JPS63283579A - 新規な加水分解酵素とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般的に酵素、特にプソイドモナスプチダ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）　ＡＴＣＣ５３
５５２から分離可能であって酵素的にほぼ純粋なペプチ
ドとして精製可能な新規な加水分解酵素とクローニング
による該加水分解酵素の製造方法に関するものである。

（従来の技術） プソイドモナスは短稈状細菌の一属である。Ｐ。

プチダを含む数種の株はモノオレイン酸ポリオキシエチ
レン（Ａｔｌａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌより入手可能なｒ
Ｔｖｅｅｎ　８０Ｊ　）を炭素源とする最少培地上では
限られた増殖能力を有することが明らかになっている（
Ｈｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｇｅｎ　Ｍ！ｃｒｏｂ１
ｏ１．．９２（１）、ｐｐ、２３４−２８５（１９７Ｂ
））。プソイドモナス属に属する株について様々な使用
法が記載されている。

１９８３年５月２４日発行の米国特許第４．３８５，１
１２号（発明者Ｍｉｓａｋｉ　ｅｔ　ａｔ　）は日本の
たまねぎ畑に由来する土壌サンプルから分離されたプソ
イドモナス属に属する微生物株を様々なヌクレオシドに
関係する酵素反応に有用なヌクレオシドオキシダーゼの
製造に用いることを開示している。１９８４年２月７日
発行の米国特許第４，４３０．４３３号（発明者Ｈａａ
＋ｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ）はプソイドモナスプチダ株を
分子量が約４８．ＯＱＯ〜ｅｏ、ｏｏｏの間にあるアリ
ルアシルアミダーゼ酵素（アニリドからアニリンと脂肪
酸アニオンへの加水分解を触媒するもの）の製造に用い
ることを開示している。これらのアリルアシルアミダー
ゼはＮアシル化された第一級芳香族アミンの分析方法に
有用であるといわれている。

１９８５年９月１７日発行の米国特許第４．５４２．１
００号（発明者Ｈａｇｅｄｏｒｎ　）はプソイドモナス
プチダ株に関連したＰ−クレゾールの製造方法を開示し
ている。１９８６年５月１３日発行の米国特許第４．５
８８．８８８号（発明者Ｍａｘｖｅｌ　ｌ）はプソイド
モナスプチダ株を含んだバイオコンバージョン（ｂｉｏ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）培地中におけるムコン酸の製造
方法を開示している。リンデン（Ｌｉｎｄｅｎ）とベニ
セック（Ｂｅｎ１ｓｅｋ）はプソイドモナスプチダバイ
オタイプＢに由来するイソメラーゼを記載している（Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｔ２８１、Ｎｏ、１４．ｐｐ、８４
５４−６５６０．１９８８年５月１５日）。

要するに、様々な応用のために様々な酵素を生産するプ
ソイドモナスプチダの新規な株が最近発見されている。

（発明の構成） 本発明は加水分解酵素活性を有す新規な酵素を提供する
。この加水分解酵素はプソイドモナスプチダＡＴＣＣ５
３５５２によって分泌されるものであり、酵素的にほぼ
純粋なペプチドとして分離可能である。また、本発明の
製造方法によれば、この新規な加水分解酵素を発現する
遺伝子を適当な発現ベクター中にクローニングし、この
加水分解酵素のための遺伝子を発現するように培養する
ことによって加水分解酵素が高い収量で得られる。本発
明の酵素は以下のアミノ酸配列： ａｌａ　　ｖａｌ　　ａｌａ　　ａｓｎ　　ｐｈｅ　　
ａｓｐ　　ａｒｇ　　ｓｅｒ　　ｇｌｙ　　ｐｒｏ　　
ｔｙｒ　　ｔｈｒｔｈｒ　　ｓｅｒ　　ｓｅｒ　　ｇｌ
ｎ　　ｓｅｒ　　ｇｌｕ　　ｇｌｙｐｒｏ　　Ｓｅｒ　
　ｅｙｓ　　ａｒｇ　　ｌｉｅｇｌｙｐｒｏ　　ｓｅｒ
　　ｔｈｒ　　ｔｙｒ　　ａｌａ　　ｇｌｙ　　Ｉｅｕ
　　ｌｅｕ　　ｓｅｒ　　ｈｉｓ　　ｔｒｐａｌａ　　
ｓｅｒ　　ｈｉｓ　　ｇｌｙ　　ｐｈｅ　ｖａｔ　　ｖ
ａｔ　　ａｌａ　　ａｌａ　　ａｌａ　ｇｌｕ　　ｔｈ
ｒｓｅｒ　　ａｓｎ　　ａｌａ　　ｇｌｙ　　ｔｈｒ　
　ｇｌｙ　　ａｒｇ　　ｇｌｕ　　ｍｅｔ　　ｌｅｕ　
　ａｌａ　　ｃｙｓｇｌｙ　　ｔｈｒ　　ｓｅｒ　　ｇ
ｌｙ　　ｈｉｓ　　ｓｅｒ　　ｇｌｎ　　ｇｌｙ　　ｇ
ｌｙ　　ｇｌｙ　　ｇｌｙ　　ｓｅｒ１１ｅ　　ｌ１ｌ
ｅｔ　　ａｌａ　　ｇｌｙ　　ｇｉｎ　　ａｓｐ　　ｔ
ｈｒ　　ａｒｇ　　ｖａｌ　　ａｒｇ　　ｔｈｒ　　ｔ
ｈｒａｌａ　　ｐｒｏ　　ｌｉｅ　　ｇｉｎ　　ｐｒｏ
　　ｔｙｒ　　ｔｈｒ　　ｌｅｕ　　ｇｌｙ　　ｌｅｕ
　　ｇｌｙ　　ｈｉｓａｌａ　　ｇｉｎ　　ｃｙｓ　　
ｓｅｒ　　ｌｅｕ　　ｃｙｓ　　ｔｈｒ　　ｓｅｒ　　
ｌｅｕ　　ｌｅｕ　　ｔｒｐｊｌｉｅｒ　　ｖａｌ　　
ｇｌｙａｒｇ　　ａｒｇ　　ｇｌｙ　　Ｉｅｕを有して
いる。

