においては、上記の第１発明〜第５発明における
前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する
タンパク質が抗体である。

【００３０】「分子間及び／又は分子内ジスルフィド結
合を有するタンパク質」の内、分子間ジスルフィド結合
を有するタンパク質としては、抗体が特に好ましく例示
される。本願発明者は、無細胞抽出液に対して一定の鋳
型遺伝子を添加することによって、無細胞タンパク質合
成系（in vitro転写・翻訳系）による抗体の生産に初め
て成功した。

【００３１】（第７発明）本願の第７発明（第７アスペ
クト）においては、上記の第６発明における前記抗体
を、無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度で、
活性型として無細胞抽出液中に得る。活性型の抗体につ
いて、「無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃
度」とは、無細胞抽出液中に合成された活性型抗体の量
が１０μｇ／ｍＬ以上であることを言う。

【００３２】上記第６発明に係るタンパク質の生産方法
においては、第７発明のように活性型の抗体が無細胞抽
出液のままで活性測定を行い得る濃度で無細胞抽出液中
に得られることが分かった。従って目的タンパク質であ
る抗体の濃縮又は精製操作等を一切行うことなく抗体の
活性測定を行うことができる。この効果は、一般的に転
写・翻訳反応液が１μｌあればタンパク質活性等の機能
の評価が可能であることから、研究開発の現場において
自動化された機器等を用いた迅速な大量スクリーニング
を可能とする等の点で大きなメリットをもたらす。

【００３３】（第８発明）本願の第８発明（第８アスペ
クト）においては、上記の第１発明〜第５発明における
前記分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有する
タンパク質が金属含有タンパク質である。

【００３４】「分子間及び／又は分子内ジスルフィド結
合を有するタンパク質」の内、分子内ジスルフィド結合
を有するタンパク質としては、金属含有タンパク質が特
に好ましく例示される。本願発明者は、鋳型遺伝子を利
用する無細胞タンパク質合成系（in vitro転写・翻訳
系）によって金属含有タンパク質の生産に初めて成功し
た。

【００３５】この金属含有タンパク質の生産方法は、鉄
（Fe）を含有する酵素ペルオキシダーゼ、同じくFeを含
有する酸素運搬タンパク質ヘモグロビン、銅（Cu）を含
有する酸素運搬タンパク質ヘモシアニン、カルシウムと
結合したシグナル伝達関連タンパク質カルモジュリン等
の金属含有タンパク質のファミリーに対して一般的に適
用できると考えられる。

【００３６】（第９発明）本願の第９発明（第９アスペ
クト）においては、上記の第８発明における前記無細胞
抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に金属を含む機能
単位を添加する。上記の第８発明においては、無細胞抽
出液に対して鋳型遺伝子と共に金属を含む機能単位とを
添加することが、より好ましい。

【００３７】（第１０発明）本願の第１０発明（第１０
アスペクト）においては、上記の第９発明における前記
金属含有タンパク質の少なくとも一部を、前記金属を含
む機能単位が関与する特定の機能を示す活性型として得
る。

【００３８】第９発明に係るタンパク質の生産方法にお
いて、金属含有タンパク質の少なくとも一部が、金属を
含む機能単位が関与する特定の機能を示す活性型として
得られることが確認された。従って金属含有タンパク質
を取得した後、その活性化のために長時間を要してフォ
ールディング等を行うと言う操作性の悪さを回避するこ
とが可能となる。

【００３９】（第１１発明）本願の第１１発明（第１１
アスペクト）においては、上記の第９発明における前記
金属を含む機能単位が金属錯体である。

【００４０】第９発明において、鋳型遺伝子と共に無細
胞抽出液に添加する金属を含む機能単位として、特に金
属錯体が好ましく例示される。

【００４１】（第１２発明）本願の第１２発明（第１２
アスペクト）においては、上記の第１１発明における前
記金属錯体がヘミンである。

【００４２】第１１発明に係る金属錯体としては特にヘ
ミンが好ましく例示される。従来、封入体として金属含
有タンパク質を生産させるため、例えば前記従来技術の
ように、金属（Fe）イオンとヘム前駆体（δ−アミノレ
ブリン酸）を培地中に添加した例はある。しかし、鋳型
遺伝子と共に金属錯体等の金属を含む機能単位を添加す
ることで、無細胞系において金属含有タンパク質を生産
できることが、初めて見出された。

【００４３】（第１３発明）本願の第１３発明（第１３
アスペクト）においては、上記の第８発明〜第１２発明
における前記金属含有タンパク質がヘム含有酵素であ
る。

【００４４】第８発明〜第１２発明において生産される
金属含有タンパク質として、各種のペルオキシダーゼ等
のヘム含有酵素が、とりわけ有用性が高い。これらにつ
いては、例えば洗剤への添加、ポリマー重合、無塩素系
によるパルプ漂白、芳香族系の難分解環境汚染物質の分
解、排水処理等の用途を挙げることができる。

【００４５】（第１４発明）本願の第１４発明（第１４
アスペクト）においては、上記の第１３発明における前
記ヘム含有酵素がペルオキシダーゼである。

【００４６】第１３発明に係るヘム含有酵素としては、
各種のペルオキシダーゼが好ましく例示される。

【００４７】（第１５発明）本願の第１５発明（第１５
アスペクト）においては、上記の第８発明〜第１４発明
における前記金属含有タンパク質を、無細胞抽出液のま
まで活性測定を行い得る濃度で、活性型として無細胞抽
出液中に得る。活性型の金属含有タンパク質について
「無細胞抽出液のままで活性測定を行い得る濃度」と
は、無細胞抽出液中に合成された活性型金属含有タンパ
ク質の量が１０μｇ／ｍＬ以上であることを言う。

【００４８】上記第８発明〜第１４発明に係るタンパク
質の生産方法においては、第１５発明のように活性型の
金属含有タンパク質が無細胞抽出液のままで活性測定を
行い得る濃度で無細胞抽出液中に得られることが分かっ
た。

【００４９】従って、目的タンパク質である金属含有タ
ンパク質の濃縮又は精製操作等を一切行うことなく金属
含有タンパク質の活性測定を行うことができる。この効
果は、一般的に転写・翻訳反応液が１μｌあればタンパ
ク質活性等の機能の評価が可能であることから、研究開
発の現場において自動化された機器等を用いた迅速な大
量スクリーニングを可能とする等の点で、大きなメリッ
トをもたらす。

