KR102292601B1 - Cyp154c8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CYP154C8을 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.
본 발명의 CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 종래의 CYP154C8 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 반응 효율이 높고, 생물전환 후 생성물의 분포를 증가시키므로, 약학 분야에서 기존 스테로이드를 대체할 수 있는 약물 개발 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법{Bioconversion method for hydroxylizing steroid using CYP154C8}

본 발명은 CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 NADPH 또는 산화제 존재 하에서 CYP154C8 효소를 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 생물전환 방법에 관한 것이다.

사이토크롬 P450(CYP)는 모든 형태의 생명(고세균, 원핵생물 및 진핵생물)에 널리 분포되어 있다. 대부분의 CYP는 O₂와, NAD(P)H에 의해 공급되고 플라빈 함유 환원 효소(flavin-containing reductase)와 철-황 페레독신(ferredoxin)과 같은 산화·환원(redox) 파트너를 통해 이동된, 2개의 전자를 이용하여 산화 반응을 촉매한다. 포유류 CYP는 막-결합되어 있으며, 소포체에서 NADPH에서 CYP로의 전자 이동에 필요한 막 결합효소인 NADPH-사이토크롬 P450 환원 효소(cytochrome P450 reductase, CPR)에 의해 환원된다. FAD 및 FMN 함유 사이토크롬 P450 환원 효소(CPR)는 클래스 Ⅱ의 CYP를 지원한다. 클래스 Ⅰ 산화·환원 시스템은 박테리아 및 미토콘드리아 철(Fe)-황(S) 함유 단백질[페레독신(ferredoxin)/아드레노독신(adrenodoxin), Fdx/Adx] 및 FAD 환원 효소[페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase)/아드레노독신 환원 효소(adrenodoxin reductase), Fdr/Adr]를 포함한다. 또한, 플라보독신(flavodoxin, 플라빈-모노뉴클레오티드-함유 단백질)으로 알려진 플라빈-의존성 단백질은 일부 원핵생물 및 특정 조류(algae)에 존재한다. 어느 특정 그룹에서는 사이토크롬 P450 환원 효소(CPR)와 같은 환원 효소 도메인이 모노옥시게나제(monooxygenase) 도메인에 융합된 소위 자급 자족형(self-sufficient) CYP로 표현된다. 하나의 잘 알려진 형태가 P450BM3(Bacillus megaterium에서 발견된 CYP102A1)이며, 지방산 히드록실라제 P450과 가용성 사이토크롬 P450 환원 효소(CPR)가 자연적으로 융합된 것이다.

전자 운반체 단백질에 연결되거나 환원 당량(reducing equivalent)으로부터 전자를 받기 위해서 산화·환원 파트너 단백질을 요구하는 CYP 외에도, 약간의 일반적이지 않은 CYP(CYP170A1, CYP154A1 및 CYP170A1)는 산화·환원 파트너가 없는 경우에 활성을 갖는 것을 특징으로 한다[R. Bernhardt, J. Biotechnol. 2006, 124, 128-145.; B. Zhao, et al., J. Biol. Chem. 2009, 284, 36711-36719.; Q. Cheng, et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 15173-15175.].

단지 소수의 고유한 CYP만이 퍼옥시게나제(peroxygenase)와 퍼옥시다제(peroxidase) 기능을 발휘하여 H₂O₂와 다른 과산화물 화합물의 존재 하에서 다양한 기질의 과산화를 촉매하는 것으로 밝혀졌다. "과산화물 단락(peroxide shunt)" 경로에 의해, 철(ferric) CYP는 화합물 0(compound 0)으로 알려진 철(ferric)-히드로퍼옥소(hydroperoxo) 중간체로 직접 변환된다. 과산화물 단락(peroxide shunt) 반응은 이러한 반응이 산화·환원 파트너 단백질과는 독립적이고, 더 중요한 것은 H₂O₂의 저렴한 비용이 산업 규모에 있어서 중요하므로, CYP 효소의 작용을 통한 단일산소화(monooxygenation) 반응에 대하여 매력적으로 선택할 수 있는 것이다. 실용적인 생체 촉매(biocatalyst)로서의 이점을 고려하여, 인공적인 H₂O₂-의존성 CYP를 개발하기 위해 많은 노력이 있어 왔다[P. C. Cirino, et al., Angew. Chem. 2003, 115, 3421-3423; S. Kumar,et al., J. Biol. Chem. 2005, 280, 19569-19575.; R. K. Behera, et al., J. Inorg. Biochem. 2010, 104, 1185-1194.]. 또한, H₂O₂-의존성 CYP는 미끼(decoy) 분자의 존재 하에서 비천연 기질을 산화시키기 위해 배치되었다. 또한, 단일 산소 공여체[예를 들어, 퍼이오데이트(periodate) 및 아이오도소벤젠(iodosobenzene)]은 CYP 촉매된 단일산소화(monooxygenation) 반응을 촉진시켜 화합물 Ⅰ(compound Ⅰ)으로 알려진 높은 반응성인 철(ferryl) 헴(heme) π-양이온 라디칼을 생성하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 특정 화학 물질이 있는 경우에 이러한 특성을 나타내는 CYP는 거의 없다. CYP의 특성화 또는 합성적 응용은 고유의 산화·환원 파트너를 얻는 것에 있어서의 어려움 때문에, 분리된(isolated) 형태 또는 CYP 복합체와의 인공 융합 후에 하나 이상의 대체 산화·환원 파트너를 통하여 종종 매개된다. 일반적으로 대체 파트너의 선택이나 그 작용 기전이 CYP에 의해 촉매된 반응의 유형과 선택성에 영향을 미치지 않는다고 믿어진다. 그러나, 대체된 산화·환원 파트너는 촉매 효율과 생성물의 분포에 영향을 줄 수 있다.

CYP106A1, CYP106A2, CYP109B1, CYP109E1, CYP154C3, CYP154C5, CYP260A1 및 CYP260B1과 같은 CYP는 박테리아 공급원으로부터 유래되어 스테로이드를 히드록시화시키는 것으로 알려져 있다. CYP154C8은 CYP154C3(74 %) 및 CYP154C5(66 %)와 높은 유사성을 나타내며, 둘 다 C16α에서 스테로이드를 히드록시화시키는 것으로 보고 되었다. CYP154C8은 NADH에서 CYP로 전자를 전달하는 산화·환원 파트너 단백질로서 푸티다레독신 환원효소(putidaredoxin reductase, Pdr)와 푸티다레독신(putidaredoxin, Pdx)을 포함하는 NADH-의존성 시스템으로 이전에 특성화되었다. 이 효소는 상이한 위치에서 다양한 스테로이드를 히드록시화하는 것이 밝혀졌다. 안드로스텐디온(androstenedione), 테스로스테론(testosterone) 및 11-옥소프로게스테론(11-oxoprogesterone)은 16α-히드록실화되었고, CYP154C8의 존재하에 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)의 후속 히드록실화의 결과로서 프로게스테론의 2개의 디히드록실화 생성물 또한 형성되었다. 코르티코스테론(corticosterone)의 주 생성물은 21-히드록시코르티코스테론(21-hydroxycorticosterone)이었고, C11 및 C21의 히드록시기 또는 카보닐기가 있는 기질은 코르티코스테론과 유사한 생성물 형성 패턴을 나타내었다.

