JPH05504462A

JPH05504462A - 酵素に関する改良

Info

Publication number: JPH05504462A
Application number: JP2503461A
Authority: JP
Inventors: ボリス，ライナー; ホーフェマイスター，エルゲン; トムセン、カール　クリスチアン; オルセン，オーレ; ホン　ベットスタイン，ディートリッヒ
Original assignee: カールスベルク　エイ／エス; アカデミー　デル　ビセンシャフテン　デル　デーデーアール
Priority date: 1989-02-16
Filing date: 1990-02-16
Publication date: 1993-07-15
Anticipated expiration: 2011-09-04
Also published as: WO1990009436A1; JP2530942B2; PT93181A; DE69028769D1; EP0458846B1; DK0458846T3; CA2050468A1; AU5101390A; AU638695B2; ATE143688T1; DE69028769T2; ES2092504T3; CA2050468C; EP0458846A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵素に関する改良発明の分野この発明は、新規な熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ類、新規な熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ類の用途、前記グルカナーゼ類をコードするＤＮＡ断片、および熱安定性（１，３−４，４）−β−グルカナーゼ類の製造方法に関する。

技術的背景（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ類は、各種食品と動物飼料の製造と、（１，３−１，４）−β−グルカン類中のβ−グルコソド結合を切断する必要がある場合、生物学的研究における補助物質として用いられる。特に、醸造産業では、このようなグルカン加水分解酵素を用いると、グルカン化合物の量の増大が原因でマツシュの粘度が高くなるために濾過で問題を起こすことなく、麦芽を使用する代わりに大比率の生の穀物を用いることができる。

混合結合（１，３−１，４）−β−グルカン類はエンバクおよび大麦のような穀物の胚乳の細胞壁の主要部分を構成している。これらは、醸造産業に、例えば抽出物の収率の減少、ウワ−ト（ｗｏｒＤの分離もしくはビールの濾過の速度の低下というようなきびしい問題を起こす。加工済みビールにβ−グルカン類か残ると濁りとゼラチン状沈殿が生成するに至る（Ｇｏｄｆｒｅｙ。

１９８３年の文献）。大麦（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ（Ｅ　Ｃ３，２，１，７３）はｐ１子の発芽の初期段階中、胚盤とアリューロン層内で合成される（ＭｃＦａｄｄｅｎ等、１９８８年の文献）。しかし大比率の麦芽のβ−グルカナーゼかキルユング中、不可逆的に熱で不活性化され、残っている活性はマッノング（ｍａｓｈｉｎｇ）中に急速に破壊される（Ｌｏｉ　ら、１９８７年の文献）。

ウワートの粘度は、中温好性のバソラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、例えばバシラス・アミロリクエファシェンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌ。

１ｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）由来のβ−グルカナーゼを用いることによって低下させることかできることは永年にわたって知られていた。これら公知のグルカナーゼの重大な欠点はその温度感受性であり、これらのグルカナーゼがマッシング法の初期の段階でしか有効でないことを意味している。温度が６５°Ｃを超える後期の段階ではその活性は著しく減少する。

熱安定性が高いグルカナーゼを得るのを目的として、グルカナーゼをコードするバシルス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｃｅｒａｎｓ）由来の遺伝子が、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）中でこれを発現させるためにこの微生物中に導入された（ドイツ民主共和国特許願ＷＰＣ１２Ｎ／３１５７０６１）。しかしこのグルカナーゼは７０°Ｃで、急速に不可逆的に変性される。醸造工程に関連する公知のグルカナーゼのその外の欠点は、これらのグルカナーゼは、マッシング中の通常の条件であるｐＨ４〜５の範囲では充分な活性を発振しないことである。例えば、ｐＨ４，６におけるバフラスβ−グルカナーゼの活性は、ｐＨ６〜７ての活性の２０％ニ過キない。その上、グルカナーゼがｐＨ４でインキュベートされると安定性が低下する。

最高の特性を育する細菌の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼは、この酵素をコードする遺伝子かクローン化され配列が決定されたバシラス・サチリスとビー・アミロリクエファシェンス由来のものである（Ｂｏｒｉｓｓ等の１９８５年文献：　ＣａｎｔＷｅｌｌと１Ｊｃｃｏｎｎｅｌｌの１９８３年文献：　ＨＯｆｅｍｅｉＳｔｅｒ等のｌ９８６年文献；　Ｍｕｒｐｈｙ等の１９８４年文献）。

ビー・マセランス由来のβ−グルカナーゼの方がビー・サチリスとビー・アミロリクエファシェンスの酵素よりも熱安定性が高いということが最近判明した（Ｂｏｒｒｉｓの１９８１年文献；　Ｂｏｒｒｉｓと５ｃｈｒｏｅｄｅｒの１９８１年文献）。しかし、６５℃を超える温度と４．５〜５．５のｐＨ値は、工業的なマッシング条件としては一般的であるが、ビー・マセランスβ−グルカナーゼはこの条件下で急速に不活性化する。ビー・マセランスβ−グルカナーゼ遺伝子はクローン化されており（Ｂｏｒｒｉｓｓ等、１９８８年の文献）、そのヌクレオチドの配列か決定されている（Ｂｏｒｒｉｓｓ等ｉｎ　ｐｒｅｐ、）。ビー・マセランスβ−グルカナーゼの誘導アミノ酸配列を、ビー・サチリスβ−グルカナーゼとビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼの誘導配列を比較すると全相同性が７０％であることが分かった。

生物活性を存する既存のタンパク質を、工業工程に一層適合させかつその利用範囲を広げるために、その改良形を構築する多くの試みが近年行われている。多くの関心か酵素の熱安定性を増大することに集中している。酵素の熱安定性は、変性エントロピーを低下する単一アミノ酸の置換で促進できると愚案されている（Ｍａｔｔｈｅ＊ｓ等の１９８７年文献）。タンパク質の熱安定性を増大する試験的な規則が作られているが（Ａｒｇｏｓ等の１９７９年文献；　Ｉｍａｎａｋａ等の１９８６年文献；　ＱｕｅｒｏｌとＰａｒｉｌｌａの１９８７年文献）、構造の変化による機能の変化を正確に予測することは明確でない。

いく人もの研究者が、親分子の生物活性を保持するハイブリッドタンパク質を生成する相同遺伝子の生体外組換えの実験を行った。５ｔｒｅｕ１ｉ等（１９８１年）とＷｅｃｋと協同研究者（１９８１年）はハイブリッドヒト白血球インターフェロン遺伝子を構築した。

いくつかのハイブリッドインターフェロンによって、水庖性口炎と脳心筋炎のウィルスに対する保護に用いる宿主細胞の範囲が拡大される。したがって、インターフェロンＡとＤの一部を結合するＡＤハイブリッドは、マウスＬ−９２９細胞、ヒトＨｅ−Ｌａ細胞および一層ラビット腎臓細胞内のいずれの親分子より著しく高い抗ウィルス活性を引き出した。熱安定性、ｐＨ安定性および抗原特異性は、ハイブリッドと親インターフェロンの分子について同じであった。

デンマーク特許願第３３６８／８７には、グリコアミラーゼによる糖化で得ることができるデキスロースの最大重１％に対してマイナスの作用がない、澱粉の液化用キメラα−アミラーゼ酵素を得るために、バシラス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）とパンラス・アミロリクエファシェンスのα−アミラーゼ遺伝子由来のＤＮＡ配列を結合することが開示されている。

このマイナスの作用は、このキメラα−アミラーゼで減少し、熱安定性は親酵素と比へて保持された。

発明の開示この発明は、インキュベートされる溶液の濃度範囲が１ｍｌ当たり０．３ｍｇ〜１ｍｇで、ｌ０ｍＭ　ＣａＣ１ｔ　、４０ｍＭ酢酸ナトリウム中、ｐ　Ｈ６，０，７０’Ｃにて、１０分間、好ましくは１５分間、さらに好ましくは１８分間インキュベートした後、その活性の少なくとも５０％を保持する熱安定性（１，３ −１，４）−β−グルカナーゼに関し、（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの活性は、その酵素の（１，３−１，４）−β−グルカン中のβ−グリコシド結合を加水分解する性能として理解される。

本願明細書において、“熱安定性の”という用語は、酵素がその基質を反応生成物に変換するのに充分な期間、本願の場合、（１，３−１，４）−β−グルカンのβ−グルコシド結合を開裂して還元糖を得るのに充分な期間、高温で、変性に抵抗しかつ酵素活性を保持する酵素の性能に関する。この高温とは６０″Ｃを超える温度を意味する。

その外の！ｌ！！様として、この発明は、粗細胞抽出物中、６５°ＣおよびｐＨ４，０で１０分間インキュベートした後、少なくとも１００％、好ましくは少なくとも１１０％、さらに好ましくは少なくとも１２０％の相対βグルカナーゼ活性を存する熱安定性の（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼに関する。この発明の（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼの上記の特徴的挙動の例は図１０に示し、この図１０で、ハイブリット酵素Ｈ１の相対β−グルカナーゼ活性が、ビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランスのβ−グルカナーゼの相対β −グルカナーゼ活性と比較されている。図１０から、Ｈ１酵素の相対β−グルカナーゼ活性は１０分間のインキュベーション後約１３０％であることは明らかである。

この発明の発明者らは、組換えパンラス（１，３−４，４）−β−グルカナーゼをコードするハイブリッド遺伝子を構築した。このグルカナーゼはいままでに知られているいかなる（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼより熱に対して安定である。

そのハイブリッド遺伝子は、β−グルカナーゼのアミノ末端とカルボキシ末端部をコードするパンラス・アミロリクエファシェンスとパンラス・マセランス由来の遺伝子を相互交換することによって構築した。この構築は、ビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランスそれぞれの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子の中央に位置する共通のＥ　ｃｏＲＶエンドヌクレアーゼ制限部位を融合点として用いるか、またはＹｏｎとＦｒ１ｅｄ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　１７巻、４８９５頁、１９８９年）とＨｏｒｔｏｎら（Ｇｅｎｅ、７７巻、６１−６８頁、１９８９年）の方法にしたがってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてハイブリッド融合遺伝子を構築して行った。

β−グルカナーゼハイブリッド酵素１（Ｈｌ）は、成熟ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼの１０７のアミノ末端残基と、ビー・マセランスβ− グルカナーゼの１０７のカルボキシ末端アミノ酸残基とを有している。相互β− グルカナーゼハイブリッド酵素（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　β−ｇｌｕｃａｎａｓｅ　ｈｙｂｒｉｄ　ｅｎｚｙｍｅ２）（Ｈ２）は、ビー・マセランス酵素由来の１０５のアミン末端部と、ビー・アミロリクエファシェンス由来のカルボキン末端の１０７のアミノ酸とて構成されている。これら２つのハイブリッド酵素の生化学特性は、互いに著しく異なるとともに、両方の親β−グルカナーゼとも著しく異なる。

ハイブリッド酵素Ｈ，、Ｈ，、Ｈ，及びＨ６をＰＣＲを用いて構築した。Ｈ３は成熟ビー・アミロリクエファシェンス（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼの１６のアミノ末端アミノ酸残基と、ビー・マセランスβ−グルカナーゼの１９８のカルボキシ末端アミノ酸残基を含有し１．Ｈ４は成熟ビー・アミロリクエファシェンスのβ−グルカナーゼの３６のアミノ末端アミノ酸残基とビー・マセランスの１７８のカルボキシ末端残基を含存し、：Ｈ５は成熟ビー・アミロリクエファシェンス（１，３−１゜４）−β−グルカナーゼの７８のアミノ末端アミノ酸残基と成熟ビー・マセランスβ−グルカナーゼの１３６のカルボキシ末端アミノ酸残基を含有し；およびＨ６はビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼの１５２のアミノ末端残基と成熟ビー・マセランス（１，３−１，４）−β− グルカナーゼの６２のカルボキシ末端アミノ酸残基を含有している。

親酵素に比較して、これらのハイブリッドタンパク質は、異なるｐＨ最適条件、熱安定性およびｐＨ耐性の差のような新規の生化学特性を示す。）ＩＩタンパク質は、醸造産業にとって特に重要である。というのはこのタンパク質には、低ｐＨに対する耐性と、酵素活性の最適ｐＨが低いこととが、ビー・マセランスβ− グルカナーゼの高ｐＨにおける熱安定性を超える熱安定性と組合わされていたからである。最適ｐＨと特にｐＨ耐性がより酸性の条件に移行したので、熱安定性は、ｐＨの全試験範囲にわたって両方の親酵素より優れている。

しかし、この発明の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの特性は、高温でかつできるだけ低ｐＨで（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ活性を得たい場合、例えば、コーヒー代用品または特に食用飼鳥類の給餌用飼料ベレットを製造する場合のような各種の目的に酵素を利用するのに興味深いものである。

食用飼鳥類は、飼料中のβ−グルカン類を分解できないので、多量のβ−グルカン類の含存するペレット化飼料は、飼料／体重所得比を低下させかつ消化障害を起こさせる。それ故に、飼料に（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを添加することによって飼料中のβ−グルカン類を分解することは有利である。飼料ベレットの生産は、高温で行われるので、非熱安定性（１，３−４，４）−β−グルカナーゼは急速に分解することを意味している。しかしこの問題は、この発明の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを飼料製造に用いることによって解決できる。

熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼをコードするハイブリッド遺伝子の構築は、各種の方法で行われる。（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼ遺伝子の池の制限部位を用いるか、（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列をヌクレアーゼで消化して次いで育用なエンドヌクレアーゼ制限部位を含有する合成ヌクレオチド配列を導入するか、または全部もしくは部分的に合成の遺伝子が構築される。

またビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランス以外の微生物由来の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子も、熱安定性（１，３−１，４）− β−グルカナーゼをコードするハイブリッド遺伝子を得るために使用できる。

したがって、この発明は、他の態様において、この発明は式Ａ−Ｍで表されるアミノ酸配列からなる熱安定性ハイブリッド（１，３−１，４）−β−グルカナーゼに関し、式中Ａは、表Ｉに示す、パンラス・アミロリクエファシェンスもしくはパンラス・マセランスの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのＮ−末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％が同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドであり、Ｍは、表Ｉに示す、パンラス・マセランスもしくはパンラス・アミ０リクエフ７ンエンスの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのカルボキシ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドである。

上記の“同一の”という用語は、２つのポリペプチド中のアミノ酸の全組成もしくはその一部を比較した場合を意味する。

各ポリペプチドにおける、個々のアミノ酸残基の数とアミノ酸残基の全数を測定した。したがって、同一度は、２つのポリペプチド中の同一アミノ酸残基の数の、比較されるポリペプチド中のアミノ酸残基の全数に対する比率で表される。かくして、本願では、同一度は、他のポリペプチドもしくはその一部分の中のアミノ酸と同一の、この発明の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼもしくはその一部分の中のアミノ酸の百分率で表される。本願では、（１，３−１，４）−β −グルカナーゼの比較される部分のアミノ酸残基の全数に対する、表工に示すビー・アミロリクエファシェンスもしくはビー・マセランスの（１，３−１，４） −β−グルカナーゼのアノ末端部と、表Ｉに示すビー・マセランスもしくはビー・アミロリクエファシェンス（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの百分率で表される。

同一性はポリペプチド中のアミノ酸の位置には左右されず、同一性は、異なる化学式を有する２つのアミノ酸のよくある同種の機能とは関係がないという意味で絶対的あることは認識されるべきである。

本願において、ポリペプチドのアミノ末端部は、問題のポリペプチドもしくはその一部分のアミノ末端部として理解され、アミノ酸の数で測定され、その末端に遊離のα−Ｎ　Ｈを基を育する。ポリペプチドのカルボキシ末端部は、問題のポリペプチドもしくはその一部分のカルボキシ末端部として理解され、アミノ酸の数で測定され、その末端に遊離のα−ＣＯＯＨ基を育する。

この発明の１つの態様において、細胞からの輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）か可能なシグナルペプチドは、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのアミノ末端部に連結することができる。このシグナルペプチドは、細菌、または酵母と真菌のような池の微生物中の自然の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子の関連部分でコードされるシグナルペプチドであるが、合成の起源もしくはこれらの起源の組合せであってもよい。シグナルペプチドの選択は、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの発現に用いられる微生物によって決まる。シグナルペプチドは好ましくは問題の微生物に相同のシグナルペプチドである。例えば酵母が発現に用いられる場合、シグナルペプチドは、熱安定性（１，３ −１，４）−β−グルカナーゼを酵母の細胞から輸送可能にするためには、酵母に相同でなければならない。適切な酵母のシグナルペプチドは、サツカロミセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃｉｅｓ　）のような酵母の少数の分泌タンパク質のうちの１つとして知られている、インベルターゼ由来のシグナルペプチドである。しかし、α因子と酸性ホスファターゼのシグナルペプチドのような酵母由来のその外のシグナルペプチドも、熱安定性（１，３−１，４）−β −グルカナーゼを酵母細胞から輸送するのに使用できる。

この発明の好ましい態様において、シグナルペプチドは、上記のアミノ酸レベルで、パンラス・アミロリクエファシェンスのシグナルペプチドと、少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、さらに好ましくは少なくとも９０％同一である。

さらに別の態様において、この発明は下記のアミノ酸配列：（ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−５ａｒ−１’ｈｅ　−Ｆｈｓ−Ｇｌｕ−１’ｒｏ−Ｆｈｓ　−Ａｊｎ−Ｓ＠ｒ−τ７’ｒ−Ａｊｎ−５ｌ撃秩|Ｇｌｙ−ＬＪｕ− τｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙ＊−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−τｙｒ−５＊ｒ−＾ｍｎ− Ｇｌｙ−Ａｊｐ−Ｍａｃ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ|τｒｐ− Ａｒｇ−＾Ｌｍ−／ｕｎ　−Ａｊｎ　−Ｖａｌ　−Ｓｉｒ　−Ｍａ　Ｃ−Ｔｈｒ　−Ｓ＠　ｌ”　−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｇ１ｕ４＠　ｔ−１％wｇ−Ｌａｕ−Ａｌａ　−Ｌａｕ− Ｔｈｒ−５ａｒ−Ｐｒｏ−５＊ｒ−τｙｒ−Ａｇｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈ＊−＾ｓｐ− Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＧＬｕ−Ａｍｎ−Ａｒｇ−５ａｒ−ＶａＬ|Ｇｌｎ− Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ−Ｌ＠ｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｔ −Ａｒｇ−Ｍｅ　ｅ−Ｌｙｍ　−Ｐｒｏ　−＋ＡＬａ　−Ｌ刄gＡｊｎ−Ｔｈｒ　− Ｇｌｙ−１１＊−Ｖａ１４＠ｒ−５＊ｒ−Ｐｈｓ−Ｆｈｓ−Ｔｈｒ−τｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−oｒｏ− Ｔｒｐ　−ｋｓｐ　−Ｇｌｕ−１１＠−Ａｊｐ　−１１＊　−Ｇｌｕ　−１’ｈ＊　−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ｔ■秩@−Ｌｙｓ　− ＶＪＩＩ　−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｎｎ−τｙｒ−τｙｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ− Ｇ　１ｙ−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｈｌｍ　−ＧＬｕ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｘ　P＠　−Ｓ＠ｒ−Ｌａｕ− ０Ｇｌｙ−Ｆｈｓ−／ｕｐ−＾１ａ−５＠ｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｈ＊−Ｈｌｓ −Ｔｈｒ−τｙｒ−Ａｌａ−Ｆｈ＊−Ａｓｐ−τｒｐ−にＬ氏|Ｐｒｏ− Ｇｌｙ−Ｔｙｒ　−Ｉ　Ｌ＊　−Ｌｙｓ　−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ　−ＶａＬ　−／ｕｐ−Ｇｌ）Ｔ−ＶＪＬＬ　−Ｌａｕ−Ｌｙｇ　−ＨＬｓ−Ｔ■秩|Ａｌｍ−イｒ −＾１トＡｓｎ−ＩＬ＠　−Ｐｒｏ　−Ｓ＠ｒ　−Ｔｈｒ−１ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　４１ｓ−Ｍａｔ−Ｍａｃ−Ａｓｎ−Ｌａｕ−τｒｐ−Ａｍｎ−fＬｙ−Ｔｈｒ− Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌｐ−Ａｉｐ−丁ｒｐ−Ｌａｕ−Ｇｌｙ−５＊ｒ−τｙτ− Ａｓｎ−Ｇｌｙ−＾１１−＾ｎｎ−１’ｒｏ−Ｌａｕ−Ｔｙ秩|Ａｌａ− Ｇｌｕ−τＦ−Ａｊｐ−τｒｐ−Ｖａｌ−Ｌｙｊｌ−τｙｒ−Ｔｈｒ−５＊ｒ− Ａｍｎまたはその類似体を含有する熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼに関する。

また、この発明は下記のアミノ酸配列：Ｇｌｙ−１１＊−Ｔｈｒ−５＠ｒ−５＠ｒ−Ｖａｌ−５＠ｒ−＾Ｌｍ−＋１；Ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−ｔｌ；１ｙ−５＠ｒ−Ｆｈｓ−Ｆｈｓ|Ｇｌｕ−１’ｒｏ− Ｆｈｓ−Ａｊｎ−５ｓｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−５＠ｒ−Ｇｌｙ−ＸＡｕ−τｒｐ− Ｇｌｎ−Ｌｙｍ−Ａｌａ−Ａｇｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−５＊ｒ|／ｕｎ− Ｇｌｙ−Ａｉｐ−Ｍ＠ｅ−Ｆｈｓ−＾ｎｎ−Ｃｙｓ−τｈｒ−τｒｐ−Ａｒｇ− Ａｌｍ−＾１ｎ−＾１ｎ−ＶａＬ−５＊ｒＪＩ＊ｔ−τｈｒ|５＊ｒ− またはその類似体を含有する熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼに関する。

一般に広く容認されているアミノ酸の省略符号は以下の表の“類似体”という用語は、本願で用いる場合、この発明の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ由来の特徴的なアミノ酸配列と類似のアミノ酸の組成もしくは配列の酵素を示し、その類似体の酵素活性と熱安定性に不利な作用をしない少数の変種も含まれる。

類似のポリペプチドもしくはタンパク質は、ビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランス以外の微生物から誘導するか、または部分的にもしくは完全に合成物の起源であってもよい。

この発明の（１，３−４，４）−β−グルカナーゼのアミノ酸は、例えば化学処理、酵素処理もしくはその外の処理によって任意に修飾されていてもよく、この処理は、（１，３−１゜４）−グルカナーゼの比活性と熱安定性に、実質的に不利に作用しない。

別の３様において、この発明は、上記の熱安定性ハイブリッド（１，３−１，４）−β−グルカナーゼをコードするヌクレオチド配列を含有するＤＮＡ断片に関する。このＤＮＡ断片は、組換えＤＮＡ法による（１．３−１．４）−β−グルカナーゼの製造法に用いることができる。この発明のＤＮＡ断片を組換え（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの製造に用いること（例えばその断片を適切なベクターに挿入し、そのベクターで適切な宿主微生物を形質転換し、得られた微生物を培養して（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを産生させ、次いでこの酵素を微生物から回収することによる使用）には多くの利点がある。か（して、多量の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを提供することが可能であり、産生される酵素は、汚染物質を含有しない実質的に純粋な形態で単離することができる。

この発明の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼは、ポリペプチド配列の個々のアミノ酸の連続連結法、またはポリペプチド配列の個々のアミノ酸を形成する断片を連結させて次いでこのポリペプチド配列を連結して所望のポリペプチドにする方法を利用する、公知の、液相もしくは固相のペプチド合成法でも製造できる。固相ペプチド合成法は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの１９６３年の文献に記載の方法で実施できる。固相合成法では、アミノ酸配列は、初期アミノ酸を固定支持体に結合させ、次に所望の長さが得られるまで、ペプチド結合法で、他のアミノ酸を配列に連続して付加することによって構築される。診断の目的に用いる合成ペプチドの製造は、特に５ｈｉｎ旧ｃｋの１９８３年の文献に記載されている方法で実施できる。

特定の態様において、この発明は、次のヌクレオチド配列：ＣＡＧＣ（ＴＣ？Ｔｒ　ＴＴＡＡＣＧＧＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＧＡＡ　ＡＧＣＣＡＧＧＡＣにに買Ｔ口τＮゴＧＧＡＧ＾ＣＡ（ＹＧＡτＡＣＣＫコ℃τ丁ＡＣにＧＡＴＡＡＡ　ＧＣＡＧにＣＡＡＡＡ　ｃＴＡにＴＣＡＡＡＣＡＡＧＴＡＴＡＡＴＧ　ＩＪＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＣＴＡＴＴＡ　ＡＴＴＣＴｒＴＣＴｒ　ＣＣＡＴＴＣＡＴＡ丁　ＣＣＴＡＴＣＴ（ＴＣＴＧ’ＴＧＣＴＧＡＴＧ　ＧＴＡにＴｒ’Ｔ`ＧＧＴＴＴＧ丁＾ＴＴｒＴ　ＴＡＡＣＡＧＡＡＧＧ　ＡＴＴＡＴＣＡＴＴＡ　ＴＴｒＣＣＡＣＣＧＡＴＣ’ｒ’ｒＣＣＣＴ”ｎ　ＧＡＡＡＡＧＧ`ＴＣ八τＧＴＡＴＧＡＴＣＡＡＴＡＡＡＧＡＡＡ　ＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡ　ＡＡＡＡにＧＧＧＧＡ　ＡＴＧＣＴＡＡＣＡＴ　ＧＡＡＡＣＣＡＣτb ＴＴにＣＴＡＡＴｒＣＴｒＧＴＣＡＣＣＧＧ　ＡＴｒＧｎＴＡＴＧ　Ａ（ＴＴＴＧＴＧ’ＴＧ　ＧＧＡτＣＡＣＴｉ℃ＴＡＣＴＧＴＩゴＣＧＧＣＴＣＡＡＡＣＡＧ　ｃｃｃｃ＾ｒｃｌｌＴｒ　ＴｒＴＴＧＡＡＣＣＴＴＴ’ｒＡＡＣＭ；Ｃｒ　Ａ詭ＣＴＣα℃工Ａ丁ＣＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡτＧ　σＴＴＡＣＴＣＡＡＡ　ＴＣＣＡＣＡ？ＡＴＧ　ＴｒＴＡＡＣτＧＣＡ　ＣＴＴにＣＣＧτＣＣＴＡＡＴＡＡＣＧＴb 丁−τ話ｃＣ：ｒユπＡ吋話晶τＣＣごπＣＣ田ロχ品σＣ工π買八−へご＝ＣＡＣＴＧＣ工Ｑ晶晶ＣＣＧごＣπ貫ユ品ム話πごｎπμσ買ＡτＣ＾＾σ簿厖τ Ｃ８１０１１１！ｉ。