【００５０】（第１６発明）本願の第１６発明（第１６
アスペクト）においては、上記の第１発明〜第１５発明
における前記無細胞抽出液が大腸菌に由来するものであ
る。

【００５１】大腸菌に由来する無細胞抽出液は、汎用性
が高く入手も容易である。大腸菌に由来する無細胞抽出
液を利用して、抗体や金属含有タンパク質等の分子間及
び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を
生産できることは、発明の実施上非常に有利である。

【００５２】（第１７発明）本願の第１７発明（第１７
アスペクト）は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド
結合を有する任意の種類のタンパク質をコードする核酸
の塩基配列に対して特定の又はランダムな塩基配列の変
更を加えてなる鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプ
ロセスと、この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子により
コードされたタンパク質を生産するプロセスと、生産さ
れたタンパク質を活性の測定によりスクリーニングする
プロセスと、を含むタンパク質のスクリーニング方法で
ある。

【００５３】任意のタンパク質をコードする核酸の塩基
配列に対して特定の又はランダムな変更を加え、これを
鋳型遺伝子として発現させることにより、新たな機能を
持つタンパク質をスクリーニングすると言う手法が注目
されている。

【００５４】第１７発明は、この手法を、無細胞系にお
いて、しかも分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合
を有するタンパク質に関して導入することを可能にした
ものである。この方法は、無細胞抽出液に対してシャペ
ロン機能を有するタンパク質を添加した場合、及び／又
は、無細胞抽出液から還元剤を排除した場合に、一層有
効である。その結果、これらのタンパク質につき、迅速
に活性型のタンパク質を生産させ、新機能を有するタン
パク質を大量スクリーニングすることが可能となる。例
えば、大腸菌等の生細胞を用いた系では１ケ月近くを要
するスクリーニングを、１日で行うことが可能となる。

【００５５】（第１８発明）本願の第１８発明（第１８
アスペクト）は、機能の発現に特定のパターンの分子間
及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、
該機能の少なくとも一部が未知である任意のタンパク質
をコードする鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプロ
セスと、この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコ
ードされたタンパク質を生産するプロセスと、生産され
たタンパク質の機能の試験により該タンパク質の未知の
機能を検索するプロセスと、を含むタンパク質の機能検
索方法である。

【００５６】機能の発現に特定のパターンの分子間及び
／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、該機
能の少なくとも一部が未知である任意のタンパク質群の
機能検索は、ポストゲノムの時代において極めて重要で
ある。そのためには、これらのタンパク質を、活性型
で、迅速に、かつ少なくとも解析可能な程度には大量
に、発現させる必要がある。

【００５７】しかし、そのために従来利用されて来たin
vitro転写・翻訳系によるタンパク質生産では、活性型
でのタンパク質生産が難しかった。第１８発明によって
上記の問題が解決され、効率的なタンパク質の機能検索
方法が提供される。この方法は、無細胞抽出液に対して
シャペロン機能を有するタンパク質を添加した場合、及
び／又は、無細胞抽出液から還元剤を排除した場合に、
一層有効である。

【００５８】（第１９発明）本願の第１９発明（第１９
アスペクト）においては、上記の第１８発明における前
記タンパク質が、任意の機能を有するタンパク質複合体
のサブユニットを構成するタンパク質である。

【００５９】上記第１８発明に係るタンパク質として、
任意の機能を有するタンパク質複合体のサブユニットを
構成するタンパク質を好ましく例示することができる。
タンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質
においては、上記特定パターン分子間のジスルフィド結
合は、他のサブユニットを構成するタンパク質分子との
間で形成される。

【００６０】（第２０発明）本願の第２０発明（第２０
アスペクト）においては、上記の第１９発明における前
記タンパク質複合体が抗体である。

【００６１】上記第１９発明に係るタンパク質複合体と
して、抗体を好ましく例示することができる。抗体にお
いては、上記特定パターン分子間のジスルフィド結合
は、Ｌ鎖とＨ鎖との間で形成される。

【００６２】

【発明の実施の形態】〔発明の詳細な記載〕 （タンパク質の生産方法）本発明に係るタンパク質の生
産方法は、分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を
有するタンパク質を生産するための in vitro 転写・翻
訳系による生産方法であって、無細胞抽出液に対して少
なくとも鋳型遺伝子を添加することにより行われる。後
述する金属含有タンパク質を生産する場合においては、
無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝子と共に金属含有
タンパク質における金属を含む機能単位を添加すること
が好ましい。

【００６３】本発明に係るタンパク質の生産方法は、下
記の (c)〜(e) の実施形態において特に好ましく行われ
る。

【００６４】(c) 無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺伝
子と共に１種又は２種以上のシャペロン機能を有するタ
ンパク質を添加する。

【００６５】(d) 無細胞抽出液から、常用されているＤ
ＴＴ等の還元剤を排除する。「還元剤を排除する」と
は、in vitro転写・翻訳系において常套的に添加されて
いるＤＴＴ等の還元剤の添加を行わないか、あるいは既
に還元剤が添加されている市販のin vitro転写・翻訳系
から透析等によってこれを排除したり、又はヨードアセ
トアミド等のＳＨ基修飾剤や酸化剤等を添加して結果的
に還元剤を無効化したりすることを言う。

【００６６】(e) 上記(c) のシャペロン機能を有するタ
ンパク質の添加と、上記(d) の還元剤の排除とを一緒に
行う。

【００６７】これら(c) 〜(e) の実施形態によれば、無
細胞抽出液中の活性型タンパク質を、無細胞抽出液その
ままで濃縮・精製することなく活性測定を行い得る濃度
で、無細胞抽出液中に得ることができる。

【００６８】（無細胞抽出液）無細胞抽出液としては、
良く利用される大腸菌，小麦胚芽，昆虫細胞等に由来す
るものは勿論利用できるが、これらに限定されず、細菌
等の原核細胞生物一般，酵母等の真核単細胞生物一般，
植物細胞一般，動物細胞一般に由来するものを利用でき
る。金属含有タンパク質の生産方法においては、元々そ
の生産能力を有する細胞に由来する無細胞抽出液も利用
できるし、元々その生産能力を有しない細胞に由来する
無細胞抽出液も利用できる。あるいは、金属錯体をその
金属イオンと前駆体とから合成する経路を備えない細胞
に由来する無細胞抽出液も利用できる。