미국 특허등록 US 9,428,771 B2 (2016.08.30.) 미국 특허등록 US 2,672,468 (1954.03.16) 미국 특허등록 US 3,071,516 (1963.01.01)

Bilash Dangi, et al., ChemBioChem 2018, 19, 1066-1077 Paula Bracco, et al., Microbial Cell Factories 2013, 12:95 Tanja Sagadin, et al., COMMUNICATIONS BIOLOGY (2018) 1:99

본 발명의 발명자들은 산화제인 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene] 및 H₂O₂ 또는, NADPH-의존성 산화·환원 파트너 시스템에 의해 매개되는 스테로이드(도 1 참조)와의 각각의 시험관 내 반응이 NADH-의존성 시스템과 관련하여 CYP154C8의 생성물 분포와 촉매 활성의 변화를 나타내는 것을 확인하였다. 그러나, 퍼이오데이트(periodate), 소듐 클로라이트(sodium chlorite) 및 tert-부틸 히드로퍼옥사이드(tert-butyl hydroperoxide)를 포함한 다른 산화제는 CYP154C8에 의해 촉매화된 시험관 내 반응을 지원하지 못하는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 NADPH 또는 특정 산화제 존재 하에서 히드록시화를 촉매하는 CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 생물전환 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 측면에 따라, CYP154C8을 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법이 제공된다.

일 구현예에서, 상기 히드록시화는 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 Fdx는 0.1 내지 100 μM이고, Fdr은 0.01 내지 10 U일 수 있다. 또한, 상기 NADPH는 10 내지 1000 μM일 수 있고, 상기 NADPH 의존성 시스템은 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 카탈라제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 히드록시화는 (다이아세톡시요오드)벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 (다이아세톡시요오드)벤젠은 0.1 내지 50 mM일 수 있다. 또한, 상기 H₂O₂는 1 내지 100 mM일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 CYP154C8은 0.1 내지 100 μM일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 생물전환 방법은 pH 4 내지 10에서 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 생물전환 방법은 20 내지 40 ℃에서 수행될 수 있다.

본 발명에 의해, NADPH 또는 (다이아세톡시요오드)벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 CYP154C8 효소를 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 생물전환 방법이 종래의 NADH 존재 하에서 CYP154C8 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 반응 효율이 높고, 생물전환 후 2개 이상의 생성물을 형성하여 생성물의 분포를 증가시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 또한, CYP154C8는 10 mM 이상의 고농도의 H₂O₂에서도 이례적으로 활성을 나타내었고, 특히 16α-히드록시프로게스테론의 경우 종래의 방법(15 % 미만의 전환율) 대비 3배 이상의 전환율의 향상을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 약학 분야에서 기존 스테로이드를 대체할 수 있는 약물 개발 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 CYP154C8의 추가 특성 규명을 위한 기질로 사용된 스테로이드의 화학구조식을 나타낸 그림이다.
도 2는 CYP154C8의 H₂O₂에 대한 내성을 나타내는 결과이다. 스펙트럼은 각각의 H₂O₂ 농도[1 mM(a),3 mM(b), 5 mM(c), 20 mM(d), 50 mM(e), 100 mM(f)]에서 1.5분 간격으로 30분 동안 측정된 흡광도를 나타낸다.
도 3은 NADPH-의존성 시스템에 의해 지원된 안드로스텐디온(androstenedione)(a) 및 테스토스테론(testosterone)(b)에 대한 반응 혼합물의 HPLC 크로마토그램이다. 반응 혼합물 및 표준물질의 크로마토그램은 각각 상부 패널 및 하부 패널에 표시된다. Di-OHA 및 Di-OHT는 디히드록시안드로스텐디온(dihydroxyandrostenedione) 및 디히드록시테스토스테론(dihydroxytestosterone)을 각각 나타낸다
도 4는 NADPH 시스템의 존재하에서 반응 혼합물의 LC-MS 스펙트럼이다. (a) 및 (b)는 기질인 안드로스텐디온에 대한 디히드록실화 생성물과 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione, 모노히드록실화된) 생성물의 스펙트럼을 나타낸다. 유사하게, (c) 및 (d)는 기질인 테스토스테론(testosterone)에 대한 디히드록실화된 생성물 및 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone, 모노히드록실화된) 생성물의 스펙트럼을 나타낸다.
도 5a는 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione) 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione, 삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 도 5b는 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone) 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone, 삽입물 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 반응은 NADPH 시스템의 존재 하에서 수행되었다.
도 6은 NADPH 시스템의 존재 하에서 난드롤론(nandrolone)의 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토 그램이다. 삽입도 Ⅰ및 Ⅱ는 각각 반응물과 표준물질의 크로마토 그램을 나타내고, P1 ~ P5는 상이한 생성물 피크를 나타낸다.
도 7은 NADPH 시스템의 존재 하에서 난드롤론 반응 혼합물에 대한 LC-MS 스펙트럼이다. P1은 디히드록실화된 생성물의 질량을 나타내고, P2 ~ P5는 난드롤론의 모노히드록실화된 생성물의 질량을 나타낸다.
도 8은 NADPH 시스템의 존재 하에서 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone, 삽입도 Ⅰ) 및 11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone, 삽입도 Ⅱ)의 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. P1과 P2는 각각 생성물 1 및 생성물 2를 나타낸다.
도 9는 NADPH 시스템의 존재 하에서 프로게스테론(progesterone, 삽입도 Ⅰ)과 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone, 삽입도 Ⅱ)의 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 2α,16α-Di-OHP 및 6β,16α-Di-OHP는 각각 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone) 및 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone)을 나타낸다.
도 10은 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene](a) 및 NADPH(b)의 존재 하에서 프로게스테론(progesterone) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 2α,16α-di-OHP 및 6β,16α-di-OHP는 각각 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone) 및 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone)을 나타낸다.
도 11은 (다이아세톡시요오드)벤젠 존재 하에서 반응시켜 제조된 프로게스테론(progesterone) 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ)과 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone) 반응 혼합물(삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다.
도 12는 (다이아세톡시요오드)벤젠(a) 및 NADPH(b)의 존재 하에서 11-옥소프로게스테론(11-oxoprogesterone=11-ketoprogesterone) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 6-OH 및 11-OP는 각각 6β-히드록시 및 11-옥소프로게스테론을 나타낸다.
도 13은 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 11-OH 프로게스테론(11-hydroxyprogesterone) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 삽입도 Ⅰ 및 삽입도 Ⅱ는 각각 반응물과 표준물질의 크로마토그램을 나타낸다. 표준물질의 반응은 30 ℃에서 2시간 동안 인산 칼륨 완충액(potassium phosphate buffer, pH 7.4)에서 기질과 (다이아세톡시요오드)벤젠으로 수행되었다.
도 14는 (다이아세톡시요오드)벤젠(삽입도 Ⅰ)의 존재 하에서 11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone=11-oxoprogesterone) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 삽입도 Ⅱ는 표준물질 16α-히드록시,11-케토프로게스테론(16α-hydroxy,11-ketoprogesterone)이다. 6-OH 및 11-KP는 각각 6β-히드록시 및 11-케토프로게스테론(11-옥소프로게스테론)을 나타낸다.
도 15는 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 안드로스텐디온(삽입도 Ⅰ), 테스토스테론(삽입도 Ⅱ) 및 난드롤론(삽입도 Ⅲ) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. P1 ~ P4는 각각의 기질에 대한 상이한 생성물 피크를 나타낸다. 16-OHA 및 16-OHT는 각각 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione) 및 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone)을 나타낸다.
도 16은 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 안드로스텐디온(a), 테스토스테론(b) 및 난드롤론(c) 반응 혼합물에 대한 LC-MS이다. P1 ~ P4는 반응 혼합물 중의 각각의 피크에 대한 질량 스펙트럼을 나타낸다.
도 17a는 안드로스텐디온 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione)(삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 도 17b는 테스토스테론 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytesosterone)(삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 두 반응은 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 수행하였다.
도 18은 H₂O₂의 존재 하에서 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone) 반응 혼합물(a) 및 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone) 표준물질(b)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 시험관 내 반응은 3 μM CYP154C8, 0.5 mM 기질 및 75 mM H₂O₂의 존재 하에서 30 ℃에서 2시간 동안 수행하였다.
도 19는 H₂O₂의 존재 하에서 11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone=11-oxoprogesterone)(a) 및 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone)(b) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 16-OH,11-KP 및 6-OH,11KP는 각각 16α- 히드록시,11-케토프로게스테론(16α-hydroxy,11-ketoprogesterone) 및 6β-히드록시,11-케토프로게스테론(6β-hydroxy,11-ketoprogesterone)을 나타낸다. P1 및 P2는 각각의 기질에 대한 생성물 1 및 생성물 2를 나타낸다.
도 20a는 프로게스테론 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone) (삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 도 20b는 안드로스텐디온 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione)(삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 도 20c는 테스토스테론 반응 혼합물(삽입도 Ⅰ) 및 표준물질 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone)(삽입도 Ⅱ)에 대한 HPLC 크로마토그램이다. 모든 반응은 H₂O₂의 존재 하에서 수행하였다.
도 21a는 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 생성된 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)에 대한 쌍곡선(hyperbolic fit)이다. 도 21b는 H₂O₂의 존재 하에서 생성된 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone) 및 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone)에 대한 쌍곡선(hyperbolic fit)이다.
도 22a는 H₂O₂의 존재 하에서 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)에 대한 시간-의존적 전환율이다. 도 22b는 (다이아세톡시요오드)벤젠의 존재 하에서 프로게스테론에 대한 시간-의존적 전환율이다. 반응은 1 μM CYP154C8 및 0.5 mM 기질로 30 ℃에서 상이한 시간 간격(1 내지 60분) 동안 수행하였다. 16α-히드록시프로게스테론 및 프로게스테론과 관련된 반응은 각각 75 mM H₂O₂ 및 2 mM (다이아세톡시요오드)벤젠으로 시작하였다.
도 23은 CYP154C8에 의해 매개된 프로게스테론(a) 및 11-케토프로게스테론(b)의 반응식을 나타낸 그림이다.

