JP2657383B2 - 新規な加水分解酵素とその製造方法 - Google Patents
新規な加水分解酵素とその製造方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は一般的に酵素、特にシュードモナスプチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 52552から分離可能であっ
て酵素的にほぼ純粋なペプチドとして精製可能な新規な
加水分解酵素とクローニングによる該加水分解酵素の製
造方法に関するものである。 （従来の技術） シュードモナスは短桿状細菌の一属である。P.プチダ
を含む数種の株はモノオレイン酸ポリオキシエチレン
（Atlas Chemicalより入手可能な「Tween 80」）を炭素
源とする最少培地上では限られた増殖能力を有すること
が明らかになっている（Howe et al.,J.Gen Microbio
l.,92（１）,pp.234−235（1976））。シュードモナス
属に属する株について様々な使用法が記載されている。 1983年５月24日発行の米国特許第4,385,112号（発明
者Misaki et al）は日本のたまねぎ畑に由来する土壌サ
ンプルから分離されたプソイドモノス属に属する微生物
株を様々なヌクレオシドに関係する酵素反応に有用なヌ
クレオシドオキシダーゼの製造に用いることを開示して
いる。1984年２月７日発行の米国特許第4,430,433号
（発明者Hammond et al）はシュードモナスプチダ株を
分子量が約48,000〜60,000の間にあるアリルアシルアミ
ダーゼ酵素（アニリドからアニリンと脂肪酸アニオンへ
の加水分解を触媒するもの）の製造に用いることを開示
している。これらのアリルアシルアミダーゼはＮアシル
化された第一級芳香族アミンの分析方法に有用であると
いわれている。 1985年９月17日発行の米国特許第4,524,100号（発明
者Hagedorn）はシュードモナスプチダ株に関連したＰ−
クレゾールの製造方法を開示している。1985年５月13日
発行の米国特許第4,588,688号（発明者Maxwell）はシュ
ードモナスプチダ株を含んだバイオコンバージョン（bi
oconversion）培地中におけるムコン酸の製造方法を開
示している。リンデン（Linden）とベニセック（Benise
k）はシュードモナスプチダバイオタイプＢに由来する
イソメラーゼを記載している（J.Biol.Chem.261,No.14,
pp.6454−6560,1986年５月15日）。 要するに、様々な応用のために様々な酵素を生産する
シュードモナスプチダの新規な株が最近発見されてい
る。 （発明の構成） 本発明は加水分解酵素活性を有す新規な酵素を提供す
る。この加水分解酵素はシュードモナスプチダATCC 535
52によって分泌されるものであり、酵素的にほぼ純粋な
ペプチドとして分離可能である。また、本発明の製造方
法によれば、この新規な加水分解酵素を発現する遺伝子
を適当な発現ベクター中にクローニングし、この加水分
解酵素のための遺伝子を発現するように培養することに
よって加水分解酵素が高い収量で得られる。本発明の酵
素は以下のアミノ酸配列： を有している。 この新規な加水分解酵素は細胞物質（クチン等）の分
解のためのバイオマス加工および洗濯や漂白のための酵
素的過加水分解等、様々な応用において有用である。 本発明の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲等
において本発明が適正に理解かつ解釈されるようにする
ため、本明細書中に用いられる用語の意味を以下に定義
する。 「過加水分解（perhydrosis）」とは過酸と水とが形
成される。選択された基質と過酸化物との反応を意味す
る。 「酵素的過加水分解（enzymatic perhydrolysis）」
とは一般に加水分解酵素として分類され、より詳細には
以下のように同定される酵素によって助長もしくは触媒
される過加水分解反応を意味する。 新規な酵素（以下「加水分解酵素１」と称することも
ある）はシュードモナスプチダによって分泌され、それ
から分離可能なものである。加水分解酵素１を分離する
ことのできる新規なシュードモナスプチダ株の培養物は
MFEP 608.1（Ｐ）に従ってアメリカンタイプカルチャー
コレクション（American Type Culture Collection,123
01 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852）の永久
培養物コレクションに寄託され、ATCC 53552と命名され
た。 本発明の微生物は上述のシュードモナスプチダ株に限
定されるものではなく、その天然および人工突然変異体
も使用できる。シュードモナスプチダATCC 53522の突然
変異体は環境的選択圧技術、UV照射、もしくは突然変異
誘発化学物質の使用によって得ることができる。後述す
るように現存株の対応する遺伝子の他の細胞への形質転
換等、加水分解酵素の生産に応用可能な遺伝子工学技術
は加水分解酵素の商業的生産に好ましく応用できる。 しかしながら、シュードモナスプチダ株は通常の培地
中で培養してもよい。また液体培地も固体培地も用いる
ことができる。液内通気培養が好ましい。通常の栄養培
地を使用することもできる。培養温度は微生物の所望の
増殖速度に依存して変化し、好ましくは25゜〜35℃であ
る。培養時間は所望に応じて選択でき、15〜50時間であ
る。培養は培地中に最高濃度の加水分解酵素が存在した
時点で終了させることができる。 加水分解酵素は発酵ブイヨン中に蓄積される。生産さ
れた酵素のブイヨンからの抽出は以下のようにして行な
うことができる。最初にマイクロ濾過および遠心分離に
よって全細胞ブイヨン培地から細胞および細胞破片を除
去し、次いで限外濾過によって加水分解酵素を濃縮す
る。次いで透析もしくは透析濾過によって余分な塩およ
び色を除去する。 次いで、この粗酵素溶液は精製することができる。酵
素の粉末は凍結乾燥によって得ることができ、様々な応
用が可能である。 加水分解酵素１は以下のアミノ酸配列：を有している。 加水分解酵素は例えば、プラスミドDNAをマルチコピ
ー宿主に移すこと、あるいは加水分解酵素生産細菌の細
胞から加水分解酵素をコードする染色体遺伝子を切除し
た後に該遺伝子を適当なベクター分子中にクローニング
すること等の遺伝子操作技術によって好ましく生産され
る。加水分解酵素１を生産するための好ましい手段の１
つはクローニングである。 実施例９において詳述されるように、第１図はpSNE4
の4.3kbのEcoR Iフラグメントのマップである。斜線状
の陰影を施したボックスはシグナルペプチドコドン（コ
ドン−22〜＋１）を示し、点描領域は成熟加水分解酵素
１ポリペプチドコドン＋１〜＋258のためのコード領域
を示している。予想されるジスルフィド結合も示されて
いる。スケールはベースペア（bp）である。配列化され
た領域（1363bpのSph Iフラグメント）は両矢印で示し
ている。ADG開始コドンおよびTAA終結コドンも示されて
いる。 加水分解酵素１は優れた加水分解活性を有しており、
過酸化物源の存在下において適当な基質（例えばトリオ
クタノインのようなトリグリセリド）から過酸を生産す
るために用いることができる。一般に酵素の活性を阻害
するアニオン性表面活性剤の存在下においてもこの加水
分解酵素は過酸を生産することができる。漂白等に応用
される過酸を生産するためのこの新規な加水分解酵素の
使用は米国特許出願932717号、1986年11月19日出願に記
載されている。 P.プチダ株の発酵によって生産された場合、加水分解
酵素１は、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィ
ー等の公知の手段によって他の蛋白質から分離し精製し
て酵素的にほぼ純粋な加水分解酵素１を産出するように
することが好ましい。その主たる理由は、P.プチダの粗
発酵ブイヨンが加水分解酵素１に加えて他の酵素（以下
「加水分解酵素２」）を含むことが発見されたことにあ
る。 加水分解酵素１と加水分解酵素２とはクロマトグラフ
ィーのような公知の手段によって分離することができ
る。これらはｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−
ニトロフェニルカプリレートに対する異なった加水分解
速度によって区別することができる。 加水分解酵素１は当業者に既知の方法による、細菌，
酵母もしくは菌類のような宿主生物を通してこの酵素を
発現するためのクローニングによって製造することが好
ましい。特に、以下詳述するように大腸菌中においてク
ローニングを行ない、次いでクローン化された加水分解
酵素１をカラムクロマトグラフィーにかけることによっ
て生産することが好ましい。本発明によるクローニング
による生産は驚異的な高収率を提供する。すなわち、実
施例９に記載されるように、プラスミドpSNtac IIを取
り込んだ大腸菌JM 101の発酵ブイヨンから回収可能な収
率は最高では約5.5g/、平均では約3.4g/であると認
められた。これらの収率は、大腸菌発酵からの従来のペ
プチド回収量が約0.2〜0.3g/のオーダーであることに
鑑みれば、驚異的に高い。すなわち、本発明の方法によ
れば、一般に予想されるよりも約10倍も高い収率で新規
な加水分解酵素を得ることができる。 加水分解酵素２も新規なものであり、グリセリド基質
