DE102010045662A1

DE102010045662A1 - Verfahren zur Oxidation von organischen Verbindungen

Info

Publication number: DE102010045662A1
Application number: DE102010045662A
Authority: DE
Inventors: Manfred T. Reetz; Felipe Emilio Zilly Claude
Original assignee: Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Current assignee: Studiengesellschaft Kohle gGmbH
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2012-03-22
Also published as: EP2616546A2; US20130236940A1; WO2012062299A3; US9428771B2; WO2012062299A2

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Oxidation von organischen Verbindungen beansprucht, in welchem die zu oxidierende organische Verbindung in einer wässerigen Lösung in Gegenwart von Cytochrom P450 zur Reaktion gebracht wird und das dadurch gekennzeichnet ist, dass dem wässrigen Reaktionsgemisch eine perfluorierte organische Verbindung als Aktivator zugegeben wird.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Aktivität und Steigerung der Regio- und Stereoselektivität von Cytochrom P450 Enzymen als Katalysatoren bei der Oxidation von organischen Verbindungen.
Cytochrom P450 Enzyme (CYPs) sind Häm-abhängige Monooxygenases, die dazu befähigt sind, insbesondere C-H aktivierende Oxidationen von organischen Verbindungen unter Einführung von Alkohol-Funktionen (C-H → C-OH) aber auch Epoxidierungen von Olefinen zu katalysieren (P. R. Ortiz de Montellano, Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry, 3. Edition, Springer, 2005; E. M. Isin, F. P. Guengerich, Biochim. Biophys. Acta 2007, 1770, 314–329). In der Natur kommen sie in vielen Organismen vor, insbesondere als Katalysatoren in der Biosynthese diverser Naturstoffe und in Entgiftungsprozessen. In der Biotechnologie werden sie gezielt eingesetzt, um bestimmte oxidative Stoffumwandlungen unter milden Bedingungen zu katalysieren, wobei Luftsauerstoff (oder Wasserstoffperoxid) als Oxidant fungiert, häufig unter Verwendung von ganzen Zellen eines Wirtsorganismus wie z. B. E. coli oder Hefe Zellen (V. B. Urlacher, S. Eiben, Trends in Biotechnology 2006, 24, 324–330; R. Bernhardt, J. Biotechnol. 2006, 124, 128–145).
Leider haben diese biotechnologischen Verfahren enge Grenzen, denn viele Substrate von industriellem Interesse werden von CYPs nur langsam umgesetzt oder erst gar nicht akzeptiert, in anderen Fällen wird unzureichende Regioselektivität und/oder geringe Stereoselektivität beobachtet (K. Drauz, H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis: A Comprehensive handbook, Vol I-III, Wiley-VCH, Weinheim, 3. Edition, 2002). Die Bindungstaschen von CYPs sind bekanntlich sehr groß, was eine spezifische bzw. optimale Fixierung des zu oxidierenden Substrats an dem katalytisch aktiven Fe-Hem-Zentrum erschwert oder sogar völlig unwahrscheinlich macht (P. R. Ortiz de Montellano, Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry, 3. Edition, Springer, 2005). Über den Mechanismus der CYP-Wirkung hat man intensiv geforscht, und so weiß man z. B., dass rasch reagierende Substrate zunächst in der Bindungstasche gebunden werden, ein Vorgang, der eine Aktivierung des CYPs induziert, weil Wasser vom Fe-Hem-Zentrum verdrängt wird unter Verlagerung des inaktiven „low-spin” Zustandes zum katalytisch aktiven „high-spin” Zustand (P. R. de Montellano, Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry, 3. Edition, Springer, 2005; A. W. Andrews, H. M. Girvan, K. J. McLean, Nat. Prod. Rep. 2007, 24, 585–609).
Um Probleme der fehlenden oder unzureichenden Aktivität sowie der schlechten Regio- und Stereoselektivität zu lösen, wurde in einigen Fällen das sogenannte Protein Engineering herangezogen, entweder in Form der ortsspezifischen Mutagenese oder der gerichteten Evolution (S. Kumar, „Engineering cytochrome P450 biocatalysts for biotechnology, medicine and bioremediation", Expert Opinion in Drug Metabb. Toxicol. 2009, 6, 1–17; R. D. Schmid, et al, J. Biotechnol. 2001, 88, 167–171; A. Glieder, E. T. Farinas, F. H. Arnold, Nature Biotechnol 2002, 20, 1135.–1139; M. W. Peteers, P. Meinwald, A. glieder, F. H. Arnold, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13442–13450; E. M. J. Gillam, Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 220–231). Allerdings sind diese molekularbiologischen Methoden nicht nur aufwendig und kostspielig, wobei ein solches Verfahren in der Regel Monate dauert, sie führen keineswegs routinemäßig zum Erfolg. Als Beispiel sei die P450-BM3-katalysierte Hydroxylierung von kleinen Alkanen wie z. B. Propan, Ethan und Methan erwähnt. Trotz umfangreicher Bemühungen unter Anwendung der gerichteten Evolution auf dieses CYP, ist es bis heute nicht gelungen, für die praktische Anwendung genügend hohe Aktivitäten bei der Oxidation von Ethan oder Propan zu evolvieren, während Methan überhaupt nicht zur Reaktion gebracht werden konnte (P. Meinwald, M. W. Peters, M. M. Y. Chen, K. Takahashi, F. H. Arnold, ChemBioChem 2005, 6, 1765–1768; S. Kumar, Expert Opinion in Drug Metab. Toxicol. 