본 명세서에서, "생물전환 방법"이라 함은 미생물 발효 및 효소 처리 등의 생명공학 기술을 통해 새로운 생성물을 생성하거나 기존의 화학 합성공정에 의해 합성 및 생산되고 있는 기존 화학물질을 대체하여 생산할 수 있는 기술을 의미하며, 생물전환(bioconversion, biotransformation), 생합성(biosynthesis), 생촉매(bio-catalysis) 등으로 불리기도 한다.

본 발명은 CYP154C8을 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법을 제공한다.

일 구현예에서 상기 히드록시화는 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx) 및 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 Fdx는 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 1 ~ 20 μM, 가장 바람직하게는 4 ~ 8 μM이고, Fdr이 0.01 ~ 10 U, 바람직하게는 0.03 ~ 5 U, 가장 바람직하게는 0.05 ~ 3 U로 사용될 수 있다. 상기 NADPH는 10 ~ 1000 μM, 바람직하게는 50 ~ 700 μM, 가장 바람직하게는 100 ~ 500 μM로 사용될 수 있다. 또한, 상기 시스템은 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제 및 카탈라제를 포함할 수 있다.

일 구현예에서 상기 히드록시화는 (다이아세톡시요오드)벤젠 또는 H₂O₂의 산화제 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 (다이아세톡시요오드)벤젠은 0.1 ~ 50 mM, 바람직하게는 0.3 ~ 20 mM, 가장 바람직하게는 0.5 ~ 5 mM로 사용될 수 있고, 상기 H₂O₂는 1 ~ 100 mM, 바람직하게는 10 ~ 100 mM, 가장 바람직하게는 60 ~ 100 mM로 사용될 수 있다.

상기 CYP154C8는 0.1 ~ 100 μM, 바람직하게는 0.5 ~ 20 μM, 가장 바람직하게는 1 ~ 6 μM로 사용할 수 있다.

또한, 상기 생물전환 방법은 pH 4 ~ 10, 바람직하게는 pH 6 ~ 8.5, 가장 바람직하게는 pH 7 ~ 8에서 수행할 수 있고, 20 ~ 40 ℃, 바람직하게는 25 ~ 35 ℃, 가장 바람직하게는 28 ~ 32 ℃의 반응 온도에서 수행할 수 있다.

본 발명의 CYP154C8 효소를 이용한 스테로이드의 히드록시화 생물전환 방법은 종래의 CYP154C8 효소를 이용한 생물전환 방법에 비해 반응 효율이 높고, 생물전환 후 생성물의 분포를 증가시킬 수 있어 약학 분야에서 기존 스테로이드를 대체할 수 있는 약물 개발 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

(1) 화학 물질 및 시약

모든 스테로이드 기질은 도쿄 화학 공업(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd, Japan)에서 구입하였다. 이소프로필1-티오-β-_D-갈락토피라노시드(Isopropyl 1-thio-β-_D-galactopyranoside, IPTG), 1,4-디티오트레이톨(1,4-dithiothreitol, DTT) 및 카나마이신(kanamycin)은 두체파 바이오케미(Duchefa Biochemie, Netherlands)로부터 입수하였다. 암피실린(Ampicillin, Amp), 클로람페니콜(chloramphenicol, Cm), α-아미노레불린 산(a-aminolevulinic acid, ALA), 니코틴 아미드아데닌 디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH), 니코틴 아미드아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH), 과산화수소(H₂O₂), (다이아세톡시요오드)벤젠[ (diacetoxyiodo)benzene], 사이토크롬 c, 카탈라제(catalase), 포르메이트 디히드로게나제(formate dehydrogenase), 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제(glucose 6-phosphate dehydrogenase), 글루코스 6-포스페이트(glucose 6-phosphate), 시금치 페레독신(spinach ferredoxin, Fdx) 및 시금치 페레독신 환원효소(spinach ferredoxin reductase, Fdr)를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, US)에서 구입하였다. 제한 효소는 다카라 클론텍(Takara Clontech, Japan)에서 구입하였다. T4 DNA 리가제(ligase), DNA 중합효소 및 dNTP는 다카라 바이오(Takara Bio, Japan)에서 입수하였다. 다른 모든 화학 물질은 상업적으로 이용가능한 공급처에서 얻어진 고순도(high-grade) 물질이었다.

(2) CYP154C8의 발현 및 정제

CYP154C8의 이종 발현 및 정제는 선행문헌[B. Dangi,et al., ChemBioChem 2018, 19, 1066-1077]에 기술된 바와 같이 수행되었다. Streptomyces sp. W2233-SM의 게놈 DNA로부터 CYP154C8 인코딩 서열(1,266 bp, 421 amino acids, GenBank accession number MF398962, 표 1 참조)을 증폭시켰다. 유전자증폭에 사용된 PCR 프라이머는 5'-GAATTC ATG AAC GGT CAG TCA GCG A - 3'(EcoRⅠ)인 순방향 및 5'-AAGCTT TCA GCT GCC GTG GAG CA-3'(HindⅢ)인 역방향 프라이머로 설계되었다. 상기 밑줄 문자는 각각 엔도뉴클레아제(endonuclease) 제한효소 부위를 나타낸다.

