KR102302692B1

KR102302692B1 - Cyp154c4-1 효소의 단백질 결정화 방법 및 이를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법

Info

Publication number: KR102302692B1
Application number: KR1020190103148A
Authority: KR
Inventors: 오태진; 이준혁; 박현
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-09-15
Also published as: KR20210023224A

Abstract

본 발명은 CYP154C4-1 효소, 그 단백질 결정화 방법 및 이를 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 Streptomyces sp. 유래 CYP154C4-1 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 테스토스테론 등의 스테로이드의 생물전환 시 위치특이성이 우수하므로, 단백질 공학 분야에서 인공 스테로이드 관련 CYP 개발 기술로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CYP154C4-1 효소의 단백질 결정화 방법 및 이를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법{Method for crystallization of CYP154C4-1 protein and bioconversion method for hydroxylizing steroid using the same}

본 발명은 CYP154C4 효소-1, 그 단백질 결정화 방법 및 이를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 NADPH 또는 산화제 존재 하에서 Streptomyces sp. 유래의 CYP154C4 효소-1를 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 생물전환 방법에 관한 것이다.

헴(heme)-함유 사이토크롬 P450 효소(CYP)는 모든 계(kingdom)에서 발견된다. CYP는 일반적으로 P450으로 명명되며, 이는 일산화탄소(CO)와의 반응 후에 약 450 ㎚에서 흡수-최대(absorption-maximum)를 나타내기 때문이다. CYP는 발견된 이후로다양한 세포 분자를 합성하고 대사하는 능력에 기초하여 종종 연구되어 왔다. 또한, CYP는 콜레스테롤, 스테롤, 알칸 및 지방산을 포함한 다양한 분자를 타겟팅하는 이러한 반응을 통해 내인성 및 생체이물질(xenobiotic) 화합물에 대한 히드록시화(hydroxylation), 에폭시화(epoxidation), 탈카복실화(decarboxylation) 및 탈알킬화(dealkylation)시키는 능력이 있어 관심을 끌고 있다. 사람에서 CYP는 약물 대사에 관여하는 주요 효소이며 약물 설계를 위한 타겟이다. 그러나, 그동안의 연구들은 막 결합된 진핵 세포 CYP의 불용성 때문에 연구가 제한되었던 포유류 CYP보다는 박테리아 CYP에 초점을 두는 경향이 있었다. 대조적으로, 가용성의 세균성 CYP는 쉽게 과발현(overexpression)시킬 수 있고 유전자 조작을 수행할 수 있어, CYP 돌연변이 유발(mutagenesis)을 통하여 생성물의 수율을 매우 효과적으로 증가시킬 수 있다. 따라서, 세균성 CYP는 약물 개발 산업에 관련된 연구의 기초가 되어 왔다.

CYP 효소는 국소화(localization) 및 산화·환원 파트너를 기반으로 2개의 주요 그룹으로 분류된다. 클래스(class) Ⅰ은 철(iron)-황(sulfur) 단백질[페레독신(ferredoxin) 및 아드레노독신(adrenodoxin)]과 플라빈(flavin)-함유 환원효소[페레독신 환원효소(ferredoxin reductase) 및 아드레노독신 환원효소(adrenodoxin reductase)]의 2개로 분리된 산화·환원 파트너를 사용하는 미토콘드리아성 및 박테리아성 P450을 포함한다. 클래스 Ⅱ 효소는 마이크로솜(microsome)에 위치하며 NADPH-CYP 환원 효소(CYP reductase, CPR)로부터 전자를 받는다. 디플라빈(diflavin) 환원효소 파트너가 폴리펩타이드 체인에 포함되어 있기 때문에 별도의 산화·환원 파트너를 필요로 하지 않는 P450BM3(CYP102A1)과 같은 다른 소수의 클래스 P450 효소도 있다[Hannemann F, et al., Biochim Biophys Acta 2007, 1770, 330-334]. CYP154 계열 구성원은 Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus 및 Nocardia farcinica와 같은 몇몇의 액티노박테리아(Actinobacteria)에서 확인되었다. 그들은 스테로이드 분자를 위치선택적 및 입체선택적으로 산화시킨다[Podust LM, et al., J Biol Chem 2003, 278, 12214-12221; Makino T, et al., Appl Environ Microbiol 2014, 80, 1371-1379; Choi KY, et al., Enzyme Microb Technol 2010, 47, 327-334].

스테로이드는 식물과 동물의 복합 기능에 필수적인 광범위한 유기 화합물이다. 스테로이드는 항-염증, 항-균, 항-진균, 항-바이러스 효능을 갖는 "항-제제"로서 널리 사용된다. 히드록시화(hydroxylation)에 의한 변형은 스테로이드의 생물학적 활성, 극성(polarity) 및 독성에 크게 영향을 줄 수 있다. 스테로이드가 히드록시화되는 위치는 매우 중요하다; 특히, 탄소 3, 11, 17 및 21에서 히드록시 또는 케톤기의 존재는 생물학적 활성과 상호 관련이 있다. 상업적으로, 코르티손(cortisone)을 생성하는 프로게스테론의 11α-히드록시화 및 히드로코르티손(hydrocortisone)을 형성하기 위한 11-디옥시코르티솔(11-deoxycortisol)의 11β-히드록시화가 산업적 규모로 확립되었다[Peterson DH, et al., J Am Chem Soc 1952, 74, 5933-5936; Petzoldt K, et al., Patent 4,353,985, 1982, Germany]. 스테로이드는 스테로이드 히드록실라제가 지방족(aliphatic) 측쇄의 분해 또는 스테란(sterane) 링(ring)의 개방을 위한 스테로이드 이화 경로 반응에 관여된 박테리아에 의한 영양분의 공급원으로 사용된다. CYP106A 계열(CYP106A1 및 CYP106A2), CYP154C 계열(CYP154C3, CYP154C5 및 CYP154C8), CYP260 계열(CYP260A1 및 CYP260B1) 및 CYP109 계열(CYP109B1 및 CYP109E1)을 포함하여 다양한 세균 공급원 유래의 많은 수의 P450이 스테로이드 히드록시화에 관여하는 것으로 알려져 있다. 마이코박테리움(mycobacterium) P450인 CYP125A1 및 CYP142A1은 히드록시화 및 히드록시화에 대한 알데히드와 카르복실산으로의 순차적 산화를 통하여 콜레스테롤의 분해에 관여한다. 특히 흥미로운 한 연구에서, Escherichia coli에서 발현된 250개의 박테리아 P450에 대한 스크리닝은 위치선택적 및 입체선택적 방식으로 테스토스테론을 다양한 위치에서 히드록시화시킬 수 있는 24개의 P450을 확인하였다[Agematu H, et al., Biosci Biotechnol Biochem 2006, 70, 307-311].

CYP154 계열에서 2개의 결정 구조(CYP154A1 및 CYP154C1)가 S. coelicolor A3(2)로부터 보고되었다. 또한, N. farcinica에서 유래된 CYP154C5의 다양한 스테로이드[프레그네놀론(pregnenolone), 프로게스테론(progesterone), 안드로스텐디온(androstenedione), 테스토스테론(testosterone)]가 결합된 형태가 93 %의 아미노산 서열 상동성을 공유하면서 결정되었다. 흥미롭게도, CYP154A1 구조 분석은 헴(heme) 배향(orientation)이 CYP154C1을 포함하여 대부분의 다른 CYP 구조물의 헴 배향과 180° 반대되는 것으로 나타났다; 그러나, 이것과 그 생물학적 의미에 대한 이유는 분명하지 않게 남아 있다. 스테로이드-결합된 CYP154C5 구조에서, 결합된 스테로이드 분자의 C16 위치는 헴 철과 직면한다. 이러한 구조적 특징은 아마도 16α-히드록시화된 스테로이드 생성물을 얻기 위하여 스테로이드 물질의 전환(conversion)에서 CYP154C5에 대한 위치선택성 및 입체선택성을 설명한다.

대한민국 특허공개 특2001-0091129호 (2001.10.23.) 미국 특허공개 US2009/0117613 A1 (2009.05.07.)

Konrad Herzog, et al., Acta Cryst. (2014) D70, 2875-2889 Sylvie E. Kandel, et al., Drug Metab Dispos (2017) 45, 1266-1275 J. Steven Leeder, et al., JPET (2005) 314, 626-635 B. P. LISBOA, et al., European J. Biochem. (1968) 6, 419-424

본 발명의 발명자들은 Streptomyces spp.로부터 2개의 CYP154C4 결정 구조, 즉 Streptomyces sp. W2061(StCYP154C4-1) 유래의 리간드-미결합 형태와 Streptomyces sp. ATCC 11861(StCYP154C4-2) 유래의 테스토스테론-결합 형태를 처음 확인하였다. 특히, StCYP154C4-1과 apo-StCYP154C4-2의 테스토스테론-결합 형태의 결정은 높은 서열 상동성(93 %)에도 불구하고 확인할 수 없었다. 얻어진 2개 구조의 구조적 비교는 테스토스테론 결합에 따라, α13-헬릭스 영역의 상이한 구조 재배열을 나타내었다. 또한, 생화학적 활성 분석에서 StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2는 다른 CYP154 단백질과 상이한 메커니즘을 통해 2-히드록시화된 테스토스테론 생성물을 생성한다는 것을 나타내었다. 또한, 이러한 구조는 다른 CYP154 계열 구성원들 사이에서 테스토스테론 생성물에 대한 위치특이성의 변화를 설명할 수 있는 상이한 활성 부위 잔기 조성을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 Streptomyces sp. 유래 CYP154C4-1 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다,

본 발명의 일 측면에 따라, CYP154C4-1을 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 스테로이드는 테스토스테론일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 히드록시화는 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 Fdx는 0.1 내지 100 μM이고, Fdr은 0.01 내지 10 U일 수 있다. 또한, 상기 NADPH는 0.01 내지 10 mM일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 히드록시화는 다이아세톡시요오드벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 다이아세톡시요오드벤젠은 0.1 내지 50 mM일 수 있다. 또한, 상기 H₂O₂는 1 내지 100 mM일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 CYP154C4-1는 0.1 내지 100 μM일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 사이토크롬(cytochrome) P450 CYP154C4-1 효소가 제공된다.

