PT93181A - Processo para a preparacao de (1,3-1,4)-beta-glucanase e a aperfeicoamentos relativos a enzimas - Google Patents

Description

CftHPQ DQ INVENTO O presente . invento diz respeito a novas (1,3-1,4)-—B-glucanases termoestáveis, à utilização das novas (1,3-i ,4)-|3--glucanases termoestáveis, fragmentos de DMA codificadores de tais glucanases, organismos que e>cpressam os fragmentos de DNA e um método para a produção de (1,3—1,4)~!5~glueanases termoestáveis.

FUNDAMENTD TÉCNICO

As (1,3-1 ,4>-í5-glucanases são usadas na produção de diferentes produtos alimentares e alimentos para animais e como materiais subsidiários em investigação biológica quando fSr necessário clivar as ligações β-glicosidicas em (1,3-1,4)-f5-glu-canos. Especialmente na indústria cervejeira a utilização de tais enzimas que hiarolizam glucanos permite a aplicação de maiores proporções de grão em substituição do uso de malte, sem que isto cause qualquer problema na filtração devida à elevada viscosidade do material triturado que pode ser causada por uma maior quantidade de compostos glucano» i r reve r s i ve1men te

Os Π ,3-1,4)-|5-glucanos mistos constituem a maior parte das paredes celulares do endosperma de cereais tais como aveia e cevada» Eles podem causar vários problemas na indústria cervejeira tais como um rendimento reduzido da extracto e velocidade inferiores dé separação do mosto ou da filtração da cerveja» Os vestígios de B-glucanos na cervaja acabada pode conduzir a formação de turvações e precipitados gelatinosos (Sodfrey, 1983). As (1,3-1,4}~S3~giucanases de cevada (Ec 3*2» 1*73) são sintetiza-dos no escutelo e na camada de aleurona durante as fases iniciais da germinação de sementes (McFadden et ai», 1888). No entanto, uma grande proporção da β-glucanase de mal te é sp

inactivada pelo calor durante a secagem e a restante activídade é rápidamente destruída durante a amassadura (Loi et al., 1987).

Desde há muito é conhecida que a viscosidade de mosto pode ser reduzida, através da utilização de β—glucanases de estirpes nesofíiicas de Baci1lus amyboliqugfaciens ou de Bacillus subtil is. Uma desvantagem séria relativa às glucanases conhecidas é a sua sensibilidade á temperatura., o que implica que eles slo eficazes apenas durante a fase inicial do processo de trituração. Posteriormente ou quando as temperaturas estio acima de é>5°C a sua activídade é substancialmente reduzida,

Numa tentativa para obter uma glucanase mais termoestá-vel, o gene de Bacillus macerans codificador de glucanase foi introduzido em Baci11us subtilis para expressar o gene neste organismo (Pedido de Patente DD WPC12N/315 7Θ6.1), No entanto, a 7Θ°0 esta glucanase é também rápida e irreversivlmente desnaturada» Uma outra desvantagem para as glucanases conhecidas em relação ao processo da produção de cerveja é que estas glucanases não exercem a sua activídade total na gama de pH de 4 a 5 que é a condição normal durante a amassadura. Por exemplo a activídade da {IB—glucanase de Bacil lus a pH 4,6 è de apenas 2€*% da observada entre pH & e 7, Ainda, a estabilidade é reduzida quando a glucanase é incubada a pH 4.

As < 1,3-t ,4) -β-qlucanses bacterianas melhor caracteri-zadas são as de Bac i11us subtil is e de B.amvlollouefaciens em que os genes codificadores das enzimas foram danados e sequenciados ^ (Borxss et al „, Í985p Cantwell e McConnell, 1983? Hofeneister et al=, 1986? Murfly et al,, 1984). Foi demonstrado recentemente que a (!—glucanase de B»macerans é mais termoestável que as enzimas de B. subtil is e de B-amvlol iouef aciens (Borriss, 1981 [i Borriss e Schroeder, 1981), No entanto -as temperaturas- que

excedem 65°G e valores de pH ds. 4,5 a 5,5,' que são típicos da amassadura industrial, a β-glucanase de B-macerans ê rápidamente inactivada. 0 gene da fê-glucanase de B,roacerans foi clonado (Borriss et al., 19SS) e a sua sequência da nucleotídeos determinada CBorriss et ai», em prep»>» A comparação da sequência de aminoácidos derivada da $~glucanase de B.roacerans com as sequências derivadas das [s-glucanases de B,subtil is e ds B.amyioli-ouefaciens revela uma homologia global de 7<3%»

