KR102023348B1

KR102023348B1 - BaCYP106A2 효소 단백질, 그의 결정화 방법 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102023348B1
Application number: KR1020180027971A
Authority: KR
Inventors: 이준혁; 박현; 오태진
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2019-09-20
Also published as: KR20190106446A

Abstract

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질 전환된 형질 전환체, 상기 단백질의 제조방법, 단백질 결정, 결정화 방법, 상기 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 스테로이드 히드록시화 방법에 관한 것이다. 본 발명의 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질을 이용하면 다양한 스테로이드 기질에 히드록시기를 특정 위치에 부착시킬 수 있어 기질 화합물의 용해도를 높일 수 있어 신약개발 또는 여러 가지 화학 반응에서 생촉매제 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 효소의 단백질 결정화 방법을 이용하면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화 효소를 효과적으로 결정화할 수 있다.

Description

BaCYP106A2 효소 단백질, 그의 결정화 방법 및 그의 용도{Enzyme Protein BaCYP106A2, Method for Crystallization of BaCYP106A2 protein, and Use thereof}

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질 전환된 형질 전환체, 상기 단백질의 제조방법, 단백질 결정, 결정화 방법, 상기 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 스테로이드 히드록시화 방법에 관한 것이다.

사이토크롬 P450(CYP 또는 P450) 효소는 주로 생체 이물 화합물(xenobiotic chemicals) 및 내인성 기질의 산화에 관여하고, 주로 인체의 중요 생리활성의 대사효소로써 작용하기 때문에 의약학적 측면에서 아주 중요한 단백질이며 원형동물, 식물, 동물, 곰팡이, 미생물에 존재하는 단백질 군으로 알려져 있다. 또한, 스테로이드, 담즙산, 지방산, 프로스타글란딘, 류코트리엔, 바이오제닉 아민 및 이차대사산물과 같은 세포내에서 생산되는 여러 산물의 산화, 과산화 및 환원 작용에 관여한다. CYP의 주된 역할은 여러 기질을 단일 산화시키는 것이다. 이 반응에는 산소분자와 NADPH 또는 NADH가 필요하며, 대부분의 세균성 CYP는 NADH로부터 필요한 전자를 얻는다. 이들은 알릴 위치, 이중결합 또는 비활성화된 C-H 결합에 산소원자를 결합시킨다. CYP는 헴-티오레이트를 포함하는 효소를 코딩하며, 주로 마크로라이드 항생제의 생합성 유전자 클러스터에 위치하여, 마크로라이드의 구조적 다양성을 가져오는 프리커서의 입체-특이적 및 부위-특이적 산화를 촉매한다(Lamb, D.C. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 307:610, 2003). 상기와 같은 CYP 효소들은 다양한 활성을 가지고 있어 산업상 활용 가능성이 높다.

생명체의 대부분의 생명활동은 20여개 아미노산의 조합으로 만들어진 단백질이라는 매개체를 통하여 유지된다. 각종 생체 내 반응을 촉매하고 조절하는 효소계는 물론이고, 각종 신호의 전달체계 역시 단백질이라는 사실은 단백질의 중요성을 예시한다. 한편 단백질은 각자의 독특한 기능을 나타내기 위해 폴딩(folding)을 통해 3차원 구조 또는 입체 구조를 형성하는데, 이러한 3차원 구조에 변형이 생기면 질병 발생의 주요 원인이 된다. 단백질의 3차원 구조 규명은 단백질의 기능을 정확하게 이해하기 위한 근본이 되며, 기능이 밝혀지지 않은 단백질의 3차원 구조 규명은 그 기능을 파악할 수 있는 중요한 수단이 된다. 따라서 선진국들은 게놈 프로젝트 이후, 단백질의 구조 규명을 위해 국가적인 노력을 경주하고 있다. 그러나 단백질의 3차원 구조는 각각의 폴리펩티드를 이루고 있는 아미노산 하나하나의 서열에 의하기 때문에 각각을 고려하여 만들어질 단백질의 구조를 예측하는 것은 무척 어려운 일이다.

이와 같이 중요한 구조를 예측하기 위해서 고순도로 정제된 재조합 단백질의 생산이 필요하고, 상기와 같이 생산된 재조합 단백질을 이용하여 결정화 및 삼차구조 해석을 통한 단백질의 결정 구조 정보로부터 단백질 공학을 이용하여 단백질 기질 특이성 및 효소의 특성을 알아내는 것이 중요하나, 아직까지 이에 대한 연구가 미흡한 실정이다.

이에 본 발명자들은 다양한 생물의 사이토크롬 P450(CYP) 효소를 연구하던 중 북극해에서 발견한 Bacillus sp. PAMC 23377 미생물 유래 사이토크롬 P450(CYP) 효소를 새롭게 발견하고 상기 효소를 대장균 발현 시스템을 이용하여 생산하였고, 상기 단백질 결정화의 최적의 조건을 확인하여 단백질결정의 삼차 구조 및 효소의 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 단백질의 제조방법, 단백질 결정, 결정화 방법, 상기 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물 및 상기 조성물을 이용한 스테로이드 히드록시화 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질을 코딩하는 핵산을 제공한다.

또한 본 발명은 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시켜 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제작하는 단계; 및 상기 제작된 형질전환체를 배양하여 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 공간군 P6122에 속하며 비대칭 유닛에 하나의 프로토머를 포함한 것을 특징으로 하는, 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화효소 단백질 결정을 제공한다.

또한 본 발명은 (ⅰ) 카코딜산나트륨(sodium cacodylate), HCl 및 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포함하는 저수조(reservior) 용액과 (ⅱ) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질 결정화 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물을 스테로이드에 처리하는 단계를 포함하는 스테로이드 히드록시화 방법을 제공한다.