【００６９】上記各種の細胞からの無細胞抽出液の調製
方法は、必要に応じて各種の周知又は公知の方法を任意
に採用すれば良く、別段に限定されない。例えば、ホモ
ジナイザーで細胞を磨り潰したり、急激な圧力変化を与
えて細胞を破砕したり、超音波処理によって破砕したり
することができる。これらの操作に加えて、細胞骨格成
分等を例えば遠心分離等で排除しても良い。あるいは、
市販されている無細胞抽出液を利用することもできる
が、市販品にＤＴＴ等の還元剤が添加されている場合に
は、前記のようにこれを排除又は無効化することが好ま
しい。

【００７０】無細胞抽出液には、タンパク質の生産能力
を向上させるために一般的に添加される各種の成分を添
加することも好ましい。これらの成分として、緩衝液，
鋳型遺伝子の転写に使用される４種類のヌクレオチド３
リン酸やＲＮＡポリメラーゼ，翻訳に使用される各種の
アミノ酸，トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ），ポリエ
チレングリコール，リン酸化酵素等を例示することがで
きる。

【００７１】（鋳型遺伝子）鋳型遺伝子は、目的とする
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタン
パク質をコードする核酸を含む限りにおいて、その構成
を限定されない。前記核酸の塩基配列に適当な制御配列
を連結することが好ましい。例えば、上流にプロモータ
ーを付加したり、下流にターミネーターを付加すること
ができる。プロモーターからターミネーターまでの遺伝
子を適当なベクターに挿入したものも使用できるし、プ
ロモーターからターミネーターまでの遺伝子をＰＣＲで
増幅した断片も使用できる。

【００７２】（分子間及び／又は分子内ジスルフィド結
合を有するタンパク質）本発明において、「分子間及び
／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質」と
は、分子間及び／又は分子内で形成される特定のジスル
フィド結合によって一定の空間的コンフォメーションが
構成され、そのことがタンパク質の機能発現に不可欠で
あるタンパク質を言う。

【００７３】この種のタンパク質の種類は限定されな
い。例えば、分子間ジスルフィド結合を有するタンパク
質としては、Ｌ鎖とＨ鎖との間で分子間ジスルフィド結
合が形成される抗体や、インシュリン、α−キモトリプ
シン等が代表的である。例えば、分子内ジスルフィド結
合を有するタンパク質としては、後述する各種の金属含
有タンパク質や、ＮＯｘリダクターゼ等の還元酵素、ト
リプシン、リボヌクレアーゼＡ等が代表的である。

【００７４】（抗体）本発明において、抗体とは、分子
間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタンパク
質であって、Ｈ鎖とＬ鎖からなる一定の機能単位を構成
要素とするタンパク質を言う。抗体として IgG免疫グロ
ブリン抗体、 Fab抗体、 Fab' 抗体、F(ab')２抗体等の
抗原結合部位を１つ又は２つ含むタンパク質を例示でき
る。

【００７５】（金属含有タンパク質）本発明において、
金属含有タンパク質とは、分子間及び／又は分子内ジス
ルフィド結合を有するタンパク質であって、金属を含む
一定の機能単位を構成要素とし、活性型においては当該
機能単位が関与する特定の機能を示すようなタンパク質
を言う。この条件に合致する限りにおいて金属含有タン
パク質の種類、金属を含む機能単位の種類、金属の種類
は限定されない。

【００７６】金属含有タンパク質としては、例えば、鉄
（Fe）を含むヘム含有タンパク質である酵素ペルオキシ
ダーゼや酸素運搬タンパク質ヘモグロビン、銅（Cu）を
含有する酸素運搬タンパク質ヘモシアニン、カルシウム
（Ca）と結合したシグナル伝達関連タンパク質カルモジ
ュリン、等を挙げることができる。

【００７７】ペルオキシダーゼとしては、マンガンペル
オキシダーゼ，ホースラディッシュ（西洋ワサビ）ペル
オキシダーゼ，チトクロームｃペルオキシダーゼ，リグ
ニンペルオキシダーゼ等を例示することができる。

【００７８】金属を含む機能単位の種類は限定されない
が、金属錯体が代表的であり、上記ペルオキシダーゼや
ヘモグロビンにおけるFe−ポルフィリン錯体であるヘミ
ン等を挙げることができる。

【００７９】（シャペロン機能を有するタンパク質）シ
ャペロン機能を有するタンパク質とは、対象とする一定
のタンパク質を正しい立体構造に修復させ、更にはその
ことにより対象とするタンパク質本来の特定の機能を発
現可能にする働きを持つタンパク質を言う。シャペロン
機能を有するタンパク質としては、例えば、対象とする
タンパク質におけるジスルフィド結合を正しく形成させ
る（ジスルフィド結合の掛け直しをさせる）ことにより
シャペロン機能を奏するものが例示される。その他に
も、アグリゲーションの溶解、前駆体タンパク質の安定
化、アグリゲーションの抑制等によりシャペロン機能を
奏するもの等が例示され、更にシャペロン機能に類似し
たシャペロン様機能を奏するものも例示される。

【００８０】本発明において、シャペロン機能（又はシ
ャペロン様機能）を有するタンパク質として最も好まし
いものはＰＤＩ（プロテイン・ジスルフィド・イソメラ
ーゼ）、とりわけカビＰＤＩである。他種のシャペロン
機能を有するタンパク質、例えば実施例で使用している
ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳの他、Ｇ
ｒｅｐＥ、Ｔｘ等も限定なく使用できる。

【００８１】（タンパク質のスクリーニング方法）本発
明に係るタンパク質のスクリーニング方法は、上記した
分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタン
パク質の生産方法をタンパク質の分子進化工学に応用す
るものである。

【００８２】より具体的には、鋳型遺伝子として、任意
の分子間及び／又は分子内ジスルフィド結合を有するタ
ンパク質をコードする核酸の塩基配列に特定の又はラン
ダムな多様な変更を加える。こうして準備された多数種
の鋳型遺伝子を上記のタンパク質の生産方法によって転
写・翻訳させる。そして、生産される多様なタンパク質
が、活性を検出可能な程度ないしは非常に大量に活性型
を含む点を利用して、活性型タンパク質を大規模にしか
も迅速にスクリーニングするのである。