Durante os últimos anos foram várias tentativas para construir formas melhoradas de proteínas existentes biológicamente activas para as tornar mais adequadas aos processos industriais e para alargar a sua gama de aplicação» Tem sido alvo de interesse crescente a termoestabilidade das enzimas» Foi proposto que a termoestahilidade das enzimas pode ser aumentada por substituições de um simples aminoácido que decresça a entropia da desenrolamento (Matthews et al», 1987)» Têm sido descritos vários métodos para aumentar a termoestabilidade das proteínas (Argos et al», 1979§ Imanaka et al», 1986? Querol and Parilla, 1987) nas previsões precisas para alterações da função como consequência de alterações estruturais permanecem mal compreendidas » Vários investigadores efectuaram experiências com recombinação in vitro de genes homólogos dando origem a proteínas híbridas mantendo a actividade biológica das moléculas parentais» Streuli et al» <1986) assim como Weck e colaboradores (1981) construíram genes híbridos de interferões de leucócitos humanos. Alguns dos interferões híbridos prolongaram a gama de células hospedeiras no que respeita è. proteeçlo contra os vírus da Estornai! te Vesicular e da Eucefalomiocardite» Assim os híbridos Ad combinando porções dos interferões A e D induziram actividades antivirais significativamenis superiores do que qualquer molécula

—ó— parenteral em células células primárias de estabilidade ao pH e para as moléculas- de L-929 de ratinho, células He-La humanas e rim de coelho. A estabilidade ao calor, especificidade antigénica foram as mesmas in-terferSo híbridas e parenterais, O Pedido de patente Dinamarquesa 3368/87 divulga a combinação de sequências de DMA dos genes das a~a.mil ases Bac i 11 us 1 ichemiformis e de Bacillus acnvloliguefaciens de modo a obter uma enzima a-amilase quimérica para a liquefação de amido, o qual não tem um efeito negativo na percentagem máxima por peso da dextrase obtida por sacarificação com uma glicoamilase. Este efeito negativo foi reduzido com a a-amilase quimérica e as propriedades termoestáveis foram mantidas em comparação com as enzimas parentais.

DIVULGAÇÃO DO INVENTO Q presente invento está relacionado com uma (1,3-1,4)--fl-glucanase termoestàvel que reiem pelo menos 50% da sua activi-dade após 1Θ minutos, de preferência 15 minutos, ainda melhor 18 minutos de incubação em 10 mM Ca01o, 40 mH Na-acetato pH 6,0 e 70°C, a solução incubada tendo uma gama de concentração de 0,3 a 1 mg de <1,3-1,4)-Pí-giucsnase por ml, a activida.de da (1,3-1,4)--β-glucanase sendo entendida como a capacidade da enzima para hidrolizar as ligações β-glicosidicas em (1,3-1,4)-|s-glucanos.

Mo presente contexto, o termo "termoestàvel" está relacionado com a capacidade de uma enzima para resistir à ^ desnaturação e para reter a actividade enzimática a altas tempe raturas durante um período de tempo suficiente para enzimas converter o seu substrato nos produtos de reacção, no presente caso para clivar as ligações β-glicosidicas em φ s*

(1,3-1,4)-(5-g1ucanos para obter açucares redutores» Por temperaturas altas entende-se temperaturas acima de 6Θ°C=

Num ouro aspecto? o presente inventa esá relacionada com uma <1,3-1?4)--í2-glucanase termoestável que após 1Θ minutos de incubação em extratos celulares brutos a 65°C e pH 4,0 tem uma actividade relativa de {5-glucanase de pelo menos 100%, de preparação pelo menos 110%., m-ais preferencialmente pelo menos 120%. Um exemplo de tal comportamento caraeterístico de < i ,3-1 ?4)—{5-glucanase do invento está apresentado na Fig.lO, onde a actividade relativa de (5-glucanase da enzima híbrida Hl ê comparada com as actividades relativas das íS-glucanases de B.amvloliquefadens e d® B.macerans. Ba Figura 10 torna-se claro que a. actividade relativa de (3-glucanase da enzima Hi é de aproximadamente 130% após 1Θ minutos de incubação.