수득된 PCR 산물을 E. coli XL1-Blue를 사용하여 pMD20-T 벡터에 클로닝하고 뉴클레오티드 서열을 자동염기서열분석(automated sequencing, Macrogen, Korea)으로 확인하였다. 또한, 유전자 생성물을 pET32a(+) 벡터에 연결하여 pET32aCYP154C8 컨스트럭트를 제조하였다. T7 프로모터(T7 promoter)의 제어하에 N-terminal His₆-tag 단백질을 코딩하여 생성된 컨스트럭트를 E.coli Bl21(DE3)에 형질전환시키고, 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 LB 아가에서 배양하였다. 배양한 LB 아가 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고, 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양된 배양액 1 ㎖를 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 배지 100 ㎖에 첨가하고, OD₆₀₀에서 세포밀도가 약 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 37 ℃, 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 180 rpm으로 교반하여 배양하였다. 배양은 0.5 mM IPTG로 유도되었고, 1 mM의 5-아미노레불린산 하이드로클로라이드(5-aminolevulinic acid hydrochloride, 5-ALA)와 0.5 mM FeCl₃를 첨가하여 헴(heme) 합성을 촉진하였다. 세포를 20 ℃에서 48시간 동안 배양하여, 펠렛을 4 ℃에서 20분 동안 3,500 rpm 조건으로 원심분리하여 수득하고, 10 % 글리세롤, 100 mM NaCl 및 1 mM DTT를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척하였다.

세척이 완료된 펠렛을 수확하여 초음파처리 후 4 ℃에서 24650 g로 40분 동안 원심분리하여 용해시켰다. 용해성 단백질 추출물을 ice에서 TALON His-tag 수지(resin)로 60분 동안 혼합하여 교반하고, 단백질의 가용성 분획을 Ni²⁺ 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 결합 수지를 2배의 평형 완충액(potassium phosphate, pH 7.4)으로 선-평형화를 시켰다. 결합된 단백질을 20, 100, 및 250 mM 이미다졸을 포함하는 용리완충액[elution buffer, potassium phosphate (pH 7.4), 10 % glycerol, 100 mM NaCl]으로 용리시켰다. 용리된 단백질이 포함된 분획은 30 kDa의 분자량 차단(molecular weight cut-off (MWCO))를 갖는 Amicon centrifugal filters(Millipore)를 사용하여 농축시켰다.

이와 유사하게, 대체 산화·환원 파트너 Fdx 및 Fdr은 선행문헌[S. Bhattarai, et al., Arch. Biochem. Biophys. 2013, 539, 63-69]에서 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였다.

(3) NADPH와 그 대체 산화·환원 파트너인 Fdx 및 Fdr을 이용한 효소 시험관 내 분석

반응 혼합물은 기질(3 μM), CYP154C8(3 μM), Fdx(6 μM), Fdr(0.1 U), 글루코스 6-포스페이트(10 mM), 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제(1 U), 카탈라제(100 ㎍/㎖^-1), MgCl₂(1 mM) 및 NADPH(250 μM)를 포함하였다. 효소 분석에 있어서 모든 시험관 내 반응 혼합물을 동일한 농도의 기질(500 μM) 및 CYP 효소(3 μM)가 함유된 최종 0.5 ㎖의 부피의 포타슘 포스페이트 완충액(50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4)을 2시간 동안 진탕(200 rpm)하면서 30 ℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 에틸아세테이트(ethyl acetate, 2 × 500 ㎕)로 추출하고 진공 하에서 건조시켰다. 건조된 반응 혼합물을 추가 분석을 위해 HPLC 용매 아세토니트릴(70 %) 및 물(30 %)에 용해시켰다.

(4) 대체 산화제를 이용한 시험관 내 효소 분석

생물학적 히드로퍼옥시드(hydroperoxide)인 H₂O₂ 및 외인성 산화제인 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyidodo)benzene]을 첨가하여 개별적으로 반응을 진행하였다. CYP154C8의 시험관 내 활성은 상이한 농도의 H₂O₂(0.2-100 mM 범위)와 (다이아세톡시요오드)벤젠(1-5 mM)을 사용하여 최적화하였다. 본 발명은 75 mM H₂O₂ 또는 2 mM (다이아세톡시요오드)벤젠을 별도로 포함하는 시험관 내 반응에서 얻어진 것이다. 각 반응 혼합물(0.5 ㎖)은 포타슘 포스페이트 완충액(50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4)에 스테로이드 기질(500 μM)과 CYP154C8(3 μM)을 함유하였다. 반응은 30 ℃에서 H₂O₂ 또는 (다이아세톡시요오드)벤젠을 개별적으로 첨가함으로써 시작되었고, 2시간 동안 수행하였다. 반응 혼합물은 NADPH-의존성 시스템과 동일한 방법으로 추출하였다.

(5) CYP154C8의 과산화수소에 대한 내성(tolerance) 평가

CYP154C8의 과산화수소에 대한 내성을 UV/VIS 분광기인 Biochrome Libra S35PC 분광 광도계로 모니터링하였다. CYP154C8(3 μM)의 산화성 변형은 0.2-100 mM 농도의 H₂O₂의 범위에서 수행하였다. H₂O₂의 첨가 후, 350-500 ㎚ 파장에서의 흡광도를 실온에서 90초마다 30분 동안 기록하였다. CYP154C8의 Soret 피크 강도(417 ㎚)를 시간에 따라 플롯팅하고 헴(heme) 산화에 대한 속도 상수(K)를 계산하기 위하여 데이터를 GraphPad Prism 6 소프트웨어에서 1상 감쇠(one-phase decay)를 이용하여 적용하였다. 헴(heme)에 대한 관련 흡광도 진폭(A)은 Soret 피크에서 가장 높은 흡광도와 가장 낮은 흡광도 사이의 차이로 계산하였다.

(6) 촉매 효율 및 반응 속도 매개 변수(kinetic parameter)의 확인 방법

프로게스테론 및 16α-히드록시프로게스테론의 시간-의존성 시험관 내 생물전환은 (다이아세톡시요오드)벤젠(2 mM) 및 H₂O₂(75 mM)를 각각 이용하여 수행하였다. 각 반응 혼합물 (500 ㎕)은 CYP154C8(1 μM) 및 기질(500 μM)을 함유하였다. 반응은 1-60분 간격으로 진탕(400 rpm)하면서 30 ℃에서 수행하였다. 각 반응 혼합물을 에틸아세테이트(ethyl acetate, 2 × 500 ㎕)로 추출하고 진공하에 건조시켰다. 건조된 반응 혼합물을 HPLC 용매 아세토니트릴(70 %) 및 물(30 %)에 용해시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 상이한 시간 간격에서의 각 생성물의 전환율(%)은 HPLC 크로마토그램의 생성물 피크 면적으로부터 계산하였다.

(다이아세톡시요오드)벤젠(2 mM)과 H₂O₂(75 mM)의 존재 하에서 25-400 μM 범위의 상이한 기질 농도에서의 프로게스테론 및 16α-히드록시프로게스테론에 대한 생성물의 농도를 각각 측정하였다. 각 반응 혼합물을 상기에서 기술된 바와 같이 반응시키고 추출하였다. 생성물과 기질의 흡광도 특성이 동일하다는 가정하에, 생성물 및 기질에 대한 조합된(combine) 피크 면적과 관련된 생성물의 피크 면적을 상관시켜 생성물을 정량화하였다.