この新規な加水分解酵素は細胞物質（クチン等）の分解
のためのバイオマス加工および洗濯や漂白のための酵素
的過加水分解等、様々な応用において有用である。

本発明の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲等に
おいて本発明が適正に理解かつ解釈されるようにするた
め、本明細書中に用いられる用語の意味を以下に定義す
る。

「過加水分解（ｐｅｒｈｙｄｒｏｓｉｓ）　Ｊとは過酸
と水とが形成される。選択された基質と過酸化物との反
応を意味する。

「酵素的過加水分解（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｐｅｒｈｙ
ｄｒｏｌｙｓｉｓ）」とは一般に加水分解酵素として分
類され、より詳細には以下のように同定される酵素によ
って助長もしくは触媒される過加水分解反応を意味する
。

新規な酵素（以下「加水分解酵素１」と称することもあ
る）はプソイドモナスプチダによって分泌され、それか
ら分離可能なものである。加水分解酵素１を分離するこ
とのできる新規なプソイドモナスプチダ株の培養物はＭ
ＦＥＰ　８０８．１（Ｐ）に従ってアメリカンタイプカ
ルチャーコレクション（Ａｗｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　
ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ　２０８５２）の永久培養物コレクショ
ンに寄託され、ＡＴＣＣ５３５５２と命名された。

本発明の微生物は上述のプソイドモナスプチダ株に限定
されるものではなく、その天然および人口突然変異体も
使用できる。プソイドモナスプチダＡＴＣ０５８５２２
の突然変異体は環境的選択圧技術、Ｕ■照射、もしくは
突然変異誘発化学物質の使用によって得ることができる
。後述するように現存株の対応する遺伝子の他の細胞へ
の形質転換等、加水分解酵素の生産に応用可能な遺伝子
工学技術は加水分解酵素の商業的生産に好ましく応用で
きる。

しかしながら、プソイドモナスプチダ株は通常の培地中
で培養してもよい。また液体培地も固体培地も用いるこ
とができる。液内通気培養が好ましい。通常の栄養培地
を使用することもできる。

培養温度は微生物の所望の増殖速度に依存して変化し、
好ましくは２５＠〜３５℃である。培養時間は所望に応
じて選択でき、１５〜５０時間である。培養は培地中に
最高濃度の加水分解酵素が存在した時点で終了させるこ
とができる。

加水分解酵素は発酵ブイヨン中に蓄積される。

生産された酵素のブイヨンからの抽出は以下のようにし
て行なうことができる。最初にマイクロ濾過および遠心
分離によって全細胞ブイヨン培地から細胞および細胞破
片を除去し、次いで限外濾過によって加水分解酵素を濃
縮する。次いで透析もしくは透析濾過によって余分な塩
および色を除去する。

次いで、この粗酵素溶液は精製することができる。酵素
の粉末は凍結乾燥によって得ることができ、様々な応用
が可能である。

加水分解酵素１は以下のアミノ酸配列：ｔｈｒ　　ｓｅ
ｒ　　ｓｅｒ　　ｇｌｎ　　ｓｅｒ　　ｇｌｕ　　ｇｌ
ｙ　　ｐｒｏ　　ｓｅｒ　　ｃｙｓ　　ａｒｇ　　１ｉ
ｅａｌａ　　ｓｅｒ　　ｈｉｓ　　ｇｌｙ　　ｐｈｅ　
　ｖａｌ　　ｖａｔ　　ａｌａ　　ａｌａ　　ａｌａ　
　ｇｌｕ　　ｔｈｒＳｅｒ　　ａＳｎ　　ａｌａ　　ｇ
ｌｙ　　ｔｈｒ　　ｇｌｙ　　ａｒｇ　　ｇｌｕ　　ｍ
ｅｔ　　ｌｅｕ　　ａｌａ　　ｃｙｓａｌａ　　ｐｒｏ
　　１１ｅ　　ｇｌｎ　　ｐｒｏ　　ｔｙｒ　　ｔｈｒ
　　ｌｅｕ　ｇｌｙ　　Ｉｅｕ　ｇｌｙ　　ｈｉｓｓｅ
ｒ　　ｈｉｓ　　ｐｈｅ　　ｇｌｕ　　ｐｒｏ　　ｖａ
ｌ　　ｇｌｙ　　ｓｅｒ　　ｇｌｙ　　ｇｌｙ　　ａｌ
ａ　　ｔｙｒｓｅｒ　　ｖａｌ　　ｇｌｙ　　ａｒｇ　
　ａｒｇ　　ｇｌｙｌｅｕを有している。

加水分解酵素は例えば、プラスミドＤＮＡをマルチコピ
ー宿主に移すこと、あるいは加水分解酵素生産細菌の細
胞から加水分解酵素をコードする染色体遺伝子を切除し
た後に該遺伝子を適当なベクター分子中にクローニング
すること等の遺伝子操作技術によって好ましく生産され
る。加水分解酵素１を生産するための好ましい手段の１
つはクローニングである。

実施例９において詳述されるように、第１図はｐｓＮＥ
４の４．３　ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントのマツプで
ある。斜線状の陰影を施したボックスはシグナルペプチ
ドコドン（コドン−２２〜＋１）を示し、点描領域は成
熟加水分解酵素１ポリペプチドコドン＋１〜＋２５８の
ためのコード領域を示している。

予想されるジスルフィド結合も示されている。スケール
はベースペア（ｂｐ）である。配列化された領域（１３
６３ｂｐのｓｐｈ　１フラグメント）は両矢印で示して
いる。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終結コドンも示さ
れている。