【００８３】本発明に係るタンパク質のスクリーニング
方法も、前記した (c)〜(e) の実施形態において特に好
ましく行われる。又、金属含有タンパク質を対象とする
場合には、所定の鋳型遺伝子と共に金属含有タンパク質
における金属を含む機能単位を添加することが好まし
い。

【００８４】本発明に係るタンパク質のスクリーニング
方法によれば、転写・翻訳反応液を数μｌ調製すればス
クリーニングができるので、短時間でスクリーニングが
可能となる。そして例えばタンパク質立体構造のコンピ
ュータモデルとの組合わせで、目的のタンパク質の効率
的デザインが可能となる。

【００８５】（タンパク質の機能検索方法）本発明に係
るタンパク質の機能検索方法は、上記したタンパク質の
生産方法を、機能の発現に特定パターンの分子間ジスル
フィド結合の形成を必要とするタンパク質であって機能
（の少なくとも一部）が未知のタンパク質の機能検索に
応用するものである。より具体的には、無細胞抽出液に
機能未知である任意のタンパク質をコードする鋳型遺伝
子を添加し、生産された活性型タンパク質の機能を検索
するのである。機能の発現に特定パターンの分子間ジス
ルフィド結合の形成を必要とするタンパク質としては、
その種類は限定されないが、任意の機能を有するタンパ
ク質複合体のサブユニットを構成するタンパク質を例示
できる。このようなタンパク質複合体の種類も限定され
ないが、Ｌ鎖とＨ鎖からなる抗体を例示できる。機能検
索方法の対象となるタンパク質としては、前記の金属含
有タンパク質も例示できる。

【００８６】本発明に係るタンパク質の機能検索方法
も、前記した (c)〜(e) の実施形態において特に好まし
く行われる。又、金属含有タンパク質を対象とする場合
には、所定の鋳型遺伝子と共に金属含有タンパク質にお
ける金属を含む機能単位を添加することが好ましい。

【００８７】本発明に係るタンパク質の機能検索方法に
より、近年のバイオインフォーマティクス（プロテオミ
クス）で問題であった機能未知のタンパク質の機能推定
が容易となり、産業上のメリットが大きい。

【００８８】

【実施例】（実施例１−１：マンガンペルオキシダーゼ
の生産）ヘムタンパク質であって分子内ジスルフィド結
合を有するマンガンペルオキシダーゼの合成反応を行っ
た。即ち、ホモジナイザー処理や遠心分離を含む通常の
調製法に従い、大腸菌Ａ１９株由来のＳ３０菌体の抽出
液を調製した。この菌体抽出液に対して、鋳型遺伝子と
ヘミンを含む以下の１）〜１５）の成分を添加し、２５
°Ｃで２時間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。
なお、菌体抽出液に対してＤＴＴ（ジチオスレイトー
ル）等の還元剤は添加しなかった。

【００８９】１）鋳型遺伝子：配列番号１に塩基配列を
示す白色腐朽菌由来のマンガンペルオキシダーゼ（Ｍｎ
Ｐ）遺伝子の上流にT7プロモーターとリボソーム結合部
位、下流にT7ターミネーターを付加したＰＣＲ反応産物
を５０μｇ／ｍｌ ２）１０μＭ ヘミン ３）５６．４ｍＭ Tris-酢酸緩衝液（ｐＨ７．４） ４）１．２ｍＭ ＡＴＰ、各１ｍＭのＧＴＰ，ＣＴＰ，
ＵＴＰ ５）４０ｍＭ クレアチンフォスフェート ６）０．７ｍＭ アミノ酸ミックス（生体タンパク質を
構成する２０種類のアミノ酸混合物） ７）４．１％（Ｗ／Ｗ） ポリエチレングリコール６０
００ ８）３５μｇ／ｍｌ フォリン酸 ９）０．２ｍｇ／ｍｌ 大腸菌ｔＲＮＡ １０）３６ｍＭ 酢酸アンモニウム １１）０．１５ｍｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ １２）１０ｍＭ 酢酸マグネシウム １３）１００ｍＭ 酢酸カリウム １４）１０μｇ／ｍｌ リファンピシン １５）７．７μｇ／ｍｌ T7ＲＮＡポリメラーゼ
。

【００９０】上記の転写・翻訳反応の後、通常の方法に
て反応産物のウェスタンブロッティング及びオートラジ
オグラフィを行い（１４Ｃ−ロイシンで標識）、ＭｎＰ
と同じ分子量にメインバンドがあることを確認した。バ
ンドの濃度から推定される菌体抽出液中のＭｎＰの生産
量は１０μｇ／ｍｌ程度であった。

【００９１】又、上記の転写・翻訳反応を２時間行った
時点での菌体抽出液２００μｌを分取し、生産されたＭ
ｎＰに付加してあるHis-tag を利用して、ＭｎＰをHis-
tagビーズに吸着させて精製・濃縮し、そのＭｎＰ活性
を測定した。

【００９２】このＭｎＰ活性測定は次のように行った。
即ち、２００μｌの２５ｍＭ コハク酸緩衝液（ｐＨ
４．５）に対して０．５ｍＭ 硫酸マンガン、２ｍＭ
シュウ酸及び５ｍＭ ＡＢＴＳ（2,2'-azinobis 3-ethy
lbenzothiazoline-6-sulfonate）を含ませた溶液に、
０．１ｍＭの過酸化水素を加えたもの（酵素活性測定
液）を調製した。次いでこの酵素活性測定液に上記のＭ
ｎＰを吸着したビーズを加え、２５°Ｃで５分間の反応
を行わせた後、４１５ｎｍでの吸光度を測定した。その
結果を図１の「 MnP(-DTT)」の欄に示す。この結果か
ら、生産されたＭｎＰの内、活性型は約１％であると推
定された。

【００９３】（比較例）上記実施例１−１のin vitro転
写・翻訳系でタンパク質合成を行うに際して、更に還元
剤ＤＴＴを１．７６ｍＭ加えた点以外は上記と同様に行
った比較例と、上記実施例１のin vitro転写・翻訳系で
タンパク質合成を行うに際して、鋳型遺伝子を添加しな
かった点以外は上記と同様に行った比較例とを行った。
これらについても同上の要領でＭｎＰ活性測定を行っ
た。その吸光度測定の結果を図１の「 MnP(+DTT)」の欄
と「鋳型なし」の欄に示すが、いずれの比較例も発色の
程度が極めて低く、活性型ＭｎＰは含まれないと考えら
れる。