Os presentes inventores construirão genes híbridos codificadores de (1?3—1s4)—β—g2ucanases recombinantes de Baci1— lus. as quais são mais termoestáveis do que quaisquer (1,3~1,4)--(5-glucanases até agora, conhecidas» Os genes híbridos foram construídos por trocas recíprocas das partes amino—terminais e carboxi-terminais dos genes codif icadores da {5-glucanase de Baci1lusamv1oliguefaclens e de Baci11us macerans usando um sítio comum da endonuclease de restrição Eco RV no meio do gene da í1?3—1?4)-β-q1ucanase em B.amyloliauefaciens e em B.macerans. respectivamente? como ponto de fusão ou por construção de genes híbridos de fusão usando a reacção de cadeias com polícnerase ÍFCR) de acordo com Yon & Fried (Nucteia ftcid Research? 1989? 17,4895) E Horton et al. (Gene? 1989? 77;61-éS)„ A enzima híbrida de f5~glucanase 1 (Hl) contem os 1Θ7 resíduos amino-terminais da B-glucanase madura de B,amv1o1iquefa-ciens e os 1Θ7 resíduos de aminoácidos carboxi-terminais da € ¥

|3-glueanase de B»macerans = Uma enzima híbrida recíproca da (3-giucanase 2 \'H2) consiste em Í05 resíduos de aminDácidos amino-terminais da enzima ds B.macerans a 107 resíduos de aminoâ-cidas carboxi-terminais de B.amv1o1iauefadens» As propriedades bioquímicas das duas enzimas híbridas diferem significativamente umas das outras assim como ds ambas as β-glucanases parentais» 'θ'

As enzimas híbridas H3S H4, H5 e H6 foram construídas usando PCRS H3 contem os 16 resíduos de aminoácidos amino-termi-nais da < 1,3-134)~f5~glucanase madura de B..amvloliauefaciens e os 198 resíduos de aminoácidos carboxi-terminais da jl-glucanase de B.maceranss H4 contem os 36 resíduos de amino-âcidas amino-termi-nais de jl-glucanase madura de B.amvloligusfaciens e os 178 resíduos carboxi-terminais de B.maceranss H5 contem os 78 resíduos de aminoácidos amino-terminais da 11 »3-1 ?4>-|3-glu.canase madura de B»amvloliouefaciens e os 136 resíduos de aminoácidos carboxi-terminais da Ji-glucanase madura de B.maceransp e H6 contem os 152 resíduos amino-terminais da fí—glucanase madura de B.amyloliquefaciens e os 62 resíduos de aminoácidos carboxi-ter-minais da (1,3-134)-p--glucanase madura de B.macerans.

Comparadas com as enzimas parentais as proteínas híbridas apresentam novas propriedades bioquímicas tais como diferentes p-Hs óptimos* termoestabilidade e diferentes de tolerância ao pH. A proteína Hl á ds especial interesse para a indústria cervejeira uma vez que nesta proteína a tolerância a pH mais baixo ε a um pH óptimo baixo da acfcividade enzimática foi combinada com uma termoestabilidade que excede a da B-glucsnase de B.macerans a pH alto» 0 pH óptimo e especial mente a. tolerância ao pH foi deslocada para condições mais acídicas e a termoes-tabilidade ultrapassa a de ambas as enzimas parentais ao longo de toda a gama de pH testada. 9- •r. *

No entanto5 as propriedades da í 1,3—1 , 4 > —(3—glucanase termoestável do invento também a torna interessante para usar a enzima com diferentes finalidades sempre que seja desejável obter actividade enzimática de (1,3-1,4í-i5-çlucanase a temperatura elevada e possivelmente a pH haixa,e«g. na produção de substitutos do café ou granulados para alimentação, especialmente para usar na alimentação de aves de aviário. As aves não conseguem degradar B-glu.canos das rações e os granulados contendo quantidades elevadas de B-glucanos provocam taxas reduzidas alimento/gan-ho de peso e também perturbações digestivas.