ＡＡＡＣ（１：ＧＣＴＡ　ＡＡＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＴＴＧＴＴｒＣＡ　ＴＣ− ゴロゴＣＡ　ＣＴＴＡＴＡＣＡＧに　ＴＣＣＭＣ（：ＧＡにα：ＧｋＣＴＣＣＴＴ　ＧＧＧＡＴＧＡＧＡＴ　ＴＣ：ＡＴＡＴＣＧＡＡ　ＴＴＴＣτＡＧＣＡＡ　ＡＡＧＡＣＡＣＣ＾ＣＡＡＡＡＧτＣＣ`（：ＡＴにＡＴＧＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＡＣＧＧ　ＡＡＣＣＧＧＡＧＴＧ　ＣＡＴＧＡＣＴＧＧＴ　ＴＡＧ（ＴＴＣＴｒＡ　ＴＡＡＴＧＧＡＧＣf ＡＡＴＣＣ（ＴＴＧＴ　ＡＣＧＣＴＣＡＡＴＡ　ＴＧＡＣ℃ａπＡ　ＡＡＡＴＡ τＡＣＧＡ　ＧＣＩＪατＡＡτＡτＧＡτｒｃｃＡｃｃＴＧＧＧＣＡＴＧＡに　ｅＡＧ’ＴＣＣＡＣＴＣＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣ丁丁またはその類似体もしくはサブ配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ　）を実質的に含有する、ＤＮＡ断片に関する。

上記配列の各ヌクレオチドは一般に用いられている符号で表されている。すなわち次の通りである。

Ａはアデニンを示す。

Ｔはチミジンを示す。

Ｇはグアニンを示す。

Ｃはシトシンを示す。

本願において、“類似体”という゛用語は、ヌクレオチド配列における１つもしくはいくつかの修飾を示すＤＮＡ断片を表すのに泪いられ、その修飾は、修飾されたＤＮＡ断片が上記定義の熱安定性を存するハイブリッド（１，３−１，４） −β−グルカナーゼをコードできるという特徴を有する。この修飾には、例えば、そのＤＮＡ断片がコードして生成するアミノ酸配列に影響しない塩基の置換、すなわち、機能として同等のアミノ酸、欠失および付加をコードすることになる単一の塩基対の置換か含まれる。本願において、°サブ配列“という用語は、この発明の上記もしくは他のＤＮＡ配列の一部を含有し、上記定義の熱安定特性を育する（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを発現する性能を保持しているＤＮＡ配列を意味し、上記説明の修飾によって類似化されたサブ配列も含む。

（１，３−１，４）−β−グルカナーゼもしくはその一部をコードするＤＮＡ断片は、例えば、紫外線、電離放射線、またはマイトマイシンＣ，５−ブロモウラシル、スルホン酸メチルメタン、ヒドロキシルアミン、ナイトロジエンマスタードもしくはニトロフランのような化学的変異原物質による処理によって突然変異を起こさせ、遺伝子産物の酵素活性と熱安定性に実質的に作用することなく、変異された配列から発現される遺伝子産物の特性のいくつかを変えることができる。特に、部位特異的変異誘発法もしくは特異的誘発法が、（１，３−１，４）− β−グルカナーゼの熱安定性、酵素活性に対する最適１）Ｈなどの有用な特性を改良するのに用いられる。

この発明のＤＮＡ断片は、適切な宿主生物内で発現されると、上記定義の熱安定特性を有する（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを産生するようになる配列を確立するために、配列中の１つ以上のヌクレオチドの置換、付加、挿入もしくは欠失によって修飾される断片である。

またさらに別の態様で、この発明は、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを産生ずることができるような方法で上記ＤＮＡ断片が導入された微生物を培養することからなり、その培養が熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを産生ずる条件下で実施され、次いで培養物から（１，３−１゜４）−β −グルカナーゼを回収する熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの製造方法に関する。

（１，３−１，４）−β−グルカナーゼもしくはその一部を産生ずるのに適切な発現ベクターは宿主生物を形質転換する際、宿主生物中で複製できるベクターである。そのベクターは、自律複製が可能な例えばプラスミドのようなもの、または、宿主の染色体で複製される例えばバクテリオファージのようなものでもよい。広く用いられる適切なベクターの例は、Ｐ　Ｂ　Ｒ３２２および類縁ベクターと、ＰＵＣベクターなどである。適切なバクテリオファージの例にＭ＋３とλが含まれる。自己複製酵母のベクターの例は、自己複製に応答しつる、酵母の２μ のＤＮＡの一部を育するベクターである。

この発明のＤＮＡ断片もしくはその一部を有するベクターをもっている生物は、前記ＤＮＡ断片を発現できる生物である。

その生物は、酵母もしくは細菌のような微生物が好ましい。サツカロミセス種のような酵母は、細胞外タンパク質を産生するのに非常に有利ないくつかの固有の特性をもっている。通常、酵母だけが、培養されている培地中に非常に少数のタンパク質を分泌する。それ故に、組換えタンパク質を酵母細胞が分泌できるならば、この酵母が産生ずる組換えタンパク質を単離し精製することは比較的容易である。熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを分泌させるためには、シグナルペプチドを酵素のＮ末端部に連結しなければならない。酵母が産生ずる酵素のインベルターゼは、酵母細胞から分泌される少数の酵母タンパク質の１つであるので、酵母のインバターゼ（１ｎｖａｔａｓｅ）からのシグナルペプチドは、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを酵母細胞から輸送できるようにするのに適切であると考えられる。しかしグラム陽性微生物とグラム陰性細菌が宿主生物として採用できる。°特にイー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１　）のようなグラム陽性菌が有用であるが、ビー・サチリスのようなグラム陽性菌、および真菌のような他の種類の微生物、または組換えＤＮＡ産物を製造するのに通常用いられる他の微生物も使用できる。

この発明のＤＮＡ断片を発現するために微生物が用いられる場合は、培養条件は、一般に、使用される微生物の種類のよってきまるが、当該技術分野の熟練者ならば、どの培養法を選ぶべきかおよびこの方法を最適化する方法を知っているであろう。

さらに別の態様で、この発明は上記のＤＮＡ断片を発現することができる植物に関する。植物の穀粒とジャームリング（ｇｅｒｍｌｉｎｇ）に熱安定性（１，３ −１，４）−β−グルカナーゼを発現できる植物を構築することは有利である。

というのは、この構築によって、例えば醸造工程中マツシュに酵素を添加する必要かなくなるからである。この植物としては、（１，３−１゜４）−β−グルカナーゼによってβ−グルカン類の分解か必要な、ビール、コーヒー代用品、食品などの製造工程で用いられるエンバク、大麦、ライ麦、小麦、米もしくはトウモロコシなとの植物が好ましい。その自然形の植物に比べて（１，３−１゜４）− β−グルカナーゼ活性が増大している植物は、例えばビール生産の原料として有利である。その理由は、増大したβ−グルカナーゼ活性によって、ウワート内の β−グルカン類の量が減少して、濾過が容易になり最終製品の品質が改良されるからである。したがって、この発明は、上記定義の熱安定性（１゜３−１．４） −β−グルカナーゼすなわち上記ＤＮＡ断片でコードされる（１．３−１．４） −β−グルカナーゼを製造するのに有用な遺伝子構造に関し、その構造は、（１，３−１，４）−β−グルカナーゼをコードし、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合もあるＤＮＡ断片２）に機能的に接続された調節配列１）、およびＤＮＡ断片２）に機能的に接続された転写終結ＤＮＡ配列３）から構成されている。

この発明の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼもしくはその一部の製造に有用な遺伝子構造は、その遺伝子構造を含有していない植物に比べβ−グルカナーゼ活性が大きい植物の構築に用いるのが好ましい。しかしこのとおりである必要はない。

というは、この発明のＤＮＡ断片を発現する植物は、そのβ−グルカナーゼ活性は弱いが高温においてその活性が保持されればよいからである。耐温度性β−グルカナーゼを産生し、かつ修飾されていない植物に比べてβ−グルカナーゼ活性が大きい植物を構築する場合、その遺伝子構造は、（１，３−１，４）−β−グルカナーゼかその中で所望の活性を必要としかっβ−グルカナーゼかそこから活性部位に輸送される組織もしくは細胞内で活性でなければならない。この遺伝子構造は、他の（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼ遺伝子と連結するかもしくはその遺伝子の代わりに挿入され、植物遺伝子の調節配列の制御下に挿入することができるため追加の調節配列は必要でない。

しかし、トウモロコシ、米及び小麦のようなある種の植物には、（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子は存在しないので、挿入されたβ−グルカナーゼ遺伝子を植物中で発現させるには、挿入されたβ−グルカナーゼ遺伝子の発現を制御する調節配列を導入するか、または代わりに発現を制御する池の調節配列を植物に用いる必要がある。ＤＮＡの植物細胞への導入は、例えばはだかの原形質体にＤＮＡを直接注入するか、またはＤＮＡでコートされた粒子を細胞もしくは原形質体に注入することによって実施することができる。

上記定義の遺伝子構造に含まれている調節配列は、植物の構成プロモーターもしくは調節可能なプロモーターのような植物プロモーターか好ましい。その遺伝子構造が遺伝子が修飾された植物中に用いられる場合、プロモーターは、植物中で活性なプロモータが好ましく、ＣａＭＶプロモーター、ＭＯＳプロモータもしくは（１，３−１，４）−β−グルカナーゼプロモーターであってもよい。プロモーターの例を示したが池の配列も同し要望を満たすことかできる。その遺伝子構造の転写終結配列は、遺伝子のＤＮＡ断片の転写を終結しかつポリアデニル化シグナルを与えることができるヌクレオチド配列であり、植物から誘導されるのが好ましく、すなわち植物の転写終結配列である。

さらに、その遺伝子構造は、それが導入された植物細胞内で遺伝子構造を選択できる標識を備えている。植物細胞内で用いられる各種の標識がある。特に抗生物質耐性を与える標識がある。これらの標識は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、プレオマイシン、カナマシンおよびゲンタマイシンに対する耐性をもっている。

近年、特異的な望ましい性能を育する新規な植物もしくは植物細胞の有用な構築法の開発に多大の努力が集中され、組換えＤＮＡ技術と適切な植物形質転換システムに基づいたいくつもの上記構築法が現在利用できる。この発明の植物、例えば上記特性を育する植物は上記の方法で構築できると考えられる。

遺伝子が修飾された植物を横策する際の基本的原理は、挿入された遺伝子物質を安定して維持するために、植物のゲノムに遺伝情報を挿入することである。遺伝情報を挿入するいくつもの方法がある。２つの主要な原理があるが、遺伝情報を直接導入する方法と、細菌のベクターシステムを使用して遺伝情報を導入する方法である。従って、他の態様において、この発明は、上記定義の遺伝子構造を加えた遺伝子を、エンバク、大麦、ライ麦、小麦、米もしくはトウモロコシのような植物のゲノムに導入することに関する。

新しい遺伝情報をもっている植物細胞が構築されると、これらの細胞は、アミノ酸、植物ホルモン、ビタミンなとのような必要な成長因子を供給された適切な培地中で細胞を培養するような公知の組織培養法にしたがって増殖され維持される。

さきに述べたように、この発明の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼはビールの製造に使うのが特に育利である。

マツソング工程中、β−グルカン類は麦芽から抽出されてマッツュの粘度を増大させる。マツシュとウアート中のβ−グルカン類の量を減らすために、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼはマツソング工程中に添加しなければならない。

いくつかの醗造所では、マツシング工程は段階的工程として実施され、温度は、約７６°Ｃの高温の最高温度まで徐々に上昇させる。その外の醸造所では、マンシング工程は、固定温度で行われ、一般に５０〜６５°ＣＯａ囲で実施される。

大麦中に存在する（１．３−１．４）−β−グルカナーゼは約５５°Ｃで不活性になり、市販されているＣｅｒｅｆｌｏ　（登録商標、デンマークのＮｏｖｏ− ＮｏｒｄｉｓｋＡ／Ｓから入手できる（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを含有するコンポジット酵素製品）は約６７゛Ｃで不活性になる。

この発明の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼは熱安定性が高く比活性が高いので、マノツユ中のβ−グルカン類の分解を達成するのに、この酵素をごく少量添加すれば充分である。

一般的なマツシュ中に存在するβ−グルカン類を分解するには、麦芽１ｋｇ当たり４ｍｇのＣｅｒｅｆｌｏを添加する必要があるが、この発明の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼは、同じ結果を達成するのに、はるかに少ない量で充分であると予想される。２０μｇ／ｋｇ麦芽程度もしくはさらに少ない量の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼで、一般的なマツシュ中のβ −グルカン類を分解するのに充分であると考えられる。

したがって、この発明はさらに、基質を、適切な時間、６５“Ｃ以上の温度で、前記の熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの有効量の作用に付すことからなり、（１，３−１゜４）−β−ガラクターゼの量が、基質１ｋｇ当たり、多くても２００１８ｇ、好ましくは多くても１００μｇ、さらに好ましくは多くても５０μｇ、一層好ましくは多くても２０μｇ、および最も好ましくは５μ ｇである、基質中の（１，３−１，４）−β−グルカン類の分解方法に関する。