【００９４】（実施例１−２：シャペロン機能を有する
タンパク質の添加効果）上記実施例１−１のin vitro転
写・翻訳系でタンパク質合成を行うに際して、無細胞抽
出液中にそれぞれ以下の１６）〜２０）に示すシャペロ
ニン又はＰＤＩを添加した。なお１９）の牛ＰＤＩと２
０）のカビＰＤＩについては、１ｍＭＧＳＨ及び０．１
ｍＭ ＧＳＳＧを併せて添加した。

【００９５】１６）１μＭ ＤｎａＫ及び０．４μＭ
ＤｎａＪ １７）１．２５μＭ ＧｒｏＥＬ及び１．２５μＭ Ｇ
ｒｏＥＳ １８）上記１６）と１７）のシャペロニンを併せ加えた
もの １９）３２μｇ／ｍｌ 牛ＰＤＩ（市販品）。

【００９６】２０）３２μｇ／ｍｌ カビＰＤＩ（特開
平６−３８７５２に開示のもの） これらの例を上記実施例１−１と同様に行い、反応後に
ＭｎＰをHis-tag ビーズに吸着させて精製・濃縮したも
のについて、実施例１−１と同様の要領で、ＭｎＰ活性
測定（吸光度測定）を行った。その結果を図２に示す。
図２において、「 MnP」の欄は前記実施例１−１の結果
を、「MnP+DnaK/J」は上記１６）の結果を、「MnP+GroE
L/ES」は上記１７）の結果を、「 DnaK/J,GroEL/ES」は
上記１８）の結果を、「MnP+牛PDI 」は上記１９）の結
果を、「MnP+カビPDI 」は上記２０）の結果を、「鋳型
なし」は前記実施例１−１における鋳型遺伝子を添加し
なかった比較例の結果を、それぞれ示す。

【００９７】図２の結果から明らかなように、シャペロ
ン機能を有するタンパク質を添加することにより、活性
型として正しくフォールディングされたＭｎＰの割合が
増大する効果が明らかに観察され、特にＰＤＩを添加し
た場合の効果が著しかった。とりわけカビＰＤＩを添加
した場合の効果が著しく、この場合の活性型は約２５％
であると推定された。

【００９８】一方、上記の各例の内、上記２０）の例に
ついて、所定の時間反応させた後の菌体抽出液をそのま
ま（His-tag ビーズにより精製・濃縮せずに）分取し、
実施例１−１と同じ酵素活性測定液にその１μｌを加え
てＭｎＰ活性測定（吸光度測定）を行った。その結果を
図３に「 MnP+PDI」のグラフとして示す。なお、前記実
施例１−１における鋳型遺伝子を添加しなかった比較例
についても、同様の測定を行った。その結果を図３に
「鋳型なし」のグラフとして示す。「 MnP+PDI」のグラ
フから分かるように、この場合にはＭｎＰ活性を十分に
検出できる。

【００９９】（実施例２：リグニンペルオキシダーゼの
生産）ヘムタンパク質であって分子内ジスルフィド結合
を有するリグニンペルオキシダーゼ（ＬｉＰ）につい
て、上記ＭｎＰ合成の最適条件と同じ条件でタンパク質
合成反応を行わせた。

【０１００】即ち、実施例１−１と同じ菌体抽出液に対
して、前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同量のＬｉＰ鋳型遺伝子
と、実施例１−１に前記した２）〜１５）の成分と、実
施例１−２に前記した２０）の成分とを添加した。この
ＬｉＰ鋳型遺伝子の塩基配列は公知であり、GENEBANK/
×76689, Nucleic Acids Res(1988) vol16, 1219pageに
開示されている。又、ＬｉＰ鋳型遺伝子も、前記ＭｎＰ
鋳型遺伝子と同様に上流にT7プロモーターとリボソーム
結合部位、下流にT7ターミネーターを付加したものであ
る。そして、この菌体抽出液によって、２５°Ｃで２時
間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。なお、菌体
抽出液に対してＤＴＴ等の還元剤は添加しなかった。

【０１０１】又、上記の転写・翻訳反応を１時間行った
時点での菌体抽出液２００μｌを分取し、生産されたＬ
ｉＰに付加してあるHis-tag を利用して、ＬｉＰをHis-
tagビーズに吸着させて精製・濃縮し、そのＬｉＰ活性
を測定した。

【０１０２】このＬｉＰ活性測定は次のように行った。
即ち、２００μｌの５０ｍＭ コハク酸緩衝液（ｐＨ
４．５）に対して０．５ｍＭ ベラトリルアルコール及
び５ｍＭ ＡＢＴＳを含ませた溶液に、０．４ｍＭの過
酸化水素を加えたもの（酵素活性測定液）を調製した。
次いでこの酵素活性測定液に上記のＬｉＰを吸着したビ
ーズを加え、２５°Ｃで５分間の反応を行わせた後、４
１５ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を図９におけ
る「 LiP+PDI」のグラフとして示す。

【０１０３】図９には、ＬｉＰの鋳型遺伝子を添加しな
かった点以外は上記と同じ組成の菌体抽出液を用いてタ
ンパク質合成反応を行わせた場合の同上の測定結果を
「鋳型なし」のグラフとして示す。又、前記２０）の成
分を添加しなかった点以外は上記と同じ組成の菌体抽出
液を用いてタンパク質合成反応を行わせた場合の同上の
測定結果を「 LiP」のグラフとして示す。図９から分か
るように、「 LiP」のグラフや「鋳型なし」のグラフは
実質的にＬｉＰ活性が認められず、これらに対して「 L
iP+PDI」は有効なＬｉＰ活性が認められた。

【０１０４】（実施例３：in vitro転写・翻訳系におけ
る還元剤排除の効果）コルチゾールに対する Fab抗体
（分子間Ｓ−Ｓ結合を有する）について、上記ＭｎＰ合
成の最適条件と同じ条件でタンパク質合成反応を行わせ
た。