상기 효소는 CYP154C4-1 효소를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 핵산으로부터 발현될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 공간군(space group) I2₁2₁2₁에 속하고, 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하고, 유닛-셀 파라미터가 a = 83.755 Å, b = 115.032 Å, c = 127.807 Å, a = b = c = 90°인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질 결정이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 CYP154C4-1 효소 단백질 결정은 21개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따라, (1-a) PEG3350, 리튬 설페이트 및 Bis-Tris-HCl을 포함하는 저장 용액과 (1-b) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 저장 용액은 5% 내지 45%(w/v)의 PEG3350, 0.02 내지 0.5 M 리튬 설페이트 및 0.01 내지 0.5 M Bis-Tris-HCl을 포함할 수 있고, 상기 저장 용액은 pH 5.5 내지 7.5일 수 있다.

본 발명에 의해, NADPH 또는 다이아세톡시요오드벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 Streptomyces sp. 유래 2개의 CYP154C4(StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2)를 이용한 생물전환 방법은, 기존에 알려진 NfCYP154C5를 이용한 생물전환 방법이 테스토스테론을 16α-히드록시화시키는 것과 상이하게 2α- 및 2β-히드록시화시키는 위치특이성이 확인되었다.

따라서, 본 발명의 Streptomyces sp. 유래 CYP154C4 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 테스토스테론 등의 스테로이드의 생물전환 시 위치특이성이 우수하므로, 단백질 공학 분야에서 인공 스테로이드 관련 CYP 개발 기술로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 StCYP154C4s에 대한 분광학적 분석 결과이다. 도 1a는 StCYP154C4-1(좌) 및 StCYP154C4-2(우)의 SDS-PAGE 사진이다. 도 1b 및 도 1c는 디티오나이트(dithionite)-환원된 CO 결합 형태의 StCYP154C4-1(b) 및 StCYP154C4-2 (c)을 나타낸다. 도 1d는 StCYP154C4-1(핑크 라인) 및 StCYP154C4-2(블루 라인)에 대한 스펙트럼에서 기질-결합 이동(shift)을 나타낸다. 최대 흡광도(Soret 피크)는 392 ㎚에서 관찰되었으며, CYP 활성 부위에서 기질 결합으로 인해 높은 스핀 이동이 달성되는 특징을 확인하였다.
도 2는 상이한 농도의 테스토스테론 기질과 결합한 StCYP154C4-1(a-c) 및 StCYP154C4-2(d-f)에 대한 분광 흡광도 그래프이다. 해리 상수(K_d) 값은 상이한 기질의 농도에 대한 피크-트로프(trough) 흡광도(Abs₃₈₉-Abs₄₁₉)를 플롯팅하여 산출하였다. 상단 패널은 상이한 농도의 기질이 결합하여 유도된 헴의 스핀 이동(shift)을 나타내며, 하단 패널은 해당 기질 농도에 대한 피크-트로프 흡광도의 플롯을 나타낸다. a 및 d에서 사용한 기질은 프로게스테론이고, b 및 e에서 사용한 기질은 테스토스테론이며, c 및 f에서 사용한 기질은 안드로스텐디온(androstenedione)이다.
도 3a 및 도 3b는 반응 시스템 Ⅰ에 의해 뒷받침된 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 프로게스테론(a) 및 테스토스테론(b) 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램이다. P는 16α-히드록시프로게스테론으로 확인된 프로게스테론의 히드록시화된 생성물을 나타낸다. 도 3c는 2α-OH 테스토스테론과 2β-OH 테스토스테론의 혼합물에 대한 ROSEY 결과이다. 2α 수소와 2α- 및 β-OH 테스토스테론에 대한 각각의 수소 사이의 거리는 포스 필드 MMFF94 최적화에 따라 나타내었다.
도 4a는 반응 시스템 Ⅱ에 의해 뒷받침되고 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 프로게스테론의 촉매성 산화를 나타낸 결과이다. 도 4b는 반응 시스템 Ⅱ에 의해 뒷받침되고 상이한 시간 간격 동안 StCYP154C4-1에 의해 촉매된 프로게스테론 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램이다. 반응 시간 간격(2, 4 및 6 시간)을 나타낸다. 도 4c는 반응 시스템 Ⅱ(패널 Ⅰ) 및 반응 시스템 Ⅲ(패널 Ⅱ)에 의해 뒷받침되는 StCYP154C4-1에 의해 촉매된 각각의 프로게스테론 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램을 비교한 결과이다. 도 4d는 반응 시스템 Ⅱ에 의해 뒷받침된 StCYP154C4-1(블랙) 및 StCYP154C4-2(레드)에 의해 촉매된 프로게스테론 반응 혼합물에서 16α-OH 프로게스테론(표준물질; 블루)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. P1, P2, P3 및 16α-OH P는 각각 생성물 1, 생성물 2, 생성물 3 및 16α-OH 프로게스테론을 나타낸다. 생성물의 LC-MS 분석은 모노히드록시화된 생성물의 가능성 있는 산화 생성물로서 P1은 디히드록시화된 생성물([M + H]⁺ 347.2222), P2는 모노히드록시화된 생성물([M + H]⁺ 331.2291) 및 P3는 모노히드록시화된 생성물에 대한 가능성 있는 산화 생성물([M + H]⁺ 329.2115)을 나타낸다.
도 5a는 반응 시스템 Ⅱ에 의해 뒷받침되고 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 테스토스테론의 촉매성 산화를 나타낸 결과이다. 패널 Ⅲ는 표준물질(16α-히드록시테스토스테론)의 크로마토그램을 나타낸다. P1, P2, P3 및 P4는 각각 테스토스테론의 생성물 1, 생성물 2, 생성물 3 및 생성물 4를 나타낸다. 도 5b는 반응 시스템 Ⅱ에 의해 뒷받침된 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 안드로스텐디온(androstenedione) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 패널 Ⅲ는 NADPH 부재 하에서 수행된 대조군 반응에 대한 크로마토그램을 나타낸다. P1, P2, P3 및 P4는 안드로스텐디온의 생성물 1, 생성물 2, 생성물 3 및 생성물 4를 각각 나타낸다. 도 5c는 PIDA에 의해 뒷받침되는 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 프로게스테론 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 패널 Ⅲ는 표준물질 16α-OH 프로게스테론(16α-OH P)에 대한 크로마토그램을 나타낸다. P는 16α-OH 프로게스테론으로 확인된 생성물을 나타낸다. 도 5d는 PIDA에 의해 뒷받침되는 StCYP154C4-1(패널 Ⅰ) 및 StCYP154C4-2(패널 Ⅱ)에 의해 촉매된 테스토스테론 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 패널 Ⅲ는 표준물질 16α-OH 프로게스테론(16α-OH P)의 크로마토그램을 나타낸다. P2 및 P4는 테스토스테론의 2개의 상이한 생성물 피크이다.
도 6은 StCYP154C4-1 및 테스토스테론-결합된 StCYP154C4-2에 대한 결정 구조 및 다중 서열 정렬을 나타낸 결과이다. 도 6a는 StCYP154C4-1의 결정 구조를 나타낸다. α-헬릭스와 β-스트랜드는 각각 연어색(salmon)와 라임색(lime)에서 채색된 리본으로 표시한다. 결합된 헴 분자는 마젠타(magenta, 자홍색) 스틱 모델로 표시한다. 도 6b는 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2의 전체 구조는 리본으로 표시하고, α-헬릭스와 β-스트랜드는 각각 올리브색(olive)와 슬레이트색(slate, 밝은 청색)으로 나타나 있다. 결합된 테스토스테론은 블루 2Fo-Fc 전자 밀도 맵(1δ에서 윤곽이 표시됨)을 갖는 시안(cyan, 청록색) 스틱 모델로 표시한다. 도 6c는 Streptomyces coelicolor A3 유래의 CYP154C1(2; PDB 코드 1GWI; UniProtKB 코드: Q9L142), Nocardia farcinica 유래의 CYP154C5(PDB 코드 4J6D; UniProtKB 코드: Q5YNS8), Streptomyces coelicolor 유래의 CYP154A1(PDB 코드 1ODO; UniProtKB 코드: Q9KZR7) 및 Streptomyces venezuelae 유래의 P450 모노옥시게나제 PikC(PDB 코드 2WHW; UniProtKB 코드: O87605)과 StCYP154C4와의 구조 기반 다중 서열 정렬을 나타낸 결과이다. 테스토스테론-결합된 StCYP154C4-2의 이차 구조는 다수의 정렬된 서열 위에 나타내었다. 테스토스테론 결합 후의 위치가 변경된 Ala238은 블랙 트라이앵글로 표시하였다. 테스토스테론과 특이적으로 상호 작용하는 잔기는 잔기 위에의 블랙 써클로 표시하였다.
도 7은 StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2의 헴 결합 모드를 나타내는 결과이다. 중첩된 StCYP154C4-1(연어색) 및 StCYP154C4-2(올리브색)의 입체도는 헴의 철이 Cys350의 측쇄에 의해 조정되어 있음을 나타낸다. 헴의 카르복실기는 Lys57, His94, Arg98 및 Arg291과 상호 작용하고, 헴의 비극성 영역은 Met86, Val101, Leu105, Ile235, Leu246, Leu279, Pro284, Val288, Phe314, Ala342 및 Phe343과 소수성 상호 작용을 형성한다.
도 8은 StCYP154C4의 기질-결합 부위를 나타내는 결과이다. StCYP154C4-1(a) 및 테스토스테론-결합된 StCYP154C4-2(b)의 기질-결합 부위는 각각 연어색 및 올리브색로 채색하였다. 기질-결합 부위의 잔기 및 결합된 헴 분자(마젠타) 및 테스토스테론(시안)은 스틱 모델로 표시하였다. 결합된 테스토스테론과 StCYP154C4-2 사이에 형성된 수소 결합은 레드 점선으로 표시하였다. 도 8c는 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2로 중첩된 StCYP154C4-1의 입체도이다. α13 헬릭스는 테스토스테론 결합 과정에서 구조학적 변화를 겪는다.
도 9는 테스토스테론(시안)-결합 StCYP154C4-2(올리브) 및 테스토스테론(녹색)-결합 NfCYP154C5(PDB 코드 4J6D; 슬레이트)의 중첩 구조의 입체도이다. 결합된 테스토스테론 및 테스토스테론 분자 근처의 잔기는 스틱으로 표시하였다. 2개 효소의 구조적 비교는 상이한 테스토스테론-결합 모드를 나타낸다.