β−グルカンを含有する基質は、固体もしくは液体の形態であってもよく、エンバクもしくは大麦のような各種の生の穀物、またはその一部もしくはその混合物も含まれている。（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ酵素は、純粋の形態で、またはその外の酵素もしくは助剤を含有する混合物の一部分として添加することもでき、その酵素は可溶化されている方が好ましい。

またその酵素は、遺伝子工学によって植物中に組込んで基質中に含有させてもよい。

また、（１，３−１，４）−β−グルカン類を含有する基質を、熱安定性（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを含有する第２基質、すなわちトウモロコシ、米もしくは小麦が起源の第２基質と混合してもよい。トウモロコノ、米および小麦は自然には（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを産生しないが、遺伝子工学の方法によって変化させて、熱安定性（１，３−１゜４）−β−グルカナーゼをコードする遺伝子を組込んで発現させることができる。

次に、添付図面と下記の実施例によってこの発明をさらに説明する。

図面の説明図１は、ハイブリッド遺伝子ｂｇｌ−Ｈ１を含有するイー・コリの発現・分泌ベクターの構築を示す図である。ｂｇｉＡはビー・アミロリクエファシェンス由来の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子、ｂｇｌ−Ｍはビー・マセランス由来の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子である。詳細は実施例１を参照。

図２は、ハイブリッド遺伝子ｂｇｌ−Ｈ２を含有するイー・コリの発現・分泌ベクターの構築を示す図である。ｂｇｌ−Ａはビー・アミロリクエファシェンス由来の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子、ｂｇｌ−Ｍはビー・マセランス由来の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ遺伝子である。詳細は実施例１を参照。

図３は、ｂｇｌ−Ｈ１ｉｉｔ伝子の線図とその融合領域の詳細である。ＳＰはシグナルペプチドである。

図４は、ｂｇｌ−８２遺伝子の線図とその融合領域の詳細である。ＳＰはシグナルペプチドである。

図５は、ハイブリッドβ−グルカナーゼとビー・マセランスβ−グルカナーゼを含有する試料のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動図である。レーン１−３はそれぞれ２μｇ、５μｇおよびｌμｇの精製β−グルカナーゼ　Ｈｌ、レーン４は５０℃ｇの上澄みタンパク質を含有する試料、レーン５は、ｐＵＣ−Ｈ２で形質転換されたイー・コリ細胞の１００μｇの細胞抽出物、レーン６は軽度に精製したビー・マセランスβ−グルカナーゼ２μｇ：レーン７は精製したビー・マセランスβ−グルカナーゼ１μｇ０図６は、７０°Ｃ５ｐＨ６，ｏにて各種の時間、インキュベートした後のトランスジェニックイー・コリ細胞由来の粗抽出物中のノＩ＜シラスハイブリッドβ− グルカナーゼＨ１と親酵素の活性を示す。活性は時間ゼロにおける活性に対する百分率として表しである。

図７は６５°Ｃ，ｐＨ６，０にて各種の時間インキュベートした後のトランスジェニック　イー・コリ細胞由来の粗抽出物（原料と方法の項参照）中のハイブリッド式シラスβ−グルカナーゼＨ１と親酵素の活性を示す。活性は時間ゼロに対する百分率として表しである。

図８はハシラスハイブリットβ−グルカナーゼＨ１とＨ２の６５°Ｃ，ｐＨ５，５における熱不活性化の時間経過を、ビー・アミロリクエファシェンスのβ−グルカナーゼと比較して示す。精製した、アミロリクエファシェンスとＨｌの酵素は、４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）　、ｌｏｍＭｃａｃｌｔおよび５０℃ｇ−ｍｌ−’のウシ血清アルブミン中で１μｇ−ｍｌ−’の濃度で溶解した。

Ｈ２酵素の製剤は、同じ緩衝液中で０．７５ｍｇ−ｍピ１のタンパク質濃度で溶解した。試料を定期的に取出して残留β−グルカナーゼ活性について検定した。

図９は、バフラスハイブリッドβ−グルカナーゼＨ１とＨ２の活性のｐＨ依存性を示す。反応は、次の緩衝液すなわち４０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３，６〜５．６　）；４０ｍＭ　Ｋ／Ｎａホスフェート（ｐＨ６〜８）および４０ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，４〜８．８）中で、１〜６　ｕ　ｇ　Ｈ１β−グルカナーゼと７−７０℃ｇのＨ２β−グルカナーゼの製剤とで行った。活性は基質としてアゾ大麦β−グルカンを用いてＢｉｏｃｏｎ検定法で測定した（　ＭｃＣ１ｅａｒｙの１９８８年の文献）。

図１Ｏは、６５°Ｃ，ｐＨ４，０にて各種の時間インキュベートした後のトランスジェニック　イー・コリ細胞由来の粗抽出物中のムシラスハイブリッドβ−グルカナーゼＨ１と親酵素の活性を示す。活性は、時間ゼロにおける活性に対する百分率で表しである。

図１１は、ハシラスβ−グルカナーゼ、すなわち２μｇのハイブリッドβ−グルカナーゼＨ１，３７５μｇのハイブリッドβ−グルカナーゼＨ２製剤のタンパク質、２μｇのビー・マセランスβ−グルカナーゼまたは１０℃ｇのビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼの５５°Ｃにおける安定性のｐＨ依存性を示す。３．６〜５．６の範囲の指定したｐＨ値に調節した４０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中、または６．０〜８．０の範囲の指定したｐＨ値に調節した４０ｍＭ　Ｋ／Ｎａホスフェート緩衝液中の１０ｍＭ　ＣａｃＬと５０℃ｇ−ｍｌ−’ウシ血清アルブミンで試験した。

５５℃で１時間インキュベートした後、残留活性をＡ法で測定した（原料と方法の項参照）。

図１２は、ＣａＣ１ｘの存在下でのムシラスハイブリッドβ−グルカナーゼの熱安定性の改良を示す。０、ｌμｇのバシラスハイブリッド酵素Ｈ１もしくは７５０℃ｇのハイブリッド酵素Ｈ２の製剤を、１ｍｌの４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）に、５０ｍＭ　Ｃａｃｌｚを添加もしくは添加せずに溶解し、５０．ｃｚ　ｇｍ　Ｉ　−’のウシ血清アルブミンを補充した。指定温度で３０分間インキュベートした後、残留活性を測定した。

図１３は、６５℃、ｐＨ４，１での精製パンラスバイブリフトβ−グルカナーゼＨ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６の熱による不活性化の時間経過を、ビー・アミロリクエファシェンス、ビー・マセランス、及びビー・サチリスの精製天然β−グルカナーゼと比較して示す。酵素を、４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，１）、１０ｍＭ　Ｃａｃｌ、中、Ｏ，１ｍｇ−ｍｌ−’の濃度で溶解した。試料を定期的に取出し、残留β−グルカナーゼ活性を検定した。

１１ｉ１１４は、精製パンラスハイブリッドβ−グルカナーゼＨ３、Ｈ４、Ｈ５及びＨ６の７０°Ｃ，ｐＨ６，０における熱不活性化の時間経過を、ビー・アミロリクエファシェンス、ビー・マセランスおよびビー・サチリスの精製した自然のβ−グルカナーゼと比較して示す。これらの酵素は、４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）　、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２中に０．１　ｍｇ−ｍ　Ｉ− ’の濃度で溶解した。試料を定期的に取出し、残留β−グルカナーゼ活性を検定した。

図１５は、５０ｇの粉砕した麦芽と２００　ｍ　ｌの水に、５μｇＨ３ハイブリッドβ−グルカナーゼと５μｇのビー・サチリスβ−グルカナーゼをそれぞれ添加した混合物とβ−グルカナーゼを加えなかった混合物のマッンング中の残留麦芽β−グルカンの濃度、ならびに１００　ｍ　ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）、５ｍＭＣａＣ１ｚによるβ−グルカン溶液（１，５ｍ　ｇ／ｍ　ｌ　）　５０ｍ１に２５０　ｎ　ｇのビー・サチリスβ−グルカナーゼとＨ３ハイブリッドグルカナーゼをそれぞれ添加した溶液の残留β−グルカンの濃度を示す。

試料を定期的に取出して残留β−グルカン類の検定を行った。

原料と方法菌株、プラスミドおよび増殖培地イー・コリＤＨ５α細胞類、すなわちＦ　−、ｅｎｄＡＩ　、ｈｓｄＲ１７（ｒｘ−、ｍｔ”　）　、５ｕｐＥ４４、ｔｈｉｌ、λ−１ｒｅｃＡ１．ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡｌ、φ８０ｄｌａｃＺ　、６Ｍ１５　（Ｈａｎａｈａｎの１９８５年の文献）を、プラスミドの増殖とβ−グルカナーゼ遺伝子の発現に用いた。ベクターにはｐ　Ｂ　ｒ　３２２　（Ｂｏｌｉｖａｒらの１９７７年の文献）およびｐＵｃ１９　（Ｖａｎｉｓｈ　Ｐｅｒｒｏｎらの１９８５年の文献）が含まれる。組換えプラスミドｐ　Ｅ　Ｇ　１　（Ｂｏｒｒｉｓｓらの１９８５年の文献）は、ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼ遺伝子を有する挿入断片を運び、ｐＵｃ１３−Ｍは、プラスミドＩ）　Ｕ　Ｃ１９／　３４　（Ｂｏｒｒｉｓｓらの１９８８年の文献）の挿入断片と同一のビー・マセランス由来のβ −グルカナーゼ遺伝子を育するＤＮＡｌｆｌ人断片を運ぶ。

培地と増殖条件は先に記憶したとおりである（Ｂｏｒｒｉｓｓらの１９８８年の文献）。

酵素と化学薬剤放射性ヌクレオチドは、米国、マサチューセッツ州、ボストンのＮｅ＊　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社から入手した。制限エンドヌクレアーゼ、子ウシ腸ホスファターゼ、およびＴ４−ＤＮＡリガーゼは、西独マンハイムのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＩＪａｎｎｈｅｉｍ社から入手した。

修飾Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ　、登録商標）は米国、オハイオ州、クリーブランドのＵｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社から入手した。Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　（登録量ａ＞キットは米国、カリフォルニア州、う・ジヨウの８１０１０１　Ｉｎｃ、社から入手した。大麦β−グルカンとβ−グルカナーゼ検定キットは、オーストラリア、ビクトリア州、ボロニアのＢｉｏｃｏｎ社から購入した。リケナンは先に記載したようにしてセトラリア・アイスランデイカ（Ｃｅｔｒａｒｉａ　１ｓｌａｎｄｉｃａ）がら製造した（Ｂｏｒｒｉｓｓの１９８１年の文献）。

形質転換イー・コリ細胞を、形質転換用に、ＬｅｄｅｒｂｅｒｇとＣｏｈｅｎ　（１９７４年の文献に記載されているようにして増殖させてｍ製し、コンピテント細胞を、Ｔｈｏｍｓｅｎ　（１９８３年の文献）が記載したようにして凍結して貯蔵した。

ＤＮＡの精製プラスミドＤＮＡを、）ｌａｔｔｏｒｉ　と５ａｋａｋ　ｉの方法（１９８６年の文献）でイー・コリから調製した。制限エンドヌクレアーゼによる消化で生成した特異的ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動法で分離し、そのゲルマトリックスがら、メーカーの指示にしたがってＧｅｎｅｃｌｅａｎキットを用いて精製した。

ＤＮＡ配列の決定ハイブリッドβ−グルカナーゼ遺伝子のスプライス部位のまわりのヌクレオチド配列を決定するために、修飾Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ（５ｅｑｕｅｎａｓｅ、登録商標）を用いた。その反応はｚｈａｎｇら（１９８８年の文献）が記載したようにして実施した。

酵素の精製と分析ハイブリッド酵素Ｈ１と親酵素の熱安定性を決定するために、プラスミドｐＵｃＩ３−Ｈ１を有するイー・コリ細胞と、プラスミドＩ）ＥＧＩとｐＵｃ１３−Ｍを有するイー・コリ細胞を、トリプトファン−酵母培地（１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇＮａＣ１／ｌ）中で、３７°Ｃにて１６〜２０時間増殖させた。得られた細胞を音波処理で（ＭＳＥ音波処理機）溶解し、溶解細胞を遠心分離によって透明にした後、透明化した溶解細胞の一部を含有する反応混合物を各種の時１１１Ｔ６５°Ｃまたは７０°Ｃでインキュベートし、次いで残留β−グルカナーゼ活性を測定することによって、β−グルカナーゼの安定性を分析した。

Ｂｏｒｒｉｓｓら（１９８８年の文献）に記載されている、細胞抽出物由来のβ −グルカナーゼの精製法を、親酵素とハイブリッド酵素Ｈ１について用いた。Ｈ２β−グルカナーゼは定収率なために、この酵素は等質にまで精製しなかった。

粗細胞抽出物を硫酸アンモニウムで沈殿させて、このβ−グルカナーゼを、１０．４Ｕ／ｍ　ｇ　（１０，４μｍ　ｏ　ｌ　ｅグルコースｍｇ−＝　ｍ　ｉ　ｎ −りの比活性まで濃縮した。タンパク質の濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ　（１９７６年の文献）にしたがって、標準としてウシ血清アルブミンを使用して測定した。酵素製剤は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ法で分析した（Ｌａｅｍｌｋｉの１９７０年の文献）。