본 발명의 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질을 이용하면 다양한 스테로이드 기질에 히드록시기를 특정 위치에 부착시킬 수 있어 기질 화합물의 용해도를 높일 수 있어 신약개발 또는 여러 가지 화학 반응에서 생촉매제 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한 본 발명의 효소의 단백질 결정화 방법을 이용하면 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화 효소를 효과적으로 결정화할 수 있다.

도 1은 정제된 Bacillus sp. PAMC 23377 유래 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화효소 단백질(BaCYP106A2)의 전기 영동 실험 결과(도 1A) 및 BaCYP106A2에 포함된 철의 환원으로 인한 자외선 스펙트럼 피크의 변화 결과(도 1B)를 나타낸 도이다.
도 2는 BaCYP106A2의 환원에 따른 파장 별 피크의 변화를 나타낸 도(도 2A) 및 4-안드로스테네온의 평형 해리 상수(K_d 값)을 통한 효소와 기질과의 친화성을 나타낸 결과(도 2B)를 나타낸 도이다.
도 3은 BaCYP106A2의 결정 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 BaCYP106A2의 리간드 결합 부위(도 4A) 및 BaCYP106A2의 리간드 결합 부위 중 소수성 포켓(도 4B)을 나타낸 도이다.
도 5는 BaCYP106A2(주황색)와 BmCYP106A2(파란색) 양 단백질 간 결정 구조의 차이를 나타낸 도(도 5A)이며, BaCYP106A2(주황색)와 BmCYP106A2(파란색)의 결정학상 B-factor 값의 결과를 그래프로 나타낸 도(도 5B)이다.
도 6은 in vitro에서의 4-안드로스테네온(도 6A) 및 난드롤론(도 6B)을 기질로 한 HPLC 크로마토그램 및 LC-MS 분석의 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질을 제공한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

상기 사이토크롬 P450 효소(CYP)는 색소 단백질인 헴단백질(hemoprotein)의 하나이며, 세포 내 다양한 종류의 크고 작은 분자를 기질로 하여 효소반응을 일으키는 효소 단백질로 그 활성 중 하나로 스테로이드 호르몬의 생합성에 관여한다고 알려져 있다. CYP 효소 중 하나인 BaCYP106A2는 북극해에서 발견한 Bacillus sp. PAMC 23377 미생물에서 유래한 효소로 48 kDa로 411개의 아미노산으로 이루어진 단백질이다. 본 발명의 단백질 효소 BaCYP106A2는 Val82, Leu239, Ala243, Phe289, Ile292, Leu294 및 Ala395로 구성된 소수성 포켓을 리간드 결합 부위로 하고 있다. 또한 BaCYP106A2에 포함된 철은 일산화탄소가 첨가되면 환원되어 자외선 스펙트럼의 peak 가 450 nm에서 420 nm로 변화한다. 또한 본 발명의 효소 BaCYP106A2는 4-안드로스테네온에 대한 387 ± 37 μM 의 K_d 값을 나타내 스테로이드 기질에 대해서 우수한 정도의 기질 친화도를 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화효소 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질 또는 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있다. 상기 “기능적 동등물”이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 CYP 효소의 활성을 유지하고 효소 및 결정 특성을 공유하는 단백질을 말한다.

본 발명의 BaCYP106A2는 다양한 스테로이드 기질에 히드록시기 잔기를 부착시킬 수 있으며, 상기 스테로이드 기질은 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone), 테스토스테론(Testosterone), 데옥시코르티코스테론아세테이트(Deoxycorticosterone acetate), 11-케토프로게스테론, 17α-메틸테스토스테론, 11α-히드록시프로게스테론, 아드레노스테론(Adrenosterone), 코르티코스테론 (corticosterone), 코르티손(cortisone), 프리드니손 (prednisone), 프레드니솔론 (prednisolone), 코르티솔 (cortisol) 및 덱사메타손 (dexamethasone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone), 테스토스테론(Testosterone), 데옥시코르티코스테론아세테이트(Deoxycorticosterone acetate), 11-케토프로게스테론, 17α-메틸테스토스테론 및 11α-히드록시프로게스테론으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

또한 본 발명의 BaCYP106A2는 다양한 스테로이드 기질에 히드록시기 잔기를 15β 위치에 부착시킬 수 있는 위치선택성(regioselectivity)을 가지며, 본 발명의 BaCYP106A2 효소의 15β 위치에 부착시킬 수 있는 위치선택성을 나타나는 스테로이드 기질은 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 및 테스토스테론(Testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 난드롤론(Nandrolone) 또는 4-안드로스테네온(4-androstenedione)일 수 있다.

본 발명에 있어서, 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)을 코딩하는 핵산은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 어떠한 염기서열도 가질 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 발현벡터는 상기 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)를 발현시킬 수 있는 복제가능한 어떤 발현벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 특정 표적 핵산의 발현의 조절에 유용한 프로모터를 함유하는 벡터로서 원핵생물, 진핵생물, 또는 양자 모두에 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 대장균에서 발현 가능한 프로모터를 갖는 벡터일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 전사 및 번역 종결(terminator), 전사 및 번역 개시(initiator) 서열을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 재조합 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있으며, 형질전환의 대상이 되는 숙주는 다양한 원핵생물 또는 진핵생물일수 있고, 바람직하게는 대장균일 수 있다. 상기 발현벡터로 형질전환시키기 위한 방법은 예컨대, 세균 원형질체의 융합, 전기천공법, 추진체 포격(projectile bombardment), 및 바이러스 벡터를 사용한 감염 등 특별히 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.