본 명세서에서, "생물전환 방법"이라 함은 미생물 발효 및 효소 처리 등의 생명공학 기술을 통해 새로운 생성물을 생성하거나 기존의 화학 합성공정에 의해 합성 및 생산되고 있는 기존 화학물질을 대체하여 생산할 수 있는 기술을 의미하며, 생물전환(bioconversion, biotransformation), 생합성(biosynthesis), 생촉매(bio-catalysis) 등으로 불리기도 한다.

본 발명은 CYP154C4를 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다. CYP154C4 효소는 Streptomyces sp. 유래일 수 있고, 구체적으로 Streptomyces sp. W2061(StCYP154C4-1) 및 Streptomyces sp. ATCC 11861(StCYP154C4-2) 유래의 2개 CYP154C4를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 2개 효소(StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2)의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열(StCYP154C4-1의 경우, 표 1 참조) 또는 서열번호 2의 아미노산 서열(StCYP154C4-2의 경우, 표 2 참조)을 포함할 수 있고, GenBank에 기탁된 등록 번호(accession number) MH444361(서열번호 3의 염기서열, 표 1 참조) 및 MH444362(서열번호 4의 염기서열, 표 2 참조)의 서열로부터 발현된 단백질일 수 있다. 또한, 2개 효소 유전자를 인코딩하는 서열(서열번호 3 또는 서열번호 4의 염기 서열)을 클로닝한 재조합 벡터를 대장균에 과발현시키는 통상적인 단백질 생산 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 공간군(space group) I2₁2₁2₁에 속하고, 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하고, 유닛-셀 파라미터가 a = 83.755 Å, b = 115.032 Å, c = 127.807 Å, a = b = c = 90°인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4 효소 단백질 결정을 제공한다. 상기 CYP154C4 효소 단백질 결정은 21개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 CYP154C4 효소 단백질 결정은 (1-a) PEG3350, 리튬 설페이트 및 Bis-Tris-HCl을 포함하는 저장 용액과 (1-b) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬 P450 CYP154C4 효소 단백질의 결정화 방법에 의해 결정화될 수 있다. 이 때, 상기 저장 용액은 5% 내지 45%(w/v)의 PEG3350, 0.02 내지 0.5 M 리튬 설페이트 및 0.01 내지 0.5 M Bis-Tris-HCl을 포함할 수 있고, pH 5.5 내지 7.5일 수 있다.

본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 공간군(space group) I2₁2₁2₁에 속하고, 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하고, 유닛-셀 파라미터가 a = 90.381 Å, b = 113.94 Å, c = 128.361 Å, a = b = c = 90°인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4 효소 단백질 결정을 제공한다. 상기 CYP154C4 효소 단백질 결정은 19개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함할 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 CYP154C4 효소 단백질 결정은 (2-a) 소듐 시트레이트 트리베이직(sodium citrate tribasic), 소듐 카코딜레이트(sodium cacodylate) 및 HCl을 포함하는 저장 용액과 (2-b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬 P450 CYP154C4 효소 단백질의 결정화 방법에 의해 결정화될 수 있다. 이 때, 상기 저장 용액은 0.1 내지 5 M의 소듐 시트레이트 트리베이직 및 0.01 내지 0.5 M 소듐 카코딜레이트:HCl을 포함할 수 있고, pH 5.5 내지 7.5일 수 있다.

본 발명의 스테로이드의 생물전환 방법에서 상기 스테로이드는 테스토스테론일 수 있으며, 하기 화학식 1로 나타내었다.

[화학식 1]

또한, 상기 생물전환 방법으로부터 화학식 2의 구조를 갖는 생성물(2-히드록시테스토스테론)을 얻을 수 있다.

[화학식 2]

일 구현예에서 상기 히드록시화는 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 Fdx는 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 1 ~ 20 μM, 가장 바람직하게는 4 ~ 8 μM이고, Fdr이 0.01 ~ 10 U, 바람직하게는 0.03 ~ 5 U, 가장 바람직하게는 0.05 ~ 3 U로 사용될 수 있다. 상기 NADPH는 0.01 ~ 10 mM, 바람직하게는 0.1 ~ 5 mM, 가장 바람직하게는 0.3 ~ 3 mM로 사용될 수 있다. 또한, 상기 시스템은 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 카탈라제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서 상기 히드록시화는 다이아세톡시요오드벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 다이아세톡시요오드벤젠은 0.1 ~ 50 mM, 바람직하게는 0.3 ~ 20 mM, 가장 바람직하게는 0.5 ~ 5 mM로 사용될 수 있고, 상기 H₂O₂는 1 ~ 100 mM, 바람직하게는 10 ~ 100 mM, 가장 바람직하게는 60 ~ 100 mM로 사용될 수 있다.

상기 CYP154C4는 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 0.5 ~ 50 μM, 가장 바람직하게는 1 ~ 20 μM로 사용할 수 있다.

또한, 상기 생물전환 방법은 pH 4 ~ 10, 바람직하게는 pH 6 ~ 8.5, 가장 바람직하게는 pH 7 ~ 8에서 수행할 수 있고, 20 ~ 40 ℃, 바람직하게는 25 ~ 35 ℃, 가장 바람직하게는 28 ~ 32 ℃의 반응 온도에서 수행할 수 있다.

본 발명의 CYP154C4 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 종래의 CYP154C4 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 위치특이성이 우수하므로, 약학 및 단백질 공학 분야에서 인공 스테로이드 관련 CYP 개발 기술로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

(1) 재료

테스토스테론은 Tokyo Chemical Industry사(Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 시금치 페레독신, 시금치 페레독신 환원효소, 과산화수소(H₂O₂), 다이아세톡시요오드벤젠(diacetoxyiodobenzne, PIDA), 카탈라제, 암피실린, 클로람페니콜(chloramphenicol) 및 α-아미노레불린산(α-aminolevulinic acid, ALA)을 Sigma-Aldrich사(Yongin, Korea)에서 구입하였다. DNA 중합 효소, T4 DNA 리가제(ligase) 및 dNTP는 Takara Bio사(Shiga, Japan)로부터 입수하였다. IPTG 및 DTT는 Duchefa Bohemie사(Netherlands)에서 입수하였다. 다른 모든 화학 물질은 상업적으로 이용 가능한 공급처에서 확보한 고-등급(high-grade)의 물질이다. 제한 효소(EcoRⅠ 및 HindⅢ)는 Takara Clontech사(Japan)로부터 입수하였다.

(2) 서열 등록 번호

CYP 효소의 암호화에 관여하는 유전자는 Streptomyces sp. W2061 및 Streptomyces sp. ATCC11861의 서열로부터 헴(heme)-결합 도메인 시그니처 서열[FxxGx(H/R)xCxG]에 기초하여 검색하였다. CYP 효소(CYP154C4)의 이름은 David Nelson 박사(http://drnelson.uthsc.edu/cytochromeP450.html)에 의해 부여되었다.

StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2의 각각 1230 bp의 인코딩 염기 서열(StCYP154C4-1의 경우 서열번호 3, 표 1 참조; StCYP154C4-2의 경우 서열번호 4, 표 2 참조)은 GenBank에 등록 번호(accession number) MH444361 및 MH444362로 각각 기탁하였다. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기 서열은 클로닝 후 대장균에서 발현된 단백질을 분석한 결과, 각각 409개의 아미노산 서열(StCYP154C4-1의 경우 서열번호 1, 표 1 참조; StCYP154C4-2의 경우 서열번호 2, 표 2 참조)인 것을 확인하였다.

(3) 2개 St CYP154C4의 클로닝, 발현 및 정제

StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2 유전자는 Streptomyces sp. W2061 및 Streptomyces sp. ATCC 11861의 게놈 DNA로부터 각각 증폭하였다. StCYP154C-1 서열은 정방향 프라이머로서 5'-GAA TTC ATG ACC CGT ATCC GCG CTC-3'(EcoRⅠ 부위는 밑줄 표기)을 사용하고, 역방향 프라이머로서 5'-AAG CTT TCA GGC GTC GCC GCC G-3'(HindⅢ 부위는 밑줄 표기)을 사용하여 증폭시켰다. 유사하게, StCYP154C4-2의 증폭은 특정 정방향 프라이머 5'-GAA TTC ATG ACC CGT ATCC GCG CTC G-3'(EcoRⅠ 부위는 밑줄 표기)를 사용하고, 역방향 프리이머 5'-AAG CTT TCA GGC GTC GTG GCC GAA-3'(HindⅢ 부위는 밑줄 표기)를 사용하여 수행하였다. 표적(target) 유전자를 pET32a(+) 벡터에 클로닝시키고 대장균 BL21(DE3) 세포에 도입하였다.

