JPH04144695A - 分泌蛋白質のリフォールディング法 - Google Patents
分泌蛋白質のリフォールディング法Info
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- JPH04144695A JPH04144695A JP26844690A JP26844690A JPH04144695A JP H04144695 A JPH04144695 A JP H04144695A JP 26844690 A JP26844690 A JP 26844690A JP 26844690 A JP26844690 A JP 26844690A JP H04144695 A JPH04144695 A JP H04144695A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は、組換えDNA技術により分泌生産される異種
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフオールディングによる製法に
関するものである。
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフオールディングによる製法に
関するものである。
[従来の技術]
今日、組換えDNA技術により微生物を宿主として異種
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。
組換えによる蛋白質の生産法は、菌体内に蓄積させる方
法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別さ
れる。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にとも
ないそれらはインクルージヨンボディと言われる封入体
の形で菌体内に蓄積する(参考文献1)。後者では、菌
体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に分
泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生産
された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有利
である。しかしながら両者とも、特に前者において、蛋
白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正し
い立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の不
活性化が大きな問題である(参考文献2)。この不活性
化の原因として最も一般的で最大のものとして認められ
ていることは、蛋白分子内でシスティン残基間における
正しいS−5架橋(ジスルフィド結合)が形成されない
ために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構造が
望ましくない蛋白が生産されることである(参考文献3
)。
法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別さ
れる。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にとも
ないそれらはインクルージヨンボディと言われる封入体
の形で菌体内に蓄積する(参考文献1)。後者では、菌
体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に分
泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生産
された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有利
である。しかしながら両者とも、特に前者において、蛋
白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正し
い立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の不
活性化が大きな問題である(参考文献2)。この不活性
化の原因として最も一般的で最大のものとして認められ
ていることは、蛋白分子内でシスティン残基間における
正しいS−5架橋(ジスルフィド結合)が形成されない
ために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構造が
望ましくない蛋白が生産されることである(参考文献3
)。
従来、このような不活性蛋白は精製時に不純物として廃
棄されるか、もしくは煩雑で効率の悪い方法によるS−
3結合の再構成処理、いわゆるリフォールディングによ
って活性型に変換されていた。
棄されるか、もしくは煩雑で効率の悪い方法によるS−
3結合の再構成処理、いわゆるリフォールディングによ
って活性型に変換されていた。
これまで行われていたリフオールディング方法を簡単に
述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは部
分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生産
系では菌体の破砕処理ならびにインクルージヨンボディ
ーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてより
煩雑である。
述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは部
分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生産
系では菌体の破砕処理ならびにインクルージヨンボディ
ーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてより
煩雑である。
次に、変性側および還元剤により蛋白質分子内の誤った
S−3結合の開裂を行い、還元剤、酸化剤および変成剤
を組合せて添加し最適条件下にて正常な蛋白質の生成に
向けてS−8結合の再構成を行う。さらに変性側、還元
剤および酸化剤を除去するためのカラムクロマト等の処
理がなされる(参考文献4)。
S−3結合の開裂を行い、還元剤、酸化剤および変成剤
を組合せて添加し最適条件下にて正常な蛋白質の生成に
向けてS−8結合の再構成を行う。さらに変性側、還元
剤および酸化剤を除去するためのカラムクロマト等の処
理がなされる(参考文献4)。
具体例を述べると、Anfinsenによる精製された
ランのりボヌクレアーゼを用いたりフォルディング実験
に代表されるように、間違ったS−3結合をもつ精製し
た蛋白質溶液にチオール化合物を添加することにより、
正しい構造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは
、蛋白質のS−8結合がチオール化合物により還元され
、次に空気酸化によりS−8結合の再構成が行われ、自
由エネルギー減少の法則に従い間違った構造が正しい安
定な構造にもどったと考えられる(参考文献6)。しか
しながら、リフォールディングに要する時間が非常に長
くかかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため
処理後に再度精製のための操作が必要であること等の理