加水分解酵素１は優れた加水分解活性を有しており、過
酸化物源の存在下において適当な基質（例えばトリオク
タノインのようなトリグリセリド）から過酸を生産する
ために用いることができる。一般に酵素の活性を阻害す
るアニオン性表面活性剤の存在下においてもこの加水分
解酵素は過酸を生産することができる。漂白等に応用さ
れろ過酸を生産するためのこの新規な加水分解酵素の使
用は米国特許出願節　　　　　号に記載されている。

Ｐ、プチダ株の発酵によって生産された場合、加水分解
酵素１は、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィ
ー等の公知の手段によって他の蛋白質から分離し精製し
て酵素的にほぼ純粋な加水分解酵素１を産出するように
することが好ましい。

その主たる理由は、Ｐ、プチダの粗発酵ブイヨンが加水
分解酵素１に加えて他の酵素（以下「加水分解酵素２」
）を含むことが発見されたことにある。

加水分解酵素１と加水分解酵素２とはクロマトグラフィ
ーのような公知の手段によって分離することができる。

これらはｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−，１
−トロフェニルカブリレートに対する異なった加水分解
速度によって区別することができる。

加水分解酵素１は当業者に既知の方法による、細菌、酵
母もしくは菌類のような宿主生物を通してこの酵素を発
現するためのクローニングによって製造することが好ま
しい。特に、以下詳述するように大腸菌中においてクロ
ーニングを行ない、次いでクローン化された加水分解酵
素１をカラムクロマトグラフィーにかけることによって
生産することが好ましい。本発明によるクローニングに
よる生産は驚異的な高収率を提供する。すなわち、実施
例９に記載されるように、プラスミドｐＳＮｔａｅ■を
取り込んだ大腸菌株ＪＭ　１０１の発酵ブイヨンから回
収可能な収率は最高では約５．５９／Ｑ、、平均では約
３．４９／９Ｊであると認められた。これらの収率は、
大腸菌発酵からの従来のペプチド回収量が約０．２〜０
．３９／９．のオーダーであることに鑑みれば、驚異的
に高い。すなわち、本発明の方法によれば、一般に予想
されるよりも約１０倍も高い収率で新規な加水分解酵素
を得ることができる。

加水分解酵素２も新規なものであり、グリセリド基質を
加水分解するものであって、消化を助けるための油脂加
工等に応用することができる。

以下の実施例の方法、材料および結果は本発明を説明す
る目的で記載されるものである。しかしながら、本発明
の範囲内における他の態様、利点および変更も本発明が
対象とする当業者には明らかであろう。

（実　施　例） 実施例１ （Ａ）播種および発酵 ０．６％の栄養ブイヨン（Ｄｉｒｃｏ）および１％のグ
ルコース（ＰＨ８，５）を用いて播種培地を調製した。

この培地１００　ｍを５００１ｄのフエルンバッハフラ
スコ中で滅菌した。滅菌した各フラスコに栄養寒天で一
晩増殖させたＰ、プチダＡＴＣＣ５３５５２の培養物を
白金耳１杯分播種し、３７℃において１２時間、２５０
ｒｐｍの二二一ブランズウィック（Ｎｅｗｂｒｕｎｓｗ
ｌｃｋ）シェーカー上に載置した。ついで、このインキ
ュベートした１２時間培養物を適当な容量（１〜１０％
ｖ／ｖ　）で温度制御器およびＲＰＭ　、空気流および
圧力の制御器を備えた１ｚ発酵器（実用容量２５０　ｍ
）、１５９Ｊバイオラフイツト（Ｂｌｏｌａｆｉｔｔｅ
）発酵器（実用容ｆｆ１１２ＱＪ）もしくは１００　ｉ
バイオラフイツト発酵器中に播種した。発酵器培地は０
．６％の栄養ブイヨン（Ｄｉｒｃｏ）　、０．３％のり
んごクチンおよび０．２％の酵母抽出物（Ｄｉｒｃｏ）
を含み、初期ＰＨは６．５であった。この培地は播種前
にｐＨｅ、ａに調節して４０分間滅菌した。細菌増殖お
よび酵素生産は発酵器中において１２〜１５時間継続さ
せた。

（Ｂ）マイクロ濾過による酵素の回収 粗発酵培養物は最初に２枚のロミコン（Ｒｏｗ　ｉ　ｃ
。

ｎ）微孔膜（０，２２ｕ）を備えたアミコン（ＡＩｌｉ
ｃｏｎ）ユニットで濾過して細胞を除去した。クチン粒
子に結合した残存物中の残留酵素を遠心分離によって除
去した。総回収率は９０％に達した。

アミコンユニットから回収した濾液は２つのロミコンＰ
ａ＋１０モジュールを備えたアミコン限外濾過ユニット
で容量３９Ｊに濃縮した。次いで、この濃縮した濾液を
ｐＨ７，５の０．０１Ｍリン酸バッファー２０免によっ
て透析した塩および色を除去した。この段階における回
収率は平均的８０％であった。この粗調整物の総括性は
８．６８　Ｘ　１０６ユニツトであった。

加水分解酵素活性の１ユニツトは０．１ｖｔ％のトリト
ン（Ｔｒｌｔｏｎ）　Ｘ−１００を含有する０、Ｉ　Ｍ
、　ｐＨ８，０のトリス（Ｔｒｉｓ）　−ＨＣ、Ｑ、バ
ッファー中の２．０ｉＭ　１）−二トロフェニルブチレ
ートと共に２５℃でインキュベートした際に４１５ｎｍ
において１．０／分の吸収増加をもたらす酵素量と定義
される。