바람직하게 상기 서열번호 2의 염기서열을 가지며 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 단백질 발현벡터를 제조하는 단계, 및 상기 제조된 발현벡터를 미생물에 도입하여 형질전환시키는 단계를 포함하는 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)의 제조방법이 제공된다. 바람직하게는 상기 형질전환 단계 이후에 상기 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 배양에 사용되는 배지는 대장균을 비롯한 임의의 숙주 세포, 및 세포 내용물을 지지하거나 또는 함유할 수 있는 임의의 배양 배지, 용액, 고체, 반고체 또는 강성 지지체를 포함하며, 바람직하게는 LB 배지, SOB 배지 혹은 TB 배지가 될 수 있다.

또한 본 발명은 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질 결정을 제공한다.

본 발명의 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2) 결정은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 공간군 P6₁22에 속하며 비대칭 유닛에 하나의 프로모터를 포함하고 있다. 또한 본 발명의 BaCYP106A2 결정은 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a=77.658Å, b=77.658Å 및 c=282.216Å 및 α=β=90°, γ=120°이다. BaCYP106A2 결정 단백질 결정은 15 개의 알파-헬릭스(α-helix) 와 8 개의 베타가닥(β-strand)을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명의 BaCYP106A2 결정 구조는 하기 표 1과 같은 특징을 가지고 있다.

[표 1]

본 발명의 결정화 방법에 사용하는 저수조 용액은 침전제를 비롯하여, 완충액, 염, 세정제(detergent) 등이 다양한 농도로 섞여 있을 수 있으며, 단백질 용액과 이런 다양한 조건의 저수조 용액이 보통의 경우 약 1:1의 비율로 섞어서 결정화를 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 저수조 용액 중의 침전제뿐만 아니라 염, 완충액 및 세정제의 종류와 적정 농도, 용액의 pH 및 실험온도는 단백질의 종류에 따라 달리 선택될 수 있으며, 상기와 같은 용액 조건은 단백질의 결정 형성에 있어서 아주 중요한 요소가 되는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 결정화 방법에서는 카코딜산나트륨(sodium cacodylate), HCl 및 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포함하는 저수조 용액으로 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)에 대한 최적의 결정화 방법을 찾아내었다. 상기 저수조 용액은 0.01 내지 1M의 카코딜산나트륨, HCl 및 1 내지 5M의 황산암모늄을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.05 내지 0.5M의 카코딜산나트륨, HCl 및 1 내지 3M의 황산암모늄을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 M의 카코딜산나트륨, HCl 및 1.26 M의 황산암모늄을 포함할 수 있다. 또한 상기 저수조 용액은 HCl로 용액의 pH를 조절할 수 있으며, 저수조 용액의 pH는 5 내지 7일 수 있으며, 바람직하게는 pH가 6.5일 수 있다.

본 발명의 결정화 방법에 있어서, 단백질 용액은 0.1 내지 0.5㎕을 사용할 수 있고, 바람직하게는 0.15 내지 1.3㎕을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.2㎕을 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)을 이용하면 다양한 스테로이드 기질에 대하여 우수한 효소활성으로 히드록시기를 부착하여 히드록시화를 촉진할 수 있다. 특히, 본 발명의 BaCYP106A2는 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 및 테스토스테론(Testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스테로이드 기질의 15β 위치에 히드록시화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명은 사이토크롬 P450 스테로이드 히드록시화 효소 단백질(BaCYP106A2)을 포함하는 히드록시화 촉진용 조성물을 스테로이드에 처리하면 스테로이드 기질에 대하여 우수한 효율로 히드록시화가 가능하다. 특히, 본 발명의 BaCYP106A2는 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 및 테스토스테론(Testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스테로이드 기질의 15β 위치에 히드록시화 시킬 수 있다.

본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

사용한 화학물질 및 용매

스테로이드 기질인 4-안드로스테네온(4-androstenedione)과 난드롤론(nandrolone)은 도쿄 화학 공업 (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 일본)에서 구입하였고, isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(IPTG), 1,4-디티오트레이톨(dithiothreitol) 및 카나마이신(kanamycin)은 Duchefa Biochemie(한국)에서 구입하여 사용하였다. Sigma-Aldrich (USA)에서 5α-Aminolevulinic acid (ALA), NADPH, 시금치 FDX 및 시금치 FDR를 구입하였고, 제한 효소, T4 DNA ligase, DNA 중합 효소 및 dNTP는 Takara Clontech (한국)에서 구입하였다. 다른 모든 화학 물질 및 용매는 상업적으로 구입한 제품을 사용하였다.

실시예 1. Ba CYP106A2의 클로닝, 과발현 및 정제

cytochrome P450(CYP)는 색소 단백질인 헴단백질(hemoprotein)의 하나로, 세포 내 다양한 종류의 크고 작은 분자를 기질로 하여 효소반응을 일으키는 효소 단백질로 그 활성 중 하나가 스테로이드 호르몬의 생합성에 관여한다고 알려져 있다. Bacillus sp. PAMC 23377 미생물에서 유래된BaCYP106A2 단백질 효소를 Bacillus sp. PAMC 23377로부터 새롭게 분리 동정하였으며, 상기 단백질 효소는 CYP의 일종으로, 411개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 BaCYP106A2 유전자는 길이가 1,236 bp이며 G+C 함량은 42%임을 확인하였다. 상기 BaCYP106A2 유전자를 하기 기재한 한 쌍의 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켰다.