2009; 6, 1–17). Die optimale räumliche Fixierung eines Substrats direkt am katalytisch aktiven Fe-Hem-Zentrum ist aber auch bei der regio- und stereoselektiven Oxidation von allen Substraten ausschlaggebend, auch von größeren Verbindungen, so z. B. bei der oxidativen Hydroxylierung von Terpenen, Steroiden und synthetischen organischen Verbindungen. Selektive C-H Aktivierung stellt eine große Herausforderung dar. Erwünscht ist ein einfaches, praktisches und kostengünstiges Verfahren, das es erlaubt, bei CYP-katalysierten Oxidationsprozessen die Aktivität und gegebenenfalls auch Regio- und Stereoselektivität zu steuern oder zu verbessern, zumal die Produkte von großem technischen Interesse sind. Beispiele sind die Gewinnung von Methanol aus Methan und Isopropanol aus Propan sowie regio- und stereoselektive Hydroxylierung von Precursorverbindungen unter Bildung von Zwischenstufen für Medikamente.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein überraschend einfaches Verfahren, die Aktivität, Regioselektivität und/oder Stereoselektivität von CYPs zu verbessern ohne dabei molekularbiologisch-gestützte Mutagenese heranziehen zu müssen. Erfindungsgemäß wird eine perfluorierte organische Verbindung, hier als Additiv bezeichnet, zu einer CYP gegeben, wodurch das katalytische Profil verbessert wird unter Erweiterung der Substratakzeptanz und Steigerung der Aktivität sowie in relevanten Fällen unter Erhöhung der Regio- und/oder Stereoselektivität. Nach Zugabe des Additivs wird es spontan in der Bindungstasche des Enzymes gebunden, wodurch das katalytische Profil positiv beeinflusst wird, ohne dass dabei das Additiv selbst oxidiert wird. Perfluorierte organische Verbindungen sind bekanntlich chemisch inert, weil perfluorierte Reste solcher Moleküle unter normalen Bedingungen keine Reaktionen eingehen (D. M. Lemal, J. Org. Chem. 2004, 69, 1–11). Deshalb eignen sich perfluorierte organische Verbindungen als Additiv in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Sie werden selber nicht von der CYP oxidiert, beeinflussen jedoch die effektive Größe der jeweiligen Bindungstasche und bewirken die erforderliche katalytische Aktivierung sowie die Erhöhung der Regio- und Stereoselektivität.
Im einfachsten Fall dienen erfindungsgemäß perfluorierte Alkane als Additiv:
CF₃(CF₂)_nCF₃ n = 3 bis 30
Insbesondere kommen erfindungsgemäß perfluorierte organische Verbindungen mit mindestens einer funktionellen Gruppe (z. B. -OH, -CO₂H, -SO₃H, -PO₃H sowie deren Salze mit Gegenionen des Typs Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺, Mg²⁺, Zn⁺², H₄N⁺, (CH₃)₄N⁺, (C₄H₉)₄N⁺). Das organische Gerüst kann aliphatisch, olefinisch oder aromatisch sein, oder Kombinationen daraus. Für die Erfindung geeignet sind z. B. perfluorierte Alkolhole wie perfluoriertes n-Octanol sowie perfluorierte Phenole wie Pentafluorphenol.
Bevorzugt, aber keineswegs ausschließlich, sind perfluorierte aliphatische Carbonsäuren. Unter der Bezeichnung „perfluorierte Carbonsäure” versteht der Fachmann die perfluorierten Analoga von Carbonsäuren RCO₂H oder Dicarbonsäuren HO₂C-(R)-CO₂H, bei denen die C-H Bindungen durch C-F Bindungen ersetzt sind und der R-Rest ein aliphatisches oder aromatisches Kohlenstoff-Gerüst mit entsprechenden C-F Bindungen darstellt. Erfindungsgemäß können bei den katalytischen Oxidationsprozessen die unterschiedlichsten perfluorierten Carbonsäuren bzw. deren Salze verwendet werden, wobei sowohl aliphatische als auch aromatische perfluorierte Carbonsäuren einschließlich chiraler Perfluorierter Carbonsäuren, wie 9-Me-Undecansäure und 8-Et-Undecansäure, in Frage kommen. Als Beispiel für eine perfluorierte aromatische Carbonsäure sei Pentafluorbenzoesäure erwähnt. Bevorzugt werden perfluorierte Carbonsäuren des Typs (I) oder deren Salze (II). CF₃(CF₂)_nCO₂H (I) n = 0 bis n = 30 CF₃(CF₂)_nCO₂ ^–M⁺ (II) n = 0 bis n = 30; M⁺ = ein Metall-Kation wie Li⁺, Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Zn²⁺ oder ein Ammonium-Kation wie NH₄ ⁺ oder (n-Butyl)₄N⁺
Erfindungsgemäß wird eine oder mehrere C-H Einheiten eines zu oxidierenden Substrats in die jeweilige Alkohol-Funktion überführt (C-H → C-OH), oder eine Olefin-Funktion wird in das entsprechende Epoxid überführt.
Erfindungsgemäß sind zwei Reaktionsführungen möglich, der in vitro Einsatz entsprechender Enzyme oder die Verwendung von ganzen Zellen.
Erfindungsgemäß wird neben dem aktivierenden Additiv auch ein organisches Lösungsmittel zur wässrigen Reaktionslösung gegeben, um das zu oxidierende Substrat besser löslich zu machen. Beispiele sind Ethanol, Isopropanol, Dimethylformamid, Acetonitril und Tetrahydrofuran.
Als Biokatalysator kommen erfindungsgemäß alle CYPs in Frage. Der Fachmann findet die CYPs in den entsprechenden Datenbanken, so zum Beispiel auf Dr. David Nelsons Webseite (http://drnelson.uthsc.edu/cytochromeP450.html), und folgenden Datenbanken http://p450.riceblast.snu.ac.kr (CYPs aus dem Reich der Pilze, http://www.cyped.unistuttgart.de/ (Datenbank zum Proteinengineering von CYPs) Hinweise zu den CYPs, die sämtlich erfindungsgemäß eingesetzt werden können. Besonders Vorteilhaft sind sogenannte Fusions-CYPs, wie z. B. P450 BM3 (A. W. Munro, et al, Trends in Biochemical Sciences, 2002, 27, 250–257), bei denen FAD/FMN- und NADPH-Cytochrom P450-Reduktase in verschiedenen Bindungsdomänen in einem Polypeptid fusioniert sind (V. B. Urlacher, S. Eiben, Trends in Biotechnology, 2006, 24, 324–330; P. R. de Montellano, Cytochrome P450: Structure, Mechanism and Biochemistry, 3. Edition, Springer, 2005).