형질 전환된 세포를 종균 배양을 위해 37 ℃에서 밤새 배양한 다음, 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하고, 37 ℃에서 세포 밀도가 600 ㎚에서 0.6에서 0.8까지의 범위에서 진탕(180 rpm) 배양하였다. 세포 배양액을 0.3 mM IPTG로 유도하고, 100 ㎍/㎖ 5-아미노레불린산 염산염(5-aminolevulinic acid hydrochloride) 및 0.5 mM FeCl₃를 첨가하였다. 20 ℃에서 48시간 동안 단백질 발현을 수행한 후, 원심분리에 의해 세포를 수거하였다. 세포 침전물을 추가로 세척하고 10 % 글리세롤, 100 mM NaCl 및 1 mM DTT를 함유하는 50 mM Tris/HCl 완충액(pH 7.4)에 재현탁시켰다.

정제를 위해, 세포를 초음파 처리하고 4 ℃에서 30분 동안 24650 g로 원심분리하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물의 가용성 분획을 TALON His-tag를 사용하는 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피에 의해 혼합하고 정제하였다. 단백질이 결합된 수지를 2컬럼 부피의 평형 완충액(potassium phosphate, pH 7.4)으로 미리 평형화시키고 결합 단백질을 20, 100 및 300 mM 이미다졸을 각각 포함하는 용리 완충액[potassium phosphate(pH 7.4), 10 % glycerol 및 100 mM NaCl}으로 용리시켰다. 용리된 단백질의 분획을 SDS-PAGE에 의해 순도를 분석하고, 분자량 컷-오프가 30 kDa인 Amicon 원심분리 필터(Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 한외 여과로 순수 분획을 농축시켰다.

(4) 자외선-가시광선 흡수 분광법

2개 StCYP154C4의 UV-가시광선 스펙트럼을 Biochrome Libra S35PC UV/visible spectrophotometer(Biochrome Libra, Cambridge, UK)를 이용하여 실온에서 측정하였다. 흡광 분광법을 사용하여 CYP 농도, 순도 및 기질 스핀 이동(spin shift)을 측정하였다. 두 CYP의 농도는 흡광 계수(extinction coefficient) ε_450-490 = 91000 mM/cm를 이용한 CO-차(difference) 스펙트럼에 근거하여 결정하였다. 단백질을 포티숨 포스페이트 완충액(pH 7.4) 2 ㎖로 희석하고, 2개의 큐벳(시료 및 참고물질)으로 분리하였다. 시료를 CO로 1분 동안 버블링시킨 다음, 2개 큐벳에 소듐 디티오나이트(sodium dithionite)를 첨가하였다. 큐벳은 400 ㎚에서 500 ㎚ 사이의 분광 광도계를 사용하여 ~ 450 ㎚에서 판독 값이 판독 값의 가장 높은 값에 비해 감소할 때까지 반복적으로 스캐닝하였다. 두 CYP의 순도(RZ 값)를 결정하기 위해, CYP 효소를 함유하는 시료를 200-500 ㎚의 범위에서 스캔하였지만, 참고물질에는 완충액만 포함되어 있었다. 기질-결합 이동(shift)은 포타슘 포스페이트 완충액(pH 7.4)에 1μM CYP 및 20 μM 기질을 함유하는 시료와 완충액 및 동량의 기질만 함유된 참고물질에서 관찰하였다. 시료와 참고물질은 350 ~ 500 ㎚에서 스캔하였다. CYP가 포화상태가 될 때까지 기질(테스토스테론)을 적정하여 StCYP154C4s(1 μM)에 대한 해리 상수(K_d) 값을 결정하였다.

(5) 효소 활성 분석

2개 StCYP154C4의 시험관 내 활성을 NADPH, PIDA 및 H₂O₂의 존재 하에서 각각 측정하였다. 기질(테스토스테론) 및 PIDA를 DMSO 및 100 % 에탄올에 용해시켜 스톡 농도를 각각 20 및 50 mM로 제조하였다.

반응 시스템 Ⅰ은 3 μM StCYP154C4, 시금치 Fdx(6 μM), 시금치 Fdr(0.025 U), 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제(1 U), 글루코스-6-포스페이트(10 mM), MgCl₂(5 mM), 카탈라제(100 ㎍/㎖) 및 기질 (500 μM)을 500 ㎕ 포타슘 포스페이트 완충액(pH 7.4)에 용해시켰다. 반응은 500 μM NADPH로 개시하였다. 반응 혼합물을 30 ℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, 에틸 아세테이트(1000 ㎕)로 추출하여 건조시키고, 이를 HPLC 및 LC-MS로 분석하였다.

반응 시스템 Ⅱ는 StCYP154C4(15 μM), Fdx (15 μM), Fdr (0.1 U), 글루코스-6-포스페이트(100 mM), 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제(5 U), MgCl₂ (10 mM), 카탈라제(100 ㎍/㎖), 기질 (500 μM)) 및 1 mM NADPH로 처리하였다. 반응 혼합물을 2 내지 6시간 범위의 상이한 시간 간격 동안 30 ℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 추출하고, 반응 시스템 I에 대해 기술된 바와 같이 분석하였다.

PIDA(2 μM) 및 H₂O₂(40 mM)로 뒷받침된 다른 2개 반응은 3 μM StCYP154C4를 포함하고, 2개의 StCYP154C4를 개별적으로 분석하였다. 모든 반응 혼합물을 30 ℃에서 2시간 동안 항온 반응시키고 반응 시스템 I에 대해 기재된 바와 같이 추출 및 분석 하였다.

(6) 생성물에 대한 정제 및 특성 규명

NMR 분석을 위해 제시된 생성물(P2)은 StCYP154C-1에 의해 촉매화된 업-스케일된 시험관 내 반응(300 ㎖)에 의해 제조하였다. 반응은 250 μM 기질을 함유하는 포타슘 포스페이트 완충액(pH 7.4) 중 10 ㎖ 부피에서 별도로 수행하였다. 반응은 2 mM PIDA를 첨가하여 개시하고 30 ℃에서 2시간 동안 수행하였다. 각 반응물을 에틸 아세테이트 10 ㎖로 추출하고, 진공하에 건조시키고, HPLC 등급 메탄올에 용해시켰다. 시료를 0.45 ㎛ 공극 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 필터로 여과하고, C₁₈ 컬럼(Mightysil RP-18 GP; 150 × 4.6 ㎜, 5 ㎛; Kanto Chemical, Tokyo, Japan)을 갖는 예비 HPLC(Shimadzu, Kyoto, Japan)에 주입하였다. 생성물(P2)의 순도는 HPLC를 통해 재확인하였다. 생성물(P2)을 함유하는 분획물을 건조시켜 DMSO-d ₆ 에 용해시키고, Varian Unity INOVA spectrometer(Varian, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 800 MHz에서 NMR 분석(¹H-NMR, ¹³C-NMR, ROSEY, COSY, HMBC 및 HSQC)을 수행하였다.

(7) 분석 방법

반응 혼합물을 양이온 모드에서 SYNAPT G2-S/ACUITY UPLC 사중극 비행 시간/전기 분무 이온화 질량 분석기(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 ultra-HPLC (UHPLC)로 분석하였다. 시료를 UHPLC 시스템에 주입하고 Mightysil 역상 C₁₈ 컬럼(4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛, Kanto Chemical)을 사용하여 분리하였다. 아세토니트릴(B)과 물(A)을 1 ㎖/min 의 유속으로 B의 농도구배 시스템(0-10분 15 %, 10-20분 50 %, 20-25분 70 % 및 25-40분 15 %)을 이용하였다. 기질 및 그 생성물의 검출은 242 ㎚에서의 UV 흡광도를 통해 수행하였다.

(8) 결정화 및 데이터 수집

StCYP154C4-1과 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2의 초기 결정화 스크리닝은 96-웰 결정화 플레이트(Emerald Bio, Bainbridge Island, WA, USA)에서 293K의 시팅 드롭(sitting drop) 증기-확산 방법을 갖는 결정화 로봇(Mosquito; TTP Labtech, Cambridge, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. MCSG suite Ⅰ-Ⅳ(Microlytic, Burlington, MA, USA) 및 SaltRx(Hampton Research, Aliso Viejo, CA, USA)를 포함한 상업적으로 구입할 수 있는 스크리닝 키트를 사용하여 스크리닝하였다.

테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2의 공-결정화는 10 mM 테스토스테론을 첨가하여 제조하였다. 상기 드롭은 단백질 용액 0.3 ㎕ 및 저장 용액 0.3 ㎕을 혼합하고, 293 K에서 80 ㎕ 저장 용액으로 평형화시켰다. StCYP154C4-1 결정은 25 %(w/v) PEG3350, 0.2 M 리튬 설페이트(lithium sulfate) 및 0.1 M Bis-Tris-HCl(pH 6.5; MCSG2 no. B11) 조건 하에서 형성시켰다. 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2의 결정은 1 M 소듐 시트레이트 트리베이직(sodium citrate tribasic) 및 0.1 M 소듐 카코딜레이트(sodium cacodylate):HCl(pH 6.5; MCSG3 no. A1)의 조건으로부터 얻었다. 결정을 장착하기 전에, 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2의 결정을 동결 방지제(cryoprotectant)로 사용된 파라톤(paratone)-N 오일에 짧게 흡수시킨 반면에, StCYP154C4-1 결정체는 곧바로 장착하였다.

두 결정에 대한 X선 회절 데이터는 100K에서 포항 가속기 연구소(PAL; 포항, 한국)의 BL-5C 빔 라인을 통해 수집하였다. StCYP154C4-1에 대한 회절 데이터의 2.2-Å 해상도는 180 이미지를 포함하고, 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2에 대한 회절 데이터의 2.7-Å 해상도는 150 이미지를 포함하였다. 이미지 데이터는 이미지 당 1° 진동(oscillation) 및 1초의 노출 시간에서 수집하였다. 모든 회절 데이터는 HKL-2000을 사용하여 인덱스, 처리 및 확장규모화하였다. X선 회절 데이터와 관련된 통계를 표 3에 제시하였다.