実施例２ 限外濾過および透析濾過後の加水分解酵素活性反応条件
を２５℃、ｐＨ８，０の０．ｌｖｔ％のトリトンｘ　−
ｉｏｏを含有する０、１Ｍ）リスとし、実施例１（Ｃ）
の粗調製物における３つのｐ−ニトロフェニル基質の結
合および転換反応速度を研究した。用いた基質はｐ−ニ
トロフェニルカブリレート、ｐ−二トロフェニルラウレ
ート、およびｐ−ニトロフェニルパルミテートであった
。データを表１１；示す。

表　　　１ 基　質　Ｋ　ｍ　（ＵＮ）　　Ｖ　ｌ１ａｘ　（Ｕモル
／分／ｌｌｌ５Ｉ蛋白質）ＰＮＰＣ２１４８０２ ＰＮＰＬ　１６７　　２１４ ＰＮＰＰ　１８３　　１１２ 様々な実験に実施例１（Ｃ）の調製物を用いたが、この
調製物には「加水分解酵素１」および「加水分解酵素２
」と称される２つの酵素が含まれていた。加水分解酵素
１はより優れた過加水分解酵素である。実施例１（Ｃ）
の粗調製物の分離・精製は実施例３に記載され、加水分
解酵素１および加水分解酵素２の完全な分離（酵素的に
ほぼ純粋な加水分解酵素１を得ることが好ましい）は実
施例４に記載され、極めて純粋な（配列化に適した分析
上純粋な）加水分解酵素１調製物のサンプルは実施例５
に記載される。

実施例３ イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーに的精製 最初にＤＥＡＥセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）ク
ロマトグラフィーにより、次いでセファデックス（Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１００ゲル浸透クロマトグラフイ
ーによってプソイドモナスプチダ発酵ブイヨンから加水
分解酵素１を部分的に精製した。ＤＥＡＥカラムをｐＨ
８の１０１１１Ｍリン酸ナトリウムバッファーで平衡さ
せ、同じバッファー中のカラムに粗蛋白質を供給した。

カラムに保持されなかったＰＮＢ　　Ｃｐ−ニトロフェ
ニルブチレート）加水分解酵素活性を加水分解酵素１に
関連づけた。ＤＥＡＥ段階からこのようにして得た加水
分解酵素１に対し、ｐＨ８の１０ｍＭリン酸ナトリウム
バッファー中においてセファデックスＧ−１００による
クロマトグラフィーを行なった。加水分解酵素１はこの
カラムから分離したピークとして溶離し、ＰＮＢ加水分
解酵素活性および過加水分解活性によって同定した。

実施例４ 疎水性クロマトグラフィーによる加水分解酵素１疎水性
樹脂を用いたクロマトグラフィーによって加水分解酵素
１は加水分解酵素２から完全に分離することができる。

限外濾過および透析濾過の後、実施例１（ｃ）の酵素溶
液は０．５ＭＮａ　Ｃ９，に調整し、１０ｏ＋Ｍ、　ｐ
Ｈ８のトリス（ＣＺ）　、　０．５ＭＮａ　Ｃ免中にお
いて平衡させた０、８Ｘ７ｃＩ１１オクチルセフアロー
スカラムに供給し、未結合の蛋白質を除去するために洗
浄した。以下の洗浄液：　１０１Ｍ、　ｐＨ８のトリス
（Ｃ込）、２Ｍの尿素；Ｐ）１８，１０１１Ｍのリン酸
Ｎａ　　；ｐＨ８，１Ｏｉ＋Ｈのリン酸、　　０．５Ｍ
のＮａＣ，Ｑ。

を用いた。洗浄後、カラムを５０％ｎ−プロパツールに
至るリニアグランジエントによって展開した。

次いで酵素活性を明らかにするためにｐ−ニトロフェニ
ルブチレート（ＰＮＢ）およびｐ−ニトロフェニルカブ
リレート（ＰＮＣ）に対する活性に関してカラムフラク
ションを検定した。２つの酵素は明確に、ＰＮＢ　／Ｐ
ＮＣ比が４．６であるフラクション３２とＰＮＢ　／Ｐ
ＮＣ比が１．４０であるフラクション５１に分離した。

これらはそれぞれ加水分解酵素１および加水分解酵素２
と命名された。

このカラムに由来するフラクションはさらにＳＤＳゲル
電気泳動によって分析した◎この分析により、２つの酵
素活性は原核生物酵素に特異的な分子ｆｆ１３０，００
０のバンドによって探知され、さらに加水分解酵素２は
二重に泳動した加水分解酵素１の単一バンドからは明確
に分離されることが明らかになった。配列分析に先立っ
て、逆相クロマトグラフィーによって、これら２つの部
分的に精製された酵素を高分子量および低分子量の夾雑
物から分離した。

実施例５ 配列分析に先立って、部分的に精製された実施例３の物
質を４．８　Ｘ１００　ｔｔｍのジンクロムバック（Ｓ
ｙｎｃｈｒｏｍＰａｋ）　Ｃ４逆相ＨＰＬＣカラムのク
ロマトグラフィーによってさらに精製した。このシステ
ムは流速０．５１１１１／分の０．０５％トリエチルア
ミン（ＴＥＡ）および０．０５％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＰＡ）　（溶媒Ａ）中において平衡させた。１００μｇ
〜ｌ＃ｖの加水分解酵素１をカラムに注入し、蛋白質は
溶媒Ａおよび０．０５％のＴＥＡおよび０．０５％のＴ
ＦＡを含有するｎ−プロパノール（溶媒Ｂ）の複合グラ
ジェントによって溶離された。典型的なグラジェントは
０〜２０％Ｂに対しては＋５％Ｂ／分、次いで６０％Ｂ
までは＋０．５％Ｂ／分であった。全ての酵素はこのＨ
ＰＬＣ溶媒システムによって不活性化された。約３５％
の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピーク（加水分解酵素１）
および約３９％の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピーク（加
水分解酵素２）を回収してさらに配列分析およびＣＮＢ
ｒフラグメントの調製のために用いた。

