KR970001813B1 - 삼상분할법을 이용한 아미노펩티다제의 정제방법 - Google Patents

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Description

삼상분할법을 이용한 아미노펩티다제의 정제방법

제1도는 삼상분할법에 의해 분리된 아미노펩티다제를 세파크릴(Sephacryl) S-200겔 여과 크로마토그라피한 결과를 나타낸 것이고,

제2도는 세파크릴 S-200겔 여과 크로마토그라피한 아미노펩티다제를 DEAE-세파로즈(Sepharose) 음이온 교환 크로마토그라피한 결과를 나타낸 것이고,

제3도는 S-200겔 여과 크로마토그라피 및 DEAE-세파로즈 음이온 교환 크로마토그라피한 후의 아미노펩티다제 용액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동한 결과를 나타낸 것이다.

제4도는 프레스코트와 월키스의 방법에 기초하여 정제한 아미노펩티다제를 재조합 인간 성장호르몬에 처리한 결과를 나타낸 것이며,

제5도는 본 발명의 방법으로 정제하 아미노펩티다제를 재조합 인간 성장호르몬에 처리한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 미생물 배양액내에 분비되는 아미노펩티다제를 정제하는 상법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 아미노펩티다제가 분비되어 있는 미생물 배양액을 삼상분할(three phase partitioning)함을 특징으로 하여 아미노펩타아제를 정제하는 방법에 관한 것이다.

아미노펩티다제는 여러 종류의 미생물에서 발견되며 대체적으로 활성유지를 위해 칼슘 또는 아연등을 요구하는 메탈로-프로테아제(metallo-protease)로서 60-70℃의 온도에서도 활성을 보유하는 공통점이 있는 반면 중에 따라 각각 다른 특성을 가지는 것으로 알려져 있다.

론카리(Roncari) 및 주버(Zuber)(G.Roncari and H. Zuber, Method in Enzymology 19,544(1970)는 바실러스 스테아로써 모필루스(Bacillus stearothermophilus)로 부터 특성이 약간씩 다른 3가지의 아미노펩티다제를 보고하였고, 우와지마(Takayuri Uwajima, Naohiro Yoshikawa and Osamu Terada, Agr. Biol. Chem 37(12), 2727(1983) 등은스트렙토미세 펩티도파시엔스(Streotomyces peptidofaciens) KY 2389로부터 칼슘을 요구하는 아미노펩티다제의 물리화학적 성질을 보고하였다.

최근에는 스트렙토미세스 그리세우스 K-1(Streotomyces griseus K-1)에서 많은 연구(K.D. Vosbeck et al. J. Biol. Chem. 238, 6029-6034)가 진행되었으며, 도한 바실러스 써틸러스(Bacillus subtilis) (Archives K.D Vosbecfk et al., J. of Biochemisty and Biophysics 197(1), 63-72(1979)) ,스트렙토미세스 리모수스(Streptomyces rimosus)(Appl. Microbioil. Biotechnol.) 23, 449-455(1986))등으로 부터의 연구도 보고되었다.

이러한 아미노펩티다제 중의 일부는 유전공학기법에 의해 제조되는 효모나 박테리아에서 발현되는 단백질의 아미노말단에 위치한 메티오닌기의 제거에 적절히 응용될 수 있으므로 이 효소를 순수하게 대량생산하기 위한 효과적인 방법이 개발이 요구되고 있다.

따라서, 재조합 단백질의 제조에 이용될 수 있는 아미노펩티다제를 효과적으로 분리정제하기 위한 노력이 다양한 미생물들에서 시도되었다. 예컨데, 프레스코트와 월키즈는 비브리오 프로티오리티커스(Vibrio proteolyticus, ATCC 15338)의 배양약을 원심분리, 한외여과, 황산 암모니움 침전법, 아세톤 침전법, 열처리과정, 세파덱스 G-75 컬럼 과정을 순차적으로 거쳐 아미노펩티다제[EC. 3,4,11,10]를 분리 정제하였다(Prescott and Wikes, Arch.Biochem. Biophys. 117, 328(1966); J.Biol. Chem. 246, 1756(1971)).