(9) 구조 결정 및 개선

StCYP154C4-1의 분자 치환은 CCP4i 패키지의 MOLREP 프로그램을 사용하여 성공적으로 수행하였다. S. coelicolor 유래의 CYP154C1(PDB code 1GWI; 73 % 서열 상동성)의 결정 구조를 주형(template) 모델로 사용하였다. 1개 분자는 64.50 % 용제(solvent)에 해당하는 Matthews 계수(coefficient) 3.45 Å³ Da^-1을 갖는 비대칭(asymmetric) 유닛(unit)에서 예측되었다. 결과물 구조는 COOT 및 REFMAC5를 이용하여 수동으로 재구성(rebuilding)하고 정련(refinement)하였다. StCYP154C4-1의 최종 모델은 R _work 및 R _free 값이 각각 17.24 % 및 22.17 %임을 나타내었다. 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2는 주형 모델로 StCYP154C4-1을 사용하여 분자 치환을 통해 해결하였다. StCYP154C4-2 구조에 대한 재구성 및 정련은 StCYP154C4-1에 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 수행하였다. 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4의 최종 모델은 R _work 및 R _free 값이 각각 20.31 % 및 25.10 %였다. MOLPROBITY 및 PROCHECK를 사용하여 2개 최종 모델의 품질을 확인하였다. StCYP154C4-1 및 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2에 대한 구조 좌표(coordinates) 및 구조 인자(factor) 데이터는 각각 6A7I 및 6A7J 등록 코드(accession code)로 Protein Data Bank에 기탁하였다.

2. 결과

(1) St CYP154C4의 발현, 정제 및 분광학적 특성화

CYP, StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2는 대장균 BL21(DE3) 세포에서 가용성 형태로 발현되었다. 각각의 분획은 SDS-PAGE 분석을 통해 분석하였고, 이는 ~ 65 kDa에서 밴드를 나타내었지만(도 1a 참조), 2개 CYP에 대해 계산된 이론적 분자 질량은 ~ 45 kDa이었다. pET32a(+) 벡터에서 Trx-His-s-엔테로키나제(enterokinase) 융합 서열로 인한 분자 질량의 차이가 전사(transcription)되고 StCYP154C4s 서열에 따라 번역된다. StCYP154C4s 순도(purity)는 RZ 값으로 결정하였으며, 이는 소렛(Soret) 밴드의 λ_max에서의 흡광도 대 280 ㎚에서의 흡광도의 비율로 계산하였으며, StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2의 흡광도는 1.32 및 1.28로 확인되어, 2개 CYP는 순도가 높은 것으로 확인되었다. StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2의 산화된 형태에 대한 자외선-가시광선 흡수 분광법(UV-visible absorption spectroscopy)은 417 ㎚에서 소렛 밴드를 나타내었다. 유사하게, 환원된 상태 및 CO 결합된 형태에서, 2개 CYP 모두 447 ㎚에서 피크를 나타내었고(도 1b 및 도 1c 참조), 이는 Fe²⁺CO 복합체 형태의 CYP 헴(heme)의 특징적인 신호(signature)를 나타낸다.

(2) 기질-결합 분석

광-흡수 분광법(optical-absorption spectroscopy)은 CYP의 물리화학적 특성에 큰 이점을 나타내었고, 농도를 측정하고, 기질과 억제제의 결합을 모니터링 하고, 상이한 동역학 파라미터를 확인하기 위해 광범위하게 활용되었다. CYP에 의한 기질 결합은 6번째 리간드로서 물의 변위(displacement)을 야기하며, 그 결과 헴(heme) 철(iron)이 낮은(415-418 ㎚) 곳에서 높은(390-394 ㎚) 곳으로 스핀 이동을 일으킨다. StCYP154C4는 테스토스테론 기질에 결합시 이러한 현상을 나타내었고, 테스토스테론을 첨가하면 418 ㎚에서 소렛 흡광도가 392 ㎚로 이동하여(도 1d참조), 2개 CYP가 테스토스테론에 결합할 수 있음을 나타내었다. 따라서, 테스토스테론을 StCYP154C4에 의해 촉매된 시험관 내 반응을 위한 기질로 선택하였다. 이와 유사하게, CYP154C4에 대한 해리 상수(dissociation constant, K_d) 값은 포화될 때까지 상이한 농도의 기질(테스토스테론)을 적정함(titrating)으로써 결정되었다(도 2 참조). StCYP154C4-1의 K_d 값은 10 μM 미만인 것으로 확인되었으며, 이는 강한(tight) 결합을 나타낸다. StCYP154C4-2는 StCYP154C4-1보다 높은 K_d 값을 나타내었다(표 4 참조).

(3) 효소 활성 및 생성물 확인

3 μM의 CYP, 0.025 U의 페레독신 환원효소(Fdr), 6 μM의 페레독신(Fdx) 및 1 U의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제를 함유하는 반응 혼합물(반응 시스템 Ⅰ)에서, 3가지 기질(프로게스테론, 테스토스테론 및 안드로스텐디온)은 10 % 미만이었다. 프로게스테론 반응 혼합물의 HPLC 분석은 단일 생성물 피크를 나타내었다(도 3a 참조). 반응 혼합물의 액체 크로마토그래피 질량 분석(LC-MS) 분석은 히드록시화된 프로게스테론의 정확한 질량을 나타내었다(자료 미도시). 프로게스테론 생성물은 표준물질(도 3a, 패널 Ⅲ 참조)과의 동시용리(coelution)에 의해 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)으로 확인되었다. 테스토스테론 반응 혼합물은 2개 CYP에 의해 2개 이상의 생성물이 형성되었음을 나타내었다(도 3b 참조). 그 중 1개의 생성물(P1)은 표준물질(도 3b, 패널 Ⅲ 참조)과의 동시용리를 기반으로 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone)으로 확인되었다. NMR 구조 해석에 기초하여, 테스토스테론 반응 혼합물에서 관찰된 다른 생성물(P2)은 2α 및 2β-히드록시테스토스테론의 혼합물로 확인되었다(도 3c 참조).

반응 시스템 Ⅰ에서 매우 낮은 전환율을 나타내었으나, 반응 시스템 Ⅱ에서는, 15 μM의 CYP, 15 μM의 Fdx, 0.1 U의 Fdr 및 5 U의 글루코스-6-포스페이트 디히드로게나제로 반응 성분의 농도를 증가시킨 경우에 3개 기질 모두에 대해 높은 전환율(> 70 %)을 나타낼 뿐만 아니라 생성물의 분포에도 변화를 나타내었다. 프로게스테론 반응 혼합물(도 4a)에서 확인된 3개 생성물 중, P2는 [M + H]⁺ 331.2291의 정확한 질량을 갖는 모노히드록시화된 프로게스테론으로 확인되었다. 생성물 P3 및 P1은 각각 [M + H]⁺ 329.2115 및 [M + H]⁺ 347.2222의 정확한 질량을 나타내었다. 이들 생성물(P1 및 P3)은 모노히드록실화된 생성물(P2)로부터 얻어졌을 수 있으며, 이는 시간에 따른 반응 결과에 의해 추가로 뒷받침되며, 시간 간격의 증가에 따라 P2의 농도는 감소하지만 다른 2개 생성물(P1 및 P3)은 시간 간격의 증가에 따라 증가하였다(도 4b 참조). P3는 히드록시기의 탈수소화(dehydrogenation)로부터 유도되어 케토(keto)기를 생성할 수 있다.

반응 시스템 Ⅲ에서, 반응 시스템 Ⅱ에 사용된 농도를 절반으로 줄이고, StCYP154C4-1에 의해 촉매된 반응을 수행하였다. 이는 2개 생성물 P1 및 P3의 매우 낮은 전환율을 나타내는 반면에, 단일 모노히드록시화된 생성물(P2)을 주로 나타내었다(도 4c 참조). 이는 P1 및 P3가 StCYP154C4-1에 의해 P2에 대한 순차적으로 산화가 있었음을 분명히 나타낸다. 놀랍게도, 표준물질(16α-히드록시프로게스테론, 도 4d 참조)과의 HPLC 비교에 기초하여, 반응 시스템 Ⅰ에서 확인된 C16α 위치(P)에서 독점적으로 히드록시화된 프로게스테론은 반응 시스템 Ⅱ에서는 확인되지 않았다.

또 다른 기질인 테스토스테론은 반응 시스템 Ⅱ를 사용하여 여러 생성물로 전환되었다. P3는 StCYP154C4-1에 의한 촉매 반응의 주요 생성물로 확인되었다(도 5a, 패널 Ⅱ 참조); 그러나, StCYP154C4-2에 의해 촉매된 반응에서, P2가 주요 생성물로서 관찰되었다(도 5a, 패널 I 참조). 반응 시스템 Ⅱ 에 의해 생성된 P2는 HPLC 머무름(retention) 시간 비교에 기초하여 2α 및 2β-테스토스테론의 혼합물로 확인되었다(도 5a, 패널 Ⅲ 참조). 16α-히드록시테스토스테론일 수 있는 P1은 다른 생성물에 비하여 매우 낮은 전환율을 나타내었다. 안드로스텐디온(androstenedione)은 StCYP154C4-1(도 5B 패널 I 참조)에 의해 1개의 주요 모노히드록시화된 생성물(P3)과 2개의 다른 미량 생성물(P1 및 P2)로 변환되었다. P1 및 P2의 LC-MS 분석은 각각 디히드록시- 및 모노히드록시- 안드로스텐디온의 정확한 질량을 나타내었다. StCYP154C4-1을 통한 촉매작용에 의해 형성된 3개의 상이한 안드로스텐디온 생성물 외에도, StCYP154C4-2는 또 다른 모노히드록시화된 생성물(P4; 도 5b, 패널 Ⅱ 참조)의 형성을 나타내었다.