Portanto 5 é vantajoso degradar os (3-glucanas nos alimentos através da adição de C1,3-1,4)-fê-gIucanases aos alimentos. A produção de granulados tem lugar a altas temperaturas significando que as (1,3-1 ,4)-j3-glucanases não termoestáveis são rápidamente degradadas. No entanto., este problema p-ode agora serres olvido usando a < 1 ,3-1 ,4)-|í-g lucanase termoestável do invento na produção.

Podem ser seguidas diferentes estratégias na construção de um gene híbrido codificador de uma ¢1,3-1,4)-β-g1ucanase termoestável. Podem ser usados outros sítios de restrição no gane da < 1,3-1,4)-(5-g lucanase; a sequencia de nucleotideos do gene da (1,3-1,4)-{5-glucanase pode ser digerido por nucleases seguido da introdução de sequ§'ncias núcleotídicas sintéticas contendo sítios úteis para endonucleases de restrição; ou pode ser construído um gene total ou parcialmente sintético. Também, os genes de (1,3-1,4>-β—glucanases derivados de outros organismos além de B.amy 1 o 1 iauefaciens e de E*.macerans podem ser usados para se obter um gene híbrido codificador de uma í 1,3-1,4)-{5-glucanase te rmoestâve1.

Assim, num outro aspecto do presente invento está relacionado com uma (1,3-t ,4>-(S-glu.canase híbrida termoestáve 1 compreendendo uma sequência de aminoácidos com a fórmula

A - M onde A é um polipeptideo consistindo em 5-200 aminoácidos que são pelo menos 75% de preferência pelo menos 85%, ainda mais preferido pelo menos 9®% idêntico dos resíduos de aminoácidos da parte N-terminal da < 1,3-1 ,4>-{3“-glucanase de Bacillus amvioliavefaciens ou de Bacillus macerans como está apresentado na Fig.3 e H é um polipeptideo consistindo em 5 a aminoácidos que são pelo menos 75%, de preferência pelo menos 85%, ainda mais preferido pelo menos 90% idênticos aos resíduos de aminoácidos da parte cartaoxi-terminal da {1,3-1,4)~{3-glucanase de Bacil lus macerans ou de Bacillus amvloliouefaciens como se mostra na Fig.3» 0 termo "idêntico aiS refere-se a uma comparação da compposição sobrepónivel da aminoácidos em dois ροϊipeptídeos ou. partesdelas. Em cada um dos polipeptídeos foi determinado o número de resíduos de aminoácidos individuais assim como o número total de resíduos de aminoácidos» Em seguida, o grau de identidade foi dado pela razSo entre o número de resíduos de aminoácidos idênticos nos dois polipeptídeos e o número total de resíduos de aminoácidos no polipeptideo a ser comparado» Assim, no presente contexto, o grau de identidade é determinado como a percentagem dos aminoácidos na (1,3-1,4)-β-glucanase do invento ou. parte dela, os quais são idênticos aos aminoácidos num outro polipeptideo ou parte dele, no presente caso a parte amino--terminal da {1,3-i ,4)-|3-glucanase de B.amvloliauef aciens ou de B.macerans conforme apresentado na Fig.3 e a parte carboxi terminal da íi,3-1,4>-B~glucanase de B.macerans ou de B.amvlol1-guefaciens conforme apresentado na Fig.3» em relação ao número -11-

St. "·»

total de resíduos de aminoácidos na parte comparada da (1,3-1,4)--jl-~glucanase» Deve ser reconhecido que a identidade não está dependendo da posição dos aminoácidos nos polipeptídeos e ê absoluta no sentido de a identidade nSo estar relacionada com possíveis funções homólogas de dois aminoácidos com diferente fórmula química»