(7) 생성물의 정제 및 특성화 평가

CYP154C8의 존재 하에서 얻어진 생성물의 구조를 결정하기 위해서, Large-scale(300 ㎖) 시험관 내 반응을 수행하였다. (다이아세톡시요오드)벤젠 (2 mM)의 존재 하에서 얻어지는 생성물을 확인하기 위해서 15 ㎖ 부피에서 별도의 반응을 수행하였다. 모든 시험관 내 반응은 CYP154C8(3 μM) 및 기질(500 μM)의 존재 하에서 포타슘 포스페이트 완충액(50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4)에서 2시간 동안 수행하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(300 ㎖)로 추출한 후 건조시키고, 감압하에 농축시킨 다음 잔류물을 HPLC 등급의 메탄올에 용해시켰다. 시료를 PTFE 필터(기공 크기 0.45 μm)를 통해 여과한 다음, 생성물의 피크를 정제하기 위하여 C₁₈ 컬럼(Mightysil RP-18 GP, 150×4.6 ㎜, 5 ㎛, Kanto Chemical, Japan)을 갖춘 예비 HPLC(Shimadzu)에 주입하였다.

(8) 분석 방법

건조 후에 얻어진 반응 혼합물을 분석에 사용하였다. 건조된 잔류물을 초고속 액체 크로마토그래피(ultra-high-performance liquid chromatography, UHPLC) 분석을 위해 아세토니트릴에 용해시켰다. 시료를 UHPLC 기기에 주입하고 Mightysil 역상 C₁₈ 컬럼(4.6×250 ㎜, 5 ㎛)을 사용하여 분리하였다. 물(A) 및 아세토니트릴(B)을 분리를 위한 이동상으로 사용하였다. 반응 혼합물은 1 ㎖/min의 유속에서 0-10분 동안 15 %, 10-20분 동안 50 %, 20-25분 동안 70 %, 25-40분 동안 15 %의 아세토니트릴(B)의 농도 구배 시스템을 이용하여 분석하였다. 기질 및 그 생성물은 242 및 245 ㎚의 UV-A에서 검출하였다. 모든 반응 혼합물을 양이온 모드에서 UHPLC 사중 극 비행 시간(quadrupole time-of-flight)/ESI MS(SYNAPT G2-S/ACUITY, Waters)로 분석하였다.

정제된 히드록실화된 생성물은 [D₆]DMSO에 용해시키고 900 MHz Unity INOVA 분광계(Varian)에서 NMR 분광법으로 분석하였다. 1차원 NMR 스펙트럼(¹H NMR 및 ¹³C NMR) 및 2D NMR[이핵 다중 결합 상관법(heteronuclear multiple bond correlation, 상관 분광법, ROESY 및 HSQC]을 이용하여 적절한 구조를 묘사하였다.

2. 결과

(1) CYP154C8의 과산화수소에 대한 내성 농도 확인

헴(heme)의 산화분해는 H₂O₂에 의해 매개된 CYP 반응에서 주요한 시도이다. CYP154C8 반응 방법에 대한 H₂O₂의 영향을 확인하기 위해, H₂O₂ 내성을 0.2-100 mM H₂O₂ 범위에서 분석하였다. CYP154C8의 산화된 형태에서의 Soret 흡광도의 감소를 최대 30분 간격으로 H₂O₂의 상이한 농도에서 모니터링하였다. 상이한 간격에서의 Soret 흡광도는 시간에 따라 플롯팅하였다.

Soret 피크 강도는 1 mM 이상의 H₂O₂ 농도에 노출되는 동안 시간에 따라 감소하였다(도 2 참조). 놀랍게도, H₂O₂의 더 높은 농도에서도 헴(heme) 산화 속도 상수(K)는 낮았다(표 2 참조). 이러한 결과로부터 CYP154C8이 50 mM 이상의 높은 H₂O₂ 농도에서도 높은 H₂O₂ 내성을 나타낸다는 것이 확인되었다.

(2) NADPH 및 대체 산화·환원제 Fdx 및 Fdr과의 반응 방법

시금치 대체 산화·환원 파트너 Fdx 및 Fdr, 보조인자(cofactor) NADPH, 글루코스 6-포스페이트 및 보조인자 재생을 위한 글루코오스 6-포스페이트 디히드로게나제를 포함하는 시험관 내 반응 방법은 NADH 시스템 및 산화제보다 매우 선호되는 것이었다. 모든 기질에 대한 전환율은 NADH-의존성 시스템과 대비하여 이 시스템에서 최소 70 % 이상의 전환율을 나타내어 유의하게 증가한 것으로 확인되었다.

특히, 안드로스텐디온(androstenedione) 및 테스토스테론(testosterone)은 생성물로 완전히 전환되었다. 16α-히드록실화 생성물에 해당하는 피크 외에도, 두 기질 반응 혼합물은 HPLC 크로마토그램에서 추가 피크를 나타내었다(도 3 참조). 반응 혼합물의 LC-MS 분석은 해당 기질에 대한 디히드록실화된 생성물로서 추가적인 피크를 나타내었다(도 4 참조). 이러한 디히드록실화된 생성물은 반응 혼합물에서 16α-히드록실화된 생성물의 후속 히드록실화로부터 기인한 것이어야 한다. 이를 확인하기 위해 안드로스텐디온(androstenedione) 및 테스토스테론(testosterone)의 16α-히드록실화된 생성물을 정제한 다음, 안드로스텐디온(androstenedione) 및 테스토스테론(testosterone) 대신에 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione)과 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone)을 시험관 내에서 각각 반응시켰다. 도 5에 나타난 바와 같이, HPLC 분석 결과 안드로스텐디온(androstenedione) 및 테스토스테론(testosterone)의 디히드록실화된 생성물이 16α-히드록시안드로스텐디온(16α-hydroxyandrostenedione)과 16α-히드록시테스토스테론(16α-hydroxytestosterone)의 히드록실화 결과물로서 얻어질 수 있다는 것이 확인되었으며, 이는 LC-MS 분석(자료 미도시)에서도 확인되었다.

또한, 난드롤론(nandrolone) 반응 혼합물은 HPLC 크로마토그램에서 다중 피크를 보였으며(도 6 참조), P4가 주요 생성물인 것에 반하여 다른 4개의 피크는 매우 낮은 전환율을 나타내었다. LC-MS 분석은 P1이 디히드록실화된 생성물임을 나타내었고, 나머지 4개 생성물은 각각의 단일 위치에서 히드록실화된 것으로 확인되었다(도 7 참조).

안드로스텐디온(androstenedione), 테스토스테론(testosterone) 및 난드롤론(nandrolone)은 CYP154C8이 NADH-의존성 시스템에 의해 수행되는 경우에는 디히드록실화된 생성물로 전환되지 않았다. 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone)은 16α-히드록실화로 인해 가능성이 있는 주요 피크와 매우 낮은 추가 생성물 피크를 나타내었다(도 8, 삽입도 Ⅰ 참조). 두 피크 모두 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone)의 모노히드록실화된 생성물로 확인되었다. 반면에, 11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone)은 단일 위치에서 히드록실화되었다(도 8, 삽입도 Ⅱ 참조). 선행문헌[B. Dangi, et al., ChemBioChem 2018, 19, 1066-1077.]에서 사용한 표준물질로 HPLC 및 LC-MS 결과를 비교 분석하여 C16α에서의 히드록실화를 확인하였다.