스펀진과 블럼버그는 스트렙토마이세스 그리세우스의 발효 배지를 열처리, 바이오-겔 P-4 겔 여과(Bio-Gel P-4 gel filtration ), DEAE-세파로즈 이온 교환 크로마토그라피의 과정을 차례로 거쳐 아미노펩티다제를 분리하였다(A Spungin and S. Blumberg, Eur. J. Biochem.183, 471-477(1989)),

미생물 배양액에는 아미노펩티다제와 물리 화학적 특성이 유사한 여러 종류의 엔도프로테아제들이 존재하는데, 이러한 엔도프로테아제는 N-말단의 메티오닌기를 제거하고자 하는 대상 단백질의 펩티드 결합을 부분 절단하고, 부분 절단된 단백질들은 통상적인 칼럼을 통하여 분리하기 어려우므로 최종 단백질의 순도에 결정적인 영향을 미친다.

그런데, 전술한 공지의 통상적인 정제 방법만으로 이러한 엔도프로테아제들을 완전히 제거할 수 없으므로, 통상의 엔도프로테아제 활성 억제 인자들을 사용하지만 이 방법 역시 잔존하는 엔도프로테아제의 활성을 완전히 억제하게 할 수는 없다.

이에 본 발명자들은 아미노펩티다제를 보다 효과적으로 분리정제하기 위한 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 삼상분할법을 이용할 경우 전술한 종래방법들에서 나타난 문제점들을 해결하고 발효 배지에 존재하는 엔도프로테아제들을 효과적으로 제거할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

삼성분할법이란, 적절한 pH 및 황산 암모늄 농도 조건에서 단백질 용액에 삼차 부탄올을 부가할때 액상의 구별이 이루어지면서 특정 단백질이 삼차 부탄올층과 수용액층 사이로 분별되어 응결체(aggregate)를 형성하게끔 하는 방법이다. 삼상분할법은 효소 활성에 큰 영향을 미치지 않고 상온에서의 처리가 가능하며, 효소의 총역가를 거의 대부분 보존하면서 비활성도를 높일 수 있고, 그 처리 과정이 간단하면서 신속하고, 색소 제거 효과가 있다는 점 등에서 효소를 대량으로 정제하는 경우에도 유용하게 이용될 수 있다.

알파-아밀라제와 만니톨 디하이드로게나제등의 정제에 삼상분할법이 이용된 예가 있다(Lovrien, R. et. al(1987), Protein Purification Micro to Macro, Alan R. Liss, Inc, New York, pp 131-148 ; Anderson P.C.1979), Ph. D Thesis, Univ. of Minnesota, St. Paul, p69 ; Niehaus W.G. Dilts R.P.(1982), J. Bact. 151, p 243).

그러나, 상기에 보고된 삼상분할법의 이용예에는 본 발명에 따른 아미노펩티다제와 같은 복잡한 단백질의 정제에 적용할 수 있다는 언급이 젼혀 없을 뿐 아니라 삼상분할법을 수행함에 있어서, 예컨데, 알파-아밀라제의 경우 바시루스 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquifaciens) 균주 배양액의 조정제된 알파-아밀라제 함유 용액에 pH 7.5조건에서 부탄올과 75%황산 암모늄을 가한후 중간층을 얻고, 여기에 다시 부탄올이 포함된 30-40%의 황산 암모늄을 가하여 정제하는 방법을 사용하고 있지만 2차의 삼상분할), 일반적으로 정제하고자 하는 효소의 성질 및 특성에 따라 pH, 황산 암모늄 농도 및 온도등의 조건이 변한다.

따라서, 본 발명에서는 전술한 삼상분할법을 아미노펩티다제의 정제에 응용하고 이방법이 효과적으로 적용될 수 있는 적합한 조건을 발견하여 아미노펩티다제를 고순도로 정제할 수 있는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 구제적으로 설명하고자 한다.