No presente contexto, a parte amino-terminal de um polipsptidea é compreendida como a parte do polipeptideo em questão ou uma fracção dela., medida em número de aminoácidos, a qual possui um grupo -NH,, livre no seu extremo» A parte carboxi--terminal de um polipeptideo é compreendida como a parte do polipeptideo em questão ou uma fracção dela, medida em número de aminoácidos, a qual possui um grupo -COOH livre no seu extremo»

Num aspecto do invento, um peptídeo sinal que permite o transporte para fora da célula pode ser ligada aa extremo amino— "terminal da Ci,3-1,4)—β—glucanase termoestável» 0 peptídeo sinal pode ser seu codificador pela parte relevante dos genes da < 1,3-1,4>-{5-glucanase nativa em bactérias ou outros microorganis-mos tais como leveduras e fungos? ele pode ser de origem sintética ou uma combinação destas fontes» A escolha do peptídeo sinal depende do microorganismo usado para a expressão da <1,3-1,4)-(3--glucanase termoestável» De preferência, o peptídeo sinal é um peptídeo sinal homólogo do microorganismo em questão? e.g» quando se usa uma levedura para expressão o peptídeo sinal deverá ser homólogo da levedura de modo a permitir o transporte da (1,3-1,4)-—β-glucanase termoestável para fora da célula de levedura»

Um peptídeo sinal de levedura adequado é o peptídeo sinal da invertase a qual se sabe uma das poucas proteínas secretadas em levedura, como sejam espécies de Saccharomvces» No entanto, também outros peptídeos sinal de levedura tais como o

peptídeo sinal para o factor a e fosfatase ácida- podem ser usadas no transporte de (1 ?3~i ?4>-|5-glucanase termoestável para fora da célula de 1evedura.

Numa realização preferida do presente invento o peptí-tieo sinal è pelo monos 75% de preferência pelo menos 85%, ou. ainda roais preferencialmente pelo menos 90% idêntico ao peptídeo sinal de Baci 11 u.s amy 1 o 1 iauefaciens ao nível dos aminoácidos como definido atrás»

Ainda um outro aspecto o invento está relacionado com uma < 1 ?3-l?4)-íl"-glucanase termoestável que se caracterisa pela seguinte sequência de aminoácidoss

Gln-Thr-Gly-Gly-Ser-Phe-Phe-Glu-Pro-Phe-Asn-Ser-Tyx-Asn-Ser-Gly-Leu·. Trp-Gln-Lys-Ala-Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-Gly-Asp-Met-Phe-Asn-Cys-Thr-Trp· Arg-Ala-Asn-Asn-Val-Ser-Mec-Thr-Ser-Leu-Gly-Glu-Met-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Pro.Ser-Tyr-Asn-Lys-Phe-Asp-Cys-Gly-Glu-Asn-Arg-Ser-Val-Gln-Thr - Ty r - Gly - Tyr * Gly * Leu* Tyr - Glu-Vai - Arg -Me t - Ly s - Pxo - Ala - Lys-Asn-Thr-Gly-Ile*Val-Ser-Ser*Phe-Phe-Thr-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr-Glu-Gly«Thr-Pro-Trp - Asp - Glu-1 le - Asp -1 le - Glu-Phe - Leu- Gly - Lys - Asp - Thr - Thr - Lys - Vai-Gln-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Thr-ABn-Gly-Val-Gly-Gly-His-Glu-Lys-Val-lle-Ser-Leu-Gly-Ehe-Asp-Ala-SÊr-Lya-Gly-Phe-His-Thr-Tyr-Ala-Phe-Asp-Txp-Glxi-Pro-Gly-Tyr-Ile-Lys-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Leu-Lys-Hia-Thr-Ala-Thr-Ala-Asn-Ile-PrQ-Ser-Thr-Pro-Gly-Lys-Ilé-Met-Mèt-Astt-LeU-Trp-Asn-Gly-Thr-Gly-Val-Asp-Asp-Trp-Leu-Gly-Ser-Tyr-Asn-Gly-Ala-Asn-Pro-Leu-Tyr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Trp-Vai-Lys-Tyr-Thr-Ser-Asn ou seus análogos 0 invento está ainda relacionado com uma ¢1,3-1,4)-~|3-glucanase termoestável com a seguinte sequência de aminoáci dos s •V .