NADPH-의존성 시스템에 의해 수행된 프로게스테론(progesterone) 반응 혼합물은 HPLC 분석에 기초하여 NADH-의존성 시스템으로 얻어진 것과 유사한 생성물 형성 패턴을 나타내었다(도 9, 삽입도 Ⅰ 참조). 본 발명자들의 이전 연구에서 프로게스테론(progesterone)은 NADH-의존성 시스템에서 C16α에서 먼저 히드록실화되어 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)을 형성하고, 2개의 다른 위치에서 순차적으로 히드록시화되어 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone) 및 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone)을 생성하였다. NADPH-의존성 시스템으로도 동일하게 16α-히드록시프로게스테론과 2개의 디히드록실화된 생성물[6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone) 및 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone)]이 형성되는 것이 확인되었다(도 9, 삽입도 Ⅱ 참조).

(2) (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]과의 CYP154C8 반응 방법

대체 산화제인 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]을 이용하여 반응을 수행했을 때, 프로게스테론(progesterone)으로부터 일반적으로 얻어지는 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone) 생성물(P1) 이외에, 다른 시스템에서는 관찰되지 않았던 또 다른 모노히드록실화 생성물(P2)이 형성되었다 (도 10 참조). 생성물 P2에 대한 NMR에 근거한 구조적 해석으로 그것이 6β-히드록시프로게스테론(6β-hydroxyprogesterone)인 것이 확인되었다. 2개의 디히드록실화된 생성물[6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone) 및 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone)] 또한 매우 낮은 수율로 동일한 반응 혼합물에서 검출되었다. 또한, (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene] 존재 하에서 프로게스테론을 대신하여 기질로서 16α-히드록시프로게스테론을 사용한 경우, 반응 혼합물은 프로게스테론 반응 혼합물에서 2개 디히드록실화된 생성물과 정확히 일치하는 머무름 시간(retention time)을 갖는 2개의 상이한 디히드록실화된 생성물을 나타내었다(도 11 참조).

유사하게, 11-옥소프로게스테론(11-oxoprogesterone=11-ketoprogesterone)(도 12 참조) 및 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone)(도 13 참조) 반응 혼합물에 대한 HPLC 분석 결과 또한, 각각의 경우에 2개의 모노히드록실화된 생성물을 나타내었다. LC-MS 분석에서도 두 피크가 상응하는 기질에 대한 모노히드록실화된 생성물임을 나타내었다(자료 미도시). NMR에 의한 11-옥소프로게스테론으로부터의 P2의 구조적 해석은 6β에서의 히드록실화를 나타내는 것에 비하여, 다른 생성물(P1)은 표준물질 16α-히드록시-11-옥소프로게스테론(16α-hydroxy-11-oxoprogesterone)과의 HPLC 머무름 시간(도 14 참조) 및 LC-MS(자료 미도시)의 비교에 기초하여 16α-히드록시-11-옥소프로게스테론으로 확인되었다. 11-히드록시프로게스테론과 유사한 피크 보유 패턴이 관찰되었으므로, 이들 생성물도 유사하게 변형되었음을 시사한다.

테스토스테론(testosterone), 난드롤론(nandrolone) 및 안드로스텐디온(androstenedione) 반응 혼합물에 대한 HPLC 크로마토그램에서 다중 피크가 관찰되었다(도 15 참조). LC-MS 분석 결과, 테스토스테론(도 16a 참조) 및 난드롤론(도 16b 참조)에 대하여 최소 4개 모노히드록실화 생성물을 나타내었고, 안드로스텐디온(도 16c 참조)에 대하여 3개 모노히드록실화 생성물을 나타내었다. 안드로스탠디온(도 17a 참조) 및 테스토스테론(도 17b 참조)의 경우에 16α-히드록실화된 생성물로의 주요 전환은 HPLC와 LC-MS(자료 미도시)로 확인되었으며, 인증된 표준물질과 비교하였다.

CYP154C8에 의해 촉매된 반응을 통해 얻어진 다른 모든 추가 생성물은 미량으로 확인되었고, 이들은 상응하는 16α-히드록실화된 생성물보다 선택성이 낮게 얻어졌다. 프로게스테론(약 83 %)이 가장 선호되는 기질이었지만, 다른 모든 기질은 표 3에 나타난 바와 같이 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene)]의 존재 하에서 최소 35 % 이상의 전환율을 나타내었다. 생성물은 생성물의 피크 면적과 생성물 및 기질이 조합된 피크 면적을 상관시킴으로써 정량화하였다. S, 기질; 16α-OHP, 16α-히드록시프로게스테론; 6β-OHP, 6β-히드록시프로게스테론; 16α-OHA, 16α-히드록시안드로스텐디온; 16α-OHT, 16α-히드록시테스토스테론을 의미한다. P1-P4는 각각의 기질과의 반응에서 형성된 상이한 생성물을 나타낸다.

(4) H ₂ O ₂ 와의 반응 방법

CYP154C8은 고농도(> 10 mM)의 H₂O₂의 존재 하에서 활성을 나타내었다. 약 75 mM H₂O₂에서 기질의 최적 전환이 나타났다. 놀랍게도, 16α-히드록시프로게스테론은 H₂O₂의 존재 하에서 CYP154C8에 대해 가장 선호되는 기질이었다(도 18 참조). 2개 생성물인 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone) 및 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone)이 전체 전환율의 약 51 %로 우세하게 관찰되었고, 나머지 기질은 매우 낮은 전환율을 나타내었다(표 4 참조).

11-케토프로게스테론(11-ketoprogesterone=11-oxoprogesterone) 및 11-히드록시프로게스테론(11-hydroxyprogesterone)의 경우 전환율이 5 ~ 7 %로 매우 낮았지만, 각각의 기질 반응 혼합물은 2개의 모노히드록실화된 생성물 피크를 HPLC(도 19 참조)로 나타내었고, LC-MS(자료 미도시)에 의해 추가 확인하였다. H₂O₂가 지원된 반응에서 얻어진 11-케토프로게스테론 생성물의 머무름 시간(retention time)은 도 14의 삽입도 I에서 확인된 6β-히드록시-11-케토프로게스테론(6β-hydroxy-11-ketpprogesterone) 및 16α-히드록시-11-케토프로게스테론(16α-hydroxy-11-ketoprogesterone)의 머무름 시간과 유사하였다. 프로게스테론(도 20a 참조), 안드로스텐디온(도 20b 참조), 테스토스테론(도 20c 참조) 반응 혼합물을 표준물질과 비교한 HPLC 및 LC-MS(자료 미도시) 결과는 H₂O₂ 존재 하에서 CYP154C8이 16α-히드록실화에 대하여 위치특이적(regiospecific)이고 입체특이적(stereospecific)임을 나타내었다.

(5) 촉매 효율 및 반응 속도 파라미터의 확인

프로게스테론은 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]에 의해 뒷받침되는 CYP154C8에 대하여 가장 선호되는 기질인 것으로 확인되었다. 또 다른 반응에서, H₂O₂에 의해 지원되는 CYP154C8의 기질로 선택된 16α-히드록시프로게스테론이 다른 스테로이드 기질보다 높은 전환율을 나타내었다. 따라서, 프로게스테론과 16α-히드록시프로게스테론을 선택하여 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]과 H₂O₂의 각각 존재 하에서 촉매 효율과 반응속도 파라미터를 측정하였다.