β−グルカナーゼの検定Ａ法：反応混合物は、１ｍｌの０．５％（Ｗ／Ｖ）のリケナンもしくは大麦のβ −グルカンと、ｌｏｍ　ＭのＣａＣＩ　ｔを含有もしくは含有していない４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）で構成されていた。反応は０．１ｍｌの酵素溶液を添加することによって開始し、インキュベーションを３７°Ｃで２０分行った。反応を０．５ｍｌの３，５−ジニトロサリチル酸を添加して停止させ、Ｍｉｌｌｅｒ（１９５９年の文献）が概説している試薬配合を用いて還元糖の量を測定した。比活性は１分間に１ｍｇのタンパク質が放出するグルコースの μｍｏｌｅ数で表される。

Ｂ法　代わりに、アゾ大麦のβ−グルカンをβ−グルカナーゼ活性分析用基質として使用した（　ＭｃＣ１ｅａｒｙの１９８８年の文献）。

使用した緩衝液は、４０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ３，６〜５．６゜４０ｍＭリン酸カリウムナトリウム、ｐＨ６〜８：４０ｍＭｈリスーＨＣＩ、ｐＨ８，４〜８．８であった。

プレート検定イー・コリ細胞を０．２％（Ｗ／Ｖ）のリケナンを含有する固形培地上でインキュベートした。０．２％（Ｗ／Ｖ）のコンゴ−・レッドで染色して、β−グルカナーゼを発現するコロニーのまわりの透明領域を出現させた。

封じ込め法組換えＤＮＡを含むすへての実験は、ＢＬＩ実験室条件下で実施し、生物物質を含む廃棄物はオートクレーブで処理した。

実施例１ハイブリッドβ−グルカナーゼ遺伝子を存するプラスミドｐＵＣ１３−Ｈ１とｐＵｃ＋９−８２の構築。

ビー・アミロリークエファンエンスとビー・マセランスのβ−グルカナーゼ遺伝子およびタンパク質は高度に相同性である。

遺伝子の中心に、ハイブリッドβ−グルカナーゼ遺伝子を構築する際の融合慨として使用される独特のＥｃｏＲＶ制限部位がある。

ｐＵｃＩ３−Ｈｌの構築（図１）５°−フランキング領域と、ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼ遺伝子のアミノ末端の１／２のコドン領域とを含有するＥｃｏＲＶ断片をプラスミドＩ）ＥＧＩから単離しくＢｏｒｉｓｓらの１９８５年の文献）、ビー・マセランス酵素のカルボキシル末端の１／２をコードするｐＵｃ１３−Ｍ由来の大きなＥｃｏＲＶ断片と連結して、ハイブリッド遺伝子ｂｇｌ−Ｈ１を育するプラスミツドｐＵｃ１３−Ｈ１を生成させた。ｐ　Ｕ　Ｃ＋３−Ｈｌで形質転換されたイー・コリＤＨ５α細胞はアンピンリンに対して耐性である。

ｐＵＣ１９−Ｈ２の構築（図２）相互的組換え遺伝子を構築するために、ビー・マセランスβ−グルカナーゼ遺伝子をプラスミドｐＵＣ１３−ＭからＥｃｏＲｌ−ＰｓｔＩ断片として切取り、ｐＢＲ３２２中で再クローン化してプラスミドｐＢＲ−ＭＡＣＩを生成させ、そのプラスミドｐＢＲ−ＭＡＣＩから小さなＥｃｏＲＶ断片を精製して、プラスミドｐＥＧ　１由来の大きなＥｃｏＲＶ断片に融合させた。正しい配向の挿入断片を存するそのプラスミドはｐＥＧ−Ｈ２と呼称され、このプラスミドで形質転換されたイー・コリ細胞を、テトラサイクリンを含存する培地内で選択した。ハイブリット遺伝子をＲｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片としてｐＥＧ−Ｈ２から切取り、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩて消化されたｐＵｃ１９内で再クローン化してプラスミドｐＵｃ１９−Ｈ２を得た。

実施例２ハイブリッドβ−グルカナーゼ遺伝子のｂｇｌ−ＨｌとＢｇｌＨ２の構造。

ｂｇｌ−８１組換え遺伝子を発現する断片を図３に示す。その構造は４６９ｂｐのフランキング領域、シグナルペプチドをコートする７５ｂｐ、およびビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼのアミノ末端の１／２をコードする３２１ｂｐを含有している。この８６５ｂｐのＤＮａストレッチを、カルボキシ末端の１／２のコドン領域と、ビー・マセランス由来のβ−グルカナーゼ遺伝子の３°　−フランキング領域５４ｂｐにフレームで融合させた。

シグナルペプチド、ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼのアミノ末端およびビー・マセランスβ−グルカナーゼのカルボキシル末端の１／２で構成されているハイブリブトブレーβ−グルカナーゼのｂｇｌ−１１遺伝子のヌクレオチド配列と誘導アミノ酸配列。スプライシングに用いられるＥｃｏＲＶ部位が示されている。矢印がシグナルペプチダーゼの切断部位を示す。

他の組換え遺伝子のｂｇｌ−８２（図４）は、９９ｂｐの５゛−フランクリン領域、シグナルペプチドをコードする７５ｂｐおよびビー・マセランスβ−グルカナーゼのアミン末端の１／２をコードする３１５ｂｌ）で構成されている。この４８９ｂｐの断片は、ビー・アミロリクエファノエンスβ−グルカナーゼのカルボキン末端の１／２をコードする３２１ｂｐのＤＮＡセグメントと約１．５ｋｂの３゛　−フランキング領域にフレームで融合させた。

プラスミドの構造は、制限酵素の消化、スプライス部位まわりのＤＮＡ配列決定もしくはその両方によって分析した。

表■ シグナルペプチドと、ビー・マセランス　β−グルカナーゼのアミノ末端の１／２とビー・アミロリクエファシェンスタンパク質のカルボキシル末端の１／２とで構成されているハイブリッドプレーβ−グルカナーゼのｂｇｌ−Ｈ２遺伝子のヌクレオチド配列と誘導アミノ酸配列。スプライシングに用いるＥｃｏＲＶ部位を示しである。矢印はシグナルペプチドの切断部位を示し、３′非コドン領域の配列は示していない。

実施例３ｐＵｃＩ３−ＨｌとｐＵｃＩ９−Ｈ２がコードするハイブリッド遺伝子産物の分析イー　−Ｄ　’Ｊ　Ｄ　Ｈ５ａ細胞をｐＵｃ１３−ＨｌもしくはｐＵＣ１９−Ｈ２それぞれで形質転換を行い、形質転換されたハイブリッドβ−グルカナーゼ遺伝子をこれらのイー・コリ細胞内で発現させた。そのハイブリッドβ−グルカナーゼＨ１を、ビー・マセランスβ−グルカナーゼに対して使った方法（Ｂｏｒｒｉｓｓらの１９８８年の文Ｉｔ）にしたかって精製した。５ＤＳ−ＰＡＧＥ法によって、β−グルカナーゼがクーマシーブルーで染色する１つのバンド（図５）として移行したことが確認された。ハイブリッド酵素Ｈ２の収率は、Ｈｌで得られた収率の１％にすぎながったので、あまりに低すぎてクロマトグラフィーで純粋な製剤を作ることができなかった（表■）。

表■ ｐＵＣＩ３−ＨｌとｐＵｃ１９−Ｈ２のそれぞれで形質転換されたイー・コリ細胞てのβ−グルカナーゼの発現。

β−グルカナーゼの活性（μｍｏｌｅグルコースｍｌ培養物−１・ｍ１ｎ−’）プラスミド　細胞　上澄みｎ、　ｄ、　＝検出不能細胞を、トリプトファン−酵母培地中で、強く振盪しながら、３７°Ｃｉ、：　テ２０時間増殖させた。遠心分離（５０００ｘ　ｇＳＩＯｍ　ｉ　ｎ　）した後、酵素の活性を検定するのに上澄み液を直接使用した。

ペレットを洗浄し、４０ｍ　Ｍ酢酸塩（ｐＨ６）に再懸濁し、氷上で、Ｂｒａｎｓｏ口５ｏｎｉｆｉｅｒを用いて４Ｘ２０ｓｅｃ音波処理を行い、次に遠心分離によって透明にした。

β−グルカナーゼＨ１の比活性は３７００μｍｏｌｅグルコースｍｇ＝−ｍｉｎ −’と測定されたが、この値は、バシラスＩＭＥＴ　８３７６由来のβ−グルカナーゼの値（１３３０μｍｏｌｅグルコースｍ　ｇ　−’　−ｍ　ｉ　！Ｎ−’ ）　（Ｂｏｒｒｉｓｓらの１９８５年の文献）およびビー・マセランス由来のβ −グルカナーゼの値（５０３０μｍ。

Ｉｅグルコースｍｇ−１・ｍｉｍ−’）に匹敵するものである。ｂｇｌ−Ｈ２遺伝子産物の特性決定には、１０．４μｍｏｌｅグルコースｍ　ｇ　−１・ｍｉｍ −’の比活性を有する濃縮抽出物を用いた（表■）。

表■ ハイブリッドと親のβ−グルカナーゼの動力学的パラメーターβ−グルカナーゼ基質　バイブリフトｌ　バイブリフト２　７セランス　アミロリクエファシェンス（１）＃總細胞抽出物（２）　ＢｏｒｒｉｓｓとＺｅｍｅｋの１９８１年の文献基質の特異性ハイブリッド酵素Ｈ１とＨ２は大麦（１，３−１，４）−β−グルカンとリケナンを分解し、両方の基質によって測定したＶｍａｘ値に有憇差はなかった（表ＩＶ）。両方のハイブリッドタンパク質のｋｍ値は、基質として大麦β−グルカンもしくはリケナンを用いて測定した。

ハイブリッドβ−グルカナーゼの熱不活性化の動力学ハイブリッドβ−グルカナーゼの熱安定性の、ビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランス由来の粗酵素との比較試験を、Ｈｌ、Ｈ２、ビー・アミロリクエファシェンスの組換え β−グルカナーゼ、およびビー・マセランスの組換えβ−グルカナーゼそれぞれをコードするプラスミドＰＵＣ１３−Ｈ１，ＰＥＧ−Ｈ２、ＰＥＧＩおよびＰ　Ｕ　Ｃ１３−Ｍで形質転換したイー・コリＤＨ５α細胞の透明化した溶菌の試料中でのβ−グルカナーゼの熱不活性化の時間経過を測定して行った。

ｐＵｃ１３−Ｈｌで形質転換したイー・コリの菌株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに、受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５４６１で寄託した。ｐＥＧ−８２で形質転換したイー・コリ菌株をＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５４６０で寄託した。ｐＥＧＩで形質転換されたイー・コリ菌株をＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５４５９で寄託した。ｐＵｃＩ３−Ｍで形質転換したイー・コリ菌株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５４６２で寄託した。

試料（濃度範囲は通常０．３〜１ｍｇタンパク質／ｍｌ）を、ｌｏｍＭ　ＣａＣｌ２．４０ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｉ）Ｈ６，Ｏ中、７０″Ｃでインキュベートし、試料を定期的に取出して残留β−グルカナーゼ活性を測定した（図６）。この分析結果によって、ＨＩ３−グルカナーゼの半減期（１８，５分間で５０％が不活性化する）が、ビー・アミロリクエファシンス由来の粗酵素（４分間）およびビー・マセランス由来の粗酵素（９分１１ｆＩ）より苦しく高いことが分かった。Ｈ２β−グルカナーゼは２分間より小さい半減期で熱不活性化するので粗酵素よりも熱に対して不安定である。

分析を６５°Ｃで実施した場合（図７）、ハイブリッド酵素Ｈ１は３０分間以上安定であったが、ビー・アミロリクエファシェンス由来の酵素の半減期は約２５分間であり、ビー・マセランスの半減期は前者２つの酵素の中間であった。精製Ｈ１酵素は、６５℃、ｐＨ６，０で分析した場合１時間以上安定であったが、軽度に精製されたＨ２酵素は２０〜２５分間以内で不可逆的に熱不活性化された（図８）。ビー・アミロリクエファシェンス由来の精製酵素の不活性化の時間経過を対照として示しである。−貫してハイブリッド酵素Ｈ１は、６５°Ｃ〜７０° Ｃで５分間後に試験したときに著しく活性化されていた（図６−８）。

ハイブリッドβ−グルカナーゼの酵素活性と安定性に対するｐＨの作用。

ハイブリッドβ−グルカナーゼＨ１の最適酵素活性のｐＨ範囲はｐＨ５，６〜６．６であったが、ハイブリッド酵素Ｈ２のそれはｐＨ７，０〜８．０（図９）であった。ビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランス由来のβ−グルカナーゼの酵素活性のｐＨ最最適範囲ハロぞれ、ｐ　Ｈ６，０〜７．０とｐ　Ｈ６，０〜７．５であった（結果は記載していない）。また図９は、パイグリッド酵素Ｈ１がｐＨ４，８でその活性の５０％を保持し、Ｈ２がｐＨ５，６でその活性の５０％を保持することを示している。粗酵素の対応する値はｐＨ５，２（ビー・アミロリクエファシェンス）とｐＨ５，５（ビー・マセランス）である。