정방향 프라이머 : 5'-GTCGACTCATGAAAGAAGTTATAGCAA-3 '(밑줄 친 부분 SalI 부위)

역방향 프라이머 : 5'-AAGCTTTTATAGTGTACGGCATGCC-3 '(밑줄 친 부분은 HindIII 부위)

Bacillus sp. PAMC 23377로부터 유래한 유전체 DNA를 94 ℃에서 5 분간의 초기 변성 후, 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 1.5 분 및 72 ℃에서 5 분을 1 사이클로 하여, 총 25 사이클의 PCR을 통해 DNA를 증폭하였다. PCR 산물을 SalI 및 HindIII로 절단 한 후, pET28a (+) 벡터에 결찰시키고 과발현을 위해 대장균 C41 (DE3) 숙주 세포에 넣었다. 과발현은 배양액이 600 nm에서 0.6-0.8의 광학 밀도에 도달시킨 후, Luria-Bertani 배지에서 1 mM ALA와 0.5 mM FeCl₃를 첨가하여 수행하였다. 20 ℃에서 30 분 배양한 후 0.5 mM IPTG를 첨가하였고, 상기 배양액을 200 rpm으로 흔들어 주면서 20 ℃에서 70 시간 동안 배양하였다. 배양물을 수득한 후, 샘플을 50 mM 인산칼륨완충액(pH 7.4)으로 2 회 세척하고 세포를 초음파 처리로 용해시켰다. 가용성 단백질을 얻기 위해 샘플을 4 ℃에서 13,000 x g로 20 분 동안 원심 분리하고 금속 친화성 Ni²⁺-NTA resin(Qiagen, Germany)와 혼합하였다. 용출 완충액으로 완충액 당 10, 100 또는 500 mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 50 mM 인산칼륨완충액 (pH 7.4)을 사용하였다. 50mM 인산칼륨완충액 (pH 7.4)으로 평형화시킨 샘플을 Amicon Ultra centrifugal filter(Ultracel-3K, Millipore, USA)에 트랩하여 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질의 농도를 450 및 490nm에서 UV 스펙트럼의 차이에 의해 계산하였다. 상기 UV 스펙트럼의 분석은 단백질 샘플을 91 mM^-1 cm^-1의 몰 흡광 계수(molar extinction coefficient)로 사용하고, 포화 상태에서 일산화탄소로 환원시켜 분석하였다. 상기 정제된 BaCYP106A2 단백질을 전기영동을 통해 분석한 결과를 도 1A에 나타내었고, 산화된 형태, 환원된 형태 일산화탄소를 첨가한 조건의 BaCYP106A2의 자외선 스펙트럼의 분석 결과를 도 1B에 나타내었다.

상기 정제된 411개의 아미노산으로 이루어진 BaCYP106A2를 분석한 결과, BmCYP106A2와 94%의 상동성을 보임을 확인하였다. 또한 도 1A에서 확인한 바와 같이, Ni²⁺ 수지를 통해 정제하여 과발현시킨 단백질을 15% SDS-PAGE로 분석한 결과, BaCYP106A2는 약 48 kDa를 나타내는 것이 확인되었으며, 또한 정제된 단백질 농도는 450.55 mg/ml임을 확인하였다. 도 1B에서 확인한 바와 같이, BaCYP106A2에 포함된 철은 아이티온산 나트륨에 의해 환원되었고, 일산화탄소의 첨가는 450 nm에서 420 nm로 자외선 (UV) 스펙트럼의 peak를 변화시키는 것을 확인하였다.

실시예 2. Ba CYP106A2 효소의 기질-결합 활성

cytochrome P450 (CYP)의 활성 부위에 기질이 결합하면 Type Ⅰ shift라고 불리는 높은 스핀 상태를 유도함과 동시에 390 nm일 때 최대 흡광도를 나타내며, 420 nm일 때 최소 흡광도를 나타내게 된다. CYP의 이러한 특성은 CYP 효소로 추정되는 단백질이 실제 CYP 효소인지 스크리닝하기 위하여 사용할 수 있다. 따라서 CYP 효소 중 하나인 BaCYP106A2 역시도 기질-결합 활성을 나타내는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 스테로이드 기질인 난드롤론은 CYP106A2의 기질로 사용할 수 있으나, 상기와 같은 Type I shift를 보이지 않는 것으로 알려져 있어, 상기와 같은 일반적인 특성이 반드시 모든 기질에서 나타나는 것은 아닌바, 본 실시예에서는 상기와 같은 특성을 나타낼 수 있는 기질인 4-안드로스테네온을 이용하여 기질 결합 분석 실험을 수행하였다. BaCYP106A2 2μM을 50 mM 인산칼륨완충액(pH 7.4)에 첨가하여 전체 기질 결합 분석에 사용하였다. 기질은 디메틸 설폭시드에 첨가하였고, 포화(0-1,700 μM)에 도달할 때까지 적정하였다. 모든 샘플의 흡광도는 Biochrome Libra S35PC UV / 가시 분광 광도계를 사용하여 350-490 nm 범위에서 측정하였다. 흡광도 차이 (A₃₉₀ - A₄₂₀)는 2차 방정식으로 GraphPad 7.01 소프트웨어를 사용하여 계산하였다. A_obs는 리간드 농도에서의 흡광도 차이, A_max는 리간드가 포화된 상태에서의 흡광도 차이, S는 기질 농도, E_t는 효소 농도, K_d는 효소 - 리간드 복합체에 대한 해리 상수이다. BaCYP106A2의 농도는 450 및 490nm의 흡광도의 차이에 의해 계산할 수 있는바, 디티오나이트(dithionite)로 환원시킨 BaCYP106A2을 참고 샘플로 하고, 일산화탄소 및 디티오나이트(dithionite)로 환원시킨 BaCYP106A2을 타겟 샘플로 흡광도를 측정한 결과를 도 2A에 나타내었고, 4-안드로스테네온(4-androstenedione)의 농도 증가에 따른 Type Ⅰ shift 스펙트라 및 상기 스펙트럼을 통한 평형 해리 상수 (K_d 값)를 도 2B에 나타내었다.