実施例６ 以下のようにしてアミノ酸配列分析用の臭化シアンペプ
チドフラグメントを調製参精製した。プールした実施例
５の加水分解酵素のアリコート量をスピードヴアック（
ＳｐｅｅｄＶａｃ）遠心分離機中において乾燥し、次い
で８Ｍの尿素を含む８８％の蟻酸中に１０ｍ９／ｃｄの
濃度で再懸濁させた。この溶液は蟻酸中において２００
　ｍ’ｊ／ｒｔｔｌのＣＮＢｒ　１容量部と混合し、暗
所において室温で２時間インキュベートした。次いで、
生成物は逆相分析に先立って、０．８×７ｃｍのＩＢＦ
　−トリスアクリルＧＦＯ５Ｃ祖）カラムによって４０
％の溶媒Ｂ：５０％の溶媒Ａ（上述）に脱塩した。ペプ
チドは最初に逆相による加水分解酵素１の精製のために
上記と同様の手順によって分離した。しかしながら、溶
媒Ｂは３５％のプロパノール二６５％のアセトニトリル
（ＴＥＡ　＃−よびＴＦＡを含有）に変えた。また、ク
ロマトグラフィー後の最初のダイジェストおよびピーク
をＳＤＳ　／尿素／ピリジンゲルおよびそれに続く銀染
色法によって分析した。

２つのピークをクロマトグラムから選択し、上述の条件
を用い、今回は０．４８Ｘ２５ｃｉのジンクロムパック
０４カラムにより、再びクロマトグラフィーにかけた。

再クロマトグラフィー後、精製したペプチドは配列分析
用に保持した。

実施例７ ラグメント （実施例４と同様の）オクチルセファロースカラムに由
来する加水分解酵素１および加水分解酵素２に由来する
精製フラクションを３容量部の溶媒Ａ　（０，０５％の
トリエチルアミンおよび０．０５％のトリフルオロ酢酸
）で希釈し、（実施例５と同様に）クロマトグラフィー
にかけた。実施例４に記載したように、精製した蛋白質
はＳＤＳゲル電気泳動によって分析し、次いで加水分解
酵素１および加水分解酵素２のＣＮＢｒフラグメントお
よびＮ末端アミノ酸配列を比較するために個別にプール
した。

実施例８ 加水分解酵素１の比活性 実施例４と同様に精製した酵素を用いて加水分解酵素１
の比活性を測定した。酵素的にほぼ純粋な加水分解酵素
１の有する実施例１（ｃ）で定義されたような比活性は
３７５０ユニット／Ｉｔｇ蛋白質であった。

実施例９ 大腸菌中におけるクローン化した加水分解酵素１の調製 プソイドモナスプチダの加水分解酵素１遺伝子のクロー
ニング プソイドモナスプチダ株（ＡＴＣＣ５３５５２）を２０
０ｄのＬＢ　（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）培地中で３７
℃において一晩増殖させた。細胞は遠心分離によって採
取し、バーンボイム等（Ｂｉｒｎｂｏｉｓ　ｅｔ　ａｌ
、、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、７．ｐｉ）、
１５１３−１５２３（１９７９））によって概説された
標準的な方法に忠実に従って高分子量総ＤＮＡを調製し
た。このＤＮＡはＥｃｏＲＩに完全に消化させ、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼによって連結させることにより、ＥｃｏＲ
Ｉに消化させ、細菌のアルカリホスファターゼによって
脱リン酸化されたプラスミドｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３
７０１７）を調製した。ＤＮＡの操作に用いた全ての酵
素は製造物（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌａｂｓ
もしくはＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｌｅｓ）の指示に従って用いた。連結した
ＤＮＡは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４５）を形質転
換するために使用し、アンピシリン耐性（Ａｉｐｒ）コ
ロニーを選択した。このようにして、約２Ｘ１０’個（
約５Ｘ１０３個／プレート）の形質転換体を得た。プレ
ートには４−メチルウンベリフェリルブチレート（ｐＨ
８，０）５ｈＭト！ｊ　スーＨＣｚ中においてｌｏｓＭ
）の溶液を満たし、次いで紫外線ランプ（波長３４００
厘）を照射した。基質を加水分解して高度蛍光原化合物
４−メチルウンベリフェロンを遊離するコロニーは強い
青色を呈した。

この方法を用いて１３個の陽性コロニーを得た。これら
陽性コロニーの各々から前述のバーンボイム記載のアル
カリ溶菌法によってプラスミド微小調製物を調製した。

各プラスミドはＥｃｏＲＩに消化させ、得られたフラグ
メントはマニアチス等（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ
）、　　ｒ分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｏｌ
ｅｃｕ　ｆａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ；Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）Ｊ、コールドスプリングハーバ
−ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ）　（１９８２）の記載に従ってポリア
クリルアミドゲルミ気泳動によって分離した。殆どのプ
ラスミドは４．３ｋｂの単一の挿入されたフラグメント
を含んでいた。他のものはこのフラグメントに加えて他
のフラグメントを含んでいた。この結果、全ての陽性コ
ロニーは４Ｊｋｂフラグメント上に含まれる共通のクロ
ーン化された遺伝子の発現の結果として発生することが
示唆された。４．３ｋｂフラグメントのみを含むプラス
ミドの１つをｐＳＮＥ４と命名し、詳細な分析のために
選択した。

６ｂｐの認識配列を有する様々な制限酵素にプラスミド
ｐｓＮＥ４を消化させた。これらの酵素は単独もしくは
対で使用した。これらの実験から得られたフラグメント
サイズの分析によってｐｓＮＥ４の４゜３ｋｂ　Ｅｃｏ
ＲＩ挿入部の予備制限エンドヌクレアーゼ切断地図を得
た。この地図を第１図に示す。