を加水分解するものであって、消化を助けるための油脂
加工等に応用することができる。 以下の実施例の方法，材料および結果は本発明を説明
する目的で記載されるものである。しかしながら、本発
明の範囲内における他の態様，利点および変更も本発明
が対象とする当業者には明らかであろう。 （実 施 例） 実施例１ （Ａ）播種および発酵 0.6％の栄養ブイヨン（Difco）および１％のグルコー
ス（pH6.5）を用いて播種培地を調製した。この培地100
mlを500mlのフェルンバッハフラスコ中で滅菌した。滅
菌した各フラスコに栄養寒天で一晩増殖させたP.プチダ
ATCC 5352の培養物を白金耳１杯分播種し、37℃におい
て12時間、250rpmのニューブランズウィック（Newbruns
wick）シェーカー上に載置した。ついで、このインキュ
ベートした12時間培養物を適当な容量（１〜10％v/v）
で温度制御器およびRPM、空気流および圧力の制御器を
備えた１発酵器（実用容量250ml）、15バイオラフ
ィット（Biolafitte）発酵器（実用容量12）もしくは
100バイオラフィット発酵器中に播種した。発酵器培
地は0.6％の栄養ブイヨン（Difco）、0.3％のりんごク
チンおよび0.2％の酵母抽出物（Difco）を含み、初期pH
は6.5であった。この培地は播種前にpH6.8に調節して40
分間滅菌した。細菌増殖および酵素生産は発酵器中にお
いて12〜15時間継続させた。 （Ｂ）マイクロ濾過による酵素の回収 粗発酵培養物は最初に２枚のロミコン（Romicon）微
孔膜（0.22μ）を備えたアミコン（Amicon）ユニットで
濾過して細胞を除去した。クチン粒子に結合した残存物
中の残留酵素を遠心分離によって除去した。総回収率は
90％に達した。 （Ｃ）全細胞濾液の濃縮および透析 アミコンユニットから回収した濾液は２つのロミコン
Pm10モジュールを備えたアミコン限外濾過ユニットで容
量３に濃縮した。次いで、この濃縮した濾液をpH7.5
の0.01Mリン酸バッファー20によって透析した塩およ
び色を除去した。この段階における回収率は平均約80％
であった。この粗調整物の総活性は8.68×106ユニット
であった。加水分解酵素活性の１ユニットは0.1wt％の
トリトン（Triton）Ｘ−100を含有する0.1M,pH8.0のト
リス（Tris）−HClバッファー中の2.0mM p−ニトロフェ
ニルブチレートと共に25℃でインキュベートとした際に
415nmにおいて1.0/分の吸収増加をもたらす酵素量と定
義される。 実施例２ 限外濾過および透析濾過後の加水分解酵素活性 反応条件を25℃、pH8.0の0.1wt％のトリトンＸ−100
を含有する0.1Mトリスとし、実施例１（Ｃ）の粗調製物
における３つのｐ−ニトロフェニル基質の結合および転
換反応速度を研究した。用いた基質はｐ−ニトロフェニ
ルカプリレート、ｐ−ニトロフェニルラウレート、およ
びｐ−ニトロフェニルパルミテートであった。データを
表１に示す。 様々な実験に実施例１（Ｃ）の調製物を用いたが、こ
の調製物には「加水分解酵素１」および「加水分解酵素
２」と称される２つの酵素が含まれていた。加水分解酵
素１はより優れた過加水分解酵素である。実施例１
（Ｃ）の粗調製物の分離・精製は実施例３に記載され、
加水分解酵素１および加水分解酵素２の完全な分離（酵
素的にほぼ純粋な加水分解酵素１を得ることが好まし
い）は実施例４に記載され、極めて純粋な（配列化に適
した分析上純粋な）加水分解酵素１調製物のサンプルは
実施例５に記載される。 実施例３ イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによる加
水分解酵素１および加水分解酵素２の部分的精製 最初にDEAEセファクリル（Sephacryl）クロマトグラ
フィーにより、次いでセファデックス（Sephadex）Ｇ−
100ゲル浸透クロマトグラフィーによってシュードモナ
スプチド発酵ブイヨンから加水分解酵素１を部分的に精
製した。DEAEカラムをpH8の10mMリン酸ナトリウムバッ
ファーで平衡させ、同じバッファー中のカラムに粗蛋白
質を供給した。カラムに保持されなかったPNB（ｐ−ニ
トロフェニルブチレート）加水分解酵素活性を加水分解
酵素１に関連づけた。DEAE段階からこのようにして得た
加水分解酵素１に対し、pH8の10mMリン酸ナトリウムバ
ッファー中においてセファデックスＧ−100によるクロ
マトグラフィーを行なった。加水分解酵素１はこのカラ
ムから分離したピークとして溶離し、PNB加水分解酵素
活性および過加水分解活性によって同定した。 実施例４ 疎水性クロマトグラフィーによる加水分解酵素１および
加水分解酵素２の完全な分離 疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーによって加水
分解酵素１は加水分解酵素２から完全に分離することが
できる。限外濾過および透析濾過の後、実施例１（ｃ）
の酵素溶液は0.5MNaClに調整し、10mM,pH8のトリス（C
l）,0.5MNaCl中において平衡させた0.8×7cmオクチルセ
ファロースカラムに供給し、未結合の蛋白質を除去する
ために洗浄した。以下の洗浄液:10mM,pH8のトリス（C
l）,2Mの尿素;pH8,10mMのリン酸Na;pH8,10mMのリン酸,
0.5MのNaClを用いた。洗浄後、カラムを50％ｎ−プロパ
ノールに至るリニアグランジェントによって展開した。
次いで酵素活性を明らかにするためにｐ−ニトロフェニ
ルブチレート（PNB）およびｐ−ニトロフェニルカプリ
レート（PNC）に対する活性に関してカラムフラクショ
ンを検定した。２つの酵素は明確に、PNB/PNC比が4.6で
あるフラクション32とPNB/PNC比が1.40であるフラクシ
ョン51に分離した。これらはそれぞれ加水分解酵素１お
よび加水分解酵素２と命名された。 このカラムに由来するフラクションはさらにSDSゲル
電気泳動によって分析した。この分析により、２つの酵
素活性は原核生物酵素に特異的な分子量30,000のバンド
によって探知され、さらに加水分解酵素２は二重に泳動
した加水分解酵素１の単一バンドからは明確に分離され
ることが明らかになった。配列分析に先立って、逆相ク
ロマトグラフィーによって、これら２つの部分的に精製
された酵素を高分子量および低分子量の夾雑物から分離
した。 実施例５ 酵素ペプチドフラグメンテーションのための基準におけ
るHPLCによる加水分解酵素１の精製 配列分析に先立って、部分的に精製された実施例３の
物質を4.8×100mmのシンクロムパック（SynChromPak）C
4逆相HPLCカラムのクロマトグラフィーによってさらに
精製した。このシステムは流速0.5ml/分の0.05％トリエ
チルアミン（TEA）および0.05％トリフルオロ酢酸（TF
A）（溶媒Ａ）中において平衡させた。100μｇ〜1mgの
加水分解酵素１をカラムに注入し、蛋白質は溶媒Ａおよ
び0.05％のTEAおよび0.05％のTFAを含有するｎ−プロパ
ノール（溶媒Ｂ）の複合グラジェントによって溶離され
た。典型的なグラジェントは０〜20％Ｂに対しては＋５
％B/分、次いで60％Ｂまでは＋0.5％B/分であった。全
ての酵素はこのHPLC溶媒システムによって不活性化され
た。約35％の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピーク（加水分
解酵素１）および約39％の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピ
ーク（加水分解酵素２）を回収してさらに配列分析およ
びCNBrフラグメントの調製のために用いた。 実施例６ アミノ酸分析のための臭化シアンペプチドフラグメント
の調製および精製 以下のようにしてアミノ酸配列分析用の臭化シアンペ
プチドフラグメントを調製・精製した。プールした実施
例５の加水分解酵素のアリコート量をスピードヴァック
（SpeedVac）遠心分離機中において乾燥し、次いで8Mの
尿素を含む88％の蟻酸中に10mg/mlの濃度で再懸濁させ
た。この溶液は蟻酸中において200mg/mlのCNBr1容量部
と混合し、暗所において室温で２時間インキュベートし
た。次いで、生成物は逆相分析に先立って、0.8×7cmの
IBF−トリスアクリルGF05（祖）カラムによって40％の
溶媒B:50％の溶媒Ａ（上述）に脱塩した。ペプチドは最
初に逆相による加水分解酵素１の精製のために上記と同
様の手順によって分離した。しかしながら、溶媒Ｂは35
％のプロパノール:65％のアセトニトリル（TEAおよびTF
Aを含有）に変えた。また、クロマトグラフィー後を最
初のダイジェストおよびピークをSDS/尿素／ピリジンゲ
ルおよびそれに続く銀染色法によって分析した。 ２つのピークをクロマトグラムから選択し、上述の条
件を用い、今回は0.48×25cmのシンクロムパックC4カラ
ムにより、再びクロマトグラフィーにかけた。再クロマ
トグラフィー後、精製したペプチドは配列分析用に保持
した。 実施例７ 加水分解酵素１の加水分解酵素２からの区別化：加水分
解酵素１および加水分解酵素２の臭化物フラグメント （実施例４と同様の）オクチルセファロースカラムに
由来する加水分解酵素１および加水分解酵素２に由来す
る精製フラクションを３容量部の溶媒Ａ（0.05％のトリ
エチルアミンおよび0.05％のトリフルオロ酢酸）で希釈
し、（実施例５と同様に）クロマトグラフィーにかけ
た。実施例４に記載したように、精製した蛋白質はSDS