산소 대체물(surrogate) 다이아세톡시요오도벤젠(diacetoxyiodobenzene, PIDA) 및 과산화수소(H₂O₂)에 의해 뒷받침되는 시험관 내 반응을 수행하였다. 요오도소벤젠(iodosobenzene)은 시험관 내 반응에서 많은 경우에 P450-촉매로 사용되었던 PIDA와 비슷한 PhIO-활성화된 화합물이다. PIDA에 의해 뒷받침된 반응은 2개 StCYP154C4에 의해 프로게스테론 기질이 주요 전환물 (P)인 16α-히드록시프로게스테론으로 전환되었으며, 이는 표준물질과의 동시용리에 기초하여 확인되었다(도 5c 참조). 테스토스테론과의 StCYP154C4-2-촉매화된 반응은 단일 생성물(P4)의 형성을 나타내었고, 이는 2α 및 2β-히드록시테스토스테론의 혼합물로 확인되었다(도 5d, 패널 Ⅰ 참조). StCYP154C4-1에 의해 촉매된 반응에서, 16α-히드록시테스토스테론(P1)으로의 미량(minor) 전환 및 2α 및 2β-히드록시테스토스테론으로의 주요 전환이 관찰되었다(도 5d, 패널 Ⅱ). 선행문헌[Bhakta MN, et al., J Am Chem Soc 20205, 127, 1376-1377]에 따르면, P450에 의한 Phlo- 및 NADPH- 뒷받침된 반응은 기계적으로 구별할 수 있어 생성물물 프로파일에 차이가 있다. NADPH 또는 PhIO에 의해 뒷받침된 CYP154C8-촉매화 반응에 의해 생성물 프로파일에서 유사한 차이가 최근에 보고되었다[Dangi B, et al., ChemBioChem 2018, 19, 2273-2282]. 16α-히드록시화에 더하여, CYP154C8에 의한 PIDA(PhIO 시스템)-뒷받침된 반응은 또한 프로게스테론 및 11-케토프로게스테론을 NADPH 또는 NADH 시스템에서 관찰되지 않았던 6β-히드록시화를 촉매하였다. 다른 보고에서, CYP17A1은 요오도소벤젠과 NADPH-P450 환원효소의 존재 하에서 화합물 Ⅰ을 형성하는 상이한 생성물을 생성하였다[Yoshimoto FK, et al., J Biol Chem 2016, 291, 17143-17164]. P450 효소인 MycG는 대안의(alternative) 대체 산화·환원 파트너와 파트너가 될 때 변경된 촉매활성을 나타내는 것도 보고되었다. 최근 개별의 반응에서 11개의 상이한 산화·환원 파트너와 함께 파트너가 될 때 CYP106A2는 산화·환원 파트너의 결합 모드의 차이로 인한 생성물 패턴의 차이를 나타내었다. 고농도(40 mM)의 H₂O₂ 존재 하에서의 반응은 테스토스테론 및 프로게스테론의 낮은 전환율(~ 5 %)을 나타내었다(자료 미도시). 테스토스테론으로 2-히드록시화를 통한 주요 전환이 관찰된 반면에, 프로게스테론 반응 혼합물은 16α-히드록시화에 상응하는 단일 생성물 피크를 나타내었다. 안드로스텐디온(androstenedione)은 H₂O₂ 존재 하에서 2개 CYP에 의한 촉매반응를 통하여 어떤 생성물로도 전환되지 않았다

StCYP154C4는 테스토스테론을 히드록시화시켜 히드록시테스토스테론의 이성질체를 생성하는 최초로 보고된 야생형 CYP 효소이다. 입체이성질체를 형성하기 위해서 7α 및 7β 위치에서 히드록시화된 디히드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone)과 반응하는 CYP106A2는 생성물 형성에 대한 유사한 패턴이 관찰되었다. 비슷한 방식으로, CYP106A2는 12α 및 12β 위치에서 아비에트산(abietic acid), 디테르펜(diterpene)을 히드록시화하는 것으로 확인되었다. C2를 히드록시화시키는 것으로 알려진 야생형 P450은 많지 않으며, 가장 잘 특성화된 P450BM3(CYP102A1)도 2-히드록시화된 테스토스테론을 얻기 위해 유전자 조작된 것이었다[van Vugt-Lussenburg BM, et al., Biochem Biophys Res Commun 2006, 346, 810-818; Vottero E, et al., J Biol Inorg Chem 2011, 16, 899-912; Kille S, et al., Nat Chem 2011, 3, 738-743]. StCYP154C4s는 미래에 단백질 공학에 의해 상이한 위치특이성(regiospecificity)을 갖는 스테로이드를 개발할 목적으로 중요한 생체 촉매(biocatalyst)를 대표할 수 있다. 최근 Sorangium cellulosum strain So ce56 유래 스테로이드를 생성능을 갖는 P450 CYP260A1은 매우 중요한 1α 및 17α 위치에서 프로게스테론의 입체- 및 위치선택적 히드록시화를 위해 유전자 조작되었다[Khatri Y, et al., ACS Chem Biol 2018, 13, 1021-1028]. 16α-프로게스테론을 생산할 수 있는 P450BM3 변이체 M01 A82W S72I의 단백질 유전자 조작을 포함하는 또 다른 연구에서 연구자들은 단일 활성 부위 돌연변이를 사용하여 16β로 입체 선택성을 변경하였다[Venkataraman H, et al., ChemBioChem 2012, 13, 520-523.]. 박테리아 기원의 다른 P450은 상이한 위치에서 테스토스테론을 히드록시화하는 것으로 확인되었다[Makino T, et al., Appl Environ Microbiol 2014, 80, 1371-1379; Agematu H, et al., Biosci Biotechnol Biochem 2006, 70, 307-311; Bracco P, et al., Microb Cell Fact 2013, 12, 95]. 그러나, 2α 및 2β 위치 모두를 히드록시화시키는 야생형 CYP는 보고된 바가 없다.

StCYP154C4는 CYP154C 서브클래스 P450 효소의 기능을 이해하기에 적합한 모델이다. 본 발명은 산화·환원 파트너의 선택이 P450 반응의 유형과 선택성에 영향을 미친다는 것을 나타낼 뿐만 아니라, P450 및 보조 단백질(산화·환원 파트너)의 다양한 농도가 P450 효소에 의해 촉매화된 반응 유형을 변형시킬 수 있다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 변형된 활성 및 생산물 분포를 넘어서 화학적으로 더욱 활용할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 2개 StCYP154C4에 의해 촉매된 기질의 생체 내(in vivo) 전환을 뒷받침하기 위한 적합한 산화·환원 파트너의 부족(lack)이 NMR을 통하여 생성물을 확인하는 방법에 있어서 주요한 문제이다. StCYP154C4, 푸티다레독신 환원효소(Pdr) 및 푸티다레독신(Pdx)을 코딩하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 함유하는 대장균 세포에서 수행된 생체 내 생물전환은 3개 기질의 전환을 나타내지 않았다. 그러나, 반응이 시험관 내에서 Pdx 및 Pdr에 의해 뒷받침되는 경우에 미량(trace)의 생성물이 검출되었다. 2개 P450의 흥미로운 기능을 고려할 때, 변형된 생성물의 구조에 대한 해석에 따라, 생체 내 변환을 뒷받침하기 위해 적합한 산화·환원 파트너를 찾기 위해서 추가 연구가 요구된다. 따라서, 이들 기능에 관여하는 특정 잔기를 확인하기 위해 2개 효소에 대한 돌연변이 유발이 또한 수행되어야 한다.

(4) 전체 구조

Streptomyces sp. W2061 유래의 CYP154C4(StCYP154C4-1) 및 테스토스테론-결합된 Streptomyces sp. ATCC 11861 유래의 CYP154C4(StCYP154C4-2)에 대한 결정 구조는 각각 2.2 Å 및 2.7 Å에서 확인되었다(도 6a 및 도 6b 참조). 2개 CYP154C4는 93 %의 서열 상동성을 나타내며, 97 %가 양성이고 단 29개의 상이한 잔기를 갖는다. 2개 결정 모두 공간군(space group) I2₁2₁2₁에 속하고 각 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하였다. StCYP154C4-1은 S. coelicolor 유래의 CYP154C1(PDB code 1GWI; 73 % 서열 상동성)을 검색 모델로 이용하여 분자 치환에 의해 해결하였다. StCYP154C4-1 구조는 StCYP154C4-2 구조를 해결하기 위한 분자 치환 직후에 사용되었다. 2개 결정 구조는 헴(heme)-결합 위치가 α-헬릭스-리치 영역의 중심에 위치한 CYP의 전형적인 특성을 나타내었다. StCYP154C4-1은 21개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함하고(도 6a 참조), 반면에 테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2는 19개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드로 구성되며, StCYP154C4-1 구조와 비교하여 2 개의 작은 α-헬릭스가 누락되었다(도 6b 참조). Dali 서버(http://ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/dali/)를 이용한 구조 정렬은 StCYP154C4가 Z 스코어 58.7인 N. farcinca(PDB 코드 4J6B) 유래의 CYP154C5와 가장 높은 구조적 유사성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 또한, S. coelicolor(PDB 코드 1GWI) 유래의 CYP154C1 및 S. coelicolor(PDB 코드 1ODO) 유래의 CYP154A1 또한 높은 수준의 구조적 유사성을 나타내었다.

(5) St CYP154C4의 활성 사이트

보조인자(cofactor) 헴은 StCYP154C4 효소의 중심에 강하게 결합되어 있다. 헴의 카르복시기는 보존된 잔기 Lys57, His94, Arg98, Arg291 및 His348과 염(salt) 가교(bridge)를 형성한다. Cys350의 측쇄는 근위 측의 중심 철(central iron)을 배위결합(coordination)한다. 헴 분자의 비극성 영역은 소수성 잔기로 둘러싸여 있다(도 7 참조).