由により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産へ
の応用は難しいものであった。
ランのりボヌクレアーゼを用いたりフォルディング実験
に代表されるように、間違ったS−3結合をもつ精製し
た蛋白質溶液にチオール化合物を添加することにより、
正しい構造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは
、蛋白質のS−8結合がチオール化合物により還元され
、次に空気酸化によりS−8結合の再構成が行われ、自
由エネルギー減少の法則に従い間違った構造が正しい安
定な構造にもどったと考えられる(参考文献6)。しか
しながら、リフォールディングに要する時間が非常に長
くかかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため
処理後に再度精製のための操作が必要であること等の理
由により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産へ
の応用は難しいものであった。
このように、従来の蛋白質のリフオールディングには数
段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操作
途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールディ
ングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋白
の収率はさほど高いとはいえない状況であった(参考文
献5)。
段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操作
途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールディ
ングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋白
の収率はさほど高いとはいえない状況であった(参考文
献5)。
[発明が解決しようとする課題]
本発明は組換えDNA技術により分泌生産される異種蛋
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なりフォルディング法を提供する
ことを目的とする。
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なりフォルディング法を提供する
ことを目的とする。
丁課題を解決するための手段]
以上のような点に鑑み本発明者らは検討を重ねた結果、
驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては分泌
されたタンパク質の精製もしくは部分精製をすることな
しに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を直接
還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見出し
本発明に到達した。
驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては分泌
されたタンパク質の精製もしくは部分精製をすることな
しに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を直接
還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見出し
本発明に到達した。
すなわち、本発明は岨換えDNA技術により分泌生産さ
れた異種蛋白質のS−8結合の誤った架橋を正しいS−
3結合に再架橋させる蛋白質のリフオールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中に
、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後に
酸化させる一連の処理により正しいS−S結合に再架橋
させることを特徴とするリフオールディング法である。
れた異種蛋白質のS−8結合の誤った架橋を正しいS−
3結合に再架橋させる蛋白質のリフオールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中に
、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後に
酸化させる一連の処理により正しいS−S結合に再架橋
させることを特徴とするリフオールディング法である。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明の対象とする蛋白質は組換えDNA技術により分
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。
本発明の使用する還元剤としては、たとえばメルカプト
エタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シス
ティン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールアミ
ン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使用
量はとくに制限はないが、通常1〜100mMである。
エタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シス
ティン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールアミ
ン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使用
量はとくに制限はないが、通常1〜100mMである。
還元の条件も特に制限はないが、10〜50°C好まし
くは20〜40°Cで数分から1時間である。
くは20〜40°Cで数分から1時間である。
還元剤の添加は培養上清を回収し、その回収した上清へ
添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中の
培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における酸
化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよい
が、好ましくは培養上清または培養液に通気することに
より行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常は
溶存酸素濃度が10%以上の条件にて10〜50°C好
ましくは20〜40°Cで数分から1時間である。
添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中の
培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における酸
化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよい
が、好ましくは培養上清または培養液に通気することに
より行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常は
溶存酸素濃度が10%以上の条件にて10〜50°C好