도 21a에 나타난 바와 같이, 프로게스테론에 대한 K _m 및 K _cat 값은 각각 (75.94±10.64) μM 및 (2.32±0.10) min^-1로 예측되었다. 이와 유사하게, 16α-히드록시프로게스테론은 (134.50±17.27) μM 및 (2.37±0.13) min^-1의 K _m 및 K _cat 값을 각각 나타내었다(도 21b 참조). 반응 속도 파라미터의 확인 이외에, 두 기질에 대한 시간-의존성 전환율이 확인되었다(도 22 참조).

(6) 고찰

NADPH-의존성 시스템과의 시험관 내 반응은 CYP154C8의 추가 특성 규명을 달성하기 위해 사용되어 왔다. CYP154C8의 촉매 효율이 NADH 의존적 시스템과 관련하여 NADPH 의존성 시스템으로 향상되었을 뿐만 아니라 새로운 생성물도 관찰되었다. 선행문헌[B. Dangi, et al., ChemBioChem 2018, 19, 1066-1077.]에 따르면, CYP154C8의 존재 하에서 NADH 의존성 시스템의 방법으로 프로게스테론의 다단계 산화(multistep oxidation)가 보고된 바 있다. NADPH 시스템에 의해 뒷받침된 반응은 프로게스테론, 안드로스텐디온, 테스토스테론 및 난드롤론의 다단계 산화를 나타내어 NADH보다 NADPH에 대하여 CYP154C8의 선호도를 나타내었다. NADPH 시스템에 의해 뒷받침된 이러한 생성물 형성은 CYP154C8의 촉매 효율 및 그 생성물 분포에 관해서도 대체 산화·환원 파트너 및 환원 당량(reducing equivalents)이 수행하는 역할을 나타내었다. 또한, CYP 효소에 대한 일반적인 촉매 효율 및 생성물 분포와 관련하여 환원 당량 및 대체 산화·환원 파트너의 적절한 선택이 중요한 역할을 할 수 있다는 것도 입증되었다. CYP154C8의 존재 하에서 스테로이드의 다단계 산화는 CYP의 세균성 공급원에 대하여 이전에 관찰되지 않았지만, 선행문헌[W. Zhang, et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136, 3640-3646. 및 M. J. Cryle, et al., Chem. Commun. 2004, 86-87.]에 따르면, 세균성 공급원으로부터의 사이토크롬 P450_BioI(CYP107H1) 및 MycG는 각각 지방산(fatty acid) 및 마이신아마이신(mycinamycin) Ⅳ의 다단계 산화를 촉매하는 것으로 보고되었다. 포유류성 공급원 유래의 CYP11A1, CYP17A1, CYP19A1 및 CYP24A1과 같은 일부 CYP는 스테로이드의 다단계 산화를 촉매하는 것으로 널리 알려져 있다.

기질인 프로게스테론 및 11-옥소프로게스테론의 16α-히드록실화된 생성물의 형성에 추가하여, 산소 대체물(surrogate)인 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]과 반응된 두 기질로부터 6β-히드록실화된 생성물의 형성(도 23 참조)은 NAD(P)H-의존성 시스템에서는 관찰된 적이 없었기 때문에 예외적이었다. 그렇지만 H₂O₂의 존재 하에서는 매우 낮은 수준의 전환이 일어났다. 그러나, 다른자리 입체성 효과(allosteric effect) 및 산화·환원 파트너와의 상호 작용이 CYP 활성 및 생성물 분포에 영향을 미치기 때문에, 그러한 생성물 형성이 산소 대체물의 존재 하에서만 발생하는지는 명확하지 않다. 최근 CYP17A1은 아이오도소벤젠(iodosobenzene)과 NADPH-P450 환원 효소의 존재 하에서 상이한 부산물(by-product)을 생성하여 화합물 I를 형성하는 것이 보고되었다. 사이토크롬 b5는 CYP의 촉매 활성 및 생성물 형성에 미치는 영향에 대하여 광범위하게 연구되어 특정 CYP의 활성을 유도하는 것으로 나타났다. 또 다른 연구에서, 세균성 공급원(Micromonospora griseorubida)에서 유래된 다기능 P450 모노옥시게나제(monooxygenase)인 MycG는 대안적(alternative) 대체 산화·환원 파트너와 함께 변형된 촉매 반응 유형을 나타내었고, 이에 따라 변형된 산화·환원 파트너에 대한 CYP 효소의 촉매 활성에 있어서 단백질-단백질 상호 작용에서의 역할을 강조하였다. 전자 전달 외에도, CYP101A1과 천연 산화·환원 파트너 단백질 Pdx의 복합체는 CYP와 결합된 이러한 산화·환원 파트너 단백질의 중요한 다른자리 입체성 조절(allosteric regulation) 역할을 나타내었다. 몇몇 CYP는 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]의 존재 하에서 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. CYP5A1, CYP17A1, CYP121, CYP101A1(P450_cam) 및 CYP106A2와 같은 포유류 및 세균성 CYP는 단일 산소 공여자로서 아이오도소벤젠(iodosobenzene)의 존재 하에서 촉매 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]에 의해 뒷받침되는 산소화(oxygenation)의 메커니즘은 아이오도소벤젠(iodosobenzene)에 의해 뒷받침되는 것과 유사할 수 있어, 아마도 단일 산소 원자가 산화제로부터 제 2철(ferric) CYP로 이동하여 기질 일산소화(monooxygenation)에 관련된 화합물 I을 생성하는 것을 매개한 것일 수 있다.

CYP154C8의 존재 하에서 스테로이드 기질의 히드록시화는 D-링의 α-면에서 주로 일어났다. 흥미롭게도, 프로게스테론 및 11-옥소프로게스테론의 경우에 히드록실화는 β면에서 발생하였고, 위치 선택성(regioselectivity)이 D-링에서 B-링으로 전환되었다. 선행문헌[B. Dangi, et al., ChemBioChem 2018, 19, 1066-1077.]에 따르면, 16α-히드록시프로게스테론은 2α 및 6β 위치에서 순차적으로 히드록실화되어 프로게스테론에 상응하는 디히드록실화된 생성물을 생성하였다. CYP17A1은 그 보편적인 기능과 대조적으로, 16α,17α-디히드록시프로게스테론이 기질로 사용되었을 때 6β-위치에서 히드록실화를 촉매하였으며, 이는 16α- 및 17α-위치에서 2 개의 히드록시기의 존재에 기인한 것이었다[F. K. Yoshimoto, et al, J. Biol. Chem. 2016, 291, 17143-17164.]. CYP154C8과 (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene] 또는 H₂O₂의 존재 하에서 D-링에서 B-링으로의 히드록실화에 있어서의 전환은 산화 시스템의 효과를 설명한다. NADPH- 및 NADH-의존성 시스템 모두가 CYP154C8의 활성을 효과적으로 뒷받침하였지만, 이들은 기질인 프로게스테론 및 11-옥소프로게스테론 또는 다른 기질로부터의 6β-히드록실화된 생성물을 유도하지 않았다. 따라서, CYP의 특이성을 조절하기 위한 단백질-단백질 상호작용에 있어서의 산화·환원 파트너에 대한 역할을 제안하였다. 또한, 기질 내에서 히드록시기 또는 카르보닐기와 같은 관능기는 상이한 CYP의 선택성에서 그러한 전환이 일관성이 없을지라도, 히드록실화의 선택성에는 영향을 줄 수 있다. (다이아세톡시요오드)벤젠[(diacetoxyiodo)benzene]과 H₂O₂에 의해 뒷받침된 CYP154C8의 존재 하에서 B-링 히드록실화의 바탕이 되는 인자(factor)는 불분명하다. 그러나, C16α에서의 프로게스테론의 히드록실화는 2α,16α-디히드록시프로게스테론(2α,16α-dihydroxyprogesterone)과 6β,16α-디히드록시프로게스테론(6β,16α-dihydroxyprogesterone)을 각각 생산하기 위해 A-링과 B-링에서의 후속 히드록시화에서 핵심적인 역할을 할 수 있다.