도 2A에서 확인한 바와 같이, 환원시킨 BaCYP106A2가 450nm에서 피크를 보이며 흡광도 490nm부터 일정한 값을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 도 2B에서 확인한 바와 같이, 기질인 4-안드로스테네온이 증가하면 390nm에서의 흡광도와 420nm에서의 흡광도간의 차이가 점점 증가하다가 일정한 값으로 수렴하는 양상을 확인하였다. 이를 통해서 본 발명의 단백질인 BaCYP106A2가 Type Ⅰ shift를 나타내는 CYP 효소 중 하나임을 확인할 수 있었다. 효소와 기질과의 친화성을 수치로 표현할 수 있어 이를 나타낸 평형 해리 상수 (K_d 값)를 계산한 결과, BaCYP106A2의 4-안드로스테네온에 대한 K_d 값은 387 ± 37 μM임을 확인하였다. 특히, 상기와 같은 K_d 값은 B. megaterium ATCC 13368에서 분리한 CYP106A2의 K_d 값이 81 ± 10 μM이며, B. megaterium DSM319에서 분리된 CYP106A1의 K_d 값이 77 ± 2 μM인 것을 고려할 때 다른 균주에서 분리한 CYP106A 단백질보다 5배 정도 높음을 확인하여 본 발명의 BaCYP106A2가 공지된 단백질 효소와는 다른 기질결합 특성을 가지는 새로운 효소임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

실시예 3. Ba CYP106A2 효소 단백질의 결정화 및 효소의 특성 확인

3.1 Ba CYP106A2 효소 단백질의 결정화 및 효소의 구조적 특성 확인

Commercial crystallization (MCSG I-IV, Microlytic USA, Wizard Classic I-IV)로 mosquito crystallization robot(TTP LabTech, UK)을 사용하여 96- well sitting-drop plate (Emerald Bio, USA)에서의 최초 결정화 스크리닝을 수행하였다. 결정화 droplets을 0.2㎕의 단백질 용액 및 0.2㎕의 저수조(reservoir) 용액과 혼합하고, 80㎕의 저수조 용액으로 293K에서 평형화시켰다. 최적의 결정은 0.1M 카코딜산나트륨(sodium cacodylate) : HCl (pH 6.5), 1.26 M 황산암모늄(ammonium sulfate)(MCSG2 # A6)의 용액조건으로 수득하였다. 하나의 단백질 결정을 수확하고, Paratone-N 오일 (Hampton Research, USA)에 침지시켜 질소 가스로부터 동결보호 하였다. Pohang Accelerator Laboratory (PAL, 포항, 한국)의 BL-5C 빔 라인에서 얻어진 120 개의 이미지의 X선 회절 데이터를 수득하였고, 2.7 Å 해상도의 데이터 세트는 HKL-2000 프로그램을 사용하여 인덱싱하고, 통합 및 단백질 정보를 분석하였다. 결정화한 단백질의 구조를 결정하기 위하여 B. megaterium ATCC 13368 (PDB 코드 4YT3)유래의 CYP106A2를 검색 모델로 단백질 분자를 교체하고, CCP4 제품군의 MOLREP 프로그램을 사용하여 결정하였다. Coot 프로그램 및 REFMAC5를 사용하여 단백질 구조 재구성 및 정제를 반복하여 수행하였다. PHENIX의 phenix.refine 프로그램으로 더 세밀하게 단백질 구조를 정제하였다. 최종적으로 결정한 단백질 구조모델은 R_work 값과 R_free 값이 각각 19.1 %과 25.8 %로 나타났고, 상기 구조모델은 MolProbity 프로그램을 사용하여 검증하였다. 상세한 정제 통계는 표 1에 나타내었으며, 최종 단백질 구조를 도 3에 나타내었다. 또한 단백질의 기질 부착 부위를 도 4에 나타내었다. 모든 단백질 구조도는 PyMOL을 사용하여 나타내었으며, BaCYP106A2의 원자 좌표 및 구조 데이터는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에 5XNT로 게시하였다. 상기와 같은 정보를 표 1에 나타내었다. ^aR_merge 및 ^bR_cryst는 다음과 같이 계산하였고, cR_free는 고해상도 데이터를 사용하여 정제 단계에서 제외된 모든 5 %의 데이터를 포함하여 계산하였으며, 괄호 안의 값은 가장 높은 해상도의 shell에서의 값을 나타낸다.

^aR_merge = Σ|<I> - I|/Σ<I>

^bR_cryst = Σ||Fo| - |Fc||/Σ|Fo|.

[표 1]

표 1 및 도 3에서 확인한 바와 같이, 2.7Å의 해상도로 확인한 BaCYP106A2의 결정 구조는 공간군 P6₁22에 속하며 비대칭 유닛에 하나의 프로토머를 포함하고 있다. 최종적으로 BaCYP106A2 단백질 결정화 구조에 관하여 411개의 아미노산 중 392개의 아미노산, 31 개의 물 분자 및 철분자가 부착된 하나의 헴 보조 인자가 포함된 결정화 구조를 확인하였다. BaCYP106A2의 결정 구조는 단단히 결합된 헴 분자를 가진 15 개의 α-helix 와 8 개의 β-strand로 구성된 나선 구조가 많이 포함된 헴-의존성 CYP 모노옥시게나제(monooxygenase)의 표준 폴드를 나타내는 것을 확인하여 CYP 모노옥시게나제 중의 하나임을 구조적으로 재확인하였다.

또한 도 3에 나타난 바와 같이, BaCYP106A2 구조의 활성 부위를 확인해보면 헴 분자는 α12 헬릭스와 α17 헬릭스 사이에 위치하고 여러 보존된 잔기와 상호 작용한다. 구체적으로, 헴의 O2D는 Arg100의 NH1 및 His96의 NE와 상호 작용한다. 헴의 O1D는 His353의 ND1과 수소 결합을 만들며, 헴의 O1A와 O2A는 각각 Arg296의 NH2와 NH1과 상호 작용함을 확인하였다. 헴의 중심에 존재하는 철 이온은 근위측에 있는 Cys355 (2.46Å)의 측면에 존재하는 체인과 연결되어 있음을 확인하였다. 또한 도 4A, B에 나타낸 바와 같이, BaCYP106A2의 리간드 결합 부위는 Val82, Leu239, Ala243, Phe289, Ile292, Leu294 및 Ala395로 구성된 소수성 포켓임을 확인하였다.