ましくは20〜40°Cで数分から1時間である。
組換えDNA技術による物質生産では、DNA配列に従
って新しく合成されたポリペプチド鎖が、正確に折りた
たまれて天然型と同し機能を持つ三次構造をとることが
必要である。そして、ポリペプチド鎖が折りたたまれて
三次構造を形づくるにあたってアミノ酸配列によって規
定される情報は蛋白質内でのアミノ酸どうしの相互作用
によって最終的に熱力学的に安定な構造をとるための情
報である。天然の蛋白質内で熱力学的に安定な構造をと
るためには、ファンデルワールス力、ねじれ力、静電力
、水素結合、疎水性結合、そしてジスルフィド結合が関
与し、これらのエネルギーの総和が最小になるようにα
−へリソクス、β−シト、ターンなどの二次構造が三次
元的に折りたたまれ、最も安定な構造をもつ。そのため
には分子内あるいは分子間相互作用のうち唯一共有結合
であるジスルフィド結合すなわちS−3結合が重要であ
ることは明らかである。
って新しく合成されたポリペプチド鎖が、正確に折りた
たまれて天然型と同し機能を持つ三次構造をとることが
必要である。そして、ポリペプチド鎖が折りたたまれて
三次構造を形づくるにあたってアミノ酸配列によって規
定される情報は蛋白質内でのアミノ酸どうしの相互作用
によって最終的に熱力学的に安定な構造をとるための情
報である。天然の蛋白質内で熱力学的に安定な構造をと
るためには、ファンデルワールス力、ねじれ力、静電力
、水素結合、疎水性結合、そしてジスルフィド結合が関
与し、これらのエネルギーの総和が最小になるようにα
−へリソクス、β−シト、ターンなどの二次構造が三次
元的に折りたたまれ、最も安定な構造をもつ。そのため
には分子内あるいは分子間相互作用のうち唯一共有結合
であるジスルフィド結合すなわちS−3結合が重要であ
ることは明らかである。
遺伝子組換え操作により微生物に異種遺伝子由来の蛋白
質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、目
的産物の精製過程における処理操作および経済性から有
利であることは明らかである。しかしながら分泌生産系
を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条件
下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、ア
ミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と同
様であるにもかかわらず活性を持たず、またHPLC分
析において活性型と異なる分離溶出のパタンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびHPL(j8出パターンを調べた
。その結果、このものの活性回復が認められ、HPLC
分離溶出パターンも天然の活性型蛋白と同様となること
を見いだした。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌
生産時に、正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、−
次構造は正しいがS−3結合のかけ違いにより活性を持
たない蛋白質が生し、さらにこれらの不活性型蛋白はチ
オール化合物の添加および再酸化により容易に活性型ヘ
リフォールディングされることを示すものである。
質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、目
的産物の精製過程における処理操作および経済性から有
利であることは明らかである。しかしながら分泌生産系
を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条件
下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、ア
ミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と同
様であるにもかかわらず活性を持たず、またHPLC分
析において活性型と異なる分離溶出のパタンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびHPL(j8出パターンを調べた
。その結果、このものの活性回復が認められ、HPLC
分離溶出パターンも天然の活性型蛋白と同様となること
を見いだした。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌
生産時に、正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、−
次構造は正しいがS−3結合のかけ違いにより活性を持
たない蛋白質が生し、さらにこれらの不活性型蛋白はチ
オール化合物の添加および再酸化により容易に活性型ヘ
リフォールディングされることを示すものである。
そこで本発明者らは、チオール化合物による蛋白質のリ
フオールディング作用を、分泌生産系において生じるS
−3結合のかけ違いにより不活性型となった蛋白質のリ
フオールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分泌
生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接チ
オール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質の
りフォルディング法の検討を行った。
フオールディング作用を、分泌生産系において生じるS
−3結合のかけ違いにより不活性型となった蛋白質のリ
フオールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分泌
生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接チ
オール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質の
りフォルディング法の検討を行った。
その結果、培養液あるいは培養上清への通気を実質上停
止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよう
な条件下にてチオール化合物を直接培養液あるいは培養
上清に添加し、蛋白質の誤ったS−3結合の開裂のため
しばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化により
リフォールディングを行う一連の操作により、S−8結
合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有する
蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明におけるリ
フォールディング法は、従来行われていたリフオールデ
ィング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのため
経済的でもある。
止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよう
な条件下にてチオール化合物を直接培養液あるいは培養
上清に添加し、蛋白質の誤ったS−3結合の開裂のため
しばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化により