ゲル電気泳動によって分析し、次いで加水分解酵素１お
よび加水分解酵素２のCNBrフラグメントおよびＮ末端ア
ミノ酸配列を比較するために個別にプールした。 実施例８ 加水分解酵素１の比活性 実施例４と同様に精製した酵素を用いて加水分解酵素
１の比活性を測定した。酵素的にほぼ純粋な加水分解酵
素１の有する実施例１（Ｃ）で定義されたような比活性
は3750ユニット/mg蛋白質であった。 実施例９ 大腸菌中におけるクローン化した加水分解酵素１の調製 シュードモナスプチダの加水分解酵素１遺伝子のクロー
ニング シュードモナスプチダ株（ATCC 53552）を200mlのLB
（Luria Broth）培地中で37℃において一晩増殖させ
た。細胞は遠心分離によって採取し、バーンボイム等
（Birnboim et al.,Nucleic Acid Res.7,pp.1513−1523
（1979））によって概説された標準的な方法に忠実に従
って高分子量総DNAを調製した。このDNAはEcoR Iに完全
に消化させ、T4DNAリガーゼによって連結させることに
より、EcoR Iに消化させ、細菌のアルカリホスファター
ゼによって脱リン酸化されたプラスミドpBR 322（ATCC
37017）を調製した。DNAの操作に用いた全ての酵素は製
造物（New England BiolabsもしくはBethesda Research
Laboratories）の指示に従って用いた。連結したDNAは
大腸菌294（ATCC 31445）を形質転換するために使用
し、アンピシリン耐性（Ampr）コロニーを選択した。こ
のようにして、約２×104個（約５×103個／プレート）
の形質転換体を得た。プレートには４−メチルウンベリ
フェニルブチレート（pH8.0の50mMトリス−HCl中におい
て10mM）の溶液を満たし、次いで紫外線ランプ（波長34
0nm）を照射した。基質を加水分解して高度蛍光原化合
物４−メチルウンベリフェロンを遊離するコロニーは強
い青色を呈した。この方法を用いて13個の陽性コロニー
を得た。これら陽性コロニーの各々から前述のバーンボ
イム記載のアルカリ溶菌法によってプラスミド微小調製
物を調製した。各プラスミドはEcoR Iに消化させ、得ら
れたフラグメントはマニアチス等（Maniatis et al），
「分子クローニング：実験マニュアル（Molecu lar Clo
ning;A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring New York）（1982）の記載に従ってポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分離した。殆どのプ
ラスミドは4.3kbの単一の挿入されたフラグメントを含
んでいた。他のものはこのフラグメントに加えて他のフ
ラグメントを含んでいた。この結果、全ての陽性コロニ
ーは4.3kbフラグメント上に含まれる共通のクローン化
された遺伝子の発現の結果として発生することが示唆さ
れた。4.3kbフラグメントのみを含むプラスミドの１つ
をpSNE4と命名し、詳細な分析のために選択した。 6bpの認識配列を有する様々な制限酵素にプラスミドp
SNE4を消化させた。これらの酵素は単独もしくは対で使
用した。これらの実験から得られたフラグメントサイズ
の分析によってpSNE4の4.3kb EcoR I挿入部の予備制限
エンドヌクレアーゼ切断地図を得た。この地図を第１図
に示す。 プラスミドpSNE4のEcoR I挿入部の少なくとも840bpの
数個のサブフラグメントを、その中に機能遺伝子が含ま
れているかを調べるために、pBR322中にサブクローン化
した。可能加水分解酵素遺伝子を含むと認められたプラ
スミドの中には、pSNE4のEcoR I挿入部由来の2.3kb Eco
R I/Sal Iフラグメントを含有するpSNES1があった。
（このフラグメントの位置については第１図参照。） pSNES1の挿入されたフラグメントはさらに他の制限酵
素に消化させ、得られた小フラグメントをサンガー等
（Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,pp.5463
−5467（1977））のジデオキシチェーンターミネーショ
ン法による配列化のためにロバーツ（Roberts,Nucleic
Acids Res.,12,増殖r67−r204（1984））記載のバクテ
リオファージM13ベクター中にサブクローン化した。Sph
I位間の1.36kbのDNA配列（第１図参照）は、予想され
る全ての読み取り枠中において翻訳された際に、直接ア
ミノ酸配列化によって決定されるような蛋白質のNH2末
端アミノ酸残基（残基１〜16）を含んだ大きなオープン
読み取り枠を顕在化させた。また、このオープン読み取
り枠は２つの他の直接配列化されたペプチド（残基94〜
105および残基173〜190）のためのコードを含んでい
る。−22位のメチオニンは、記号ペプチドに典型的な高
度疎水性領域のためのコードを開始するものであるた
め、開始コドンであると推測されている。この信号ペプ
チドは−１位のアラニンの後の分泌工程の間におそらく
切断されるものと考えられる。オープン読み取り枠は25
9位で終ることから、エンコードされた成熟蛋白質は258
個の残基を有することが示唆される。 大腸菌中におけるP.プチダ加水分解酵素１遺伝子の調節
された発現 大腸菌中におけるP.プチダ加水分解酵素遺伝子の調節
された発現を達成するために、バクテリオファージM13
中においてアデルマン等（Adelman et al.,DNA 2,pp.18
3−193（1983））の特定部位の突然変異誘発により、Xb
a I位を最初にATG開始コドンの前に導入し、修飾した遺
伝子は次いでデボーア等（de Boer et al.,Proc.Natl.S
ci.USA 80,p.2125（1983））の強力なtac IIプロモータ
ーを含む発現ベクター中にクローン化した。これは最初
にpSNES1をSph Iに消化させることによって行なった。 全ての加水分解酵素コーディング配列を含んだ2.4kb
のSph Iフラグメントを分離し、M13mp19の複製型（RF）
のSph I位に連結し、混合物は大腸菌JM 101（ATCC 3387
6）をトランスフェクトするために用いた。透明プラー
クを採取し、Sph Iフラグメントが時計回りに配向して
存在するバクテリオファージ（テンプレート）DNAを調
製した。加水分解酵素1ATG開始コドン５′に隣接するXb
a I位を含んだ、50個のヌクレオチドからなる部分的に
補完性の一重鎖DNAフラグメントを合成した。これは、
−27ヌクレオチド位（ATG開始コドンの前）から−９位
まで、および＋１位（ATGのＡ）から＋20位までテンプ
レートDNAを補完する。しかしながら、−９位と＋１位
の間においては天然加水分解酵素プロモーター領域の
５′−AACCTCG−３′はtac IIプロモーター５′−TATCT
AGAATT−３′に変化させねばならなかった。突然変異誘
発が行なわれた。 変化領域に及ぶ32Pでラベルした合成オリゴヌクレオ
チド（５′−ATGAGGTATCTAGAATTAG−３′）とのハイブ
リダイゼーションによって、300個のプラークをスクリ
ーニングした。陽性ハイブリダイジングクローンのRFを
調製し、Xba IおよびSph Iで切断した。遺伝子を含んだ
1kbのXba I/Sph Iフラグメントを分離し、前述のデボー
ア記載のpHGH 907tac IIをXba IおよびSph Iに消化させ
てtac IIプロモーターを含んだ4.3kbのXba I/Sph Iフラ
グメントおよびアンピシリン耐性遺伝子を分離すること
によって得たベクター中に連結した。次いでJM 101細胞
をこの連結混合物で型質転換した。アンピシリン耐性コ
ロニー（プラスミドpSNtac IIを含む、第２図参照）を
選択した。 大腸菌によって合成されるクローン化された加水分解
酵素１のレベルを測定するため、1mMのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を付加した20mlのLB
培地中で37℃において10時間JM 101/pSNtac IIを増殖さ
せた。陰性の対照としては294/pBR 322を用いた。細胞
は遠心分離によって培養上澄液から分離し、次いで上述
のコッシュランド（Koshland）によるペリプラズム成分
および膜／細胞質成分に分別した。各フラクションはｐ
−ニトロフェニルブチレート加水分解によって活性を試
験した。またグレイ等（Gray et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 81,pp.2645−2649（1984））により、細胞分別
法の効果を確認するためにβ−ラクトーゼ（ペリプラズ
マのマーカー）およびβ−ガラクトサーゼ（細胞質のマ
ーカー）を測定した。 加水分解酵素１の活性の殆ど（74％）が培養上澄液中
に存在していた。細胞に関連づけられた酵素の殆どは細
胞洗浄フラクション中に存在し（合計17％）、ペリプラ
ズムフラクション（２％）および細胞質／膜フラクショ
ン（７％）中にはより小量存在することが認められた。
陰性の対照である294/pBR 322培養物のいかなるフラク
ションにも加水分解酵素１の活性は存在しなかった。前
述の８つの醗酵物（10発酵器）中における加水分解酵
素１の収量は1.5g/〜5.5g/の間により、平均収量は