CYPs kommen im Reich der Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen vor. Die Familie der CYPs wird üblicher Weise in vier Klassen eingeteilt. Die erste Klasse umfasst CYPs, die Elektronen von einem spezifischen Ferredoxin (ein Eisen-Schwefel (2Fe-2S)-Protein) erhalten, das Elektronen von einer NAD(P)H-abhängigen Ferredoxin Reduktase auf CYP übertagen. Mitochondriale und die meisten bakteriellen CYPs, wie z. B. P450cam aus Pseudomonas putida, gehören zu dieser Klasse.
Zur zweiten Klasse gehören CYPs, die Elektronen direkt von einer NADPH–Cytochrome-P450 Reduktase (CPR) erhalten. Diese Reduktase besteht aus einer FAD- und einer FMN-Domäne. Die meisten mikrosomalen CYPs gehören zu dieser Klasse, sind membrangebunden und erhalten von einer universalen CPR die Elektronen. Zur zweiten Klasse der CYPs gehören ebenfalls CYPs, die in einer einzigen Polypeptidkette die beiden funktionalen Einheiten vereinigen, eine CYP-Domäne (auch Häm-Domäne genannt) und eine Reduktase Domäne. Diese Enyzme zeichnen sich durch Ihre hohen katalytischen Raten aus, da der Elektronentransport von der Reduktase zu der Häm-Domäne effizient gekoppelt ist und nicht durch die Diffusionsraten der einzelnen Komponenten limitiert ist. Als besonderer Vertreter dieser Klasse seien die CYPs 102A genannt, insbesondere die bakteriellen CYPs 102A1-CYPA12 genannt, ganz besonders hervorgehoben, CYP102A1 aus Bacillus megaterium, P450-BM3.
Die CYPs der dritten Klasse benötigen keine Cofaktoren als Elektronendonor, da sie mittels H₂O₂ Substrate direkt oxidieren können. Ein Vertreter dieser Klasse ist P450_BS☐ von Bacillus subtilis.
CYPs aus der Klasse Vier können die Elektronen direkt von NADH empfangen und benötigen keine weiteren Domänen oder Reduktasen.
Zusätzlich gibt es Vertreter der CYPs, die sich nicht eindeutig der ersten oder zweiten Klasse zuordnen lassen. Dies sind meist Fusionsproteine, bei denen die CYP/Häm-Domäne mit mindestens einer weiteren Domäne fusioniert ist.
Ein Vertreter diese Gruppe ist CYP116 (PFOR = P450-phthalate dioxygenase reductase), bei dem an die CYP Domäne eine FMN-Domäne und eine Ferredoxin-Domäne fusioniert sind. Ein zweites Beispiel ist CYP51FX aus M. capsulatus (McCYP51FX), das eine CYP-Domäne und Ferredoxin-Domäne besitzt. In A. thaliana findet sich CYP177A1 (XplA), das eine FMN und ein CYP-Domäne besitzt. Als letztes Beispiel soll CYP221A1 aus P. fluorescens (ACAD-P450 = putative P450-acyl CoA dehydrogenase fusion) vorgestellt werden, das eine FAD- und eine CYP-Domäne besitzt.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem Additive zu einem CYP-Enzym-Rohlysat gegeben werden. In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird das Additiv zu aufgereinigtem CYP gegeben. Ein anderer Aspekt betrifft ein Verfahren, bei dem zu ganzen Zeilen, die CYP exprimieren, das Additiv gegeben wird. In einer Ausführungsform handelt es sich dabei um ein endogen exprimiertes CYP. In einer anderen Ausführungsform exprimiert die Zelle rekombinantes CYP. Eine besondere Ausführungsform umfasst den Einsatz von ganzen Zellen, die rekombinant CYP exprimieren und kein endogenes CYP exprimieren oder deren endogenes CYP durch gentechnische Manipulation ausgeschaltet wurde oder durch eine chemische Substanz die endogene CYP-Expression unterbunden wird. Die Verfahren können so gestaltet werden, dass ganze Zellen verwendet werden, die das CYP auf der extrazellulären Seite der Zellmembran exprimieren. Alternativ werden die CYPs nach der Expression sekretiert. In weiteren Ausführungsformen wird das CYP intrazellulär exprimiert und neben dem Additiv noch Kosolventien, Cyclodextrine, Detergenzient, in der Zellmembran Poren bildende Stoffe der Reaktionsmischung beigemischt. Weiterhin Gegenstand der Erfindung sind Verfahren, bei denen die Additive zu Zellen gegeben werden, die CYP und zusätzliche Proteine, z. B. Shuttle, Transporter, Antiporter, Symporter und Kanäle, exprimieren, die den Transport des Additivs in die Zelle erhöhen.
Bei der rekombinanten Expression können beispielsweise Säuger-CYPs in Bakterienzellen oder Hefezellen exprimiert werden. Denkbar ist auch die Expression von bakteriellen CYPs in fremden Bakterien-Zellen, Säuger- oder Hefe-Zellen. Hefe-CYPs können sowohl in fremden Hefe-Zellen, Bakterien- und Säuger-Zellen exprimiert werden. Gleiches gilt auch für die Expression von pflanzlichen CYPs. Dem Fachmann ist hinreichend bekannt, welche gentechnologischen Vorkehrungen er hierfür vornehmen muss.
Bevorzugte CYPs sind: CYP102, CYP1A1 CYP1A2, CYP2A6, CYP1B1, CYP2B1, CYP2B4, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4, CYP3A5, CYP101A1, CYP106A2 und CYP154.
In einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf humane CYPs, insbesondere auf CYPs der Klassen CYP1, CYP2, CYP3 und CYP4. Ohne Einschränkung seien hier beispielhaft genannt: CYP1 Familie: CYP1A1; CYP1A2; CYP1B1; CYP2 Familie: CYP2A6; CYP2A13; CYP2B6; CYP2C8; CYP2C9; CYP2C19; CYP2D6; CYP2E1; CYP2F1; CYP2J2; CYP2R1; CYP2S1; CYP2W1; CYP3 Familie: CYP3A4; CYP3A5; CYP3A7; CYP3A43; CYP4 Familie: CYP4A11; CYP4A22; CYP4B1; CYP4F2. Ebenfalls besonders hervorgehoben seien die folgenden humanen CYPs: CYP5A1; CYP8A1; CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP19A1; CYP21A2; CYP26A1.
Die oben genannten CYPs können statt vom Menschen auch aus einem anderen Säuger stammen. Bevorzugte Organismen, aus denen diese CYPs stammen sind: Ratte, Maus, Rind und Schwein.