본 발명에 따른정제방법을 비브리오 프로티오리티커스(Vibrio proteolyticus)로 부터 분비되는 아미노펩티다제를 예를 들어 설명하지만 본 발명의 방법은 여러 종의 미생물로부터 분비되는 다양한 아미노펩티다제의 정제에 거의 제약없이 이용될 수 있다.

먼저, 비브리오 프로티오리티커스를 발효하여 얻은 배양액을 원심분리하여 상등액을 농축한다. 용액의 pH를 조절한 후 황산 암모늄을 가하여 포화시킨 다음 동일 부피의 삼차 부탄올을 부가하고 층(phase)의 분리가 일어날 때까지 상온에서 방지한다. 층분리가 완결되면 상층의 삼차 부탄올층과 하층의 수용액층 중간에 형성된 단백질 응결층만을 회수한 수, 여기에 완충용액을 적당량 부가하여 완전히 용해시킨 후 한외여과(diafiltration)를 수행함으로써 잔존하는 삼차 부탄올을 제거하고, 삼차 부탄올이 제거된 단백질 용액을 열 처리한 후 4℃로 냉각하고 원심분리하여 침전물을 제거한 상등액 만을 모아서 겔 여과 크로마토그라피와 음이온 교환 크로마토그라피를 수행한다.

이상에서 설명한 정제과정에서 요구되는 삼상분할법의 최적 조건을 찾기 위하여 연구한 결과 비브리오 아미노펩티다제의 비활성도와 오염된 엔도프로테아제 활성도에 관한 pH 및 황산 암모늄 농도와의 관계를 발견하였다. 즉, 삼상분할법을 적용함에 있어 pH 4 내지 8과 40 내지 70% 황산 암모늄 구간에서 삼상분할 처리한 아미노펩티다제의 비활성도는 삼상분할법을 사용하지 않은 대조구에 비해 모두 증가하였으며, 엔도프로테아제 활성도도 삼상분할법을 사용하지 않은 대조구에 비해 모두 감소하였으며, 특히 pH 5, 60% 황산암모늄 조건에서 최소로 나타났다.

이에 비추어 볼 때, 엔도프로테아제를 최대로 제거하면서 정체수율을 최상으로 높일 수 있는 바람직한 pH 는 5내지 6이고, 최종 황산 암모늄 농도는 50내지 60%로 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에 따라 정제된 아미노펩티다제는, 제조합 메티오닌 인간 성장호르몬등의 단백질의 천연형과 동일한 형태로 전환시키기 위해 N-메티오닌을 제거하는데 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 참고적으로 하기에 그 처리과정을 간단히 설명하면 다음과 같다.

예를들어, 재조합 메티오닌 인간 성장호르몬의 경우, 본 발명에 따라 분리한 상기 아미노펩티다제를 적정량 혼합하고, 반응액에 1mM이 되도록 PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)를 부가한후 35℃에서 약 15시간 방치한다. 반응액을 겔 여과 크로마토르라피, 음이온 교환 크로마토그라피를 순차적으로 수행하면 메티오닌이 제거된 천연형 인간 성장호르몬 순도 99.5% 이상으로 얻을 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 더욱 구체적으로 설명한다. 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

삼상분할법 조건의 최적화

비브리오 프로티오리티커스(ATCC 15338)를 31 규모로 발효하여 얻은 배양액을 13,000g에서 10분간 원심분리하여, 상등액을 수득하고 이를 효소원으로 이용하였다.

효소원으로부터 각 10ml씩을 취하여 대조구를 제외한 나머지 시료를 5% 아세트산으로 pH를 4에서 8까지 1단위별로 조정하였다. 각 pH별로 황산 암모늄을 40에서 70%까지 10% 단위로 포화시켰다. 이어서 각 시험구의 부피에 해당하는 양의3차 부탄올을 부가하고 상온에서 10분간 방치하였다.

반응 혼합물을 약 500g에서 10분간 원심분리하여 중간층에 형성된 단백질 응결층이 압축되도록 한 후 주사기를 이용하여 상충액(삼차 부탄올층)과 하층액(수용액층)을 각각 분리 제거하였다. 남은 단백질 응결층을 20ml의 트리스 완충용액(pH 8.0)에 녹이고 단백질 농도의 아미노펩티다제 및 엔도프로테아제 활성을 각각 측정하여 표 1에 나타내었다.