3.2 Ba CYP106A2 효소 단백질의 구조적 특성 비교

본원 발명의 BaCYP106A2와 유사한 서열을 가진 BmCYP106A2간 구조적 차이점을 나타나는지 확인해보고, 이를 도 5A 및 5B에 나타내었다.

한편, 도 5A에서 확인한 바와 같이, BaCYP106A2와 BmCYP106A2 양 단백질의 아미노산 서열은 유사하지만, 양 단백질을 겹쳐서 구조적인 차이점을 확인해보면 α8 - α9 및 β6 - β7 루프 영역에 명확하게 구조적인 차이가 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 도 5B에서 확인한 바와 같이, BmCYP106A2 단백질구조의 α8-α9 루프 영역은 부분적으로 비정형(disordered)의 형태를 가지고 있으며 BaCYP106A2 단백질에서는 상기 영역이 높은 평균 B-factor 값을 나타내어 구조적으로 명확한 차이점을 나타내는 것을 확인하였다. 본원 발명의 단백질 BaCYP106A2는 α8-α9 루프 영역이 유사한 아미노산 서열을 가진 BmCYP106A2와 상이한 것이 확인되었고, 단백질은 3차원적 구조에 의해 그 활성이 달라질 수 있어 본 발명의 단백질은 기존의 BmCYP106A2와 그 서열 및 구조가 상이하고 이로 인한 활성 역시 상이할 것임을 확인할 수 있었다.

실시예 4. Ba CYP106A2의 스테로이드 기질에 대한 히드록시화 활성 확인

4.1 Ba CYP106A2의 스테로이드 기질에 대한 히드록시화 활성 확인을 위한 in vitro HPLC 및 LC-MS 분석

히드록시화 활성 확인을 위한 in vitro HPLC 및 LC-MS 분석을 위하여, 10 μM의 BaCYP106A2, 25 μg의 FDX, 0.1 U의 FDR, 100 μg/ml의 카탈라아제, NADPH-재생산 시스템 (10 mM 글루코스-6-포스페이트, 1U 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제 및 5mM MgCl₂) 및 스테로이드 기질 100μM을 첨가한 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4)을 포함하는 최종적으로 250μl 용액을 제조하였다. 1mM의 NADPH가 첨가시켜 반응을 시작하였고, 30 ℃에서 180 rpm으로 2 시간 동안 반응을 진행시켰다. 반응의 종결 후, 시료를 에틸 아세테이트 500 ㎕로 2 회 추출하고, 12,000 x g로 10 분간 원심분리 하였다. 분리된 상청액을 건조시킨 다음, HPLC 및 LC-MS분석을 위한 아세토나이트릴 (acetonitrile) 및 물이 60:40 비율이 되도록 혼합한 HPLC 용매를 제조하였다. 시료는 Mightysil 역상 C₁₈ GP 컬럼 (4.6 × 250 mm, 5 μm)을 사용하여 Dionex Ultimate 3000 UHPLC⁺ 시스템 (Thermo Fisher Scientific, Germany)으로 분석하였다. 본 실시예에서 사용한 HPLC 시스템은LPG-3400SD 펌프, ACC-3000 autosampler 컬럼 부분 및 DAD-3000 다이오드 어레이 검출기를 포함하며, 이동상은 용액 A (HPLC-grade의 물)와 용액 B (HPLC-grade의 아세토나이트릴에서)를 포함한다. 유속을 1.0 ml/min으로 유지하였고, 오븐 온도를 30 ℃로 유지하였다. 상기 시료를 분석하기 위해, 구배 시스템을 다음의 조건으로 하여 분석을 수행하였다. 용액 B의 농도를 15 %에서 50 % (0-10 분)로 증가시킨 다음 70 % (10-20 분)로 증가시키고 이후 70 %(20-25 분)로 유지한 후, 15 % (25-30 분)로 감소시켜 사용하였다. 이후 기질 및 생성물을 확인하기 위하여, 245 nm에서 UV 검출을 수행하였다. LC-MS분석을 위하여 상기 HPLC에서 사용한 것과 동일한 시료 및 이동상 용액을 사용하여 양성 이온 모드에서 SYNAPT G2-S 시스템 (Waters, USA)에 연결된 LC-electrospray quadrupole-time-of-flight MS (ACQUITY UPLC) connected로 분자량을 측정하였다.

4-안드로스테네온과 난드롤론은 소의 adrenodoxin과 adrenodoxin reductase가 NAD(P)H로부터 CYP에 전자를 공급할 때 사용될 수 있는 스테로이드 기질로 알려져 있으며, 또한 FDX와 FDR 역시도 전자 전달을 할 수 있음이 최근 알려져 있어, in vitro에서 FDX와 FDR을 사용하여 BaCYP106A2의 효소 활성을 알아보는 HPLC 및 LC-MS 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6A에서 확인한 바와 같이, 4-안드로스테네온을 기질로 사용한 경우에 HPLC 분석한 결과 100 %에 가까운 기질 전환율을 나타내었고, 다른 사소한 생성물 피크와 함께 생성되는 생성물 P1이 주요 피크임을 확인할 수 있었다. LC-MS 반응 혼합물의 분석으로 분자량 C₁₉H₂₇O₃ ⁺ 의 계산된 질량 303.1960 와 거의 동일한 값으로 주요 피크인 P1이 m/z ⁺ [M+H]⁺ 가 303.1958의 질량 값을 가지는 것을 확인하여 모노하이드록실화 시키는 활성을 확인할 수 있었다. 또한, S 피크는 실제 구조를 나타내는 것이며, P1 피크는 4-안드로스테네온이 주로 15β 위치에서 하이드록실화된다는 사실에 기초한 예측된 구조인 바, BaCYP106A2는 4-안드로스테네온의 15β 위치에 수산화기를 부착시킬 수 있는 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로, 도 6B에서 확인한 바와 같이, 난드롤론을 기질로 사용한 경우에도 일부 사소한 생성물 피크와 함께 생성물 P1을 주요피크로 나타나면서 기질 전환율이 거의 100 %에 가까운 결과를 확인하였다. LC-MS 반응 혼합물의 분석의 경우 모노하이드록실화된 생성물이 분자식 C₁₈H₂₇O₃ ⁺ 의 계산된 질량인 291.1960와 유사하게 P1은 m/z ⁺ [M + H] + 291.1975 값을 나타내는 것을 확인하였다.