その外の特徴は、ｐＨの関数としての酵素の安定性である。

粗抽出物中のβ−グルカナーゼの熱不活性化の時間経過をｐＨ４，０と温度６５ °Ｃでたどったところ、ハイブリッド酵素Ｈ１は３０分間以上安定であったが、ビー・アミロリクエファシェンス由来のβ−グルカナーゼの半減期は２０分間であり、ビー・マセランス由来のβ−グルカナーゼの半減期はわずかに１２分間であった（図１０）。この特徴を、バイブソリッドと親のβ−グルカナーゼについて次のようにして試験した。すなわち、ｐＨ３〜９の範囲で５５°Ｃにて１時間インキュベートし次に残留酵素活性を測定した（図１１）。β−グルカナーゼＨ１は、３．６より小さいｐＨから７．０のｐＨまで安定であるが、β−グルカナーゼＨ２はＩ）Ｈ５，６〜６．０の非常に狭いｐＨ範囲で安定であることは明らかである。両者の親β−グルカナーゼは４．８より低いｐＨでは不安定であり、６．０より高いｐＨ（ビー・アミロリクエファシェンス）もしくは６．５より高いｐＨ（ビー・マセランス）で不安定である。

熱安定性に対するＣａ”の影響ハイブリッドβ−グルカナーゼの安定性に対するＣａ”の影響を、ｐＨ５，５，４５°Ｃ〜７５°Ｃの温度範囲での３０分間検定法で分析した。図１２に示すこの分析の結果から、３０分間検定法で５０％が不活性化する温度を推定することができる。Ｃａ″＊イオンには両ハイブリッド酵素に対する安定化作用があることは明らかである。５０％か不活性化する温度は、１０ｍＭＣａ’″′″の存在下で両ハイブリッドβ−グルカナーゼについて約５℃上昇する。またＣａ−イオンの同じ安定化作用が２つの粗酵素にも見出される。

実施例４ハイブリッドβ−グルカナーゼＨ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６の構築。

４つの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼを次のようにして製造した。すなわち、ＹｏｎとＦｒ１ｅｄ　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、。

１７巻、４８９５頁、１９８９年およびＨｏｒｔｏｎら、Ｇｅｎｅ、　７７巻、６１−６８頁、１９８９年に記載されている方法にしたかい、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて、グルカナーゼをコードするハイブリッド融合遺伝子を構築することによって製造した。その融合遺伝子は、ビー・アミロリクエファシェンスＢ　Ｅ　２０／７８β−グルカナーゼ遺伝子由来のＤＮＡ配列と、ビー・マセランスＥ１３８β−グルカナーゼ遺伝子由来のＤＮＡ配列とを含有している。この融合遺伝子をプラスミドｐ　Ｔ　Ｚ　１９Ｒに挿入した（　Ｍｅａｄら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｊｎｅｅｒｉｎｇ　、１巻、６７−７４頁、１９８６年）。得られた４つの組換えプラスミドをそれぞれｐＴＺＩ９Ｒ−Ｈ３、ｐＴＺ］９Ｒ−Ｈ４、ｐＴＺＩ９Ｒ−Ｈ５おＪ：びｐＴＺＩ９Ｒ−Ｈ６，！：命名シタ。コレラのプラスミドをイー・コリＤＨ５αの形質転換に使用した。得られた宿主細胞を最少培地中、定常期まで増殖させてβ−グルカナーゼ遺伝子を発現させた。得られたハイブリッド酵素をそれぞれＨ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６と命名した。そのＨ３酵素は式Ａ　Ｉ６−　Ｍで表されているが、これは、Ｈ３酵素か、成熟ビー・アミロリクエファシェンス（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのＮ末端部由来の１６のアミノ酸を含有するハイブリッド酵素であることを示し、このアミノ酸は、成熟ビー・マセランス（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのＮ末端部由来の対応する１６のアミノ３を置換したものである。ハイブリッド酵素Ｈ４〜Ｈ６は、成熟ビー・マセランス（１，３−１，４）−β−グルカナーゼのＮ−末端部の３６．７８および１５２のアミノ酸をそれぞれ、ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼのＮ末端部由来の対応する数のアミノ酸で置換することによって、同じ方法で構築した。したがって４つの構築されたハイブリッド酵素はすべて、ビー・アミロリクエファシェンス（１゜３−１．４）−β−グルカナーゼ由来のＮ末端をもっている。

さらに、すべてのハイブリッド酵素は、ビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼのトランジェントシグナルペプチドで合成した。

ハイブリッド酵素Ｈ３をコードするｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ３を有するイー°コリ菌株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖａｎ　ＭｉｋｒｏｏｒＨｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５７９０て寄託した。ハイブリッド酵素Ｈ４をコートするｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ４て形質転換したイー・コリ菌株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　Ｖａｎ　ｋｌｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号ＤＳＭ５７９１で寄託した。ハイブリッド酵素Ｈ５をコードするｐＴ　Ｚ　１９Ｒ− Ｈ５で形質転換したイー・コリを、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５７９２で寄託した。

またハイブリッド酵素Ｈ６をコードするｐ　Ｔ　Ｚ　１９Ｒ−Ｈ６ブラスミドを育す６イー　−：Ｉり菌株を、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに受託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ５７９３で寄託した。上記４つの菌株はすべて１９９０年２月９日に寄託した。

実施例５ハイブリッドβ−グルカナーゼＨ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６の精製と特性決定。

ハイブリッド融合遺伝子がコードするハイブリッド酵素を、その最適温度、最適ｐＨ１比活性および熱安定性を測定することによって特性を決定した。これらの特性を、上記のハイブリッド酵素Ｈ１、ならびに次のバシラス種：ビー・アミロリクエファシェンスＢ　Ｅ　２０／７８、ビー・マセランスＥ１３８、およびビー・サチリス種が産生ずる自然のバクラスβ−グルカナーゼとの対応する特性と比較した。前記のビー・アミロリクエファシェンスβ−グルカナーゼをコードする遺伝子を有するプラスミド（ｐＥＧｌ）と、ビー・マセランスβ−グルカナーゼをコードする遺伝子を育するプラスミド（ｐＵｃＩ３−Ｍ）それぞれで形質転換したイー・コリ細胞を、最少培地で定常期まで増殖させて、β−グルカナーゼ遺伝子産物を発現させた。

ハイブリットβ−グルカナーゼＨ３、Ｈ４、Ｈ５およびＨ６、ならびに自然のビー・アミロリクエファシェンスとビー・マセランスのβ−グルカナーゼを発現する上記の形質転換イー・コリ細胞を増殖させて得た培地１１〜５１を遠心分離と０．８μｍフィルターによる濾過とで透明化した。透明な上澄み液を限外濾過で１００　ｍｌまで濃縮した。２０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，０，５ｍ　Ｍ　ＣａＣ１ｚに対してダイアフィルトレージョンを行い（ｄｉａｆｉｌｒａｔｉｏｎ）　、得られた粗上澄み液をＣＭ−セファロースカオチン交換カラムにかけた。洗浄後、カラムを５０ｍ　Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５，０，５０ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭＣａＣＩｔで溶離した。この精製法で得たβ−グルカナーゼは特に純粋であったが、通常、β−グルカナーゼ活性を含有する画分をプールし、２〜５ｍｌまで濃縮し、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，０，５ｍ　Ｍ　ＣａＣ１ｔを用いるセファクリル５２０ＯＨＲカラム（２，５ｘ６０ｃｍ）の分子ふるいクロマトグラフィーに付した。β−グルカナーゼのピークの両分を純粋な酵素の熱安定性の分析に用いた。純粋なβ−グルカナーゼの収量は、１１の培地当たり０．５〜２５ｍｇの範囲であった。

自然のビー・サチリス酵素は市販の（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ製品（Ｃｅｒｅｆｌｏ　（登録商標）、デンマーク、バグスバード、Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／　Ｓ　）であった。精製の第１段階として、この製品を５倍に濃縮し、次いで５０ｍＭ）リス−ＨＣ１、ｐＨ８に対してダイアフィルトレージョンを行い、次にアニオン交換クロマトグラフィー（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｄε５３）に付した。

未結合タンパク質を濃縮し、緩衝液は、ダイアフィルトレージョンによって、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，０，５ｍＭＣａＣｌ２に変更された。さらに、ＣＭ５２によるカチオン交換クロマトグラフィー（Ｗｈａｔｍａｎ　）によって精製した。β−グルカナーゼ活性を有する画分をプールし、濃縮し、セファクリル５２００ＨＲの分子ふるいクロマトグラフィーに付した。約１００　ｍｇの純粋なビー・サチリスβ−グルカナーゼを、１１のＣｅｒｅｆｌｏ　２００Ｌ　から得た。

Ｈ３〜Ｈ６に対する最適温度。

１ｍｌ当り１００μｇの精製酵素を含有する、上記４種の試験酵素と４種の対照酵素の上記純品製剤を希釈して、含有量を、検定条件下で測定可能な値が得られる酵素量（０，５〜１．５μｇ／ｍｌ）にした。反応混合物は、５０Ｒｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを補充した１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）中の１ｍｌの基質（０，５ｍｇ／ｍｌリケナン）と０．１ｍｌの適切に希釈された酵素製剤とで構成されていた。その混合物を、次の温度：２５．３７．５０．５５．６０．６５．７０．７５．８０および８５°Ｃで１０分間インキュベートした。０．５ｍｌの３．５−ジニトロサリチル酸を添加して反応を停止させた。最適温度と、最適活性の少なくとも９０％が与えられる温度範囲を測定し、結果を下記表に示す。

表ＶＨ３〜Ｈ６、Ｈｌおよび自然のハシラスβ−グルカナーゼの最適温度 β−グルカｔ−ゼ　最ａ温度（°Ｃ）　最適活性の＞９０％が得られる温度範囲（°Ｃ）その上、Ｈ３酵素は、８０°Ｃで、最適活性の７５％の残留活性を有し、８５° Ｃでは対応する残留活性は２０％であった。

被検ハイブリッド酵素の中で、Ｈ４は、いずれの自然酵素より高い最適温度（７０°Ｃ）を育しＨ３酵素は、最適活性の９０％以上が保持される最も広い温度範囲（５５〜７５°Ｃ）を示した。またこの酵素は、その最適活性に対して少な（とも９０％の活性が得られる最高の温度限界をもっていた。

Ｈ３〜Ｈ６の最適ｐＨ。

これらの実験では、４つの対照酵素を含む上記の同じ酵素製剤の酵素活性を、３．６〜８．０の異なるｐＨ値の範囲で検定した。

検定には、アゾー大麦β−グルカンを基質として用いた。２００μｌの基質溶液を、適切なｐＨ値を育し１０〜ｌ００ｎＨの精製酵素製剤を含有する２００μｍの１００ｍＭ緩衝溶液と混合した。３．６〜６．０のｐＨ範囲では、酢酸ナトリウム緩衝液を用い、６．１〜８．０のｐＨ範囲ではトリス−アセテート緩衝液を使用した。検定時間は１０分間であった。最適ｐＨと、最適活性の少なくとも９０％が存在するｐＨ範囲とを各酵素製剤について測定した。さらに、酵素の最適ｐＨにおける活性に対するｐＨ５，０における活性を計算した。これらの検定結果を以下の表に要約した。

表■ Ｈ３〜Ｈ６，Ｈｌおよび自然パンラスβ−グルカナーゼの最適Ｈ β−グルカナーゼ　最適ｐＨ最適活性のと　最適ｐＨ５，５に９０％が得られ　対するｐＨ５，０るｐＨ範囲　の活性Ｈ３７，０６，５〜７．０　１０％　６３％Ｈ４６，５５，９〜７．６　１５％　７０％Ｈ５７，０５，９〜７．６　３０％　８８％Ｈ６６，５５，９〜６．５　５０％　８０％Ｈ１５，９５，５〜６．５　５５％　８６％ビー　・　すチリス　６．５　５．９〜６．５　１９％　７５％ビー　・　７セランス　７．６　５．９〜７．６　８％　５６％ピー　・　アミロツクエフＴノエンス　６．５　５．９〜７．０　３０％　６９％４つの被検酵素の最適ｐＨは６．５〜７．０の範囲内であった。

ｐＨ５，０で、酵素Ｈ５とＨ６は、その最適ｐＨにおける活性に対して、非最適ｐＨ条件に対していくぶん低い感度を示す３つの自然バランス酵素全部の対応する値を超える活性を示した。

少なくとも９０％の活性を保持する低ｐＨの限界は、すべての被検酵素について５．９であったが、この値は自然酵素について見出された値に類似している。それ故に、この実験の結果はビー・アミ０リクエフアンエンスとビー・マセランスの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼ由来のポリペプチドを含存するハイブリット酵素を慣築することによって、酸性条件に対してより高い酸性を得ることができることを示している。

Ｈ３〜Ｈ６の比活性Ｈ３〜Ｈ６β−グルカナーゼの比活性を、５（７１ＭＣａＣ１，を補充した２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ当たり１００μｇβ−グルカナーゼタンパク質の濃度で精製酵素の製剤を用いて、特に先に述べたようにして測定した。反応混合物を、２５°Ｃと５０°Ｃとでそれぞれ２０分間インキュベートし、次いで、１ｍｇの酵素当たり１　ｍｉｎで放出されるグルコースのμｍｏｌｅ数で比活性を測定した。得られた結果を以下の表に示す。