3.4g/であった。 プラスミドpSNtac IIを包含した大腸菌JM 101株の発
酵に由来するブイヨンは0.5MNaClに調節し、プロパノー
ルグリジェーションを省略したことおよび溶離をpH8の1
0mMリン酸Na,0.5MNaCl中の20％アセトニトリルによって
達成したことを除いてはP.プチダの発酵に関しての記載
（実施例４）とほぼ同様にオクチルセファロースによっ
て精製した。分離した生成物（酵素を発現する遺伝子か
らクローン化したもの）をSDSゲルによって分析したと
ころ、元のシュードモナスプチダ株から分離された加水
分解酵素１生産物と同様に泳動した。 実施例10 クローン化した加水分解酵素１由来の臭化シアンフラグ
メントの調製 クローン化した加水分解酵素１に由来する臭化シアン
フラグメントを以下のようにして調製した。クローン化
した生成物のオクチルセファロース精製に由来する生成
物（実施例９）を、シュードモナスプチダから分離され
た加水分解酵素１および加水分解酵素２に関して記載し
たように、３容量部の溶媒Ａで希釈し、短いC4HPLCカラ
ムにより精製した。生成物はSDSゲル上で分析した。 実施例11 P.プチダ由来の加水分解酵素１のCNBrフラグメントと大
腸菌中のクローン化された加水分解酵素１由来のCNBrフ
ラグメントとの比較 P.プチダ由来の加水分解酵素１のCNBrフラグメントと
大腸菌中のクローン化された加水分解酵素１由来のCNBr
フラグメントを比較した。シュードモナス由来のHPLCで
精製した加水分解酵素１および２とクローン化した加水
分解酵素１をそれぞれ上述した実施例６に記載されたよ
うにCNBrによって加水分解した。生成物はSDS/尿素／ピ
リジン電気泳動により分析した。その結果、クローン化
された蛋白質は明らかに加水分解酵素１であることが示
された。（実施例４〜５のように）P.プチダから分離さ
れた加水分解酵素１は以下の観点から、大腸菌より分離
したクローン化された加水分解酵素１と同一であること
が明らかとなった。すなわち（ａ）いずれの生物に由来
する加水分解酵素１も（実施例４のような）同一のクロ
マトグラフィー法によって分離され；（ｂ）いずれの生
物から分離された加水分解酵素１のＮ末端のアミノ酸配
列も同一であり；（ｃ）CNBrフラグメントパターンによ
れば、加水分解酵素１および加水分解酵素２は明確に識
別でき、P.プチダおよび大腸菌のいずれに由来する加水
分解酵素１のCNBrフラグメントも同一であることが明ら
かになり；（ｄ）両細菌源に由来する加水分解酵素１の
ｐ−ニトロフェニルブチレートとｐ−ニトロフェニルカ
プリレートとの基質活性比は同一であり；（ｅ）どちら
の生物から分離された加水分解酵素についてもトリカプ
リリンを基質とした場合の加水分解酵素／過加水分解比
は同一である。 分離されると加水分解酵素１および加水分解酵素２は
ｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−ニトロフェニ
ルカプリレートに対して全く異なった加水分解速度（加
水分解活性）を有することが認められた。したがって、
実施例12に説明するように、これら２つの新規な酵素は
それらのｐ−ニトロフェニルブチレート/p−ニトロフェ
ニルカプリレート加水分解比によって識別することがで
きる。 実施例12 ｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−ニトロフェニ
ルカプリレートを基質とした場合の加水分解酵素１およ
び加水分解酵素２の加水分解速度 反応はpH8の0.1MトリスHClおよび0.1wt％のトリトン
Ｘ−100非イオン性界面活性剤（Rohm ＆ Haasより入手
可能）を含有するサンプル中で25℃において行なった。
（実施例３に由来するような）加水分解酵素１における
2.0mMのｐ−ニトロフェニルブチレート（PNB）の加水分
解速度は0.60（OD 415nm/分）であるのに対し、2.0mMの
ｐ−ニトロフェニルカプリレート（PNC）のそれは0.09
であり、PNB/PNC比は７であった。これに対し、同一濃
度における加水分解酵素２のPNB加水分解速度は0.54、
同一濃度におけるPNC加水分解速度は0.44であって、PNB
/PNC比は１であった。 実施例13 加水分解酵素１を用いたしみ抜きの研究 以下のようにクリスタルバイオレットでしみを付けた
綿100％の布サンプルを用いてオキシダント作用を分析
評価した。クリスタルバイオレット（0.125g）を1.25
の蒸留水に添加した。100枚の２インチ×２インチ（約5
cm×5cm）の綿100％の無染色布サンプルをこの溶液に入
れ、８時間攪拌した。（クリスタルバイオレットで染色
された）綿布サンプルは染色溶液から取り出し、流出液
が殆ど透明となるまで冷たい水道水で繰り返しすすい
だ。次いでしみの付いた布サンプルは個別にアルミフォ
イル上に配し、ペーパータオルでぬぐい、空気乾燥し
た。 加水分解酵素１を使用した製剤を対応する対照組成物
と同様に調製した。両組成物はそれぞれ、しみの付いた
綿布サンプルを洗浄するのに用い、それぞれのしみ抜き
能力を評価した。その能力の結果を表２にまとめる。 表 ２ 加水分解酵素１を用いた組成物 0.06wt.％トリオクタノイン 80.4 0.04wt.％ドデシル硫酸ナトリウム 200ppm H2 O2 １μg/ml加水分解酵素１ 20UM EDTA （pH＝10.5） 対照組成物 0.06wt.％トリオクタノイン 69.8 0.04wt.％ドデシル硫酸ナトリウム 200ppm H2 O2 20UM EDTA （pH＝10.5） 表２のデータから認められるように、対照組成物も過
酸化水素成分を含んでいるのにもかかわらず、加水分解
酵素１を含んだ組成物は対照組成物よりも優れたしみ抜
き効果をもたらした。この改善されたしみ抜きは、多く
の公知の市販された酵素を阻害する陰イオン性表面活性
剤の存在下で起こる点において特に顕著である。 本発明は特定の実施例に関連して説明したが、一般に
本発明の範囲を逸脱することなく、当業者に公知の方法
等によって様々な変更が可能なものである。
（Pseudomonas putida）ATCC 52552から分離可能であっ
て酵素的にほぼ純粋なペプチドとして精製可能な新規な
加水分解酵素とクローニングによる該加水分解酵素の製
造方法に関するものである。 （従来の技術） シュードモナスは短桿状細菌の一属である。P.プチダ
を含む数種の株はモノオレイン酸ポリオキシエチレン
（Atlas Chemicalより入手可能な「Tween 80」）を炭素
源とする最少培地上では限られた増殖能力を有すること
が明らかになっている（Howe et al.,J.Gen Microbio
l.,92（１）,pp.234−235（1976））。シュードモナス
属に属する株について様々な使用法が記載されている。 1983年５月24日発行の米国特許第4,385,112号（発明
者Misaki et al）は日本のたまねぎ畑に由来する土壌サ
ンプルから分離されたプソイドモノス属に属する微生物
株を様々なヌクレオシドに関係する酵素反応に有用なヌ
クレオシドオキシダーゼの製造に用いることを開示して
いる。1984年２月７日発行の米国特許第4,430,433号
（発明者Hammond et al）はシュードモナスプチダ株を
分子量が約48,000〜60,000の間にあるアリルアシルアミ
ダーゼ酵素（アニリドからアニリンと脂肪酸アニオンへ
の加水分解を触媒するもの）の製造に用いることを開示
している。これらのアリルアシルアミダーゼはＮアシル
化された第一級芳香族アミンの分析方法に有用であると
いわれている。 1985年９月17日発行の米国特許第4,524,100号（発明
者Hagedorn）はシュードモナスプチダ株に関連したＰ−
クレゾールの製造方法を開示している。1985年５月13日
発行の米国特許第4,588,688号（発明者Maxwell）はシュ
ードモナスプチダ株を含んだバイオコンバージョン（bi
oconversion）培地中におけるムコン酸の製造方法を開
示している。リンデン（Linden）とベニセック（Benise
k）はシュードモナスプチダバイオタイプＢに由来する
イソメラーゼを記載している（J.Biol.Chem.261,No.14,
pp.6454−6560,1986年５月15日）。 要するに、様々な応用のために様々な酵素を生産する
シュードモナスプチダの新規な株が最近発見されてい
る。 （発明の構成） 本発明は加水分解酵素活性を有す新規な酵素を提供す
る。この加水分解酵素はシュードモナスプチダATCC 535
52によって分泌されるものであり、酵素的にほぼ純粋な
ペプチドとして分離可能である。また、本発明の製造方
法によれば、この新規な加水分解酵素を発現する遺伝子
を適当な発現ベクター中にクローニングし、この加水分
解酵素のための遺伝子を発現するように培養することに
よって加水分解酵素が高い収量で得られる。本発明の酵
素は以下のアミノ酸配列： を有している。 この新規な加水分解酵素は細胞物質（クチン等）の分
解のためのバイオマス加工および洗濯や漂白のための酵
素的過加水分解等、様々な応用において有用である。 本発明の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲等
において本発明が適正に理解かつ解釈されるようにする
ため、本明細書中に用いられる用語の意味を以下に定義
する。 「過加水分解（perhydrosis）」とは過酸と水とが形
成される。選択された基質と過酸化物との反応を意味す