【０１０５】即ち、実施例１−１と同じ菌体抽出液に対
して、前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と同量の Fab抗体鋳型遺伝
子と、実施例１−１に前記した２）〜１５）の成分と、
実施例１−２に前記した２０）の成分とを添加した。こ
の Fab抗体鋳型遺伝子の塩基配列は公知であり、特許出
願公開２０００−１３９４６０号公報に開示されてい
る。又、 Fab抗体鋳型遺伝子も前記ＭｎＰ鋳型遺伝子と
同様に上流にT7プロモーターとリボソーム結合部位、下
流にT7ターミネーターを付加したものである。

【０１０６】なお、この Fab抗体のin vitroでの転写・
翻訳として、還元剤を添加しない系と、還元剤としてＤ
ＴＴを１．７６ｍＭ添加した系とを設定した。そしてこ
れらの菌体抽出液について、２５°Ｃで２時間、in vit
roでの転写・翻訳反応を行って、それぞれ Fab抗体の生
産を試みた。次いで、通常の方法でウェスタンブロッテ
ィングを行った。その結果を図４に示す。図４から分か
るように、分子量マーカーとの対比により、「-DTT」で
示す還元剤を添加しない系では Fab抗体の生産及び活性
を確認した。「+DTT」で示すＤＴＴを添加した系では、
Ｌ鎖とＨ鎖との生産が認められるものの、この両者間で
分子間ジスルフィド結合を形成できないために、活性な
Fab抗体を生産できていない。

【０１０７】（実施例４：熱安定化変異ＭｎＰのスクリ
ーニング）ＭｎＰ遺伝子を、error-prone PCR(10 mM Tr
is-HCl pH9.0, 50 mM KCl, 0.1％TritonX-100, 7 mM Mg
Cl２, 0.7 mM MnCl２, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 m
MdCTP, 1 mM dTTP, 100 ng/ μl MnP, 0.3 μM prime
r, 25 mU/μl Promega TaqDNA polymerase) により増幅
し、１００塩基当たり平均１．５個の変異（エラー率
１．５％）をランダムに導入したライブラリーを作製し
た。

【０１０８】そして平均１分子／ウェルまで希釈した後
に宝酒造社製 LA Taq polymeraseを用いて、94°C-2 mi
n.96°C-10 sec., (Tm-5) °C-5 sec., 72°C-1.6 min.
: 65 cycles72°C-7 min.でＰＣＲを行った。

【０１０９】次に、前記大腸菌Ａ１９株由来のＳ３０菌
体抽出液に対して実施例１−１に示した２）〜１５）の
成分と、実施例１−２に示した２０）の成分とを添加し
た。そして、この菌体抽出液の３７μｌに対して上記の
ＰＣＲ産物各３μｌを鋳型として加え、２５°Ｃで３時
間、in vitroでの転写・翻訳反応を行った。

【０１１０】その後、合成産物各１．５μｌを実施例１
−１と同じ酵素活性測定液１００μｌに添加し、６０°
Ｃで２５分間のインキュベートの後、これに終濃度０．
１ｍＭとなるように過酸化水素を添加し、４１５ｎｍで
の吸光度測定によってＭｎＰ活性を測定した。

【０１１１】本実施例に係る上記合成産物について、ハ
イスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が可能な３８
４穴プレート（１〜２４列×Ａ〜Ｐ列）でのスクリーニ
ングの結果を図５に示すが、図示のようにポジティブク
ローンが確実に検出できている。

【０１１２】更に、３８４穴プレート１６枚（６１４４
ウェル分）についてスクリーニングした結果、上記した
６０°Ｃで２５分間のインキュベート後にＭｎＰ活性を
示す１次ポジティブクローン４個を取得した。これらの
Ｎｏ．１〜Ｎｏ．４のクローンのＭｎＰ活性を図６に示
す。同時に図示するように、変異導入前のＭｎＰ（野生
型ＭｎＰ）では、このような温度処理後は活性を示さな
い。

【０１１３】（実施例５：過酸化水素安定化変異ＭｎＰ
のスクリーニング）ＭｎＰにおける過酸化水素結合ポケ
ットの入り口に位置する３個のアミノ酸（７９番目のア
ラニン、８１番目のアスパラギン、８３番目のイソロイ
シン）を、それぞれ２０種類のアミノ酸へ変換した変異
ライブラリー（ＮＮＳ変異；Ｎ＝Ａ，Ｇ，Ｃ or Ｔ、Ｓ
＝Ｃ or Ｇ）を作製した。変異ライブラリーを平均１分
子／ウェルまで希釈した後に、前記 LA Taq polymerase
を用いて実施例４の場合と同じ条件でＰＣＲを行った。

【０１１４】次に、実施例４で用いたものと同じ無細胞
タンパク質合成反応液３７μｌに対して上記のＰＣＲ産
物各３μｌを鋳型として加え、転写・翻訳共役反応を行
った。そして合成産物各１．５μｌを実施例１−１と同
じ酵素活性測定液１００μｌに添加し、これに終濃度１
ｍＭとなるように過酸化水素を添加し、４１５ｎｍでの
吸光度測定によってＭｎＰ活性を測定した。

【０１１５】本実施例に係る上記合成産物について、実
施例４と同様のＨＴＳを３８４穴プレート１０枚（３８
４０ウェル分）を用いて行った。そのスクリーニングの
結果を図７に示すが、図示のように終濃度１ｍＭの過酸
化水素存在下でＭｎＰ活性を示す１次ポジティブクロー
ン１２個（図の No.１〜 No.１２のクローン）を取得し
た。同時に図示するように、野生型ＭｎＰでは、このよ
うな過酸化水素処理後は活性を示さない。

【０１１６】次に過酸化水素安定性を詳細に評価した。
即ち、上記の１次ポジティブクローン１２個を用いた転
写・翻訳共役反応の合成産物を、それぞれ、０．１ｍ
Ｍ、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭの過酸化水素の存在下
で、３７°Ｃで５分間インキュベートした。その後、過
酸化水素濃度が０．５ｍＭ及び１．０ｍＭであるものに
ついては、過酸化水素濃度が０．１ｍＭになるまで、５
０ｍＭ コハク酸緩衝液で希釈した。

【０１１７】次に、これらの過酸化水素濃度が０．１ｍ
Ｍである合成産物に対して、実施例１−１で前記した酵
素活性測定液であって過酸化水素を含まないものを１０
０μｌ添加し、これに終濃度１ｍＭとなるように過酸化
水素を添加し、４１５ｎｍでの吸光度測定によってＭｎ
Ｐ活性を測定した。その結果、 No.１〜 No.１２のクロ
ーンの内、 No.１，２，４，６，８の５個のクローンに
おいて、野生型ＭｎＰよりも過酸化水素に対する安定性
が向上していた。これら５個の２次ポジティブクローン
について、０．１ｍＭ過酸化水素の存在下で４°Ｃで５
分間インキュベートした後のＭｎＰ活性を１００％とし
た場合における残存活性を、図８に示す。