Insbesondere bevorzugt sind die bakteriellen CYPs der Klasse CYPs 102, z. B. CYP102A1, CYP102A2, CYP102A3, CYP102A4, CYP102A5, CYP102A6, CYP102A7, CYP102A8, CYP102A9, CYP102A10, CYP102A11, CYP102A12. Ganz besonders bevorzugte Kandidaten dieser Klasse können der Tabelle 2 entnommen werden. Tabelle 1. Bevorzugte Mitglieder der CYP102A Familie.

CYP102	Herkunft
A1	Bacillus megaterium DSMZ 32
A2	Bacillus subtilis
A3	Bacillus subtilis
A4	Bacillus anthracis str. Ames
A5	Bacillus cereus ATCC 14579
A6	Bradyrhizobium japonicum USDA 110
A7	Bacillus licheniformis ATCC 14580
A8	Bacillus thuringiensis serovar konkukian str. 97-27
A9	Bacillus weihenstephanensis KBAB4
A10	Erythrobacter litoralis HTCC2594
A11	Erythrobacter sp. NAP1
A12	Rhodopseudomonas palustris HaA2

Die beanspruchten Verfahren betreffen auch den Einsatz von Mutanten oder Chimären der oben beschriebenen CYPs.
Die Auswahl des Oxidationsmittels ist im erfindungsgemäßen auf kein bestimmtes Oxidationsmittel beschränkt, es können alle Oxidationsmittel eingesetzt werden, die die Reaktion nicht negativ beeinflussen. Bevorzugt eingesetzte Oxidationsmittel sind Luftsauerstoff, H₂O₂, Cumol-hydroperoxid, tert-Butyl-hydroperoxid, Linolsäure-hydroperoxid, NaClO₂ und/oder NaIO₄.
Beispiel 1: Herstellung eines CYP-Expressionsvektors
Im Allgemeinen findet der Fachmann Hinweise zur Klonierung von Genen und zur Kultivierung von Bakterien in Sambrook, Molecular Cloning, 2001, und in Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols in Microbiology und Current Protocols in Cell Biology, alle von 2010.
Das Gen p450-bm3/cyp102a1, dass für das Wildtyp-Enzym P450-BM3 von Bacillus megaterium kodiert (ATTC 14581, Stamm Nr., 32 bei DSMZ GmbH), wurde aus der genomischen DNA mittels PCR amplifiziert und über die Enzymschnittstellen Nco I und Sac I in den E. coli Expressionsvektor pETM11 (EMBL, Germany) kloniert, so dass der Vektor pETM11-P450-BM3-WT erhalten wurde. Der Vektor pETM11 trägt 5' von der eingefügten DNA-Sequenz eine Nukleotidsequenz, die für sechs Histidin-Aminosäuren kodiert. Das bei der Expression resultierende Protein trägt daher einen N-terminalen Polyhistidin-Tag. Weiterhin ist der Vektor zu Selektionszwecken mit keiner Kanamycin-Resitenzkasette ausgestattet. Das klonierte Gen wird für die Expression durch einen T7/lac-Promoter kontrolliert.
Beispiel 2: Expression eines rekombinanten CYPs
E. coli BL21 (DE3) GOLD (Novagen) Zellen, die ein Tetracyclin-Resistenzgen enthalten, wurden mit dem Vektor pETM11-P450-BM3-WT mittels Hitzeschock oder Elektroporation transformiert. Ein Aliquot einer Übernachtkultur in LB-Medium, versetzt mit Kanamycin (20 mg/l) und Tetracyclin (12.5 mg/l) zu Selektionszwecken, wurde zum Animpfen von TB-Kulturmedium verwendet, dass mit 50 mg/l Kanamycin, 0.1 g/l Glutamat, 0.4% (v/v) Glycerol, Spurenmetalle (50 μM FeCl₃, 20 μM CaCl₂, 10 μM MnCl₂, 10 μM ZnSO₄, 2 μM CoCl₂, 2 μM CuCl₂, 2 μM NiCl₂, 2 μM Na₂MoO₄, 2 μM H₃BO₃) und 1 mM MgCl₂ versetzt war. Nach Kultur bei 37°C unter horizontalem Schütteln bei 250 upm und Erreichen einer OD₆₀₀ von ~0.6–0.8 wurde IPTG bis zu einer Endkonzentration von 100 μM hinzugegeben, die Temperatur auf 25°C reduziert und die Schüttelrate von 250 upm auf 130 upm reduziert. Die Expression wurde für 24 Stunden durchgeführt. Anschließend wurden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80°C gelagert.
Beispiel 3: Aufreinigung eines rekombinanten CYPs
Für den Aufschluß der Bakterien-Zellen wurde das Pellet durch Zugabe von Lysepuffer (25 mM Tris, 20% Glycerol, 0.1% Tween-20 und 20 mg/l DNAse I (Applichem, Germany)) aufgetaut und resuspendiert. Die Zellen wurden in der Suspension mittels French-Press (American Instruments Company, Silverspring, USA) bei einem Druck von 1200 psi aufgeschlossen. Das erhaltene Lysat wurde für 1 Stunde bei 18000 g und 4°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand mit einem Filter (0.22 μm) filtriert.
Das Lysat wurde mittels HiTrap Entsalzungssäulen (Bettvolumen von 5 mL, GE Healthcare) und 100 mM Tris/HCl pH 7.8 Puffer entsalzen. Dieser und die folgenden chromatografischen Schritte wurden mittels ÄKTA Purifier (GE Healthcare) durchgeführt. Die Proteinfraktionen wurden gesammelt und einer Anionen-Tauscher-Chromatographie unterworfen. Dieser Schritt wurde ähnlich zu einem früher schon beschriebenen Protokoll durchgeführt (Schwaneberg U. et al., J. Chromat. A, 1999), wobei Tosoh DEAE-5PW Harz (Tosoh Bioscience, Japan) als Stationärephase verwendet wurde, die mit 100 mM Tris-HCl pH 7.8 Puffer äquilibriert war. Das Protein wurde mittels Stufen-Gradient mit dem Puffer 1 M NaCL, 100 mM Tris-HCl pH 7.8 eluiert. Die rotgefärbten, Enzym-haltigen Fraktionen wurden vereinigt. Insgesamt wurden etwa 0.8 μmol aufgereinigtes Wildtyp P450 BM3 aus 11 Bakterienkultur erhalten.
Beispiel X: Bestimmung der Enzymkonzentration
Die Enzymkonzentration wurde mittels CO Differenzspektrumanalyse bestimmt (Omura T und Sato R, J Biol. Chem., 1964). Dazu wurde das Enzym in einer Lösung von 2% Na₂S₂O₄ in 100 mM KPi pH 8,0 verdünnt. Die Verdünnung wurde halbiert und auf zwei Küvetten gleichmäßig verteilt. In einer der beiden Küvetten wurde für 30 Sek. CO-Gas eingeleitet, die Lösung CO-gesättigt und die Küvette anschließend mit Parafilm verschlossen. Nach 5 Minuten wurde mit den beiden Küvetten ein Differenzspektrum aufgenommen. Dazu wurde ein Spektrometer 2401-PC der Firma Shimadzu verwendet. Das Differenzspektrum wurde von 350–500 nm aufgenommen und die Differenz der Absorption A_450nm–A_490nm bestimmt. Mit dem von Omura und Sato (JBC, 1964) bestimmten millimolaren Extinktionskoeffizienten ☐ 91 wurde die Konzentraion der Enzymlösung berechnet.