る。 「酵素的過加水分解（enzymatic perhydrolysis）」
とは一般に加水分解酵素として分類され、より詳細には
以下のように同定される酵素によって助長もしくは触媒
される過加水分解反応を意味する。 新規な酵素（以下「加水分解酵素１」と称することも
ある）はシュードモナスプチダによって分泌され、それ
から分離可能なものである。加水分解酵素１を分離する
ことのできる新規なシュードモナスプチダ株の培養物は
MFEP 608.1（Ｐ）に従ってアメリカンタイプカルチャー
コレクション（American Type Culture Collection,123
01 Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852）の永久
培養物コレクションに寄託され、ATCC 53552と命名され
た。 本発明の微生物は上述のシュードモナスプチダ株に限
定されるものではなく、その天然および人工突然変異体
も使用できる。シュードモナスプチダATCC 53522の突然
変異体は環境的選択圧技術、UV照射、もしくは突然変異
誘発化学物質の使用によって得ることができる。後述す
るように現存株の対応する遺伝子の他の細胞への形質転
換等、加水分解酵素の生産に応用可能な遺伝子工学技術
は加水分解酵素の商業的生産に好ましく応用できる。 しかしながら、シュードモナスプチダ株は通常の培地
中で培養してもよい。また液体培地も固体培地も用いる
ことができる。液内通気培養が好ましい。通常の栄養培
地を使用することもできる。培養温度は微生物の所望の
増殖速度に依存して変化し、好ましくは25゜〜35℃であ
る。培養時間は所望に応じて選択でき、15〜50時間であ
る。培養は培地中に最高濃度の加水分解酵素が存在した
時点で終了させることができる。 加水分解酵素は発酵ブイヨン中に蓄積される。生産さ
れた酵素のブイヨンからの抽出は以下のようにして行な
うことができる。最初にマイクロ濾過および遠心分離に
よって全細胞ブイヨン培地から細胞および細胞破片を除
去し、次いで限外濾過によって加水分解酵素を濃縮す
る。次いで透析もしくは透析濾過によって余分な塩およ
び色を除去する。 次いで、この粗酵素溶液は精製することができる。酵
素の粉末は凍結乾燥によって得ることができ、様々な応
用が可能である。 加水分解酵素１は以下のアミノ酸配列：を有している。 加水分解酵素は例えば、プラスミドDNAをマルチコピ
ー宿主に移すこと、あるいは加水分解酵素生産細菌の細
胞から加水分解酵素をコードする染色体遺伝子を切除し
た後に該遺伝子を適当なベクター分子中にクローニング
すること等の遺伝子操作技術によって好ましく生産され
る。加水分解酵素１を生産するための好ましい手段の１
つはクローニングである。 実施例９において詳述されるように、第１図はpSNE4
の4.3kbのEcoR Iフラグメントのマップである。斜線状
の陰影を施したボックスはシグナルペプチドコドン（コ
ドン−22〜＋１）を示し、点描領域は成熟加水分解酵素
１ポリペプチドコドン＋１〜＋258のためのコード領域
を示している。予想されるジスルフィド結合も示されて
いる。スケールはベースペア（bp）である。配列化され
た領域（1363bpのSph Iフラグメント）は両矢印で示し
ている。ADG開始コドンおよびTAA終結コドンも示されて
いる。 加水分解酵素１は優れた加水分解活性を有しており、
過酸化物源の存在下において適当な基質（例えばトリオ
クタノインのようなトリグリセリド）から過酸を生産す
るために用いることができる。一般に酵素の活性を阻害
するアニオン性表面活性剤の存在下においてもこの加水
分解酵素は過酸を生産することができる。漂白等に応用
される過酸を生産するためのこの新規な加水分解酵素の
使用は米国特許出願932717号、1986年11月19日出願に記
載されている。 P.プチダ株の発酵によって生産された場合、加水分解
酵素１は、イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィ
ー等の公知の手段によって他の蛋白質から分離し精製し
て酵素的にほぼ純粋な加水分解酵素１を産出するように
することが好ましい。その主たる理由は、P.プチダの粗
発酵ブイヨンが加水分解酵素１に加えて他の酵素（以下
「加水分解酵素２」）を含むことが発見されたことにあ
る。 加水分解酵素１と加水分解酵素２とはクロマトグラフ
ィーのような公知の手段によって分離することができ
る。これらはｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−
ニトロフェニルカプリレートに対する異なった加水分解
速度によって区別することができる。 加水分解酵素１は当業者に既知の方法による、細菌，
酵母もしくは菌類のような宿主生物を通してこの酵素を
発現するためのクローニングによって製造することが好
ましい。特に、以下詳述するように大腸菌中においてク
ローニングを行ない、次いでクローン化された加水分解
酵素１をカラムクロマトグラフィーにかけることによっ
て生産することが好ましい。本発明によるクローニング
による生産は驚異的な高収率を提供する。すなわち、実
施例９に記載されるように、プラスミドpSNtac IIを取
り込んだ大腸菌JM 101の発酵ブイヨンから回収可能な収
率は最高では約5.5g/、平均では約3.4g/であると認
められた。これらの収率は、大腸菌発酵からの従来のペ
プチド回収量が約0.2〜0.3g/のオーダーであることに
鑑みれば、驚異的に高い。すなわち、本発明の方法によ
れば、一般に予想されるよりも約10倍も高い収率で新規
な加水分解酵素を得ることができる。 加水分解酵素２も新規なものであり、グリセリド基質
を加水分解するものであって、消化を助けるための油脂
加工等に応用することができる。 以下の実施例の方法，材料および結果は本発明を説明
する目的で記載されるものである。しかしながら、本発
明の範囲内における他の態様，利点および変更も本発明
が対象とする当業者には明らかであろう。 （実 施 例） 実施例１ （Ａ）播種および発酵 0.6％の栄養ブイヨン（Difco）および１％のグルコー
ス（pH6.5）を用いて播種培地を調製した。この培地100
mlを500mlのフェルンバッハフラスコ中で滅菌した。滅
菌した各フラスコに栄養寒天で一晩増殖させたP.プチダ
ATCC 5352の培養物を白金耳１杯分播種し、37℃におい
て12時間、250rpmのニューブランズウィック（Newbruns
wick）シェーカー上に載置した。ついで、このインキュ
ベートした12時間培養物を適当な容量（１〜10％v/v）
で温度制御器およびRPM、空気流および圧力の制御器を
備えた１発酵器（実用容量250ml）、15バイオラフ
ィット（Biolafitte）発酵器（実用容量12）もしくは
100バイオラフィット発酵器中に播種した。発酵器培
地は0.6％の栄養ブイヨン（Difco）、0.3％のりんごク
チンおよび0.2％の酵母抽出物（Difco）を含み、初期pH
は6.5であった。この培地は播種前にpH6.8に調節して40
分間滅菌した。細菌増殖および酵素生産は発酵器中にお
いて12〜15時間継続させた。 （Ｂ）マイクロ濾過による酵素の回収 粗発酵培養物は最初に２枚のロミコン（Romicon）微
孔膜（0.22μ）を備えたアミコン（Amicon）ユニットで
濾過して細胞を除去した。クチン粒子に結合した残存物
中の残留酵素を遠心分離によって除去した。総回収率は
90％に達した。 （Ｃ）全細胞濾液の濃縮および透析 アミコンユニットから回収した濾液は２つのロミコン
Pm10モジュールを備えたアミコン限外濾過ユニットで容
量３に濃縮した。次いで、この濃縮した濾液をpH7.5
の0.01Mリン酸バッファー20によって透析した塩およ
び色を除去した。この段階における回収率は平均約80％
であった。この粗調整物の総活性は8.68×106ユニット
であった。加水分解酵素活性の１ユニットは0.1wt％の
トリトン（Triton）Ｘ−100を含有する0.1M,pH8.0のト
リス（Tris）−HClバッファー中の2.0mM p−ニトロフェ
ニルブチレートと共に25℃でインキュベートとした際に
415nmにおいて1.0/分の吸収増加をもたらす酵素量と定
義される。 実施例２ 限外濾過および透析濾過後の加水分解酵素活性 反応条件を25℃、pH8.0の0.1wt％のトリトンＸ−100
を含有する0.1Mトリスとし、実施例１（Ｃ）の粗調製物
における３つのｐ−ニトロフェニル基質の結合および転
換反応速度を研究した。用いた基質はｐ−ニトロフェニ
ルカプリレート、ｐ−ニトロフェニルラウレート、およ
びｐ−ニトロフェニルパルミテートであった。データを
表１に示す。 様々な実験に実施例１（Ｃ）の調製物を用いたが、こ
の調製物には「加水分解酵素１」および「加水分解酵素
２」と称される２つの酵素が含まれていた。加水分解酵
素１はより優れた過加水分解酵素である。実施例１
（Ｃ）の粗調製物の分離・精製は実施例３に記載され、
加水分解酵素１および加水分解酵素２の完全な分離（酵
素的にほぼ純粋な加水分解酵素１を得ることが好まし
い）は実施例４に記載され、極めて純粋な（配列化に適
した分析上純粋な）加水分解酵素１調製物のサンプルは
実施例５に記載される。 実施例３ イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーによる加
水分解酵素１および加水分解酵素２の部分的精製 最初にDEAEセファクリル（Sephacryl）クロマトグラ
フィーにより、次いでセファデックス（Sephadex）Ｇ−