リフォールディングを行う一連の操作により、S−8結
合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有する
蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明におけるリ
フォールディング法は、従来行われていたリフオールデ
ィング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのため
経済的でもある。
また、分泌生産された蛋白質を対象としているため分泌
生産のだめの宿王菌株は、一般に利用されている大腸菌
、枯草菌、酵母を問わない。
生産のだめの宿王菌株は、一般に利用されている大腸菌
、枯草菌、酵母を問わない。
本発明者らは、すでにトロンビンの阻害側であるヒルジ
ン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形質
転換された枯草菌菌株を造成している(FERM P
−10028)。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは
、分子内に3組のSS結合ををするものであるが、高通
気条件下の高率発現、分泌においては誤った架橋による
不活性型のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。
ン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形質
転換された枯草菌菌株を造成している(FERM P
−10028)。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは
、分子内に3組のSS結合ををするものであるが、高通
気条件下の高率発現、分泌においては誤った架橋による
不活性型のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。
しかしこのような培養条件下においても、本発明のリフ
オールディング法を適用することにより目的とする活性
型ヒルジンの生産量を飛躍的に増大させることに成功し
た。また増大した量は、本発明の処理以前に存在する不
活性型のものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的
に行われることが見いだされた。このことは本発明の再
架橋法により不活性型のものが、はぼ100%の転換率
で活性型に変換されることを示すものである。
オールディング法を適用することにより目的とする活性
型ヒルジンの生産量を飛躍的に増大させることに成功し
た。また増大した量は、本発明の処理以前に存在する不
活性型のものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的
に行われることが見いだされた。このことは本発明の再
架橋法により不活性型のものが、はぼ100%の転換率
で活性型に変換されることを示すものである。
:実施例:
以下本発明を具体例で説明するが、本発明はこの例によ
り何ら限定されるものではない。
り何ら限定されるものではない。
実施例1
(培養上清への還元剤添加によるリフォールディング)
ヒルジン分泌枯草菌株(FERM P−10028)
を、2倍濃度のLB培地(0,2%グルコス)を用い3
0°Cで一夜振曇培養し、0D660が5〜6の培養液
を得る。この培養液から高速遠心分離により画体を除き
、培養上清を回収する。
を、2倍濃度のLB培地(0,2%グルコス)を用い3
0°Cで一夜振曇培養し、0D660が5〜6の培養液
を得る。この培養液から高速遠心分離により画体を除き
、培養上清を回収する。
本培養上清を均等に分注し、各々にメルカプトエタノー
ルを終濃度にして0〜50mMになるように直接添加し
、軽く撹拌した後室温にて10分間静置した。次に30
°Cにて30分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理
を行った後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定
量した(参考文献7)。結果を第1表に示す。なお、コ
ントロールには無処理の培養上清を用いた。また、第1
表に示されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオス
ライト−ル、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度
により効果の差があるものの、まったく代替えすること
が可能であった。
ルを終濃度にして0〜50mMになるように直接添加し
、軽く撹拌した後室温にて10分間静置した。次に30
°Cにて30分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理
を行った後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定
量した(参考文献7)。結果を第1表に示す。なお、コ
ントロールには無処理の培養上清を用いた。また、第1
表に示されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオス
ライト−ル、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度
により効果の差があるものの、まったく代替えすること
が可能であった。
第1表
濃度 (m門)(mg/l)
49゜
実施例2
(培養液中への還元剤の直接添加によるリフオルディン
グ) 溶存酸素センサーを装備した30!容ジャーファーメン
タ−(丸菱ハイオエンジ■社製MSJし3W型)に21
B培地(0,4%グルコース)を20ff仕込み、前培
養したヒルジン分泌枯草菌株(EFRM P−100
28)を植菌し、空気量4f/min、回転数25Or
pmにて30°Cて培養を行う。17〜18時間培養後
0D660が7〜8の時点て、通気を停止する。しばら
く後熔存酸素濃度がOになったところで直ちに終濃度1
.5mMまでメルカプトエタノールをジャー中に直接添
加する。5分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を継
続する。さらに培養開始後22時間において同様の操作
を行った。第2表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。
グ) 溶存酸素センサーを装備した30!容ジャーファーメン
タ−(丸菱ハイオエンジ■社製MSJし3W型)に21
B培地(0,4%グルコース)を20ff仕込み、前培
養したヒルジン分泌枯草菌株(EFRM P−100
28)を植菌し、空気量4f/min、回転数25Or
pmにて30°Cて培養を行う。17〜18時間培養後
0D660が7〜8の時点て、通気を停止する。しばら
く後熔存酸素濃度がOになったところで直ちに終濃度1
.5mMまでメルカプトエタノールをジャー中に直接添
加する。5分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を継
続する。さらに培養開始後22時間において同様の操作
を行った。第2表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。
第2表
22 78.L 140.