특히 도 6을 종합해보면 BaCYP106A2가 기질인 4-안드로스테네온 및 난드롤론의 특정 위치에만 특이적으로 하나의 히드록시기를 부착시키는 활성을 나타내는 것이 확인되었고, 이는 다른 아과 효소인 CYP106A1가 6β 와 7β 위치에서 히드록시기를 부착시키는 것과는 다른 활성을 가지는 것인바, BaCYP106A2 의 15β 히드록시기 위치선택성은 BaCYP106A2 효소만의 특이한 활성임을 확인하였다.

4.2 Ba CYP106A2의 스테로이드 기질에 대한 히드록시화 활성 확인

상기 실시예 4.1에서 확인한 2개의 기질 이외의 스테로이드 기질에 대하여 히드록시화 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 실시예 4.1과 동일하게 HPLC 및 LC-MS 분석을 수행하여 기질 전환율을 측정하는 실험을 수행하였으며, 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]

표 2에서 확인한 바와 같이, BaCYP106A2는 상기 실시예 4.1에서 구체적으로 히드록시화를 확인한 4-안드로스테네온 및 난드롤론 이외에 프로게스테론에 대하여도 100%에 가까운 높은 기질 전환율을 나타내었고, 테스토스테론, 데옥시코르티코스테론아세테이트, 11-케토프로게스테론, 17α-메틸테스토스테론, 11α-히드록시프로게스테론에 대하여도 높은 정도의 기질 전환율을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 BaCYP106A2의 효소단백질이 다양한 스테로이드 기질에 대하여 히드록시기를 부착시킬 수 있는 것을 확인하였다.

또한, 실시예 4.1에서 확인한 4-안드로스테네온 및 난드롤론 이외에 BaCYP106A2의 효소단백질의 스테로이드 기질에 대한 15β 히드록시기 위치선택성이 프로게스테론 및 테스토스테론에도 나타나는 것을 상기 실험을 통하여 확인하였다.

따라서 BaCYP106A2의 효소단백질이 다양한 스테로이드 기질에 대하여 특정한 위치에 히드록시기를 부착시킬 수 있는 것을 확인하였다.