100ゲル浸透クロマトグラフィーによってシュードモナ
スプチド発酵ブイヨンから加水分解酵素１を部分的に精
製した。DEAEカラムをpH8の10mMリン酸ナトリウムバッ
ファーで平衡させ、同じバッファー中のカラムに粗蛋白
質を供給した。カラムに保持されなかったPNB（ｐ−ニ
トロフェニルブチレート）加水分解酵素活性を加水分解
酵素１に関連づけた。DEAE段階からこのようにして得た
加水分解酵素１に対し、pH8の10mMリン酸ナトリウムバ
ッファー中においてセファデックスＧ−100によるクロ
マトグラフィーを行なった。加水分解酵素１はこのカラ
ムから分離したピークとして溶離し、PNB加水分解酵素
活性および過加水分解活性によって同定した。 実施例４ 疎水性クロマトグラフィーによる加水分解酵素１および
加水分解酵素２の完全な分離 疎水性樹脂を用いたクロマトグラフィーによって加水
分解酵素１は加水分解酵素２から完全に分離することが
できる。限外濾過および透析濾過の後、実施例１（ｃ）
の酵素溶液は0.5MNaClに調整し、10mM,pH8のトリス（C
l）,0.5MNaCl中において平衡させた0.8×7cmオクチルセ
ファロースカラムに供給し、未結合の蛋白質を除去する
ために洗浄した。以下の洗浄液:10mM,pH8のトリス（C
l）,2Mの尿素;pH8,10mMのリン酸Na;pH8,10mMのリン酸,
0.5MのNaClを用いた。洗浄後、カラムを50％ｎ−プロパ
ノールに至るリニアグランジェントによって展開した。
次いで酵素活性を明らかにするためにｐ−ニトロフェニ
ルブチレート（PNB）およびｐ−ニトロフェニルカプリ
レート（PNC）に対する活性に関してカラムフラクショ
ンを検定した。２つの酵素は明確に、PNB/PNC比が4.6で
あるフラクション32とPNB/PNC比が1.40であるフラクシ
ョン51に分離した。これらはそれぞれ加水分解酵素１お
よび加水分解酵素２と命名された。 このカラムに由来するフラクションはさらにSDSゲル
電気泳動によって分析した。この分析により、２つの酵
素活性は原核生物酵素に特異的な分子量30,000のバンド
によって探知され、さらに加水分解酵素２は二重に泳動
した加水分解酵素１の単一バンドからは明確に分離され
ることが明らかになった。配列分析に先立って、逆相ク
ロマトグラフィーによって、これら２つの部分的に精製
された酵素を高分子量および低分子量の夾雑物から分離
した。 実施例５ 酵素ペプチドフラグメンテーションのための基準におけ
るHPLCによる加水分解酵素１の精製 配列分析に先立って、部分的に精製された実施例３の
物質を4.8×100mmのシンクロムパック（SynChromPak）C
4逆相HPLCカラムのクロマトグラフィーによってさらに
精製した。このシステムは流速0.5ml/分の0.05％トリエ
チルアミン（TEA）および0.05％トリフルオロ酢酸（TF
A）（溶媒Ａ）中において平衡させた。100μｇ〜1mgの
加水分解酵素１をカラムに注入し、蛋白質は溶媒Ａおよ
び0.05％のTEAおよび0.05％のTFAを含有するｎ−プロパ
ノール（溶媒Ｂ）の複合グラジェントによって溶離され
た。典型的なグラジェントは０〜20％Ｂに対しては＋５
％B/分、次いで60％Ｂまでは＋0.5％B/分であった。全
ての酵素はこのHPLC溶媒システムによって不活性化され
た。約35％の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピーク（加水分
解酵素１）および約39％の溶媒Ｂで溶離する蛋白質のピ
ーク（加水分解酵素２）を回収してさらに配列分析およ
びCNBrフラグメントの調製のために用いた。 実施例６ アミノ酸分析のための臭化シアンペプチドフラグメント
の調製および精製 以下のようにしてアミノ酸配列分析用の臭化シアンペ
プチドフラグメントを調製・精製した。プールした実施
例５の加水分解酵素のアリコート量をスピードヴァック
（SpeedVac）遠心分離機中において乾燥し、次いで8Mの
尿素を含む88％の蟻酸中に10mg/mlの濃度で再懸濁させ
た。この溶液は蟻酸中において200mg/mlのCNBr1容量部
と混合し、暗所において室温で２時間インキュベートし
た。次いで、生成物は逆相分析に先立って、0.8×7cmの
IBF−トリスアクリルGF05（祖）カラムによって40％の
溶媒B:50％の溶媒Ａ（上述）に脱塩した。ペプチドは最
初に逆相による加水分解酵素１の精製のために上記と同
様の手順によって分離した。しかしながら、溶媒Ｂは35
％のプロパノール:65％のアセトニトリル（TEAおよびTF
Aを含有）に変えた。また、クロマトグラフィー後を最
初のダイジェストおよびピークをSDS/尿素／ピリジンゲ
ルおよびそれに続く銀染色法によって分析した。 ２つのピークをクロマトグラムから選択し、上述の条
件を用い、今回は0.48×25cmのシンクロムパックC4カラ
ムにより、再びクロマトグラフィーにかけた。再クロマ
トグラフィー後、精製したペプチドは配列分析用に保持
した。 実施例７ 加水分解酵素１の加水分解酵素２からの区別化：加水分
解酵素１および加水分解酵素２の臭化物フラグメント （実施例４と同様の）オクチルセファロースカラムに
由来する加水分解酵素１および加水分解酵素２に由来す
る精製フラクションを３容量部の溶媒Ａ（0.05％のトリ
エチルアミンおよび0.05％のトリフルオロ酢酸）で希釈
し、（実施例５と同様に）クロマトグラフィーにかけ
た。実施例４に記載したように、精製した蛋白質はSDS
ゲル電気泳動によって分析し、次いで加水分解酵素１お
よび加水分解酵素２のCNBrフラグメントおよびＮ末端ア
ミノ酸配列を比較するために個別にプールした。 実施例８ 加水分解酵素１の比活性 実施例４と同様に精製した酵素を用いて加水分解酵素
１の比活性を測定した。酵素的にほぼ純粋な加水分解酵
素１の有する実施例１（Ｃ）で定義されたような比活性
は3750ユニット/mg蛋白質であった。 実施例９ 大腸菌中におけるクローン化した加水分解酵素１の調製 シュードモナスプチダの加水分解酵素１遺伝子のクロー
ニング シュードモナスプチダ株（ATCC 53552）を200mlのLB
（Luria Broth）培地中で37℃において一晩増殖させ
た。細胞は遠心分離によって採取し、バーンボイム等
（Birnboim et al.,Nucleic Acid Res.7,pp.1513−1523
（1979））によって概説された標準的な方法に忠実に従
って高分子量総DNAを調製した。このDNAはEcoR Iに完全
に消化させ、T4DNAリガーゼによって連結させることに
より、EcoR Iに消化させ、細菌のアルカリホスファター
ゼによって脱リン酸化されたプラスミドpBR 322（ATCC
37017）を調製した。DNAの操作に用いた全ての酵素は製
造物（New England BiolabsもしくはBethesda Research
Laboratories）の指示に従って用いた。連結したDNAは
大腸菌294（ATCC 31445）を形質転換するために使用
し、アンピシリン耐性（Ampr）コロニーを選択した。こ
のようにして、約２×104個（約５×103個／プレート）
の形質転換体を得た。プレートには４−メチルウンベリ
フェニルブチレート（pH8.0の50mMトリス−HCl中におい
て10mM）の溶液を満たし、次いで紫外線ランプ（波長34
0nm）を照射した。基質を加水分解して高度蛍光原化合
物４−メチルウンベリフェロンを遊離するコロニーは強
い青色を呈した。この方法を用いて13個の陽性コロニー
を得た。これら陽性コロニーの各々から前述のバーンボ
イム記載のアルカリ溶菌法によってプラスミド微小調製
物を調製した。各プラスミドはEcoR Iに消化させ、得ら
れたフラグメントはマニアチス等（Maniatis et al），
「分子クローニング：実験マニュアル（Molecu lar Clo
ning;A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring New York）（1982）の記載に従ってポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって分離した。殆どのプ
ラスミドは4.3kbの単一の挿入されたフラグメントを含
んでいた。他のものはこのフラグメントに加えて他のフ
ラグメントを含んでいた。この結果、全ての陽性コロニ
ーは4.3kbフラグメント上に含まれる共通のクローン化
された遺伝子の発現の結果として発生することが示唆さ
れた。4.3kbフラグメントのみを含むプラスミドの１つ
をpSNE4と命名し、詳細な分析のために選択した。 6bpの認識配列を有する様々な制限酵素にプラスミドp
SNE4を消化させた。これらの酵素は単独もしくは対で使
用した。これらの実験から得られたフラグメントサイズ
の分析によってpSNE4の4.3kb EcoR I挿入部の予備制限
エンドヌクレアーゼ切断地図を得た。この地図を第１図
に示す。 プラスミドpSNE4のEcoR I挿入部の少なくとも840bpの
数個のサブフラグメントを、その中に機能遺伝子が含ま
れているかを調べるために、pBR322中にサブクローン化
した。可能加水分解酵素遺伝子を含むと認められたプラ
スミドの中には、pSNE4のEcoR I挿入部由来の2.3kb Eco
R I/Sal Iフラグメントを含有するpSNES1があった。
（このフラグメントの位置については第１図参照。） pSNES1の挿入されたフラグメントはさらに他の制限酵