0実施例3 (リフォールディング処理を行った培養液のHPLC検
定) 実施例2で得られるメルカプトエタノール処理を行う直
前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加えるこ
とによりpHを3に合わせ、生しる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、50mM酢酸アンモニウム−ギ酸緩
衝1a(pH3,0)により平衡化したイオン交換樹脂
5P−TRISACRYL M (IBF社製)カラ
ムに添加する。次に同緩衝液にてカラムを洗浄した後、
50mM酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝液(pH4,2)
により溶出されるヒルジン活性画分を集め部分精製を行
う。このようにして得られたヒルジン画分をHPLCに
供試しその溶出パターンを調べた。
0実施例3 (リフォールディング処理を行った培養液のHPLC検
定) 実施例2で得られるメルカプトエタノール処理を行う直
前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加えるこ
とによりpHを3に合わせ、生しる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、50mM酢酸アンモニウム−ギ酸緩
衝1a(pH3,0)により平衡化したイオン交換樹脂
5P−TRISACRYL M (IBF社製)カラ
ムに添加する。次に同緩衝液にてカラムを洗浄した後、
50mM酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝液(pH4,2)
により溶出されるヒルジン活性画分を集め部分精製を行
う。このようにして得られたヒルジン画分をHPLCに
供試しその溶出パターンを調べた。
用いたカラムは、μBondasphere C3(
Waters社製)で、0.1%トリフルオロ酢酸と1
00%アセトニトリルの二液グラジェント系により溶出
を行った。メルカプトエタノール理を行う直前および処
理直後の培養液中に含まれるヒルジンの溶出パターンの
比較を第1図に示す。ここで、双方における29分のリ
テンションタイムのピークが活性型ヒルジンのピークで
ある。処理前に認められる40〜50分のピークは、そ
れらを分取しアミノ酸組成分析およびN末端アミノ酸配
列の解析を行ったところ完全に活性型のヒルジンと一致
することがらS−3結合のかけ違いにより生したヒルジ
ンの不活性型分子種であることが判明した。さらにこれ
らの処理直前に見られた40〜50分のリテンションタ
イムのピクは、処理後には完全に消失していることが認
められた。さらに、処理後におけるヒルジンの活性の増
加分は、消失したピークの量と一致するものであった。
Waters社製)で、0.1%トリフルオロ酢酸と1
00%アセトニトリルの二液グラジェント系により溶出
を行った。メルカプトエタノール理を行う直前および処
理直後の培養液中に含まれるヒルジンの溶出パターンの
比較を第1図に示す。ここで、双方における29分のリ
テンションタイムのピークが活性型ヒルジンのピークで
ある。処理前に認められる40〜50分のピークは、そ
れらを分取しアミノ酸組成分析およびN末端アミノ酸配
列の解析を行ったところ完全に活性型のヒルジンと一致
することがらS−3結合のかけ違いにより生したヒルジ
ンの不活性型分子種であることが判明した。さらにこれ
らの処理直前に見られた40〜50分のリテンションタ
イムのピクは、処理後には完全に消失していることが認
められた。さらに、処理後におけるヒルジンの活性の増
加分は、消失したピークの量と一致するものであった。
(参考文献−覧)
1、門1traki、A Et at、 (1989
) Bio/Technology、、 7,690 2、 Tsuji、T、 et al、 (198
7) Biochem、、23、安藤鋭部ら (19
73) タンパク質化学3433 共立出版 4、池原森男ら (1988) タンパク賞工学実験
7.1−ユアル 83 講談社すイエンティフィク 5、特開昭62−501262 6、 Anfinsen、C,B (1964)
in ’New Perspectives in
Biology 5ela、M、、ed、
42 American Elsevier 7 、0gasawara、N、 (1985)
Gene、40,145
) Bio/Technology、、 7,690 2、 Tsuji、T、 et al、 (198
7) Biochem、、23、安藤鋭部ら (19
73) タンパク質化学3433 共立出版 4、池原森男ら (1988) タンパク賞工学実験
7.1−ユアル 83 講談社すイエンティフィク 5、特開昭62−501262 6、 Anfinsen、C,B (1964)
in ’New Perspectives in
Biology 5ela、M、、ed、
42 American Elsevier 7 、0gasawara、N、 (1985)
Gene、40,145
第1図は、培養液中へのメルカプトエタノールの直接添
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のHPLCの溶出パター
ンを示したものである。図中の数字は、各ピークのリテ