プラスミドｐＳＮＥ４のＥｃｏＲＩ挿入部の少なくとも
８４０ｂｐの数個のサブフラグメントを、その中に機能
遺伝子が含まれているかを調べるために、ｐＢＲ３２２
中にサブクローン化した。機能加水分解酵素遺伝子を含
むと認められたプラスミドの中には、ｐＳＮＥ４のＥｃ
ｏＲＩ挿入部由来の２Ｊｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／　５ａｌ
Ｉフラグメントを含有するｐｓＮＥｓｌがあった。（こ
のフラグメントの位置については第１図参照。）ｐｓＮ
Ｅｓｌの挿入されたフラグメントはさらに他の制限酵素
に消化させ、得られた小フラグメントをサンガー等（Ｓ
ａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．１）Ｉ）、５４８３−５
４６７（１９７７））のジデオキシチェーンターミネー
ション法による配列化のためにロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔ
ｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１２．増
補ｒ８７−ｒ２０４（１９ｇ４乃記載のバクテリオファ
ージＭ１３ベクター中にサブクローン化した。Ｓｐｈ　
１位間の１゜３６ｋｂのＤＮＡ配列（第１図参照）は、
予想される全ての読み取り枠中において翻訳された際に
、直接アミノ酸配列化によって決定されるような蛋白質
のＮＨ２末端アミノ酸残基（残基１〜１Ｂ）を含んだ大
きなオープン読み取り枠を顕在化させた。また、このオ
ープン読み取り枠は２つの他の直接配列化されたペプチ
ド（残基９４〜１０５および残基１７３〜１９０）のた
めのコードを含んでいる。−２２位のメチオニンは、記
号ペプチドに典型的な高度疎水性領域のためのコードを
開始するものであるため、開始コドンであると推測され
ている。この信号ペプチドは一１位のアラニンの後の分
泌工程の間におそらく切断されるものと考えられる。オ
ープン読み取り枠は２５９位で終ることから、エンコー
ドされた成熟蛋白質は２５８個の残基を有することが示
唆される。

大腸菌中におけるＰ、プチダ加水分解酵素遺伝子の調節
された発現を達成するために、バクテリオファージＭｌ
Ｂ中においてアデルマン等（Ａｄｅｌｍａｎｅｔ　ａｌ
、、ＤＮＡ　２．ｐｐ、１８３−１９３（１９８３））
の特定部位の突然変異誘発により、Ｘｂａ　１位を最初
にＡＴＧ開始コドンの前に導入し、修飾した遺伝子は次
いでデボーア等（ｄｅ　Ｂｏｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ　８０、ｐ、２１２
５（１９８３））の強力なｔａｃ　ＩＩプロモーターを
含む発現ベクター中にクローン化した。これは最初にｐ
ｓＮＥｓｌをｓｐｈ　１に消化させることによって行な
った。

全ての加水分解酵素コーディング配列を含んだ２．４ｋ
ｂのｓｐｈ　Ｉフラグメントを分離し、Ｍ　１３ｍｐ１
９の複製型（ＲＦ）のＳｐｈ　１位に連結し、混合物は
大腸菌ＪＭ　１ｏｔ（ＡＴＣＣ３３８７Ｂ）をトランス
フェクトするために用いた。透明プラークを採取し、ｓ
ｐｈ　Ｉフラグメントが時計回りに配向して存在するバ
クテリオファージ（テンプレート）ＤＮＡを調製した。

加水分解酵素Ｉ　ＡＴＣ開始コドン５′に隣接するｘｂ
ａ、１位を含んだ、５０個のヌクレオチドからなる部分
的に補完性の一重鎖ＤＮＡフラグメントを合成した。こ
れは、−２７ヌクレオチド位（ＡＴＧ開始コドンの前）
から−９位まで、および＋１位（ＡＴＧのＡ）から＋２
０位までテンプレートＤＮＡを補完する。

しかしながら、−９位と＋１位の間においては天然加水
分解酵素プロモーター領域の５’　−ＡＡＣＣＴＣＧ−
３′はｔａｃ　Ｕプロモーターの５’　−ＴＡＴＣＴＡ
ＧＡＡＴＴ−３’　に変化させねばならなかった。突然
変異誘発が行なわれた。

変化領域に及ぶ３２ｐでラベルした合成オリゴヌクレオ
チド（５’　−ＡＴＧＡＧＧＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡ
Ｇ　−３’　）とのハイブリダイゼーションによって、
３００個のプラークをスクリーニングした。陽性ハイブ
リダイジングクローンのＲＦを調製し、Ｘｂａ　Ｉおよ
び５ｐｈｌで切断した。遺伝子を含んだｌｋｂのＸｂａ
ｌ／ｓｐｈ　Ｉフラグメントを分離し、前述のデボーア
記載のｐＨＧＨ９０７ｔａｃ　ＩＩをＸｂａ　Ｉおよび
ｓｐｈ　Ｉに消化させてｔａｃ　ｎプロモーターを含ん
だ４．３ｋｂのＸｂａ１／５ｐｈＩフラグメントおよび
アンピシリン耐性遺伝子を分離することによって得たー
ベクター中に連結した。次いでＪＭ　１０１細胞をこの
連結混合物で形質転換した。アンピシリン耐性コロニー
（プラスミドｐｓＮｔａｃＩＩを含む、第２図参照）を
選択した。