素に消化させ、得られた小フラグメントをサンガー等
（Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74,pp.5463
−5467（1977））のジデオキシチェーンターミネーショ
ン法による配列化のためにロバーツ（Roberts,Nucleic
Acids Res.,12,増殖r67−r204（1984））記載のバクテ
リオファージM13ベクター中にサブクローン化した。Sph
I位間の1.36kbのDNA配列（第１図参照）は、予想され
る全ての読み取り枠中において翻訳された際に、直接ア
ミノ酸配列化によって決定されるような蛋白質のNH2末
端アミノ酸残基（残基１〜16）を含んだ大きなオープン
読み取り枠を顕在化させた。また、このオープン読み取
り枠は２つの他の直接配列化されたペプチド（残基94〜
105および残基173〜190）のためのコードを含んでい
る。−22位のメチオニンは、記号ペプチドに典型的な高
度疎水性領域のためのコードを開始するものであるた
め、開始コドンであると推測されている。この信号ペプ
チドは−１位のアラニンの後の分泌工程の間におそらく
切断されるものと考えられる。オープン読み取り枠は25
9位で終ることから、エンコードされた成熟蛋白質は258
個の残基を有することが示唆される。 大腸菌中におけるP.プチダ加水分解酵素１遺伝子の調節
された発現 大腸菌中におけるP.プチダ加水分解酵素遺伝子の調節
された発現を達成するために、バクテリオファージM13
中においてアデルマン等（Adelman et al.,DNA 2,pp.18
3−193（1983））の特定部位の突然変異誘発により、Xb
a I位を最初にATG開始コドンの前に導入し、修飾した遺
伝子は次いでデボーア等（de Boer et al.,Proc.Natl.S
ci.USA 80,p.2125（1983））の強力なtac IIプロモータ
ーを含む発現ベクター中にクローン化した。これは最初
にpSNES1をSph Iに消化させることによって行なった。 全ての加水分解酵素コーディング配列を含んだ2.4kb
のSph Iフラグメントを分離し、M13mp19の複製型（RF）
のSph I位に連結し、混合物は大腸菌JM 101（ATCC 3387
6）をトランスフェクトするために用いた。透明プラー
クを採取し、Sph Iフラグメントが時計回りに配向して
存在するバクテリオファージ（テンプレート）DNAを調
製した。加水分解酵素1ATG開始コドン５′に隣接するXb
a I位を含んだ、50個のヌクレオチドからなる部分的に
補完性の一重鎖DNAフラグメントを合成した。これは、
−27ヌクレオチド位（ATG開始コドンの前）から−９位
まで、および＋１位（ATGのＡ）から＋20位までテンプ
レートDNAを補完する。しかしながら、−９位と＋１位
の間においては天然加水分解酵素プロモーター領域の
５′−AACCTCG−３′はtac IIプロモーター５′−TATCT
AGAATT−３′に変化させねばならなかった。突然変異誘
発が行なわれた。 変化領域に及ぶ32Pでラベルした合成オリゴヌクレオ
チド（５′−ATGAGGTATCTAGAATTAG−３′）とのハイブ
リダイゼーションによって、300個のプラークをスクリ
ーニングした。陽性ハイブリダイジングクローンのRFを
調製し、Xba IおよびSph Iで切断した。遺伝子を含んだ
1kbのXba I/Sph Iフラグメントを分離し、前述のデボー
ア記載のpHGH 907tac IIをXba IおよびSph Iに消化させ
てtac IIプロモーターを含んだ4.3kbのXba I/Sph Iフラ
グメントおよびアンピシリン耐性遺伝子を分離すること
によって得たベクター中に連結した。次いでJM 101細胞
をこの連結混合物で型質転換した。アンピシリン耐性コ
ロニー（プラスミドpSNtac IIを含む、第２図参照）を
選択した。 大腸菌によって合成されるクローン化された加水分解
酵素１のレベルを測定するため、1mMのイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）を付加した20mlのLB
培地中で37℃において10時間JM 101/pSNtac IIを増殖さ
せた。陰性の対照としては294/pBR 322を用いた。細胞
は遠心分離によって培養上澄液から分離し、次いで上述
のコッシュランド（Koshland）によるペリプラズム成分
および膜／細胞質成分に分別した。各フラクションはｐ
−ニトロフェニルブチレート加水分解によって活性を試
験した。またグレイ等（Gray et al.,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 81,pp.2645−2649（1984））により、細胞分別
法の効果を確認するためにβ−ラクトーゼ（ペリプラズ
マのマーカー）およびβ−ガラクトサーゼ（細胞質のマ
ーカー）を測定した。 加水分解酵素１の活性の殆ど（74％）が培養上澄液中
に存在していた。細胞に関連づけられた酵素の殆どは細
胞洗浄フラクション中に存在し（合計17％）、ペリプラ
ズムフラクション（２％）および細胞質／膜フラクショ
ン（７％）中にはより小量存在することが認められた。
陰性の対照である294/pBR 322培養物のいかなるフラク
ションにも加水分解酵素１の活性は存在しなかった。前
述の８つの醗酵物（10発酵器）中における加水分解酵
素１の収量は1.5g/〜5.5g/の間により、平均収量は
3.4g/であった。 プラスミドpSNtac IIを包含した大腸菌JM 101株の発
酵に由来するブイヨンは0.5MNaClに調節し、プロパノー
ルグリジェーションを省略したことおよび溶離をpH8の1
0mMリン酸Na,0.5MNaCl中の20％アセトニトリルによって
達成したことを除いてはP.プチダの発酵に関しての記載
（実施例４）とほぼ同様にオクチルセファロースによっ
て精製した。分離した生成物（酵素を発現する遺伝子か
らクローン化したもの）をSDSゲルによって分析したと
ころ、元のシュードモナスプチダ株から分離された加水
分解酵素１生産物と同様に泳動した。 実施例10 クローン化した加水分解酵素１由来の臭化シアンフラグ
メントの調製 クローン化した加水分解酵素１に由来する臭化シアン
フラグメントを以下のようにして調製した。クローン化
した生成物のオクチルセファロース精製に由来する生成
物（実施例９）を、シュードモナスプチダから分離され
た加水分解酵素１および加水分解酵素２に関して記載し
たように、３容量部の溶媒Ａで希釈し、短いC4HPLCカラ
ムにより精製した。生成物はSDSゲル上で分析した。 実施例11 P.プチダ由来の加水分解酵素１のCNBrフラグメントと大
腸菌中のクローン化された加水分解酵素１由来のCNBrフ
ラグメントとの比較 P.プチダ由来の加水分解酵素１のCNBrフラグメントと
大腸菌中のクローン化された加水分解酵素１由来のCNBr
フラグメントを比較した。シュードモナス由来のHPLCで
精製した加水分解酵素１および２とクローン化した加水
分解酵素１をそれぞれ上述した実施例６に記載されたよ
うにCNBrによって加水分解した。生成物はSDS/尿素／ピ
リジン電気泳動により分析した。その結果、クローン化
された蛋白質は明らかに加水分解酵素１であることが示
された。（実施例４〜５のように）P.プチダから分離さ
れた加水分解酵素１は以下の観点から、大腸菌より分離
したクローン化された加水分解酵素１と同一であること
が明らかとなった。すなわち（ａ）いずれの生物に由来
する加水分解酵素１も（実施例４のような）同一のクロ
マトグラフィー法によって分離され；（ｂ）いずれの生
物から分離された加水分解酵素１のＮ末端のアミノ酸配
列も同一であり；（ｃ）CNBrフラグメントパターンによ
れば、加水分解酵素１および加水分解酵素２は明確に識
別でき、P.プチダおよび大腸菌のいずれに由来する加水
分解酵素１のCNBrフラグメントも同一であることが明ら
かになり；（ｄ）両細菌源に由来する加水分解酵素１の
ｐ−ニトロフェニルブチレートとｐ−ニトロフェニルカ
プリレートとの基質活性比は同一であり；（ｅ）どちら
の生物から分離された加水分解酵素についてもトリカプ
リリンを基質とした場合の加水分解酵素／過加水分解比
は同一である。 分離されると加水分解酵素１および加水分解酵素２は
ｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−ニトロフェニ
ルカプリレートに対して全く異なった加水分解速度（加
水分解活性）を有することが認められた。したがって、
実施例12に説明するように、これら２つの新規な酵素は
それらのｐ−ニトロフェニルブチレート/p−ニトロフェ
ニルカプリレート加水分解比によって識別することがで
きる。 実施例12 ｐ−ニトロフェニルブチレートおよびｐ−ニトロフェニ
ルカプリレートを基質とした場合の加水分解酵素１およ
び加水分解酵素２の加水分解速度 反応はpH8の0.1MトリスHClおよび0.1wt％のトリトン
Ｘ−100非イオン性界面活性剤（Rohm ＆ Haasより入手
可能）を含有するサンプル中で25℃において行なった。
（実施例３に由来するような）加水分解酵素１における
2.0mMのｐ−ニトロフェニルブチレート（PNB）の加水分
解速度は0.60（OD 415nm/分）であるのに対し、2.0mMの
ｐ−ニトロフェニルカプリレート（PNC）のそれは0.09
であり、PNB/PNC比は７であった。これに対し、同一濃
度における加水分解酵素２のPNB加水分解速度は0.54、