ンションタイムを表わしている。記号Aで示した不活性
なビクは、リフォールディング処理後には消失しており
記号Bで示される活性型のピークに変換されている。 特許出願人 三井東圧化学株式会社
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のHPLCの溶出パター
ンを示したものである。図中の数字は、各ピークのリテ
ンションタイムを表わしている。記号Aで示した不活性
なビクは、リフォールディング処理後には消失しており
記号Bで示される活性型のピークに変換されている。 特許出願人 三井東圧化学株式会社
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、組換えDNA技術により分泌生産された異種蛋白質
のS−S結合の誤った架橋を正しいS−S結合に再架橋
させる蛋白質のリフオールディング法において、該蛋白
質を含む培養液もしくは培養液上清中に、還元剤を添加
し、誤った架橋を開裂させ、しかる後に酸化させる一連
の処理により正しいS−S結合に再架橋させることを特
徴とするリフオールディング法。 2、還元剤がメルカプトエタノール、ジチオスライトー
ル、グルタチオン、システイン、チオグリコール酸、メ
ルカプトエタノールアミン、ジチオエリスリトールより
任意に選ばれた一もしく二以上の組合せである請求項1
に記載のリフオールディング法。 3、還元剤の添加が、通気を停止した状態の培養中の培
養液へ直接行われることを特徴とする請求項1または2
に記載のリフオールディング法。 4、還元剤により開裂されたS−S結合の酸化および還
元剤の酸化が、培養槽への通気により行われることを特
徴とする請求項1ないし3のいずれか1項に記載のリフ
オールディング法。 5、分泌生産のための宿主菌株が、大腸菌、枯草菌また
は酵母であることを特徴とする請求項1ないし4のいず
れか1項に記載のリフオールディング法。 6、分泌生産された異種蛋白質が、トロンビンの阻害剤
であるヒルジンであることを特徴とする請求項1ないし
5のいずれか1項に記載のリフオールディング法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26844690A JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP26844690A JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04144695A true JPH04144695A (ja) | 1992-05-19 |
JP2927927B2 JP2927927B2 (ja) | 1999-07-28 |
Family
ID=17458624
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP26844690A Expired - Fee Related JP2927927B2 (ja) | 1990-10-08 | 1990-10-08 | 分泌蛋白質のリフォールディング法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2927927B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995008573A1 (fr) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide a action inhibant l'agregation plaquettaire et procede de production de ce compose |
US6590072B2 (en) | 1999-12-22 | 2003-07-08 | Nna/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
-
1990
- 1990-10-08 JP JP26844690A patent/JP2927927B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995008573A1 (fr) * | 1993-09-22 | 1995-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide a action inhibant l'agregation plaquettaire et procede de production de ce compose |
US5856126A (en) * | 1993-09-22 | 1999-01-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide having anti-thrombus activity and method of producing the same |
US6590072B2 (en) | 1999-12-22 | 2003-07-08 | Nna/S | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2927927B2 (ja) | 1999-07-28 |
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