결합된 헴 위에, 기질이 결합된 포켓의 비극성 영역을 포함하는 Pro82, Leu87, Phe173, Phe174, Leu234, Ala237, Ala238 및 Val288 잔기를 갖는 소수성 기질 결합 부위가 존재한다. 또한, Gln233, Thr242, Thr285 및 Gln391을 포함한 여러 극성 잔기가 기질 결합 포켓에 위치한다(도 8 참조). 이들은 기질과 수소 결합을 담당할 수 있다. 이러한 모든 잔기는 StCYP154C4-1과 StCYP154C4-2 사이에서 공유되므로, 2개의 효소 모두 위치특이성과 기질특이성이 거의 유사할 수 있다(도 8a 및 도 8b 참조). 예상한 바와 같이, 이러한 예측은 생화학적 분석 결과에 의해 확인되었다. StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2의 구조적 비교는 테스토스테론 결합 후 α13 헬릭스의 형태적 변화를 나타내었다(도 8c 참조). α13 헬릭스에 위치한 Ala238은 테스토스테론 기질 근처로 이동하여 소수성 상호 작용을 형성하였다. 이러한 이동은 α13 헬릭스의 재배열을 유도한다. 기질 결합 포켓을 구성하는 다른 잔기의 배향은 테스토스테론 결합에 의해 약간 변경된다. 구체적으로, StCYP154C4-2와 테스토스테론 사이의 상호 작용은 각각 Thr285의 OG1 및 Gln233의 OE1과 상호 작용하는 테스토스테론의 O3 및 O17 원자를 포함한다. 이러한 2개의 수소 결합이 테스토스테론 결합의 배향을 결정하는데 중요할 수 있다. 또한, 테스토스테론의 C18 및 C19 원자는 α13 헬릭스의 반대편에 위치하고 Leu79, Pro82 및 Leu87과 비극성 상호 작용을 형성한다. 테스토스테론의 C2 원자는 헴 분자의 Fe를 향하고 2-히드록시화를 가능하게 하는 위치에서 4.5 Å 내에 놓인다. 활성 분석은 StCYP154C4가 테스토스테론의 2α-히드록시화 및 2β-히드록시화를 모두 촉매할 수 있음을 확인하였다.

(6) St CYP154C4의 테스토스테론 결합 모드

테스토스테론이 결합된 StCYP154C4-2 및 테스토스테론이 결합된 NfCYP154C5(PDB 코드 4J6D; 52 % 서열 상동성)의 구조적 중첩은 두 효소가 기질 결합 포켓에서 상이한 잔기 조성 뿐만 아니라 상이한 테스토스테론-결합 모드를 갖는 것을 나타낸다(도 9 참조).

StCYP154C4-2에서 결합 포켓의 비극성 영역을 포함하는 소수성 잔기 Leu79, Pro82, Leu87 및 Leu234는 각각 NfCYP154C5에서 Met84, Val88, Phe92 및 Ala240으로 표시된다. 이러한 차이는 StCYP154C4에서 리간드 결합 및 위치특이성에 영향을 미칠 수 있는 독특한 공동(cavity) 형태를 형성한다. 구체적으로, StCYP154C4의 Thr285는 테스토스테론의 O3 원자와 상호 작용하지만 NfCYP154C5에서 동일한 위치에 Val291로 표시된다. 대조적으로, NfCYP154C5 구조에서 테스토스테론 결합은 Gln398이 테스토스테론의 O3 원자와 상호 작용한다는 것을 나타낸다. StCYP154C4-2 구조에서 테스토스테론의 O3 원자는 수소 결합을 형성한다. Thr285는 NfCYP154C5 Gln398보다 결합 포켓의 더 깊은 지점에 위치한다. 기질-결합 부위 및 개별 측쇄 상호 작용에서의 이러한 차이는 테스토스테론이 StCYP154C4에서 반대 방향으로 결합할 가능성이 있다. 또한, StCYP154C4는 테스토스테론에서 2-히드록시화 및 16α-히드록시화 활성을 모두 나타내지만, NfCYP154C5는 단지 16α-히드록시화 활성을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명자들은 이전에 특성화된 NfCYP154C5 효소와 비교하여 StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2 효소의 일부에서 광범위하고 유연한 기질-히드록시화 활성을 확인하였다. 이러한 결과는 활성 사이트에서 위치된 잔기에서의 차이가 CYP154C4 효소에서 관찰된 변경된 기질 위치 및 촉매 활성을 설명할 수 있다는 것을 제시한다. 종합하면, 이러한 결과는 변형된 스테로이드 화합물을 생성하기 위하여 CYP154C4 계열 구성원의 후속 단백질 유전자 조작에 관한 유용한 식견을 제공한다.