* : 대조구

1 : 황산 암모늄%

2 : 1분간 405nm에서 투이신파라나이트로페닐라이드의 흡광도를 1단위 변화시키는 효소의 양을 1로 함

3 : 용액중의 총 단백질 농도(mg/ml)

4 : 단백질 1mg당 효소의 활성도

5 : 엔도프로테아제의 활성도

1분간 37℃에서 레조루핀 표지된 카제인의 흡광도를 574nm에서 1단위 변화시키는 엔도프로테아제의 양을 1로 함

6 : 아미노펩티다제와 엔도프로테아제의 활성도 비

N.D. : 단백질 응결층의 생성이 느려 측정 대상에서 제외

표 1에 비추어 볼 때, 아미노펩티다제의 비활성도는 pH4 내지 8과 40내지 70% 황산 암모늄 구간에서 삼상분할법을 사용하지 않은 대조구에 비해서 모두 증가하였으며, 특히 아미노펩티다제의 비활성도는 pH5,50% 황산 암모늄 조건에서 최대로 나타났으며, 엔도프로테아제 활성도는 pH 5,60% 황산 암모늄 조건에서 최소로 나타났다.

실시예2

아미노펩티다제의 정제

비브리오 프로티오리티커스를 10리터 규모로 발효하여 얻은 배양액을 13,000g에서 10분간 원심 분리하여 상등액만을 취하고 이를 아미콘 농축기(amicon spiral cartridge S10Y10,MVCO 10,000Da)로 약 1리터까지 농축하였다. 5% 아세트산을 이용하여 용액의 pH를 5로 조정하고 황산 암모늄을 최종 농도가 60%가 되도록 가한 후 포화시켰다. 황산 암모늄 b포화용액에 동일 부피의 삼차 부탄올을 가하고 층의 분리가 일어날때까지 상온에서 방치시킨 후 약 500g에서 원심분리하여 상층의 삼차 부탄올 층과 하층의 수용액층 중간에 형성된 단백질 응결층이 압축되도록 한후 상층과 하층액 각각을 분리 제거하였다. 분리된 단백질 응결층에 100mM NaCl과 50μM ZnCl가 포함된 10mM트리스(Tris) 완충용액(pH 8.0)을 적당량 부가하여 완전히 용해시킨후 아미콘 농축기(Amicon spiral cartidge S1Y10,MWCO 10,000Da)를 이용하여 동일 환충용액에 대해 한외여과(diafiltration)를 수행함으로써 잔존하는 삼차 부탄올을 제거하였다.

삼차 부탄올이 제거된 상기 용액을 70℃에서 8시간 동안 가열한 후 4℃로 냉각시키고 13,000g에서 원심분리하여 침전물을 제거한 상등액 80ml를 모아서 100mM NaCl과 50μM ZnCl가 포함된 10mM트리스 완충용액(pH8.0)으로 이미 평형화시킨 세파크릴(sephacryl) S-200(100 x 78) 컬럼에서 겔 여과 크로마토그라피를 수행하였으며 그 결과를 제 1도에 나타내었다.

겔 여과 크로마토그라피의 분획중 아미노펩티다제 활성을 나타내는 분획들만을 모아 아미콘 농축기 (Amicon, stirred cell YM10 membrane, MWCO 10,000Da)로 50mM NaCl과 50μM ZnCl가 포함된 10mM트리스 완충용액(pH8.0)에 대하여 한외여과를 수행하였다. 단백질 용액 40ml를 50mM NaCl과 50μM ZnCl가 포함된 10mM 트리스 완충용액(pH8.0)으로 이미 평형화시킨 DEAE-세파로즈 고속(DEAE-Sepharose Fast Flow) 수지(5 x 17) 에 흡착시키고 동일 완충 용액으로 세척하였다. 100mM에서 300mM NaCl의 선형 농도 구배를 이용하여 단백질을 용출시키고 그 결과를 제2도에 나타내었다. 상기 크로마토그라피에 의해 수득된 분확중 아미노펩티다제 활성을 나타내는 분획들만을 모아 아미콘 농축기(Amicon stirred cell YM10 membrane, MVCO 10,000Da)로 50mM NaCl과 500μM ZnCl가 포함된 10mM트리스완충용액(pH8.0) 에 대하여 한외 여과를 수행하고 65℃에서 2시간 동안 열처리한후 0.22μM의 여과막을 통과시킨후 -20℃에서 보관하였다.