Beispiel 4: Additive
Die eingesetzten fluorierten Additive stammen von den folgenden Herstellern: Perfluoroheptansäure (Aldrich), Perfluorononansäure (ABCR), Perfluorodecansäure (Aldrich), Perfluoroundecansäure (ABCR), Perfluorododecansäure (Acros), Perfluorotridecansäure (Aldrich), Perfluorotetradecansäure (Aldrich), Perfluorhexadecansäure (ABCR), 6-(Perfluoroethyl)hexanol (Fluorochem, GB), 1H, 1H, 1H, 2H, 2H, 3H, 3H-Perfluoroundecanol (ABCR), 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctan-1-ol (Fluorochem, GB).
Die grundsätzliche Eignung der Additive kann wie folgt mittels Differenzspektroskopie getestet werden. Entscheidend ist die Bindung des Additivs in der Aktiventasche des Enzyms. Es wird eine Verdünnung des Enzyms z. B. 0,1–1 μM in 100 mM KPi pH 8,0 hergestellt. Die Verdünnung wird gleichmäßig auf zwei Quarzküvetten verteilt. Der einen Verdünnung wird das Additiv beigemischt, der Anderen wird als Kontrolle im gleichen Verhältnis das Lösungsmittel, in dem sich das Additiv befindet, zugegeben. Typischer Weise wird mit einer Konzentration von ca. 10–100 μM Additiv begonnen, diese kann in Abhängigkeit vom Additiv auf z. B. bis zu 20 mM gesteigert werden. Nach 5 Minuten wird das Differenzspektrum aufgenommen. Dazu wird ein Spektrometer, z. B. das Spektrometer 2401-PC der Firma Shimadzu, verwendet. Das Differenzspektrum wird von 350–500 nm aufgenommen. Ohne Additiv am Häm zeigt das Enzym keine Änderung im Differenzspektrum. Geeignete Additive verdrängen das im enzymatischen Ruhezustand am Häm koordinierte Wassermolekül und sorgen für einen Spin Wechsel des Häm-Eisenatoms vom Low- zum High-Spin. Dieser Spin-Wechsel ist im Differenz-Spektrum durch einen Abfall der Absorption bei ca. 417 nm und einen Anstieg bei ca. 390 nm zu beobachten. Dieser Spin-Wechsel bedeutet, dass das Enzym sich nun in einem für die Katalyse bereiten Zustand befindet. Das Additiv aktiviert also das Enzym. In anderen Fällen eignen sich die Additive, wenn sie die gerade beschriebene Änderung im Differenzspektrum in zusätzlicher Gegenwart des Substrates (in beiden Küvetten) erzeugen. Dies Bedeutet, wenn das Additiv das Substrat so in der Enzymtasche positioniert, dass das Substrat das Wassermolekül verdrängt. Als weitere Eignungskontrolle, insbesondere für die zuerst genannten Additive, können Titrationsexperimente mit CYP-Enzyminhibitoren dienen. CYP Inhibitoren sind meist stickstoffhaltige Substanzen, die über den Stickstoff eine Bindung mit dem Häm-Eisenatom eingehen, das Wassermolekül verdrängen und durch die Bindung zum Eisenatom das Eisenatom im Low-Spin Zustand arretieren und das Enzym inaktivieren. Im Differenzspektrum ist die Bindung der Inhibitoren durch einen Anstieg der Absorption bei ca. 430–440 m zu beobachten. Typische Inhibitoren sind z. B. Imidazol oder n-Oktylamin. Die geeigneten Additive verdrängen den Inhibitor, so dass im Differenzspektrum ein Abfall bei 430–440 nm ein Anstieg bei 390 nm zu beobachten ist. Dies Bestätigt zusätzlich, dass die Additive tatsächlich in der Aktiventasche des Enzyms binden.
Beispiel 5: Ganzzell-Katalyse
Zur Ganzzellkatalyse können verschiedene Protokolle durchgeführt werden (Current Protocols in Cell Biology, Current Protocols in Microiology). Eines sieht vor, dass eine E. coli Kultur von CYP exprimierenden Zellen für 10 Min bei 900 g und 4°C zentrifugiert wird und die pelletierten Zellen mit 100 mM KPi, 5% Glycerol (v/v) pH 7,4 resuspendiert und unter denselben Bedingungen erneut zentrifugiert werden. Darauf wird das Pellet in 100 mM KPi, 5% Glycerol (v/v), 5% Glucose (w/v), 5 mM EDTA, 0,25 mM NADP⁺, 1 U/ml GDH, optional Antibiotika, pH 7,4 resuspendiert. Die Zellen werden daraufhin gefriergeschockt und können Kryo-gelagert werden. Die anschließend aufgetauten Zellen stehen für die Katalyse bereit. Dazu wird der Zellsuspension das Substrat und das Additiv beigemischt.
Beispiel 6: Oxidation von Alkanen (> C₄):
Zur Hydroxylierung von Alkanen, beispielsweise C₆ und C₈ Alkanen, wurde das Substrat aus einem 160 mM Stock in EtOH in die Reaktionslösung gegeben und eine Endkonzentration von 3.2 mM eingestellt. Die Lösung enthielt weiterhin 0.1 M Glucose (Riedel de Haen), 1 mM NADP⁺ (Codexis, Jülich, Germany), 1 U/ml GDH (#001, Codexis, Jülich, Germany), 1 mM Additiv (falls nicht anders angegeben), BM3-WT Enzym und 100 mM KPi, pH 8,0 mit einem Gesamtvolumen von 20 ml. Die Reaktionen wurden für 1 Stunde bei 20°C in einem 50 ml Falcon-Reaktionsgefäß in einem Bakterieninkubator bei 130 rpm geschüttelt. Nach einer Stunde wurden drei Aliquots von je 1 ml Volumen entnommen und mit 0,1 ml 10% HCl angesäuert. Anschließend wurde 1 mM 1-Pentanol als interner Standard hinzugegeben. Die Mischung wurden mit einem halben Volumen MTBE extrahiert und mittels Gaschromatographie untersucht.
Beispiel 7: Gaschromatografische Untersuchung von C₆ und C₈ Hydroxylationsprodukten
Die Hydroxylationsprodukte wurden mittels GC mit den folgenden Geräten und unter den folgenden Bedingungen untersucht: HP6890 + 7683HP (HewletPackard, USA); Säule: 15 m Stabilwax Phase, innerer Durchmesser 0,25 mm, Filmdicke 0.5 μm, (J&W, Germany); Druck: 0,8 bar H2; Splitrate 60; Injector: 220°C; Temperaturgradient: 40°C 4 min isotherm, 40–60°C mit 4°C/Min, 60°C–250°C mit 15°C/Min. FID-Detektor. Zur Quantifizierung wurden die Produktpeaks ins Verhältnis gesetzt zu dem 1 mM 1-Pentanol-Peak mit den folgenden, vorab bestimmten Korrekturfaktoren: 2-Oktanol: 2,36; 3-,4-Oktanol: 2,23; 2-, 3-Hexanol: 1,218; 3-Me-3-PeOH,3-Me-2-PeOH: 1,49; 3,3-Di-Me-2-BuOH: 1,43; 2,3-Di-Me-BuOH: 1,317.