(7) 요약

박테리아 사이토크롬 P450(CYP) 효소는 헴(heme) 분자를 보조인자로 사용하면서 다양한 내인성 기질의 히드록시화에 관여한다. CYP는 위치특이적 방식으로 히드록시기를 첨가하여 화학적 구조를 변형시킬 수 있는 유용한 생물 촉매로서 생명공학적 관심을 얻었다. 여기에서, Streptomyces sp. W2061(StCYP154C4-1) 및 Streptomyces sp. ATCC 11861(StCYP154C4-2) 유래의 2개 CYP154C4 단백질을 식별, 정제 및 특성화하였다. 활성 분석 결과, 테스토스테론의 16α-히드록시화 측면에서 Nocardia farcinica 유래로 이전에 기술된 NfCYP154C5의 활성과 상이하게, StCYP154C4-1 및 StCYP154C4-2는 2-히드록시화된 테스토스테론을 생산할 수 있다는 것이 확인되었다. 이러한 2개 CYP154C4 단백질의 위치선택성에 대한 분자적 기초를 더 잘 설명하기 위하여, StCYP154C4-1의 리간드 결합 형태의 결정 구조 및 StCYP154C4-2의 테스토스테론이 결합된 형태의 결정 구조가 확인되었다. 기존에 확인된 NfCYP154C5 구조와의 비교는 기질-결합 잔기에서의 차이를 나타내며, 이는 효소 사이의 높은 서열 유사성(54 % 상동성)에도 불구하고, 테스토스테론 히드록시화의 상이한 패턴에 대한 가능한 설명을 시사한다. 결론적으로, 본 발명은 단백질 공학 분야에서 상이한 위치특이성을 나타내는 인공 스테로이드 관련 CYP의 개발 기술로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> Bioconversion method for hydroxylizing steroid using CYP154C4 <130> P190618 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> StCYP154C4-1 from Streptomyces sp. W2061 <400> 1 Met Thr Arg Ile Ala Leu Asp Pro Phe Val Arg Asp Leu Asp Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly Pro Leu Ala Glu Val Glu Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Val His Val Tyr Ala Val Thr Arg His Ala Glu Ala Arg Ala 35 40 45 Leu Leu Thr Asp Ser Arg Val Val Lys Asp Ile Asp Val Trp Asn Ala 50 55 60 Trp Arg Arg Gly Glu Ile Pro Met Asp Trp Pro Leu Ile Gly Leu Ala 65 70 75 80 Asn Pro Gly Arg Ser Met Leu Thr Val Asp Gly Ala Asp His Arg Arg 85 90 95 Leu Arg Thr Leu Val Ala Gln Ala Leu Thr Val Lys Arg Val Glu Arg 100 105 110 Leu Arg Ala Gly Ile Glu Ala Leu Thr Asn Ala Ser Leu Glu Lys Leu 115 120 125 Ala Ala Leu Pro Ala Gly Glu Pro Val Asp Leu Lys Ala Glu Phe Ala 130 135 140 Tyr Pro Leu Pro Met Asn Val Ile Ser Glu Leu Met Gly Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Asp His Pro Arg Leu Lys Glu Leu Phe Glu Lys Phe Phe Ser Thr 165 170 175 Gln Thr Pro Pro Glu Glu Val Pro Gln Met Met Ala Asp Leu Gly Ala 180 185 190 Leu Phe Thr Lys Ile Val Asp Ala Lys Arg Thr Asn Pro Gly Asp Asp 195 200 205 Leu Thr Ser Ala Leu Ile Ala Ala Ser Glu Asn Gly Asp His Leu Thr 210 215 220 Asp Glu Glu Ile Val Asn Thr Leu Gln Leu Ile Ile Ala Ala Gly His 225 230 235 240 Glu Thr Thr Ile Ser Leu Ile Val Asn Val Val Glu Ala Leu Gln Thr 245 250 255 His Pro Glu Gln Arg Lys Lys Val Leu Asn Gly Glu Ile Gly Trp Asp 260 265 270 Gly Val Ile Glu Glu Thr Leu Arg Trp Asn Thr Pro Thr Ser His Val 275 280 285 Leu Ile Arg Phe Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Gly Asp Lys Ile Leu 290 295 300 Pro Lys Gly Glu Gly Leu Ile Ile Ser Phe Gly Ala Leu Gly Arg Asp 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Glu Phe Asp Ala Thr Arg Thr 325 330 335 Pro Asn Arg His Ile Ala Phe Gly His Gly Pro His Val Cys Pro Gly 340 345 350 Ala Ala Leu Ser Arg Leu Glu Ala Gly Ile Ala Leu Pro Ala Leu Tyr 355 360 365 Glu Arg Phe Pro Glu Leu Asp Leu Ala Val Pro Ala Ser Asp Leu Arg 370 375 380 Asn Lys Pro Ile Val Thr Gln Asn Asp Leu His Glu Leu Pro Val Lys 385 390 395 400 Leu Gly Cys Pro Phe Gly Gly Asp Ala 405 <210> 2 <211> 409 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> StCYP154C4-2 from Streptomyces sp. ATCC 11861 <400> 2 Met Thr Arg Ile Ala Leu Asp Pro Phe Val Arg Asp Leu Asp Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ala Gly Pro Leu Ala Glu Val Glu Leu Pro 20 25 30 Gly Gly Val His Val Tyr Ala Val Thr His His Lys Glu Ala Arg Ala 35 40 45 Leu Leu Thr Asp Ser Arg Val Val Lys Asp Ile Asn Val Trp Asn Ala 50 55 60 Trp Gln Arg Gly Glu Ile Pro Ala Asp Trp Pro Leu Ile Gly Leu Val 65 70 75 80 Asn Pro Gly Arg Ser Met Leu Thr Val Asp Gly Pro Asp His Arg Arg 85 90 95 Leu Arg Thr Leu Val Ala Gln Ala Leu Thr Val Lys Arg Val Glu Lys 100 105 110 Leu Arg Ala Gly Ile Glu Ala Leu Thr Asn Ala Ser Leu Glu Arg Leu 115 120 125 Ala Ala Leu Pro Ala Gly Glu Pro Val Asp Leu Lys Ala Glu Phe Ala 130 135 140 Tyr Pro Leu Pro Met Asn Val Ile Ser Glu Leu Met Gly Val Asp Ala 145 150 155 160 Ala Asp His Pro Arg Leu Lys Glu Leu Phe Glu Lys Phe Phe Ser Thr 165 170 175 Gln Thr Pro Pro Glu Glu Val Pro Gln Met Met Ala Asp Leu Gly Thr 180 185 190 Leu Phe Thr Lys Ile Val Glu Glu Lys Lys Ala Asn Pro Gly Asp Asp 195 200 205 Leu Thr Ser Ala Leu Ile Ala Ala Ser Glu Asp Gly Asp His Leu Thr 210 215 220 Asp Glu Glu Ile Leu Asn Thr Leu Gln Leu Ile Ile Ala Ala Gly His 225 230 235 240 Glu Thr Thr Ile Ser Leu Ile Val Asn Val Val Glu Ala Leu Ala Ile 245 250 255 His Pro Glu Gln Arg Lys Lys Val Leu Ser Gly Glu Ile Pro Trp Glu 260 265 270 Gly Val Ile Glu Glu Thr Leu Arg Trp Asn Thr Pro Thr Ser His Val 275 280 285 Leu Ile Arg Phe Ala Thr Glu Asp Ile Glu Val Gly Asp Lys Val Leu 290 295 300 Pro Lys Gly Glu Gly Leu Val Val Ser Phe Gly Ala Leu Gly Arg Asp 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Asp Phe Asp Ala Thr Arg Thr 325 330 335 Pro Asn Arg His Ile Ala Phe Gly His Gly Pro His Val Cys Pro Gly 340 345 350 Ala Ala Leu Ser Arg Leu Glu Ala Gly Ile Ala Leu Pro Ala Leu Tyr 355 360 365 Glu Arg Phe Pro Glu Leu Asp Leu Ala Val Pro Ala Ala Glu Leu Arg 370 375 380 Asn Lys Pro Ile Val Thr Gln Asn Asp Leu His Asp Leu Pro Val Lys 385 390 395 400 Leu Gly Cys Pro Phe Gly His Asp Ala 405 <210> 3 <211> 1230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StCYP154C4-1 from Streptomyces sp. W2061 <400> 3 atgacccgta tcgcgctcga ccccttcgtc agagacctcg acggcgagag tgctgcgctg 60 cgggccgccg gtccgctggc ggaggtggag ctgccgggcg gtgtacacgt gtacgcggtc 120 acccgccacg cggaggcccg cgcgctgctc accgacagcc gggtggtcaa ggacatcgac 180 gtctggaacg cctggcggcg cggcgagata ccgatggact ggccgctgat cggcctggcc 240 aacccgggcc gctcgatgct gacggtcgac ggggccgacc accgccggct ccgtacgctg 300 gtggcgcagg cgctcacggt gaaacgggtg gagcggctgc gggcgggcat cgaagccctc 360 acgaacgcga gcctggagaa gctggcggcg ctgcccgccg gggagccggt cgacctcaag 420 gccgagttcg cctaccccct ccccatgaac gtcatcagcg agctgatggg cgtggacgcg 480 gcggaccacc cgcggctgaa ggagctgttc gagaagttct tctcgacgca gaccccgccg 540 gaggaggtcc cgcagatgat ggcggacctg ggcgcactct tcacgaagat cgtcgacgcc 600 aagcggacca accccggcga cgacctgacg agcgccctga tcgcggcctc cgagaacggt 660 gaccacctca ccgacgagga gatcgtcaac acgctgcaac tgatcatcgc cgccggacac 720 gagaccacga tcagcctgat cgtcaacgtg gtcgaggcgc tccagaccca cccggagcag 780 cgcaagaagg tcctcaacgg cgagatcggg tgggacggcg tgatcgagga gacgctgcgc 840 tggaacaccc cgacctcgca cgtcctgatc cgcttcgcga cggaggacat cgaggtcggc 900 gacaagatcc tgcccaaggg cgagggcctg atcatctcgt tcggcgcgct gggccgggac 960 gaggagcagt acggcccgac ggcgggcgag ttcgacgcca cgcgcacccc gaaccggcac 1020 atcgccttcg gccacggccc gcacgtctgc cccggcgcgg cgctgtcccg cctggaggcg 1080 ggcatcgcgc tcccggcgct ctacgagcgc ttcccggaac tggacctggc ggtcccggcg 1140 tccgacctgc gcaacaagcc gatcgtgacg cagaacgacc tgcacgagct gccggtgaag 1200 ctgggctgcc cgttcggcgg cgacgcctga 1230 <210> 4 <211> 1230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> StCYP154C4-2 from Streptomyces sp. ATCC 11861 <400> 4 atgacccgta tcgcgctcga cccgttcgtc agagacctcg acggcgagag cgccgcgctg 60 cgggcggccg gtccgctggc cgaggtggag ctgccgggtg gggtgcacgt gtacgcggtc 120 acccaccaca aggaggcccg ggcgctgctc accgacagcc gggtggtcaa ggacatcaac 180 gtctggaacg cctggcagcg cggcgagata ccggcggact ggccgctgat cgggctggtc 240 aacccgggcc gctcgatgct gacggtagac ggcccggacc accgccgcct ccgtacgctg 300 gtggcgcagg cgctcacggt gaagcgggtc gagaagctgc gcgccgggat cgaggcgctg 360 acgaacgcga gcctggagcg gctggcggcc ctcccggccg gggaaccggt ggacctgaag 420 gccgagttcg cctacccgct gccgatgaac gtgatcagcg agctgatggg cgtggacgcg 480 gcggaccacc cgcggctcaa ggagctgttc gagaagttct tctcgacgca gaccccgccg 540 gaggaggtcc cgcagatgat ggcggacctc gggaccctct tcacgaagat cgtcgaggag 600 aagaaggcga acccgggcga cgacctgacc agcgccctga tcgccgcctc cgaggacggc 660 gaccacctca ccgacgagga gatcctcaac accctgcagc tgatcatcgc cgccgggcac 720 gagaccacga tcagcctgat cgtcaacgtc gtggaggccc tcgcgatcca ccccgagcag 780 cgcaagaagg tgctgagcgg ggagatcccg tgggagggcg tgatcgagga gacgctgcgc 840 tggaacaccc cgacctcgca cgtcctgatc cgcttcgcga cggaggacat cgaggtcggc 900 gacaaggtgc tccccaaggg cgagggcctg gtcgtctcgt tcggcgcgct gggccgggac 960 gaggagcagt acggcccgac ggcgggcgac ttcgacgcga cccgcacccc caaccgccac 1020 atcgccttcg gccacggccc gcacgtctgc ccgggtgcgg cgctgtcccg cctggaggcg 1080 gggatcgcgc tgccggccct gtacgagcgg ttcccggagc tggacctcgc ggtccccgcc 1140 gccgagctgc gcaacaagcc gatcgtgacg cagaacgacc tgcacgacct gccggtgaag 1200 ctgggctgcc cgttcggcca cgacgcctga 1230

Claims

CYP154C4-1을 이용하여 스테로이드의 2번 탄소를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 있어서,
상기 스테로이드가 테스토스테론이고, 상기 히드록시화가 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행되며, 상기 NADPH 의존성 시스템이 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 카탈라제로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 포함하고, 상기 히드록시화가 다이아세톡시요오드벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
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제1항에 있어서, 상기 Fdx가 0.1 내지 100 μM이고, Fdr이 0.01 내지 10 U인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
제1항에 있어서, 상기 NADPH가 0.01 내지 10 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
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제1항에 있어서, 상기 다이아세톡시요오드벤젠이 0.1 내지 50 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
제1항에 있어서, 상기 H₂O₂가 1 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
제1항에 있어서, 상기 CYP154C4-1가 0.1 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
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서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 공간군(space group) I2₁2₁2₁에 속하고, 비대칭 유닛에 단일 분자를 포함하고, 유닛-셀 파라미터가 a = 83.755 Å, b = 115.032 Å, c = 127.807 Å, a = b = c = 90°인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질 결정.
제13항에 있어서, 상기 CYP154C4-1 효소 단백질 결정이 21개 α-헬릭스 및 6개 β-스트랜드를 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질 결정.
(1-a) PEG3350, 리튬 설페이트 및 Bis-Tris-HCl을 포함하는 저장 용액과 (1-b) 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질 용액을 서로 혼합하여 결정화시키는 단계를 포함하는, 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.
제15항에 있어서, 상기 저장 용액이 5% 내지 45%(w/v)의 PEG3350, 0.02 내지 0.5 M 리튬 설페이트 및 0.01 내지 0.5 M Bis-Tris-HCl을 포함하는 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.
제15항에 있어서, 상기 저장 용액이 pH 5.5 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 사이토크롬 P450 CYP154C4-1 효소 단백질의 결정화 방법.