Me t-Lys -Arg-Val-Leu-Leu- Ile-Leu-Val -Thr - Gly-Leii-Phe -Met-Ser -Leu-Cys -Gly-Ile-Thr-Ser-Ser-Val-Ser-Ala-Gln-Thr-GÍy-Gly-Sei-Pb.é-Phe-Glu-Pro-Phe-Asn-Ser-Tyr-Asn-Ser-Gly*Leu-Trp-GlTi-Lys-Ala-Asp-Gly*Tyr-Ser-Asn-Gly-Asp-Met-PhÊ-Asn-Cys*Thr-Trp-Arg-Ala-Afin-Asn-Val-Ser-Mec-Thr-Ser-Leu-Gly-Glu-Met-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Ser-Pro-Ser-Tyr-Asn-Lys-Phe-Asp-

Cys-Gly-Glu-Asn-Arg-Ser*Val*Gln*Thr-Tyr*Gly-Tyr«Gly-Leu-Tyr*Giu-Val* Arg-Met-Lys-Pro-Ala-Lys-Asn-Thr-Gly-Ile-Val-Ser-Ser-Phe-Phe-Thr-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thr-Glu-Gly-Thr-Pro-Trp-Asp*Glu-Ile*Asp-Ile-Glu-Phe-Leu* Gly-Lys-Asp-Thr-Thr-Lys-Val-Gln-Phe-Asn*Tyr-Tyr-Thr-Asn-Gly-Val-Gly-Gly-His-Glu-Lys-Val-Ile-Ser-Leu-Gly-Phe-Asp-Ala-Ser-Lys-Gly-Phe-His-Thr-Tyr-Ala-Phe-Asp-Trp-Gln-Pro-Gly-Tyr-Ile*Lys-Trp-Iyr-Val-Asp-Gly-Val-Leu-Lys-His-Thr-Ala-Thr-Ala-Asn-Ile-Pro-Ser-Thr-Pro-Gly-Lys-Ile-Met‘Met-Asn-Leu-Trp-Asn-Gly-Thr-Gly-Val‘Asp-Asp-Trp-Leu-Gly-Sar.Tyr-Asn-Gly-Ala-Asn-Pro-Leu-Tyr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Trp-Val-Lys-Tyr-Thr-Ser-Asn ou seus análogos

Na tabela que se segue são apresentados os códigos de abreviaturas geralmente aceites para sminoécidoss

Aminoácido

Abrevi a tur as

Ala Arg Asn Asp Ask Cis Gin Glu Gl ;·; Gl i His Ile Leu Lxs Met Fen Pro Qfjsp T re Trp Tir Vai

Alamina

Arqinxna

Asparagina

Acido aspártico

Asparagina ou ácido aspártico

Cisteina

Glutamina

Acido glutSnico

Glutamina ou ácido glutSnico

Glicina

Histidina

Isó1sue ina

Leucina

Lisina

Hetioni nã

Fenilalnina

Prolina

Serina

Treonina

Triptofa.no

Tirosina

Vaiina 0 termo "análogo" é usado no presente contexto para indicar uma enzima de uma composição ou sequfncia de aminoácidos semelhante à sequfncia de aminoácidos característica derivada da ( i ?3-15 4> -p~g 1 ucanase do invento, permitindo pequenas variações que nSo tSm um efeito adverso na actividade enzimática e na termoestábilidade da análoga. Q palipeptldea ou proteína análoga pode ser derivado de outros mi croorgani senos diferentes de B,a<nv~-loliquefaciens e de B«macarans ou. pode ser parcial ou totalmente de origem sintética,

Os aminoácidos da (1,3-1,4)—B~g1acanass podem facultativamente ter sido modificados, e.g, por tratamento químico emzimático ou de outro tipo que não afecte adversamente a activi-dade especifica da (1,3-1 ,4>-f3~glucsnase e a sua termoestábil idade num grau substancial,