大腸菌によって合成されるクローン化された加水分解酵
素１のレベルを測定するため、１１Ｍのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を付加した２０
ａｔｅのＬＢ培地中で３７℃において１０時間ＪＭ　１
０１／　ｐｓＮｔａｃＩ［を増殖させた。陰性の対照と
しては２９４　／ｐＢＲ３２２を用いた。細胞は遠心分
離によって培養上澄液から分離し、次いで上述のコツシ
ュランド（Ｋｏｓｈｌａｎｄ）によるペリプラズム成分
および膜／細胞質成分に分別した。各フラクションはｐ
−ニトロフェニルブチレート加水分解によって活性を試
験した。またグレイ等（Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．ＵＳＡ　８１．ｐ
ｐ、２８４５−２６４９（１９８４））により、細胞分
別法の効果を確認するためにβ−ラクターゼ（ペリプラ
ズマのマーカー）およびβ−ガラクトサーゼ（細胞質の
マーカー）をｉＵＪ定した。

加水分解酵素１の活性の殆ど（７４％）が培養上澄液中
に存在していた。細胞に関連づけられた酵素の殆どは細
胞洗浄フラクション中に存在しく合計１７％）、ペリプ
ラズムフラクション（２％）および細胞質／膜フラクシ
ョン（７％）中にはより小量存在することが認められた
。陰性の対照である２９４　／ｐＢＲ３２２培養物のい
かなるフラクションにも加水分解酵素１の活性は存在し
なかった。前述の８つの醗酵物（１０！Ｑ、発酵器）中
における加水分解酵素１の収量は１．５９／９！、〜５
．５　ｇ、’９Ｊの間により、平均収量は３．４　ｇ／
９Ｊであった。

プラスミドｐｓＮｔａｃｎを包含した大腸菌ＪＭ　１０
１株の発酵に由来するブイヨンは０．５ＭＮａ　Ｃ９Ｊ
に調節し、プロバノールグラジェーションを省略したこ
とおよび溶離をＰＨ８の１０ｄリン酸Ｎａ　、　０．５
ＭＮａＣ９Ｊ中の２０％アセトニトリルによって達成し
たことを除いてはＰ、プチダの発酵に関しての記載（実
施例４）とほぼ同様にオクチルセファロースによって精
製した。分離した生成物（酵素を発現する遺伝子からク
ローン化したもの）をＳＤＳゲルによって分析したとこ
ろ、元のプソイドモナスプチダ株から分離された加水分
解酵素１生産物と同様に泳動した。

実施例１０ クローン化した加水分解酵素１に由来する臭化シアンフ
ラグメントを以下のようにして調製した。

クローン化した生成物のオクチルセファロース精製に由
来する生成物（実施例９）を、プソイドモナスプチダか
ら分離された加水分解酵素１および加水分解酵素２に関
して記載したように、３容量部の溶媒Ａで希釈し、短い
Ｃ４ＨＰＬＣカラムにより精製した。生成物はＳＯＳゲ
ル上で分析した。

実施例１１ Ｐ、プチダ由来の加水分解酵素１のＣＮＢｒフラグメン
トと大腸菌中のクローン化された加水分解酵素１由来の
ＣＮＢｒフラグメントを比較した。プソイドモナス由来
のＨＰＬＣで精製した加水分解酵素１および２とクロー
ン化した加水分解酵素１をそれぞれ上述した実施例６に
記載されたようにＣＮＢｒによって加水分解した。生成
物はＳＤＳ　／尿素／ピリジン電気泳動により分析した
。その結果、クローン化された蛋白質は明らかに加水分
解酵素１であることが示された。（実施例４〜５のよう
に）Ｐ。

プチダから分離された加水分解酵素１は以下の観点から
、大腸菌より分離したクローン化された加水分解酵素１
と同一であることが明らかとなった。

すなわち（ａ）いずれの生物に由来する加水分解酵素１
も（実施例４のような）同一のクロマトグラフィー法に
よって分離され；（ｂ）いずれの生物から分離された加
水分解酵素１のＮ末端のアミノ酸配列も同一であり；　
（ｃ）ＣＮＢｒフラグメントパターンによれば、加水分
解酵素１および加水分解酵素２は明確に識別でき、Ｐ、
プチダおよび大腸菌のいずれに由来する加水分解酵素１
のＣＮＢｒフラグメントも同一であることが明らかにな
り；（ｄ）両細閑源に由来する加水分解酵素１のｐ−ニ
トロフェニルブチレートとｐ−ニトロフェニルカブリレ
ートとの基質活性比は同一であり；（ｅ）どちらの生物
から分離された加水分解酵素についてもトリカブリリン
を基質とした場合の加水分解酵素／過加水分解比は同一
である。

分離されると加水分解酵素１および加水分解酵素２はｐ
−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−二トロフェニル
カプリレートに対して全く異なった加水分解速度（加水
分解活性）を有することが認められた。したがって、実
施例１２に説明するように、これら２つの新規な酵素は
それらのｐ−ニトロフェニルブチレート／ｐ−ニトロフ
ェニルカブリレート加水分解比によって識別することが
できる。

実施例１２ 反応はｐＨ８の０．１ＭトリスＨＣｌおよび０．１ｗｔ
％のトリトンＸ−１００非イオン性界面活性剤（Ｒｏｈ
ｇ＋＆Ｈａａｓより入手可能）を含有するサンプル中で
２５℃において行なった。（実施例３に由来するような
）加水分解酵素１における２、Ｏｎ＋Ｍのｐ−ニトロフ
ェニルブチレート（ＰＮＢ）の加水分解速度は０゜８０
　（ＯＤ　４１５ｎｍ／分）であるのに対し、２．０ｍ
Ｍのｐ−ニトロフェニルカブリレー）　（ＰＮＣ）のそ
れは０゜０９であり、ＰＮＢ　／ＰＮＣ比は７であった
。これに対し、同一濃度における加水分解酵素２のＰＮ
Ｂ加水分解速度は０．５４、同一濃度におけるＰＮＣ加
水分解速度は０．４４であって、ＰＮＢ　／ＰＮＣ比は
１であった。