과산화물(peroxide) 단락 경로(shunt pathway)는 CYP를 돕기 위해 H₂O₂ (또는 산소 공여체)를 사용하며, 산업적으로 활용하기 위해 이들 효소를 사용하는 가장 효율적인 방법 중 하나를 나타낸다. 그러나, 과산화물에 의한 헴(heme)의 산화분해는 중요한 문제가 되어 왔었다. 고농도의 H₂O₂의 존재 하에서 CYP154C8의 활성은 흥미롭고 놀라운 것이다. CYP154C8은 시험관 내 활성이 10 mM H₂O₂ 이상에서만 관찰되었지만, H₂O₂에 대하여 비교적 내성을 나타내었다. 보다 중요하게는, 심지어 고농도 (100 mM)의 H₂O₂에서의 CYP154C8의 헴(heme) 산화 속도 상수(K)는 지속적으로 낮았다(K> 0.6 min^-1). 또 다른, 널리 연구된 CYP인 CYP152L1은 반응의 촉매 작용에서 H₂O₂를 사용하고, H₂O₂ 내성을 연구하는 최근 연구에서 CYP152L1가 다른 CYP(CYP121A1, P450 BM3 및 CYP51B1)보다 내성이 큰 것으로 나타났다[S. Matthews, et al., FEBS Lett. 2017, 591, 737-750.]. 이전에 보고된 CYP152L1의 헴(heme) 산화 속도 상수(K)와 CYP154C8에 대한 상수의 비교를 통하여 서로 다른 CYP를 상이한 농도의 H₂O₂로 1시간 동안 반응시킬 때 30분에 걸쳐 H₂O₂에 대한 CYP154C8의 높은 내성을 나타내었다. H₂O₂의 존재 하에서 스테로이드 기질에 대한 CYP154C8의 활성은 낮았으나 대조적으로, 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)에 대한 활성이 높은 것은 이례적인 것이었다.

6β-히드록시프로게스테론(6β-hydroxyprogesterone) 및 16α-히드록시프로게스테론(16α-hydroxyprogesterone)은 약학적으로 중요한 화합물이다. 6β-히드록시프로게스테론(6β-hydroxyprogesterone)은 유방암 세포의 증식 억제제 및 수컷 랫트에서의 5α-환원효소(5α-reductase) 활성에 대한 억제제인 항암 화합물 6β,14α-디히드록시안드로스트-4-엔-3,17-디온(6β,14α-dihydroxyandrost-4-ene-3,17-dione)의 합성 중간체로 사용되므로, 유방암 및 전립선 암에 대한 약물 개발의 잠재적인 후보물질이 될 것으로 사료된다.

(7) 결론

결론적으로, CYP154C8은 NADH-의존성 시스템보다 NADPH-를 더 선호하면서 스테로이드 기질에 대한 순차적 산화를 촉매하였다. 또한, 대안적 대체 산화·환원 파트너 및 환원 당량(reducing equivalent)을 사용하여 촉매 효율 및 생성물의 분포를 변화시켰다. NADPH, (다이아세톡시요오드)벤젠 및 H₂O₂ 시스템의 사용으로 관찰된 스테로이드 기질에 대한 생성물 분포 패턴에서 예상하지 못한 변화는 P450 매개된 산화 반응에서 활성 산소종(active oxygen species)에 대한 변화된 역할을 나타낸다. 고농도의 H₂O₂의 존재 하에서 CYP154C8의 최적의 활성은 이례적인 경우이므로, 이에 대한 추가 연구가 필요하다.

(8) 요약

CYP154C8은 다양한 스테로이드의 히드록실화를 촉매한다. 이는 이전에 NADH로부터 전자를 운반하는 산화·환원 파트너 단백질로서 푸티다레독신(putidaredoxin) 및 푸티다레독신 환원 효소(putidaredoxin reductase)를 포함하는 NADH 의존성 시스템을 사용하여 증명되었다. 다른 반응들에서, 시금치 페레독신(spinach ferredoxin) 및 NADPH-의존성 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase)로 재구성된 CYP154C8은 NADH-의존성 시스템과 상이한 촉매 활성을 나타내었다. NADPH-의존성 시스템은 프로게스테론, 안드로스텐디온, 테스토스테론 및 난드롤론을 포함한 다른 기질에 대한 다단계 산화를 나타내었다. (다이아세톡시요오드)벤젠을 사용하여 CYP154C8에 의해 촉매된 산화·환원 반응으로 적극적으로 뒷받침된 화합물 I(FeO³⁺)을 생성하였다. 16α-히드록실화 외에도 프로게스테론 및 11-옥소프로게스테론은 (다이아세톡시요오드)벤젠에 의해 뒷받침되는 반응에서 6β-위치에서 히드록실화를 나타내었다. CYP154C8은 고농도(> 10 mM)의 H₂O₂의 존재 하에서도 활성이 있었으며, 최적의 전환율은 놀랍게도 약 75 mM H₂O₂에서 얻어졌다. 더 중요한 것은, CYP154C8에 의한 H₂O₂ 내성은 고농도의 H₂O₂에서도 매우 낮은 헴(heme) 산화 속도 상수(K)에서 분명하게 나타났다. 이러한 결과는 대안적 대체 산화·환원 파트너와 산화제가 사이토크롬 P450 효소에 대한 촉매 효율과 생성물 분포에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 더욱 중요하게는, 이러한 선택이 P450 효소에 의해 촉매된 반응의 유형과 선택성에 영향을 주었다는 것이다.

Claims (11)

1. CYP154C8을 이용하여 스테로이드를 히드록시화시키는 단계를 포함하는 스테로이드의 생물전환 방법에 있어서, 상기 스테로이드는 프로게스테론, 안드로스텐디온, 테스토스테론, 난드롤론, 11-히드록시프로게스테론, 11-케토프로게스테론 및 16α-히드록시프로게스테론으로 이루어진 군으로부터 선택된 것이고, 상기 히드록시화는 다이아세톡시요오드벤젠 존재 하, H₂O₂ 존재 하 또는 산화·환원 단백질 페레독신(ferredoxin, Fdx)과 페레독신 환원 효소(ferredoxin reductase, Fdr)를 이용한 NADPH 의존성 시스템 존재 하에서 수행되는 것이며, 상기 NADPH 의존성 시스템은 글루코스 6-포스페이트, 글루코스 6-포스페이트 디히드로게나제, 카탈라제 및 NADPH를 포함하는 것을 특징으로 하는, 스테로이드의 생물전환 방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 Fdx가 0.1 내지 100 μM이고, Fdr이 0.01 내지 10 U인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 NADPH가 10 내지 1000 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 다이아세톡시요오드벤젠이 0.1 내지 50 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 H₂O₂가 1 내지 100 mM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 CYP154C8가 0.1 내지 100 μM인 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 생물전환 방법이 pH 4 내지 10에서 수행되는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 생물전환 방법이 20 내지 40 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 스테로이드의 생물전환 방법.

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