表ＶＨ３〜Ｈ６、Ｈｌおよび自然のハシラスβ−グルカナーゼの比活性（μｍｏｌｅ　グルコース１ｍｇｎ製酵素−’−ｍｉｎ　−’）下記温度における比活性 β−グルカナーゼ　２５°Ｃ５０℃ Ｈ３７９０１７００Ｈ４８５０２６００Ｈ５６１５１８９０Ｈ６２０４０３７５０ＨＩ　２１３０　３６９０ビー・サチリス　１４２０　２６００ビー・マセランス　３５０　１＋８０ビー　・　アミ０リクエフアンエンス　１３２０　２４９０上記の結果から、２５°Ｃにおいて、ハイブリッド酵素Ｈ６は、親バシラス酵素とビー・サチリスβ −グルカナーゼのいずれよりも著しく高い比活性を存することは明らかである。

一般に５０°Ｃにおける比活性は、２５°Ｃにおける値より高く１．５〜３倍であった。またこの温度では、Ｈ６の比活性は、親酵素と自然のパンラス・サチリスβ−グルカナーゼより大きい。ハイブリッド酵素Ｈ１も１両方の温度でＨ６酵素と同程度の高い比活性を示した。

ハイブリッドβ−グルカナーゼＨ３〜Ｈ６の熱安定性。

精製ハイブリッド酵素の熱安定性を、特に実施例３に記載の方法にしたがって、先に述べたバシラス種由来の精製自然酵素の熱安定性と比較して測定した。その酵素活性は、６５°Ｃ，Ｉ）８４．１および７０’Ｃ，ｐＨ６，０で測定した。

酵素の濃度は１ｏｏμｇ／ｍｌ検定緩衝液であって。反応混合物の試料は、図１３と１４に示す時間間隔で集め結果を要約した。ハイブリッドβ−グルカナーゼのＨ３、Ｈ４およびＨ５が、自然酵素と比べて、６５’Ｃ，Ｉ）Ｈ４，Ｉにおいて、明らかに著しく高い安定性を示した。Ｈ３とＨ４の初期酵素活性の９０％以上およびＨ５の同活性の８５％が６０分後に残った。７０°Ｃ５ｐＨ６，ｏでは、Ｈ３の６０分後の残留酵素活性は８５％であった。これに対して、自然酵素の６５℃、ｐＨ４，１における６０分後の残留活性は、ビー・アミロリクエファシェンスとビー・サチリスの（１，３−１，４）−β−グルカナーゼについてはわずかに約ｌＯ％であったが、ビー・マセランスβ−グルカナーゼは１０分後に完全に不活性化した。７０°Ｃ，ｐＨ６，０では、ビー・サチリス、ビー・マセランスおよびビー・アミロリクエファシェンスの酵素は、６０分間のインキュベーションの後、１０％より少ない活性しか残らなかった。

実施例６大麦β−グルカンの、マツソング中での加水分解反応に対する、Ｈ３ハイブリッド（１，３−１，４）−β−グルカナーゼの作用。

マソンング工程中に大麦β−グルカンを分解するＨ３″／Ｘイブリッド酵素の効率を、市販のβ−グルカナーゼ製品の効率と比較する実験を実施した。マツソング混合物は、２００　ｍｌの予め加温された水道水（３７°Ｃ）を添加した５０ｇの粉砕麦芽で構成されていた。この基質混合物に対し、Ｈ３酵素の精製製剤５ μｇを混合しながら添加した。対照として、２つの類似のマツソング混合物を作製した。その１つには、５μｇのパンラス・サチリスβ−グルカナーゼを含有する市販のβ−グルカナーゼ製品Ｃｅｒｅｆｌｏ　２００１　（Ｎｏｖｅ−Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ）の量を添加して作製した。最後のマツソング混合物は、β− グルカナーゼを含む添加しない負の対照である。このように作製した混合物を３７°Ｃで約５０分間放置してマツソングを開始し、その後、図１５に示す温度曲線にしたがって、１７５分後まで加熱した。６５分間〜１８５分間の期間、図１５に示す時間間隔をおいて試料を混合物から取出した。このマツソング期間に続いて、４．６および２４時間後に、別の試料を取出した。

取出した試料は、直ちに水中で冷却し、４０″Ｃで遠心分離し、上澄み液を新しい試験管に移し、沸騰水中で１５分間インキュベートして酵素を不活性化した。

次で試料を、Ｊφｒｇｅｎｓｅｎが報告した方法（Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　５３巻、２７７−２８５頁および２８７−２９６頁１９８８年）にしたがってカルコフラワー（ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ）複合物生成反応とフローインジェクション法を利用して、残留β−グルカンを検定した。

マツソング実験の結果を図１５に要約し、上記マツソング混合物中の残留β−グルカンの量を示した。β−グルカナーゼを添加すると、負の対照と比較して混合物中のβ−グルカンの量が著しく低くなることは明らかである。市販のβ−グルカナーゼ製品は、温度か約６７°Ｃをこえるとβ−グルカンを加水分解しなくなったか、同濃度で添１１１１　ｔ、たハイブリッド酵素Ｈ３は、温度条件にかかわらず全インキュベーション期間を通して、連続してβ−グルカンを分解した。

Ｈ３酵素は活性か大きく、マツソング工程終了後の残留β−グルカンの量が１００　ｍｇ／　Ｉより少なく、これに比べて、自然の対照混合物では約１６００ｍｇであり、市販のビー・サチリスβ−グルカナーゼの混合物ては約６００　ｍｇ／ｌであった。Ｈ３ハイブリッド酵素を添加した混合物は、マツソングと静置の２４時間後、特に残留β−グルカンは検出できなかまた。

同じ実験中に、Ｈ３ハイブリッドβ−グルカナーゼとビー・サチリスβ−グルカナーゼをそれぞれ２５０ｇｇづつ添加した純品のβ−グルカン溶液中の残留β− グルカンの量を分析した。

その溶液は、５０ｍ１のβ−グルカン（１，５ｍｇ／ｍｌ）を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５，５，５ｍＭＣａＣ１ｚで構成されていた。これら溶液は酵素を添加するまえに３７°Ｃに予め加温した。

文１献Ａｒｇｏｎ、　？、、　Ｍ、Ｇ、　Ｒｏｍｓａ＋ａｎｎ、Ｖに、　Ｇｒａｕ、Ｈ，Ｚｕｂａｒ　＆　Ｊ　、Ｄ　τｒａｅｓｃｈＬｎ（１９７９）　τｈ＠ｒ＋ａａＬ　５ｅａｂｉＩＬｅｙ　ａｎｄ　ｐｒｏｅａＬｎ　５ｅｒｕｃｅｕｒｓ、ＥＬｏｃｈｅａｉｙ：ｒｙｌＢ、　５６９ｇ−５７０１Ｂｏｌｉｖａｒ、　Ｆ、、　Ｒル、　Ｒｏｄｒｉｇｗｚ、　１’、Ｊ、　Ｇｒｏａｎｓ、に、Ｃ，ＢａｃＬａｃｈ、Ｈ，Ｌ。

Ｈａｙｒｎｋ＠ｒ、Ｈ，’Ｊ　Ｂｏｙｓ　（１９７７）：　Ｃｏｎ＊ｅｒｕｃｅＬｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃ＋：ａｒＬｚａｅＬｏｎ　ｏ■ ｎｅｗｃｒａｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅ、Ｈ，＾＋ｆｕＬｅｉｐｕｒｐａｇ＊ｃｌｏｎｉｎｇｍｙｓｔａｃａ、Ｇａｎｇ２゜５−Ｌ１２ＢｏｒｒｏＳｓ、Ｒ，（１９８１）：　ＰｕｒｉｆｉｃａｅＬｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｅａｒＬｚａｅｉｏｎ　ｏｆ　ａｎａｘｅｒａｅ＊ＬＬｕｌａｒ　ｂ＠ｃａ−ｇＬｕｃａｎＡｓａ　ｅτｏｓ　！Ｊａｃ１１１ｗ　ＩＫＥＴ　Ｂ５７６、　Ｚ、　ＡｕｇＭＬＪｃｒｏｂＬｏｌｏｇＬａ２１，７−１７Ｂａｔｒｉｘｓ、　Ｒ，＆　Ｋ、Ｌ、　５ｃｈｒｏ＠ｄ＠ｒ　（１９８１３：β−Ｌ、］−１．４−ｇＬｕｅａｎａｓｅ　Ｌｎｓｐａｒ・ｆｏｎｍｉｎｇ　ｍｉｃτｏｏｒｇｉｎｉｘｍｓ、Ｖ、　τｈａ　５ｆｆｉｃｉ＊ｒ＋ｅｙ　ｏｆ　β−ｇｌｕｃａｎａｓ・　Ｌ■ ｒｅｄｕｃｉｎｇ　ｅｈ＊　ｖｉｉｃｏｓｉｅｙ　ｏｆ　ｗｏｒｅ、Ｚｂｌ、ｊａｋｅ、ＩＩ　Ａｂｃ、１３６．　３３０４４０ＢｏｔｒＬｓｓ、　艮１．１４．　ＢＡｕａｌａｉｎ　＆　Ｊ、ＨｏｆａｍａＬｇｃｓｒ　（１９８５）：　ＬｘフｒａｍｇＬｏｒ＋　１ｎＥｚｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｉｌ　ｏｆ　ａ　ｃＬｏｎ＠ｄ　β−ｇＬｕｃａｒｕｓ＊　ｇａｎｇ　ｆｒｏｅａ　ＥａｃｌｌｌｕｘａｔｘｙｌｏｌＬｑｕａｆａｃｉｅｎｚ、　Ａｐｐｌ、　ＮＬｃｒｏｂＬｏｌ、　ｊＬｏｃａｃｈｎｏｌ、　２２．６３−７１゜１１ｏｒｒｉｍ（Ｒ８Ｒ，ＫａｎｃｓｕｆｆｓＬ　＆　Ｊ、　Ｈｏｆ＊ｔｍ＊Ｌｓｔ＊ｒ　（１９１１ｇ）：にｏＬａｅｕｌａｒｃｒａｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ　ｇ＠ｎａ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｅｈ＊ｒｅａａｍｅａｂＬｓ　ｂｅセａ−ｇｌｕｃａｎａｓａ　ｆｒｏｍＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｘａｃｍｒａｎｚ、　Ｊ、　Ｍａｊｉｃ　／４Ｌｃｒｏｂｌｏ１．２Ｂ、　］−Ｌ１０Ｂｒａｄｆｏｒｄ、に　Ｍ　（１９７６）：　Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓａｗｉｅＬｖ＊　＋ｍ＊ｅｈｏｄ　ｆｏｒ　＊＊ｑｕａｎｅｉＨｉ＋：Ｌｏｎ　ｏｆ　＋ｍｉｃｒａｇｒａ＋ｍ　ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　ｃｈ■ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｏｆ　ｐｒｏｃｓｉｎ　ｄｙ＠ｂＬｎｄＬｎｇ、　Ｉ４Ｊ ′！Ｊ１．　Ｅｉｏｃｈａｓｍ、　７２．２４１１−２５４K ＣａｎＩ：ｖ＠ＬＬ、　Ｂ、Ａ、　＆　Ｄ、Ｊ、　ＭｃＣｏｎｎａｌｌ　（１９ｇ３）　：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃＬａｍｎｇ　ａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｅａｃｌｌｌｕｓ　ｊｕｂｅｉｌｌｒ　β−ｇｌｕｃａｎａｍｓ　ｇｏｎｅ　Ｌｎ　ＫｓｃｈｍｒＬ−ζｈＬａ　ｅｏｌＬ、Ｃｒａｎｅ　２コ、２ＬＬ−２１９゜口Ｄ　Ｐａｅ＠ｎｃ　ＡｐｐＬｉｃａｅｉｏｎ　Ｗｌ’　ａＬ２Ｎ／コＬ５　７０６　Ｌ。

にｏｄｆｒ＠ｙ、　τ　（１９１Ｄ）：　Ｏｎ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏＥ　ｋ＠ｙ　ｃｈａｒａｃｃ＊ｒＬｍｃＬｃｘ　ｏＥｉｎｄｕｓｅｒｉａｌ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｂｙ　ｅｙｐｓ　ａｎｄ　５ｏｕｒｃｅ、Ｇｏｄｌ！ｒａｙ、τ、＆　Ｊ、ＲａＬｃｈｓｌｃ（ａｄｓ）　ＩｎｄｕｎｃｒｉａＬ　ＥｎｚｙｔｍｏＬｏｇｙ、　ＫａｃＭＬＬＬａｎ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　ｐ、　４６６゜１４ａｎａｈａｎ、Ｄ、（１９１＋５）：τａｅｈｎｉｑｕ＊５ｆｏｒ＋：ｒａｎｓｆｆａｎｍａｅｉｏｎｏｆＥ、ｃｏＬＬ。