同一濃度におけるPNC加水分解速度は0.44であって、PNB
/PNC比は１であった。 実施例13 加水分解酵素１を用いたしみ抜きの研究 以下のようにクリスタルバイオレットでしみを付けた
綿100％の布サンプルを用いてオキシダント作用を分析
評価した。クリスタルバイオレット（0.125g）を1.25
の蒸留水に添加した。100枚の２インチ×２インチ（約5
cm×5cm）の綿100％の無染色布サンプルをこの溶液に入
れ、８時間攪拌した。（クリスタルバイオレットで染色
された）綿布サンプルは染色溶液から取り出し、流出液
が殆ど透明となるまで冷たい水道水で繰り返しすすい
だ。次いでしみの付いた布サンプルは個別にアルミフォ
イル上に配し、ペーパータオルでぬぐい、空気乾燥し
た。 加水分解酵素１を使用した製剤を対応する対照組成物
と同様に調製した。両組成物はそれぞれ、しみの付いた
綿布サンプルを洗浄するのに用い、それぞれのしみ抜き
能力を評価した。その能力の結果を表２にまとめる。 表 ２ 加水分解酵素１を用いた組成物 0.06wt.％トリオクタノイン 80.4 0.04wt.％ドデシル硫酸ナトリウム 200ppm H2 O2 １μg/ml加水分解酵素１ 20UM EDTA （pH＝10.5） 対照組成物 0.06wt.％トリオクタノイン 69.8 0.04wt.％ドデシル硫酸ナトリウム 200ppm H2 O2 20UM EDTA （pH＝10.5） 表２のデータから認められるように、対照組成物も過
酸化水素成分を含んでいるのにもかかわらず、加水分解
酵素１を含んだ組成物は対照組成物よりも優れたしみ抜
き効果をもたらした。この改善されたしみ抜きは、多く
の公知の市販された酵素を阻害する陰イオン性表面活性
剤の存在下で起こる点において特に顕著である。 本発明は特定の実施例に関連して説明したが、一般に
本発明の範囲を逸脱することなく、当業者に公知の方法
等によって様々な変更が可能なものである。
【図面の簡単な説明】
第１図はpSNE4と名付けられたプラスミドの4.3kbEcoR I
フラグメントの地図を示す模式図であり、斜線領域は信
号ペプチドコドン（コドン−22〜＋１）を示し、点描領
域は加水分解酵素１と名付けられた成熟ポリペプチドの
ためのコーディング領域（コドン＋１〜＋258）を示
し、またATG開始コドンおよびTAA終結コドンも標識する
ものであり、 第２図はシュードモナスの加水分解酵素１遺伝子のため
の大腸菌発現ベクターを示す模式図であり、点描領域は
22個のアミノ酸からなる加水分解酵素信号配列のための
コーディング領域を示し、斜線領域は成熟加水分解酵素
のためのコーディング領域を示し、矢印の方向に沿って
ATG開始コドンから転写が始まりTAA終結コドンまで進む
ようになっており、両側の色の濃い領域は５′−および
３′−の非翻訳領域を示すものである。
フラグメントの地図を示す模式図であり、斜線領域は信
号ペプチドコドン（コドン−22〜＋１）を示し、点描領
域は加水分解酵素１と名付けられた成熟ポリペプチドの
ためのコーディング領域（コドン＋１〜＋258）を示
し、またATG開始コドンおよびTAA終結コドンも標識する
ものであり、 第２図はシュードモナスの加水分解酵素１遺伝子のため
の大腸菌発現ベクターを示す模式図であり、点描領域は
22個のアミノ酸からなる加水分解酵素信号配列のための
コーディング領域を示し、斜線領域は成熟加水分解酵素
のためのコーディング領域を示し、矢印の方向に沿って
ATG開始コドンから転写が始まりTAA終結コドンまで進む
ようになっており、両側の色の濃い領域は５′−および
３′−の非翻訳領域を示すものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 スコット ディー パワー
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
94066 サン ブルーノ オリーブ コ
ート 732
(56)参考文献 特開 昭61−104785（ＪＰ，Ａ)
特開 昭59−25684（ＪＰ，Ａ)
特開 昭52−61292（ＪＰ，Ａ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】以下に示すアミノ酸配列を有する実質的に
酵素として純粋な加水分解酵素。 から成るアミノ酸配列を有する加水分解酵素を製造する
に当たり、 該加水分解酵素のための遺伝子を発現するように、該加
水分解酵素を発現する該遺伝子を含む組換え型プラスミ
ドを含有する宿主生物形質転換細胞を培養し、 前記発現した加水分解酵素を単離し精製する 各工程から成る高収率で加水分解酵素を製造する方法。 【請求項３】宿主生物がバクテリアである特許請求の範
囲第２項記載の方法。 【請求項４】宿主生物形質転換細胞がイー・コリである
特許請求の範囲第３項記載の方法。 【請求項５】宿主生物がイーストである特許請求の範囲
第２項記載の方法。 【請求項６】宿主生物が菌類である特許請求の範囲第２
項記載の方法。 【請求項７】発現した加水分解酵素の精製がカラムクロ
マトグラフィを含む特許請求の範囲第２項記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| US93295986A | 1986-11-19 | 1986-11-19 | |
| US10790287A | 1987-10-19 | 1987-10-19 | |
| US107902 | 1987-10-19 | ||
| US932959 | 1987-10-19 |
Publications (2)
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JP2657383B2 (ja) |
| AU (1) | AU621813B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1339597C (ja) |
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| EP0334462B2 (en) † | 1988-03-25 | 2002-04-24 | Genencor International, Inc. | Molecular cloning and expression of genes encoding lipolytic enzymes |
| US5292448A (en) * | 1988-05-10 | 1994-03-08 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Enzymatic detergent composition |
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| US5308765A (en) * | 1991-05-15 | 1994-05-03 | Mitsubishi Rayon Co., Ltd. | Esterase genes, esterase, recombinant plasmids and transformants containing the recombinant plasmid and methods of producing optically acitve carboxylic acids and their enantiomeric esters using said transformants |
| ES2333789T3 (es) * | 2002-03-05 | 2010-03-01 | Genencor International, Inc. | Procedimiento de cribado de mutagenesis de alta productividad. |
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| JPS60188072A (ja) * | 1984-03-09 | 1985-09-25 | Lion Corp | 組換え体ｄνａ、その製造方法、それを含む大腸菌及びそれを用いたリパ−ゼの製造方法 |
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| AU603101B2 (en) * | 1986-06-09 | 1990-11-08 | Clorox Company, The | Enzymatic perhydrolysis system and method of use for bleaching |
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- 1987-11-17 DE DE8787310120T patent/DE3776284D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-18 CA CA 552141 patent/CA1339597C/en not_active Expired - Lifetime
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- 1987-11-19 JP JP62293083A patent/JP2657383B2/ja not_active Expired - Lifetime
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