【０１１８】上記の５個の２次ポジティブクローンのア
ミノ酸配列を決定して、野生型ＭｎＰのアミノ酸配列と
比較した。その結果を表１に示す。

【０１１９】

【表１】 表１では野生型ＭｎＰを「変異なし」と表記し、そのア
ミノ酸配列の一部を１文字表記式により「アミノ酸配
列」の欄に記載している。このアミノ酸部分配列中、左
から２番目の「Ａ」は７９番目のアラニン、左から４番
目の「Ｎ」は８１番目のアスパラギン、左から６番目の
「Ｉ」は８３番目のイソロイシンである。そして表から
分かるように、いずれの２次ポジティブクローンにおい
ても、（ａ）７９番目のアラニンがグルタミン酸又はセ
リンに変換され、（ｂ）８１番目のアスパラギンがセリ
ン又はロイシンに変換され、（ｃ）８３番目のイソロイ
シンがロイシンに変換されていることが分かった。

【０１２０】（実施例の評価）上記の各実施例から明ら
かなように、本発明によれば、無細胞抽出液を用いて、
活性型の金属含有タンパク質あるいは分子間及び／又は
分子内ジスルフィド結合を有するタンパク質を効果的に
生産することができ、更に本発明のバイオインフォマテ
ィクスへの応用が可能である。

【配列表】 ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ <110> KABUSHIKI KAISHA TOYOTA CHUO KENKYUSHO <120> タンパク質生産方法、タンパク質のスクリーニング方法及びタンパク質の 機能検索方法 <130> POK-02-023 <160> 1 <210> 1 <211> 1074 <212> DNA <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 1 gca gtc tgt cca gac ggc acc cgc gtc act aac gca gct tgt tgc gca 48 Ala Val Cys Pro Asp Gly Thr Arg Val Thr Asn Ala Ala Cys Cys Ala 5 10 15 ttt att cca ctg gct caa gac ctc cag gag acc ctc ttc cag ggc gac 96 Phe Ile Pro Leu Ala Gln Asp Leu Gln Glu Thr Leu Phe Gln Gly Asp 20 25 30 tgc ggt gaa gat gcg cat gag gtc att cgt ctt acc ttc cac gac gcc 144 Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Val Ile Arg Leu Thr Phe His Asp Ala 35 40 45 att gct atc tct cag agc ctg gga ccc cag gcc ggc ggt ggt gct gac 192 Ile Ala Ile Ser Gln Ser Leu Gly Pro Gln Ala Gly Gly Gly Ala Asp 50 55 60 ggc tcc atg ctg cac ttc ccg acc atc gag ccg aat ttt tcg gcg aac 240 Gly Ser Met Leu His Phe Pro Thr Ile Glu Pro Asn Phe Ser Ala Asn 65 70 75 80 aac ggc att gac gac tcc gtg aac aac ctt atc ccc ttc atg cag aag 288 Asn Gly Ile Asp Asp Ser Val Asn Asn Leu Ile Pro Phe Met Gln Lys 85 90 95 cac aac acg atc agc gcc gct gac ctc gtc cag ttc gcg gga gcc gtt 336 His Asn Thr Ile Ser Ala Ala Asp Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Val 100 105 110 gct ctc agt aac tgc ccc ggc gcc cct cgc ctc gag ttc ctc gct ggt 384 Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Arg Leu Glu Phe Leu Ala Gly 115 120 125 cgc ccg aac acg act att ccc gca gtc gag ggc ctc atc cct gag ccg 432 Arg Pro Asn Thr Thr Ile Pro Ala Val Glu Gly Leu Ile Pro Glu Pro 130 135 140 cag gac agt gtc acc aaa att cta caa cgc ttc gag gac gca ggg aac 480 Gln Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu Gln Arg Phe Glu Asp Ala Gly Asn 145 150 155 160 ttc tcg cct ttt gag gtc gta tcc ctc ctc gcc tct cac act gtt gct 528 Phe Ser Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Leu Ala Ser His Thr Val Ala 165 170 175 cgt gca gac aag gtc gac gag acc atc gac gcc gca ccc ttc gat tcc 576 Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Thr Ile Asp Ala Ala Pro Phe Asp Ser 180 185 190 acg cct ttc act ttc gac acc cag gtc ttc ctc gag gtc ctt ctg aag 624 Thr Pro Phe Thr Phe Asp Thr Gln Val Phe Leu Glu Val Leu Leu Lys 195 200 205 ggt acc ggc ttc cct gga tcg aac aac aac acc ggt gag gtc atg tcc 672 Gly Thr Gly Phe Pro Gly Ser Asn Asn Asn Thr Gly Glu Val Met Ser 210 215 220 cca ctt ccc ctc ggc agc ggc agc gac acg ggc gag atg cgc ctg cag 720 Pro Leu Pro Leu Gly Ser Gly Ser Asp Thr Gly Glu Met Arg Leu Gln 225 230 235 240 tct gac ttt gcg ctc gcg cgc gac gag cgc acg gcg tgc ttc tgg cag 768 Ser Asp Phe Ala Leu Ala Arg Asp Glu Arg Thr Ala Cys Phe Trp Gln 245 250 255 tcg ttc gtc aac gag cag gag ttc atg gcg gcg agc ttc aag gcc gcg 816 Ser Phe Val Asn Glu Gln Glu Phe Met Ala Ala Ser Phe Lys Ala Ala 260 265 270 atg gcg aag ctc gcg atc ctc ggc cac agc cgc agc agc ctc atc gac 864 Met Ala Lys Leu Ala Ile Leu Gly His Ser Arg Ser Ser Leu Ile Asp 275 280 285 tgc agc gac gtc gtc ccc gtg ccg aag ccc gcc gtc aac aag ccc gcg 912 Cys Ser Asp Val Val Pro Val Pro Lys Pro Ala Val Asn Lys Pro Ala 290 295 300 acg ttc ccc gcg acg aag ggc ccc aag gac ctc gac aca ctc acg tgc 960 Thr Phe Pro Ala Thr Lys Gly Pro Lys Asp Leu Asp Thr Leu Thr Cys 305 310 315 320 aag gcc ctc aag ttc ccg acg ctg acc tct gac ccc ggt gct acc gag 1008 Lys Ala Leu Lys Phe Pro Thr Leu Thr Ser Asp Pro Gly Ala Thr Glu 325 330 335 acc ctc atc ccc cac tgc tcc aac ggc ggc atg tcc tgc cct ggt gtt 1056 Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asn Gly Gly Met Ser Cys Pro Gly Val 340 345 350 cag ttc gat ggc cct gcc 1074 Gln Phe Asp Gly Pro Ala 355 358