한편, 상기 S-200 겔 여과 크로마토그래피한 아미노펩티다제와 DEAE-세파로즈 음이온 크로마토그라피한 아미노펩티다제를 전기 영동하여 순도를 비교하고 그 결과를 제 3도에 나타내었다. 제 3도에서 제1열은 단벡질 표준 분자량 (미국 바이오-래드(Bio-Red)사에서 구입)을 나타낸 것으로, 위에서부터 66.2Kd, 42.7Kd, 31Kd, 21.5Kd, 14.4Kd을 나타내며, 제2열은 S-200 겔 여과 크로마토그라피 후의 아미노펩티다제를 나타낸 것이고; 제3열은 DEAE -음이온 크로마토그라피 후의 아미노펩티다제를 나타낸 것이다.

적용예

아미노펩티다제에 의한 재조합 인간 성장호르몬의 처리

실시예 2의 방법으로 정제된 아미노펩티다제와 프레스코드와 윌키스의 방법에 기초하여 정제한 아미노펩티다제를 65℃에서 2시간 동안 각각 가열하였다. 정제된 재조합 메티오닌 인간 성장호르몬에 대하여 상기 실시예 2에서 얻은 아미노펩티다제를 각각 1/500(w/w)로 혼합하고, 반응액에 1mM로 PMSF(phenylmethyl sulfonyl fluoride)를 부가한 후 35℃에서 약 15분간 방치하였다.

반응액 각각을 세파크릴 S-200 컬럼에서 겔 여과 크로마토그라피를 수행한 후 DEAE-세파로즈 상에서 음이온 교환 크로마토그라피를 수행하여 인간 성장호르몬만을 수득하고 이를 SDS-PAGE(sodium dodesyl sulfate polycryamide gel electrophoresis)하여 순도를 비교하였으며 그 결과를 제4도와 제5도에 나타내었다. 제4도에서 가는 재조합 인간 성장호를몬을 나타내고,나와 다는 아미노펩티다제 용액내에 존재하는 엔도프로테아제에 의해 재조합 인간 성장호르몬이 절단된 것을 보여준다.

심상분할법을 이용하여 정제한 아미노펩티다제를 재조합 메티오닌 인간 성장호르몬에 처리한후 N-말단아미노산을 확인하였더니 페닐알라닌 이었으며 메티오닌 등의 다른 아미노산은 검출되지 않음을 확인함으로써 아미노펩티다제의 유용성이 입증되었다.

Claims (5)

1. 비브리오 프로티오리티커스의 발효 배양액을 원심분리하여 상등액을 농축하고, 농축액의 pH를 조절한 후 황산 암모늄과 삼차 부탄올을 가하여 삼상분할시키는 단계를 포함하는, 아미노펩티다제의 정제방법.
2. 제1항에 있어서, (가)삼상분할 후 분리된 아미노펩티다제 응결체를 완충용액에 용해한 후 한외여과시키고; (나) 열처리 및 원심분리하고; (다) 겔 여과 크로마토그라피하며; (라) 음이온 교환 크로마토그라피함을 추가적으로 수행함을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 용액의 pH를 5내지 6으로 조절함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 황산 암모늄의 최종 농도가 40내지 70% 범위임을 특징으로 하는 방법.
5. 제2항에 있어서, (가)단계의 한외여과는 약 10kd M,W의 절단점 갖는 여과막을 사용하여 수행함을 특징으로 하는 방법.