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２［！Ｚ、［ｌ−２８５２゜Ｔｈｏｍｅｎ、　Ｋ、に、　（１９８３）：　Ｍｏｕｓｅ　ａ−ａｊＩｙｌａｍｓ　５ｙｎｅｈａｍＬｚａｄ　ｂｙ　！；ａｃｃｈａｒｏｒ■凵| ｃｍｚ　ｃｅｒｍｖｉｓｉａｅ　ｉｓ　ｒｅｌｅａｓｅｄ　Ｌｎｅｏ　ｅｈｅ　ｅｕｌｅｕｒ＊　ｍ＊ｄｉｕ＋ｍ、　ＣａｒｌｘｂｅｒｇＲａｇ、Ｃｏｒｒｍｕｓ、Ａ１１．５４５−５５５゜シａｎｉｓｈ−Ｐａｒｒｏｎ、Ｃ，、Ｊ、ＶｉａＬｒａ　＆　Ｊ、Ｍａｓｓｉｎｇ　（１９１１５）：　Ｚ＋ＩＩ′Ｐｒｏｖ＊ｄ　Ｍ↓ゴｐｈａｇ＠　ｅｌｏｎｉｎｇ　ｖ＊ｃｃｏｒｇ　ａｎｄ　ｈｏｓｅ　５ｅｒａｉｎｘ：　ｎｕｃｌ＊ｏｅＬｄ＊　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆｅｈｓ　Ｎ１３　ｒｘｐＬＢ　ａｎｄ　ｐＵｃＬ９　ｖ＊ｅｅｏｒｇ、　Ｇａｎｇ　３３．１０３−１１９゜ＩＪ＊ｃｋ、　？−，τ、　Ａｐｐ＠ｒｓｏｎ、Ｎ、　ＳｅａｂｂＬｎｇ、　Ｈ，Ｍ、　Ｓｈ＊ｐｈａｒｄ、　Ｄ、Ｖ、　Ｇｏ＊ｄｄａＬ（１９！１１）　：　ＡｎＩ：１ｖｉｒａＬ　ａｃｅｉｖｉｅＬａｍ　ｏｆ　ｈｙｂｒｉムｏｆ　ｅｖｅ　ｍｊｏｒ　ｈｕｚａａｎ１＠ｕｋｏｅｙｃ＠　１ｎｃａｒｆ＠ｒｏｎｓ、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｅ：Ｌｄｚ　Ｒｍｇ、９．　６１５３−６１６５゜Ｙｏｎ、　Ｊ−＆　Ｍ、　Ｆｒ１ａｄ　（１９＋１９）：　Ｐｒｅｃｉｓｅ　ｇ＠ｎ＠ｆＬＬｊＬｏｎ　ｂｙ　ＰＣＲ，ＮｕｃｌａＬｃＡｃｉｄ　Ｒａｔ、１７．４８９５゜Ｚｈａｎｇ、Ｈ，、Ｒ，５ｃｈｏｏ１．　Ｊ、Ｂｒｏｗｎｓ　＆　Ｃ，５ｏａａｎ＊ｒｖｉｌｌｓ　（１９８１＋）＋　Ｄｏｕｂｌｅｇｅｒｉｎｄｓｄ　５ｅｑｕ＠ｎｃｉｎｇ　ａｓ　ａ　ｅｈｏｉｅｅ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、　ＮｕｃｌｅＬｃＡｃｉｄｓ　Ｒａｇ、１６．１２２０゜７０℃、　ｐｌ＋６．　（１におけるインキュベーション時間（ｍｉｎ）６５℃、　ｐｉ！（ｉ、　０におけるインキュベーション時間（ａ＋１ｎ）インキユベーシヨン（ｍｉｎ）Ｈ６５℃、　ｐｌ＋４．０におけるインキュベーション時間軸】ｒｌ）ｐＨｔ品度　°ＣＦｉｇ、　１４７０°Ｃ、ｐＨ６，０１０２０３０４０５０６０（ｍｉｎ）、＼補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７）平成３年８月１３日

Claims

【特許請求の範囲】１．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜１ｍｇで、６．０以下のｐＨおよび６５℃以上の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１０分間以上インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４） −β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．３ｍｇ〜１ｍｇで、ｐＨ６．０および７０℃にて、１０ｍＭＣａＣｌ２、４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１０分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が（１．３−１．４）−β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）− β−グルカナーゼ。３．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜１ｍｇで、６．０以下のｐＨおよび６５℃以上の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１５分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が（１．３−１．４）−β− グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。４．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．３ｍｇ〜１ｍｇで、ｐＨ６．０および７０℃にて、１０ｍＭＣａＣｌ２、４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１５分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４）−β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４） −β−グルカナーゼ。５．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜１ｍｇで６．０以下のｐＨおよび６５℃以上の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１８分間インキュベートした後、酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が（１．３−１．４）−β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。６．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．３ｍｇ〜１ｍｇで、ｐＨ６．０および７０℃にて、１０ｍＭＣａＣｌ２、４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で１０分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも５０％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４）−β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項５記載の熱安定性（１．３−１．４） −β−グルカナーゼ。７．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜１ｍｇで、６．０以下のｐＨおよび６５℃以上の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で３０分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも８５％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４）−β −グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。８．インキュベートされる溶液の酵素濃度範囲が１ｍｌ当たり０．０５ｍｇ〜１ｍｇで、６．０以下のｐＨおよび６５℃以上の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で６０分間インキュバートした後、その酵素活性の少なくとも８５％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４）−β −グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項７記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。９．インキュベートされる溶液の酵素濃度が１ｍｌあたり０．１ｍｇで、４．１のｐＨおよび６５℃の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中でインキュベートした後、その酵素活性の少なくとも８５％を保持し、その酵素活性が、（１．３−１．４）−β−グルカン類のβ−グルコシド結合を加水分解する性能と解される請求項７または８に記載の熱安定性（１．３− １．４）−β−グルカナーゼ。１０．その酵素活性の少なくとも９０％を保持している請求項９記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１１．インキュベートされる溶液の酵素濃度が１ｍｌ当たり０．１ｍｇで、６．０のｐＨおよび７０℃の温度にて、５〜１０ｍＭＣａＣｌ２、２０〜４０ｍＭ酢酸ナトリウム中で３０分間インキュベートした後その酵素活性の少なくとも８５％を保持している請求項７記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１２．３０分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも９０％を保持している請求項１１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１３．６０分間インキュベートした後、その酵素活性の少なくとも８５％を保持している請求項１１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１４．粗細胞抽出物中で６５℃およびｐＨ６．０にて１０分間インキュベートした後、少なくとも１００％の相対β−グルカナーゼ活性を有する請求項１〜１３のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１５．粗細胞抽出物中で６５℃およびｐＨ６．０にて１０分間インキュベートした後、少なくとも１１０％の相対β−グルカナーゼ活性を有する請求項１４記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１６．粗細胞抽出物中で６５℃およびｐＨ６．０にて１０分間インキュベートした後、少なくとも１２０％の相対β−グルカナーゼ活性を有する請求項１５記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１７．式：Ａ−Ｍ（式中、Ａは表Ｉと表ＩＩに示すバシラス・アミロリクエファシエンスもしくはバシラス・マセランスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドであり、およびＭは表Ｉと表ＩＩに示すバシラス・マセランスもしくはバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＣ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドである）で表されるアミノ酸配列からなる請求項１〜１６のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１８式：Ａ−Ｍ（式中、Ａは表Ｉと表ＩＩに示すバシラス・アミロリクエファシエンスもしくはバシラス・マセランスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも８５％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドであり、およびＭは図３と図４に示すバシラス・マセランスもしくはバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＣ末端部のアミノ酸残基と少なくとも８５％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドである）で表されるアミノ酸配列からなる請求項１７記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。１９式：Ａ−Ｍ（式中、Ａは表Ｉと表ＩＩに示すバシラス・アミロリクエファシエンスもしくはバシラス・マセランスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも９０％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドであり、およびＭは表Ｉと表ＩＩに示すバシラス・マセランスもしくはバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＣ末端部のアミノ酸残基と少なくとも９０％同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドである）で表されるアミノ酸配列からなる請求項１８記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２０．Ａが、表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一および特に少なくとも９０同一の５〜２００のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項１７〜１９のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２１．Ａが、表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、および特に少なくとも９０％同一の１６のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項２０記載の熱安定性（１．３− １．４）−β−グルカナーゼ。２２．Ａが表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、および特に少なくとも９０％同一の３６のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項２０記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２３．Ａが、表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、および特に少なくとも９０％同一の７８のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項２０記載の熱安定性（１．３− １．４）−β−グルカナーゼ。２４．Ａが、表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、および特に少なくとも９０％同一の１０７のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項２０記載の熱安定性（１．３ −１．４）−β−グルカナーゼ。２５．Ａが、表Ｉに示すバシラス・アミロリクエファシエンスの（１．３−１．４）−β−グルカナーゼのＮ末端部のアミノ酸残基と少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、および特に少なくとも９０％同一の１５２のアミノ酸で構成されているポリペプチドである請求項２０記載の熱安定性（１．３ −１．４）−β−グルカナーゼ。２６．酵素のＮ末端に連結されたシグナルペプチドを有する請求項１〜２５のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２７．サッカロミセス種のような酵母由来のシグナルペプチドを有する請求項２６記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２８．酵母α因子、酵母酸性ホスファターゼまたは酵母インベルターゼ由来のシグナルペプチドであるシグナルペプチドを有する請求項２７記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。２９．アミノ酸レベルで、バシラス・アミロリクエファシエンスのシグナルペプチドと少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一のシグナルペプチドを有する請求項２６記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナ−ゼ。３０．下記アミノ酸配列：【配列があります】またはその類似体からなる請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。３１．下記アミノ酸配列：【配列があります】またはその類似体からなる請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼ。３２．請求項１〜３１のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β −グルカナーゼをコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。３３．下記ヌクレオチド配列：【配列があります】またはその類似体もしくはサブ配列からなる請求項３２記載のＤＮＡ断片。３４．熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを発現できるようなしかたで、請求項３２もしくは３３で定義されたＤＮＡ断片を導入された微生物を培養することからなり、その培養を、熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを産生させその（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを培養物から回収する条件下で行う請求項１記載の熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼの製造方法。３５．微生物が細菌である請求項３４記載の方法。３６．細菌がグラム陰性菌である請求項３５記載の方法。３７．グラム陰性菌がイー・コリ菌株である請求項３６記載の方法。３８．イー・コリ菌株が、受託番号ＤＳＭ５４６１でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＵＣ１３−Ｈ１を有するイー・コリ菌株またはその変異体もしくは変種である請求項３７記載の方法。３９．イー・コリ菌株が、受託番号ＤＳＭ５７９０でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ３を有するイー・コリ菌株またはその変異体もしくは変種である請求項３７記載の方法。４０．イー・コリ菌株が、受託番号ＤＳＭ５７９１でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ４を有するイー・コリ菌株またはその変異体もしくは変種である請求項３７記載の方法。４１．イー・コリ菌株が、受託番号ＤＳＭ５７９２でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ５を有するイー・コリ菌株またはその変異体もしくは変種である請求項３７記載の方法。４２．イー・コリ菌株が、受託番号ＤＳＭ５７９３でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ６を有するイー・コリ菌株またはその変異体もしくは変種である請求項３７記載の方法。４３．微生物が酵母である請求項３４記載の方法。４４．酵母がサッカロミセス種である請求項４３記載の方法４５．サッカロミセス種がサッカロミセス・セレビシエである請求項４４記載の方法。４６．請求項３２または３３に定義されたＤＮＡ断片を発現できる真核生物もしくは原核生物。４７．微生物である請求項４６記載の生物。４８．細菌である請求項４７記載の微生物。４９．グラム陰性菌である請求項４８記載の細菌。５０．イー・コリ菌株である請求項４９記載の細菌。５１．受託番号５４６１でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＵＣ１３−Ｈ１を有するイー・コリ菌株ならびにその変異体および変種。５２．受託番号ＤＳＭ５７９０でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ３を有するイー・コリ菌株ならびにその変異体および変種。５３．受託番号５７９１でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ４を有するイー・コリ菌株ならびにその変異体および変種。５４．受託番号５７９２でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ５を有するイー・コリ菌株ならびにその変異体および変種。５５．受託番号５７９３でＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、プラスミドｐＴＺ１９Ｒ−Ｈ６を有するイー・コリ菌株ならびにその変異体および変種。５６．酵母である請求項４７記載の微生物。５７．サッカロミセス種である請求項５６記載の酵母。５８．サッカロミセス・セレビシエである請求項５７記載のサッカロミセス種。５９．植物である請求項４６記載の生物。６０．エンバク、大麦、ライ麦、小麦、米またはトウモロコシである請求項５９記載の植物。６１．基質を６５℃以上の温度にして、ある期間、請求項１〜２２のいずれか１つに定義した熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼの有効量の作用に付することからなり、（１．３−１．４）−β−グルカナーゼの量が、基質の１ｋｇ当たり、多くても２００μｇ、好ましくは多くても１００μｇ、さらに好ましくは多くても５０μｇ、さらに好ましくは多くても２０μｇ、および最も好ましくは１５μｇである基質内の（１．３−１．４）−β−グルカン類を分解する方法。６２．基質が、大麦、エンバクなどの殻粒由来の、未修飾で生の殻粒もしくはその一部分からなる請求項６１記載の方法。６３．（１．３−１．４）−β−グルカン類を含有する基質を、請求項１〜２２のいずれか１つに定義した熱安定性（１．３−１．４）−β−グルカナーゼを含有する、トウモロコシ、米もしくは小麦由来の第２基質と混合する請求項６１または６２に記載の方法。６４．ウワートを、マッシング中に、６５℃以上の温度および４〜５．５のｐＨで、請求項１〜２２のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β− グルカナーゼで処理することを特徴とするビールの製造方法。６５．温度が７０℃以上である請求項６４記載の方法。６６．動物飼料に、給餌された動物の胃腸管内でβ−グルカン類を充分に分解する量の請求項１〜２２のいずれか１つに記載の熱安定性（１．３−１．４）−β −グルカナーゼを補充することを特徴とするβ−グルカン類を含有する動物飼料の製造方法。６７．動物飼料がペレット化されている請求項６６記載の方法。