Beispielhaft wurden folgende Substrate untersucht:
Additiv: CF₃(CF₂)_nCO₂H
1a: n = 0; 1b: n = 5; 1c: n = 7; 1d: n = 8; 1e: n = 9; 1f: n = 10; 1g: n = 11; 1h: n = 12

Tabelle 1 P450-BM3 katalysierte Oxidation von Alkanen in Gegenwart und Abwesenheit von Perfluorocarboxysäuren 1. Reaktionsbedingungen: 3.2 mM Alkan; 1% v/v DMF; 2% v/v Ethanol; 100 mM Glukose, 1 mM NADP⁺, 1 U/ml GDH, 1 mM Additiv, 100 mM KPi, pH 8.0, Gesamtvolumen 20 ml; 1 Std.; 20°C. Die P450-BM3 Konzentration betrug zum Umsatz von Verbindung 2: 1 μM, 3: 2,9 μM, 4: 2,9 μM, 5: 1,1 μM, 6: 2,7 μM)

Alkan	Additiv	Insgesamt gebildetes Produkt (mM)	TON	Regioselektivität
2	kein	0.15	150	2-:3-:4-Oktanol = 12:44:44
2	1c	1.16	1184	2-:3-:4-Oktanol = 10:42:48
3	kein	0.43	149	2-:3-Hexanol = 83:17
3	1e	1.50	525	2-:3-Hexanol = 77:23
4	kein	0.36	126	2-Hydroxy-3-Methyl-:3-Hydroxy-3-Methylpentan = 89:11
4	1c	1.36	476	2-Hydroxy-3-Methyl-:3-Hydroxy-3-Methylpentan = 88:12
5	kein	0.12	111	nur 2-Hydroxy-3,3-dimethylbutan
5	1c	0.96	892	nur 2-Hydroxy-3,3-dimethylbutan
6	kein	0.02	20	nur 2-Hydroxy-2,3-dimethylbutan
6	1e	0.19	3241	nur 2-Hydroxy-2,3-dimethylbutan