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１−１におけるＭｎＰ活性の測定結果を
示すグラフである。

【図２】実施例１−２におけるＭｎＰ活性の測定結果を
示すグラフである。

【図３】実施例１−２において、ＭｎＰを精製・濃縮せ
ずに行ったＭｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。

【図４】実施例３におけるウェスタンブロッティングの
結果を示す写真である。

【図５】実施例４におけるＨＴＳによるポジティブクロ
ーンの検出結果を示す３次元グラフである。

【図６】実施例４における１次ポジティブクローンのＭ
ｎＰ活性の測定結果を示すグラフである。

【図７】実施例５における変異ＭｎＰのスクリーニング
の結果を示すグラフである。

【図８】実施例５における変異ＭｎＰの活性の測定結果
を示すグラフである。

【図９】実施例２におけるＬｉＰ活性の測定結果を示す
グラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 中野 秀雄 愛知県岩倉市東町藤塚67 グリーンシティ 岩倉50 ２ (72)発明者 山根 恒夫 愛知県名古屋市千種区若水３−22−１ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA11 DA36 4B024 AA11 BA07 BA08 BA80 CA02 GA30 HA01 4B050 CC03 DD02 EE10 LL03 4B064 AG01 CA50 CC24 DA01

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分子間及び／又は分子内ジスルフィド結
   合を有するタンパク質の鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添
   加するプロセスと、 この無細胞抽出液を用いて、前記分子間及び／又は分子
   内ジスルフィド結合を有するタンパク質を生産するプロ
   セスと、を含むタンパク質の生産方法。
2. 【請求項２】 前記無細胞抽出液に対して、前記鋳型遺
   伝子と共に１種又は２種以上のシャペロン機能を有する
   タンパク質を添加する、請求項１に記載のタンパク質の
   生産方法。
3. 【請求項３】 前記シャペロン機能を有するタンパク質
   がプロテイン・ジスルフィド・イソメラーゼ（ＰＤＩ）
   である、請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
4. 【請求項４】 前記シャペロン機能を有するタンパク質
   が、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ、Ｇ
   ｒｅｐＥ又はチオレドキシン（Ｔｘ）である、請求項２
   に記載のタンパク質の生産方法。
5. 【請求項５】 前記無細胞抽出液からは還元剤が排除さ
   れている、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
6. 【請求項６】 前記無細胞抽出液からは還元剤が排除さ
   れている、請求項２に記載のタンパク質の生産方法。
7. 【請求項７】 前記分子間及び／又は分子内ジスルフィ
   ド結合を有するタンパク質が抗体である、請求項１に記
   載のタンパク質の生産方法。
8. 【請求項８】 前記抗体を、無細胞抽出液のままで活性
   測定を行い得る濃度で、活性型として無細胞抽出液中に
   得る、請求項７に記載のタンパク質の生産方法。
9. 【請求項９】 前記分子間及び／又は分子内ジスルフィ
   ド結合を有するタンパク質が金属含有タンパク質であ
   る、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
10. 【請求項１０】 前記無細胞抽出液に対して、前記鋳型
    遺伝子と共に金属を含む機能単位を添加する、請求項９
    に記載のタンパク質の生産方法。
11. 【請求項１１】 前記金属含有タンパク質の少なくとも
    一部を、前記金属を含む機能単位が関与する特定の機能
    を示す活性型として得る、請求項１０に記載のタンパク
    質の生産方法。
12. 【請求項１２】 前記金属を含む機能単位が金属錯体で
    ある、請求項１０に記載のタンパク質の生産方法。
13. 【請求項１３】 前記金属錯体がヘミンである、請求項
    １２に記載のタンパク質の生産方法。
14. 【請求項１４】 前記金属含有タンパク質がヘム含有酵
    素である、請求項９に記載のタンパク質の生産方法。
15. 【請求項１５】 前記ヘム含有酵素がペルオキシダーゼ
    である、請求項１４に記載のタンパク質の生産方法。
16. 【請求項１６】 前記金属含有タンパク質を、無細胞抽
    出液のままで活性測定を行い得る濃度で、活性型として
    無細胞抽出液中に得る、請求項９に記載のタンパク質の
    生産方法。
17. 【請求項１７】 前記無細胞抽出液が大腸菌に由来する
    ものである、請求項１に記載のタンパク質の生産方法。
18. 【請求項１８】 分子間及び／又は分子内ジスルフィド
    結合を有する任意の種類のタンパク質をコードする核酸
    の塩基配列に対して特定の又はランダムな塩基配列の変
    更を加えてなる鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプ
    ロセスと、この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子により
    コードされたタンパク質を生産するプロセスと、 生産されたタンパク質を活性の測定によりスクリーニン
    グするプロセスと、を含むタンパク質のスクリーニング
    方法。
19. 【請求項１９】 機能の発現に特定のパターンの分子間
    及び／又は分子内ジスルフィド結合の形成を必要とし、
    該機能の少なくとも一部が未知である任意のタンパク質
    をコードする鋳型遺伝子を無細胞抽出液に添加するプロ
    セスと、 この無細胞抽出液を用いて鋳型遺伝子によりコードされ
    たタンパク質を生産するプロセスと、 生産されたタンパク質の機能の試験により該タンパク質
    の未知の機能を検索するプロセスと、を含むタンパク質
    の機能検索方法。
20. 【請求項２０】 前記タンパク質が、任意の機能を有す
    るタンパク質複合体のサブユニットを構成するタンパク
    質である、請求項１９に記載のタンパク質の機能検索方
    法。
21. 【請求項２１】 前記タンパク質複合体が抗体である、
    請求項２０に記載のタンパク質の機能検索方法。