<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> Enzyme Protein BaCYP106A2, Method for Crystallization of BaCYP106A2 protein, and Use thereof <130> 1-26P <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 411 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> BaCYP106A2 amino acid sequence <400> 1 Met Lys Glu Val Ile Ala Ile Lys Glu Phe Thr Arg Phe Lys Thr Arg 1 5 10 15 Thr Glu Glu Phe Ser Pro Tyr Ala Trp Cys Lys Arg Met Leu Glu Asn 20 25 30 Asp Pro Val Ser Tyr His Glu Gly Thr Asp Thr Trp Asn Val Phe Lys 35 40 45 Tyr Glu Asp Val Lys Arg Val Leu Ser Asp Tyr Lys His Phe Ser Ser 50 55 60 Val Arg Lys Arg Thr Thr Ile Ser Val Gly Thr Asp Ser Glu Glu Gly 65 70 75 80 Ser Val Pro Asp Lys Ile Lys Ile Thr Glu Ala Asp Pro Pro Glu His 85 90 95 Arg Lys Arg Arg Ser Leu Leu Ala Ala Ala Phe Thr Pro Arg Ser Leu 100 105 110 Gln Asn Trp Glu Pro Arg Ile Gln Glu Ile Ala Asp Glu Leu Ile Glu 115 120 125 Glu Met Asp Glu Glu Thr Glu Ile Asp Ile Val Gln Ser Leu Ala Ser 130 135 140 Pro Leu Pro Ile Ile Val Met Ser Asp Leu Met Gly Val Pro Ser Lys 145 150 155 160 Asp Arg Leu Leu Phe Lys Lys Trp Val Asp Ile Leu Phe Leu Pro Phe 165 170 175 Asp Lys Glu Lys Gln Glu Glu Val Asn Glu Leu Lys Gln Val Ala Ala 180 185 190 Lys Glu Tyr Tyr Gln Tyr Leu Tyr Pro Ile Val Val Gln Lys Arg Leu 195 200 205 Asn Pro Ala Asp Asp Ile Ile Ser Asp Leu Leu Lys Ala Glu Val Asp 210 215 220 Gly Glu Met Phe Thr Asp Asp Glu Val Val Arg Thr Thr Met Leu Ile 225 230 235 240 Leu Gly Ala Gly Val Glu Thr Thr Ser His Leu Leu Ala Asn Ser Phe 245 250 255 Tyr Ser Leu Leu Tyr Asp Asp Lys Glu Val Tyr Gln Glu Leu His Glu 260 265 270 Asn Leu Asp Leu Val Pro Gln Ala Val Glu Glu Met Leu Arg Tyr Arg 275 280 285 Phe Asn Leu Ile Lys Leu Asp Arg Thr Val Lys Glu Asp Asn Asp Leu 290 295 300 Leu Gly Val Glu Leu Lys Glu Gly Glu Asn Val Val Val Trp Met Ser 305 310 315 320 Ala Ala Asn Leu Asp Glu Glu Met Phe Glu Asp Ala Phe Thr Leu Asn 325 330 335 Ile His Arg Pro Asn Asn Lys Lys His Leu Thr Phe Gly Asn Gly Pro 340 345 350 His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Lys Ile Ala 355 360 365 Leu Thr Thr Phe Leu Lys Lys Phe Lys His Ile Glu Ala Val Pro Ser 370 375 380 Phe Gln Leu Glu Asp Asn Leu Thr Asp Ser Ala Thr Gly Gln Thr Leu 385 390 395 400 Thr Ser Leu Pro Leu Lys Ala Cys Arg Thr Leu 405 410 <210> 2 <211> 1236 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> BaCYP106A2 sequence <400> 2 atgaaagaag ttatagcaat aaaagaattt actaggttta aaacacgtac ggaggaattt 60 agtccatacg cttggtgtaa acggatgtta gaaaatgacc ccgtgagtta tcacgaagga 120 acggatacgt ggaatgtttt taaatatgaa gatgttaagc gtgttctcag tgattataaa 180 catttttcga gtgtccggaa acggactacc atatcggttg gaacggatag tgaggaaggt 240 tcagtgcctg ataagatcaa aatcactgaa gcggatccac cggagcatag aaaacgccgt 300 tcactgcttg ccgcagcatt cacacctaga agtcttcaaa actgggaacc tcgcattcag 360 gaaatagcgg atgaattgat cgaagaaatg gatgaggaaa cggaaatcga tattgtgcaa 420 tcattggcga gtccgcttcc gatcattgtc atgtcagatt tgatgggcgt tccctcgaaa 480 gatcgtttat tgtttaagaa atgggtggat atcttattcc ttccttttga taaagaaaaa 540 caagaagaag taaatgaatt gaagcaagtg gcagcaaaag aatactatca gtatttgtat 600 ccgattgttg tgcaaaaacg attgaacccg gcagatgata tcatctcgga tcttttgaag 660 gcggaagtgg atggggagat gtttacggat gatgaggttg tccgcacgac catgctgatt 720 ttaggagcag gtgtcgagac aacaagtcat ttactggcca atagctttta ttccctgcta 780 tatgatgaca aggaagttta tcaagagcta catgaaaacc tggatttggt tccgcaggcg 840 gtcgaagaaa tgctccgtta ccgtttcaat ctcattaaat tagatcgcac cgtaaaggaa 900 gataacgatc tattaggagt ggaattgaaa gaaggggaaa acgtggttgt ttggatgagc 960 gcagctaatt tggatgaaga gatgtttgaa gacgccttca cccttaatat ccaccgccca 1020 aataataaga aacatctaac cttcggaaat ggtcctcatt tctgcctcgg agcaccgcta 1080 gccagactgg aagcaaagat tgcgcttact acattcctga agaaattcaa gcatattgaa 1140 gcggtgccat cgttccagtt agaagacaac cttaccgatt cagcgaccgg gcaaactttg 1200 acatcactac cgcttaaggc atgccgtaca ctataa 1236

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 바실러스 균(Bacillus sp.) PAMC 23377로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 Val82, Leu239, Ala243, Phe289, Ile292, Leu294 및 Ala395로 구성된 소수성 포켓을 리간드 결합부위로 하는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 스테로이드를 히드록시화 시키는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone), 테스토스테론(Testosterone), 데옥시코르티코스테론아세테이트(Deoxycorticosterone acetate), 11-케토프로게스테론, 17α-메틸테스토스테론 및 11α-히드록시프로게스테론으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스테로이드를 히드록시화 시키는 것을 특징으로 하는 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 스테로이드의 15β 위치를 히드록시화 시키는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 난드롤론(Nandrolone), 4-안드로스테네온(4-androstenedione), 프로게스테론(Progesterone) 및 테스토스테론(Testosterone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 스테로이드의 15β 위치를 히드록시화 시키는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 난드롤론(Nandrolone) 또는 4-안드로스테네온(4-androstenedione)의 15β 위치를 히드록시화 시키는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질.
제1항의 단백질을 코딩하는 핵산.
제9항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 핵산.
제9항 또는 제10항의 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
제11항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제11항의 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환시켜 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제작하는 단계; 및 상기 제작된 형질전환체를 배양하여 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 제조방법.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지고, 공간군 P6₁22에 속하며 비대칭 유닛에 하나의 프로토머를 포함하며, 단백질 결정의 단위 셀 디멘션(unit-cell dimension)은 a=77.658Å, b=77.658Å 및 c=282.216Å 및 α=β=90°, γ=120°인 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질 결정.
삭제
제14항에 있어서, 상기 단백질 결정은 15 개의 알파-헬릭스(α-helix) 와 8 개의 베타가닥(β-strand)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질 결정.
(ⅰ) 카코딜산나트륨(sodium cacodylate), HCl 및 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포함하는 저수조(reservior) 용액과 (ⅱ) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 포함하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 결정화 방법.
제17항에 있어서, 상기 저수조 용액은 0.01 내지 1M의 카코딜산나트륨, HCl 및 1M 내지 5M의 황산암모늄을 포함하는 것인, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 결정화 방법.
제17항에 있어서, 상기 저수조 용액은 pH 5 내지 7인 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 결정화 방법.
제17항에 있어서, 상기 단백질 용액은 0.1 내지 0.5㎕인 것을 특징으로 하는, 사이토크롬(cytochrome) P450 스테로이드 히드록시화효소(steroid hydroxylase) 단백질의 결정화 방법.
제1항의 단백질을 포함하는 스테로이드 히드록시화 촉진용 조성물.
제21항의 조성물을 스테로이드에 처리하는 단계를 포함하는 스테로이드 히드록시화 방법.