Die Daten zeigen, dass die Additive die Enzymaktivität deutlich erhöhen und auch die Regioselektivität beeinflussen.
Die Turnover-number (TON) wurden für das Enzym nach Abschluss der Reaktion berechnet (Mol Produkt/Mol Enzym). Diese Untersuchungen zeigen, dass sowohl die Regioselektivität als auch die Aktivität des Enzyms durch den Einsatz von Additiven beeinflusst werden kann.
Beispiel 8: Chirale Untersuchung von n-Hexan Hydroxylierungsprodukten
Für die chirale Untersuchung von 2- und 3-Hexanol wurden die folgenden Geräte unter den folgenden Bedingungen verwendet: AT 6890N (HP Agilent, USA); Säule: 15 m BGB-177/BGB-15 Phase, innerer Durchmesser 0.25 mm, Filmdicke 0.25 μm, (BGB Analytik AG, Germany); Druck: 0.5 bar H₂; Splitrate 25; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 40–200°C mit 0,5°C/Min, FID-Detektor. In beiden Fällen, für 2-Hexanol und 3-Hexanol, wurde eine Änderung der Enantiselektivität beobachtet. Im Fall von 2-Hexanol wurde ein 25% Zuwachs des Enantiomerenüberschusses für R-2-Hexanol auf ee_R 43,9 beobachtet. Im Fall von 3-Hexanol wurde die Enantioselektivität sogar umgekehrt. Das belegt, dass die Additive auch die Stereoselektivität der CYP-katalysierten Reaktion beeinflussen.
Beispiel 9: Hydroxylierung von gasförmigen Alkanen, z. B. C₁, C₃ und C₄ Alkanen:
Die Hydroxylierung von gasförmigen Alkanen wurde in einem selbstgebauten Niederdruckreaktor durchgeführt. Zwölf Reaktionsgefäße mit jeweils einem Gesamtvolumen von 7 ml wurden mit 2,5 ml Reaktionsmischung gefüllt, bestehend aus: 0.1 M D-Glukose (Riedel de Haen), 1 mM NADP⁺ (Codexis), 1 U/ml GDH (Codexis), 1 mM Additiv, BM3-WT Enzym (für die Umsetzung von n-Butan: 2,3 μM, Propan: 2,9 μM, Methan 1,3 μM) und 100 mM KPi, pH 8.0. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße über eine Mehrkanalgaszufuhr mit einer Gasflasche verbunden. Die folgenden Gasmischungen wurden verwendet, um die Apparatur zu spülen und einen Druck von 10 bar auf die Reaktionslösung auszuüben: a) 7% Methan, 8% Sauerstoff, 85% Stickstoff, b) 7% Propan, 8% Sauerstoff, 85% Stickstoff oder c) 10% Butan, 8% Sauerstoff, 82% Stickstoff. Die Reaktionsmischung wurde bei 100 upm mit einem Kreuzkopf-förmigen Magnetrührer gerührt (VWR). Zum Abbruch der Reaktion wurde der Druck vorsichtig von den Reaktionsgefäßen entlassen, ein 1 ml Aliquot für 10 min bei 13000 upm zentrifugiert und mittels HPLC analysiert. Ein weiteres Aliquot von 1 ml Volumen wurde mit 0,1 ml 10% HCl für eine spätere GC-Analyse angesäuert. Jedes Experiment enthielt zumindest eine Positivkontrolle für die Enzymaktivität, wobei Dodecansäure als Additiv (1 mM Endkonzentration, aus einem 100 mM Stock in DMSO) hinzugegeben wurde, während das Enzym 10 bar der gasförmigen Alkanmischung ausgesetz war. Der Umsatz von Dodecansäure wurde mit Decansäure (1 mM Endkonzentration, aus einem 100 mM Stock in DMSO) als Standard untersucht. Die Proben wurden für die GC Untersuchung mit 0,5 Volumen an MTBE extrahiert und mittels GC analysiert.
Beispiel 10: GC-Untersuchung von Butanol und Propanol
Butanol wurde mittels GC mit den folgenden Geräten und unter den folgenden Bedingungen untersucht: HP6890plus + 7683HP (HewletPackard, USA); Säule: 15 m Stabilwax Phase, innerer Durchmesser 0.25 mm, Filmdicke 0.5 μm, (J&W, Germany); Druck: 0.8 bar H2; Splitrate 60; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 40°C 4 Min isotherm, 40–60°C mit 4°C/Min, 60–250°C mit 15°C/Min. FID-Detektor.
Propanol wurde mittels GC mit den folgenden Geräten und unter den folgenden Bedingungen untersucht: HP6890plus + 7683HP; 530 (HewletPackard, USA); Säule: 15 m Free Fatty Acid Phase (FFAP) G/366; Druck: 0.5 bar H2; Probenvolumen 1 μl; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 80–240°C mit 8°C/Min, 250°C für 15 Min isotherm, FID-Detektor.
Beispiel 11: GC-MS Analysen von Methanol, Propanol und Butanol
Für die GC-MS Detektion von Butanol wurden die folgenden Geräte unter den folgenden Bedingungen verwendet: SSQ 7000 GC/MS System (Thermo Finnigan, USA); Säule: 15 m DB-Wax Phase, innerer Durchmesser 0.25 mm, Filmdicke 0.5 μm, (J&W, Germany); Druck: 0.5 bar He; Splitrate 50; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 30–60°C mit 4°C/Min, 60–250°C mit 20°C/Min.
Für die GC-MS Detektion von Propanol wurden die folgenden Geräte unter den folgenden Bedingungen verwendet: GC: HP6890 + MS: HP5973 (HewletPackard, USA); Säule: 15 m DB-Waxetr Phase, innerer Durchmesser 0.25 mm, Filmdicke 0.25 μm, J&W, Germany; Druck: 0.5 bar He; Splitrate 10; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 40°C 10 Min, 40–240°C mit 16°C/Min.
Für die GC-MS Detektion von Methanol wurden die folgenden Geräte unter den folgenden Bedingungen verwendet: GC: HP6890 + MS: 5973 (HewletPackard, USA); Säule: 60 m Stabilwax Phase, innerer Durchmesser 0.25 mm, Filmdicke 0.5 μm (Restek, Germany); Druck: 1.4 bar He; Splitrate 5; Injektor: 220°C; Temperaturgradient: 60°C 30 Min isotherm, 60–240°C mit 16°C/Min, 240°C mit 5 min isotherm.
Beispiel 12: HPLC Analysen von Methanol, Propanol und Butanol
Die HPLC Analysen wurden mit einem LC-10A System durchgeführt, dass durch die LC-Solution Software (Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, Germany) gesteuert wurde. Das modular aufgebaute LC-System war mit LC-10AD Pumpen, einem SIL-10A Autoinjektor, einem CTO-10AC Säulenofen, einem Differential-Brechungsindex-Detektor RID-10A (alle von Shimadzu Deutschland, Duisburg, Germany) oder einem elektrochemischen Detektor ED 50 (Dionex) ausgestattet.
Die Trennungen wurden mit Organic Acid Resin Säulen (300 mm Länge, 8 mm innerer Durchmesser und eine Vorsäule von 40 mm Länge, 8 mm innerer Durchmesser; CS-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Germany) und 10 mM Trifluoressigsäure in Wasser durchgeführt. Die Trennungen wurden bei 333 K mit einer Elutionsrate von 1.0 ml/min durchgeführt.
Die Quantifizierung von Propanol und Butanol wurde mit dem RID-10A Detector durchgeführt, wogegen die Quantifizierung von Methanol mit dem RID-10A oder, bevorzugter Weise, mit dem ED 50 Detektor durchgeführt wurde. Der ED 50 Detektor wurde im integrierten, amperometrischen Messmodus mit einer Ag-Rreferenzelektrode im Bereich von 300 nC betrieben. Die Messung wurde in Wellenform wie folgt durchgeführt:

Schritt Zeit (Sek) Potential (V)

0 0.0 +0.4

1 0.28 +0.4 Beginn

2 0.30 +0.4 Ende

3 0.31 +0.4

4 0.32 +1.4

5 0.44 +1.4

6 0.45 –0.4

7 0.88 –0.4
Beispiel 13:

Tabelle 2 P450 BM3 katalysierte Oxidation von Butan und Propan in der Gegenwart oder Abwesenheit von Additiven 1 unter Standardbedingungen: 2.5 ml Reaktionsvolumen, 5 ml Gasvolumen, 1% DMF, 100 mM KPi, pH 8.0, 10 bar Druck (10% n-Butan, 8% O₂, 82% N₂; 7% Propan, 8% O₂, 85% N₂), Propan Oxidation: 14,5 Std, Butan Oxidation: 17,5 Std., 25°C.