実施例１３ 加水分解酵素１を用いたしみ抜きの研究以下のようにク
リスタルバイオレットでじみを付けた綿１００％の布サ
ンプルを用いてオキシダント作用を分析評価した。クリ
スタルバイオレット（０，１２５ＳＦ）を１．２５免の
蒸留水に添加した。１００枚の２インチ×２インチ（約
５１×５α）の綿１００％の無染色布サンプルをこの溶
液に入れ、８時間撹拌した。（クリスタルバイオレット
で染色された）綿布サンプルは染色溶液から取り出し、
流出液が殆ど透明となるまで冷たい水道水で繰り返しす
すいだ。次いでじみの付いた布サンプルは個別にアルミ
フォイル上に配し、ペーパータオルでぬぐい、空気乾燥
した。

加水分解酵素１を使用した製剤を対応する対照組成物と
同様に調製した。両組酸物はそれぞれ、じみの付いた綿
布サンプルを洗浄するのに用い、それぞれのしみ抜き能
力を評価した。その能力の結果を表２にまとめる。

表　　　２ 加水分解酵素１を用いた組成物 ０．０８ｖｔ、％トリオクタノイン　　　　　　　８０
．４０．０４ｖｔ６％ドデシル硫酸ナトリウム２００ｐ
ｐｌ　ｆｉｚ　　Ｏｚ １μｇ／Ｉ１１加水分解酵素１ ２ＯＵＭ　ＥＤＴＡ （ｐＨ−１０，５） 対照組成物 ０．０８ｖｔ、％トリオクタノイン　　　　　　　Ｂ９
．８０．０４ｖｔ、％ドデシル硫酸ナトリウム２００ｐ
ｐｍ　Ｈ２０２ ２００Ｍ　ＥＤＴＡ （ＰＨ−１０，５） 表２のデータから認められるように、対照組成物も過酸
化水素成分を含んでいるのにもかがゎらず、加水分解酵
素１を含んだ組成物は対照組成物よりも優れたしみ抜き
効果をもたらした。この改善されたしみ抜きは、多くの
公知の市販された酵素を阻害する陰イオン性表面活性剤
の存在下で起こる点において特に顕著である。

本発明は特定の実施例に関連して説明したが、一般に本
発明の範囲を逸脱することなく、当業者に公知の方法等
によって様々な変更が可能なものである。。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓＮＥ４と名付けられたプラスミドの４゜３
ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントの地図を示す模式図であり
、斜線領域は信号ペプチドコドン（コドン−２２〜＋１
）を示し、点描領域は加水分解酵素１と名付けられた成
熟ポリペプチドのためのコーディング領域（コドン＋１
〜＋２５８）を示し、またＡＴＧ開始コドンおよびＴＡ
Ａ終結コドンも標識するものであり、 第２図はプソイドモナスの加水分解酵素１遺伝子のため
の大腸菌発現ベクターを示す模式図であり、点描領域は
２２個のアミノ酸からなる加水分解酵素信号配列のため
のコーディング領域を示し、斜線領域は成熟加水分解酵
素のためのコーディング領域を示し、矢印の方向に沿っ
てＡＴＧ開始コドンから転写が始まりＴＡＡ終結コドン
まで進むようになっており、両側の色の濃い領域は５′
−および３′−の非翻訳領域を示すものである。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下に示すアミノ酸配列を有する実質的に酵素と
   して純粋な加水分解酵素。 【アミノ酸配列があります】
2. （２） 【アミノ酸配列があります】 から成るアミノ酸配列を有する加水分解酵素を製造する
   に当たり、 該加水分解酵素のための遺伝子を発現するように、該加
   水分解酵素を発現する該遺伝子を含む組換え型プラスミ
   ドを含有する宿主生物形質転換細胞を培養し、 前記発現した加水分解酵素を単離し精製する各工程から
   成る高収率で加水分解酵素を製造する方法。
3. （３）宿主生物がバクテリアである特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
4. （４）宿主生物形質転換細胞がイー・コリである特許請
   求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）宿主生物がイーストである特許請求の範囲第２項
   記載の方法。
6. （６）宿主生物が菌類である特許請求の範囲第２項記載
   の方法。
7. （７）発現した加水分解酵素の精製がカラムクロマトグ
   ラフィを含む特許請求の範囲第２項記載の方法。
8. （８） 【アミノ酸配列があります】 から成るアミノ酸配列を有するペプチドに対するＤＮＡ
   配列コーディング、およびペプチドを生成するように形
   質転換宿主生物のペプチドの発現を指示するため前記Ｄ
   ＮＡ配列に有効に結合した発現信号、を含むベクターに
   よって、形質転換した形質転換宿主生物を栄養培地で培
   養する工程を含む機能ペプチドの製造方法。
9. （９）宿主生物がバクテリアである特許請求の範囲第８
   項記載の方法。
10. （１０）ベクターがイー・コリで複製できるプラスミド
    である特許請求の範囲第８項記載の方法。
11. （１１）宿主生物がイーストである特許請求の範囲第８
    項記載の方法。
12. （１２）宿主生物が菌類である特許請求の範囲第８項記
    載の方法。
13. （１３）さらにペプチドを単離する工程を含む特許請求
    の範囲第８項記載の方法。
14. （１４）さらに単離したペプチドを精製し、蛋白質ｍｇ
    当り約３８５０単位の比酵素活性を有する実質的に酵素
    として純粋な量のペプチドを得る工程を含み、その際に
    １単位は、ＨＬＢ１３．５の０．１重量％のオクチルフ
    ェノールエトキシレート非イオン性界面活性剤を含む０
    ．１ＭのｐＨ８．０のトリス−ＨＣｌ緩衝液中、２．０
    ｍＭのｐ−ニトロフェニルブチレートを用いて２５℃で
    酵素を培養する場合に、４１５ｎｍで１．０／分で吸光
    度が増加する酵素の分量である特許請求の範囲第１３項
    記載の方法。