Alkan	Additiv	Insgesamt gebildetes Produkt (mM)	TON	% ee
Butan	None	1.2	527	24
Butan	1a	1.1	469	32
Butan	1b	8.4	3632	22
Butan	1c	2.0	879	23
Butan	1d	3.9	1699	20
Butan	1e	5.8	2519	19
Propan	1e	3.0	1021	-
Propan	1f	0.67	227	-
Propan	1 h	0.50	170	-

Wie zuvor, in Gegenwart von Additiven kommt es zu einem Anstieg der Enzymaktivität und Zunahme der Produktbildung. In beiden Fällen waren wenn, dann nur Spuren von 1-Butanol und 1-Propanol zu detektieren (~1%). Tabelle 3 P450 BM3 katalysierte Oxidation von Methan in der Gegenwart eines Additivs 1 unter Bildung von Methanol: 2.5 ml Reaktionsvolumen, 5 ml Gasvolumen, 1 mM Additiv, 100 mM KPi, pH 8.0, 10 bar Druck (7% Methan, 8% O₂, 85% N₂), 21 Std., 25°C.

Additiv Insgesamt gebildetes Produkt (mM) TON

1c 2.75 2053

1d 3.31 2472

1e 1.81 1353

1f 1.25 933

1g 0.75 560

1h 0.28 210
Ohne Additiv kam es zu keiner merklichen Umsetzung von Methan. Dagegen führte die Zugabe von Additiven zu deutlichen Umsätzen von Methan zu Methanol. Tabelle 4 P450 BM3 katalysierte Oxidation von Methan in der Gegenwart eines Additivs unter Bildung von Methanol: 2.5 ml Reaktionsvolumen, 5 ml Gasvolumen, 1 mM Additiv, 100 mM KPi, pH 8.0, 10 bar Druck (7% Methan, 8% O₂, 85% N₂), 19 Std., 25°C.

Additiv Insgesamt gebildetes Produkt (mM) TON

1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooktan-1-ol 2,53 1889

1H, 1H, 2H, 2H, 3H, 3H Perfluoroundekanol 0,84 630

6(perfluoroethyl)hexanol 2,69 2006
Wie im vorherigen Beispiel, kam es ohne Additiv zu keiner merklichen Umsetzung von Methan. Dagegen führte der Einsatz der partiell fluorierten Alkohole zu einer deutlichen Bildung von Methanol. Im Fall von Methan und Propan, in denen ohne Additiv keine merklichen Umsätze zu beobachten sind, führt die Gegenwart des Additivs zu Substratakzeptanz. Damit eignen sich die Additive nicht nur zur Erhöhung der Enzym-Aktivität, Manipulation der Regio- und Stereoselektivität, sondern auch zur Änderung der Substrat-Akzeptanz. Vermutlich positionieren die Additive Substrate, die zuvor nicht am Häm zuliegen kamen, im richtigen Abstand zum Eisenatom und ermöglichen somit deren Umsatz. In manchen Fällen könnten die Additive durch eine Verkleinerung des Volumens der Aktiventasche die Substratkonzentration am Häm und damit die Wahrscheinlichkeit für deren Umsatz erhöhen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zur Oxidation von organischen Verbindungen in welchem die zu oxidierende organische Verbindung in einer wässerigen Lösung in Gegenwart von Cytochrom P450 zur Reaktion gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass dem wässrigen Reaktionsgemisch eine perfluorierte organische Verbindung als Aktivator zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruchen 1, dadurch gekennzeichnet, dass die perfluorierte organische Verbindung ausgewählt ist aus perfluorierten Alkanen mit der allgemeinen Formel I CF₃(CF₂)_nCF₃ (I) wobei n = 3 bis 30, aus perfluorierten aromatischen Verbindungen, die mindestens eine funktionelle Gruppe aufweisen können.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die funkionelle Gruppe ausgwählt ist aus OH-, -COOH, SO₃H- und/oder PO₃H oder deren Salze.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass perfluorierte Carbonsäuren mit der allgemeinen Formel II. CF₃(CF₂)_nCO₂H (II) n = bis n = 30 oder deren Salze verwendet werden
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion des Salzes ausgewählt ist aus Li⁺, Na⁺, K⁺, Cs⁺, Mg⁺², Zn⁺², H₄N⁺ oder (N-Butyl)N⁺.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die perfluorierte organische Verbindung ausgewählt ist aus Perfluoro-n-oktanol und/oder Pentafluorbenzoesäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Oxidationsmittel Luftsauerstoff, H₂O₂, Cumol-hydroperoxid, tert-Butyl-hydroperoxid, Linolsäure-hydroperoxid, NaClO₂ und/oder NaIO₄ eingesetzt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ein ionisches Lösungsmittel oder ein organisches Lösungsmittel als Kosolvens verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass superkritisches CO₂, Dimethylformamid, Acetonitril oder Tetrahydrofuran als Kosolvens verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass isolierte Enzyme oder CYP-haltige ganze Zellen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass Cytochrom ausgewählt ist aus bakteriellen CYPs der Klasse CYPs102, wie CYP102A1, CYP102A2, CYP102A3, CYP102A4, CYP102A5, CYP102A6, CYP102A7, CYP102A8, CYP102A9, CYP102A10, CYP102A11, CYP102Al2.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass als Cytochrom P450 das Cytochrom Enzym P450 BM3 eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass C₁-C₈-alkane zu den entsprechenden Alkoholen oxidert werden.