Num outro aspecto, o invento está relacionado com um fragmento de DNA compreendendo uma sequência de nucleotldeos codificadora da ( 1,3-1 ,4)—{S-giucanase híbrida termoestável como descrito atrás, 0 fragmento de DNA pode ser usado num método de preparação de í i ,3-1,4)-j5-glucanase por técnicos de DNA recombinante, A utilização do fragmento de DNA do invento na produção de < 1,3-1,4)~i3-glucanase recombinante íe,g, através da inserção de um vector adequado, transformação de um microorganis-mo hospedeira adequado com o vector, cultura do microroganismo de modo a produzir a <1,3-i,4>-fs-glucanase e subsequentemente recuperação da enzima a partir dos microorganismos) inclui uma série de vantagens, E assim possível proporcionar grandes quantidades da (1,3-1,4)--(3-glucanase e a enzima produzida pode ser isolada numa forma substancialmente pura, livre de substâncias contaminantes, A (1,3-1,4)-(3-g.lucanase do invento pode também ser preparada por métodos bem conhecidos de síntese peptldica em fase Liquida ou sólida utilizando o acoplamento sucessivo dos aminoá— eidos individuais da sequência polipeptidica ou o acoplamento de aminoácxdDs individuais formando fragmentas da sequência polipep-tidica os quais são subsequentemente acoplados de modo a resultar

-16- no polpipeptídeo pretendido» A síntese em fase sólida pode e.g» ser efectuada como descrito por Merrifield (1963). Na síntese em fase sólida, a sequência de aininoácidos é construída acoplando um amínoácido inicial a um suporte sólido e adicionando então sequenciatíamente os outros aininoácidos na sequência por ligação peptídica até se obter o comprimento pretendido» A preparação de peptídeos sintéticos para usar com fins de.diagnóstico pode ser efectuada essencialmente como descrito em Shinnick (1983)«

Num aspecto particular, o presente invento está relacionado com um fragmento de DNA compreendendo substancialmente a sequência de nucleotídeoss 17- Â *

;b

.•"7. 30 60

GAATTCAACG AAGAATCGCT GCACtAXTAT CCATTCGTCA CCCAGTTAAA GTTTTTCGAC 90 120

CAGCGTCTTT TTAACGGCAC ACACATGGAA AGCCAGGACG ATTTTTTACT GGAGACAGTG 150 180 aaagaaaagt atcatcaggc gtataaatgc acgaagaata tccataccxa cattgagaaa 2ió 240

GAGTATGGGC ATAAGCTCAC CAGTGACGAG CTGCTGTATT IAACGAIIGA GATAGAAAGG 270 300 ataggattgt tacggataaa gcaggcaaaa gtagtcaaac aagtataatg aaagcgcttt 330 360 cctcgtatta attgtttctt ccattcatat cctatctgtc tgtgctgatg gtagxttagg 390 420

TXTGTATITT XAACAGAAGG ATTAICATTA XTTCGACCGA TGTTCCCTIT GAAAAGGATC 450 480

ATGTATGAXC AATAAAGAAA GCGIGTTCAA AAAAGGGGGA AXGCXAACAX GAMCGAGTG 510 540

TXGCTAATTC TTGTCACCGG ATTGIXTATG AGXTTGIGTG GGATCACTTC TAGTGTTXCG 570 600

GCICAAACAG GCGGAICGIT TTXTGAACCT TXIAACAGCX ATAACXCCGG GTXATGGCAA 630 660

AAAGCTGATG GTTACTCAAA XGGAGAXATG IIXAACTGCA CXTGGCGTGC TAATAACGXC 690 720

TCXATGACGT CAXTAGGIGA AATGCGTTTG GCGCTGACAA GTCCGICTTA TMCAAGTTT 750 780

GACTGCGGGG AAAACCGCTG GGTTCAAACA TAXGGCTATG GACTTXATGA AGTCAGAAXG 810 840

AAAGCGGCIA AAAACAGAGO GATTGXXICA TGGTTCTTCA GTTAXACAGG TCCAACGGAG 870 900

GGGACICCTT GGGATGAGAX TGAXAXCGAA ITTCTAGGAA AAGACACGAC AAAAGXCCAG 930 960

TITAACTAXT AIACCAAXGG GGXTGGCGGT CATGAAAAGG ITATCICICT XGGCITXGAT

< V

990 1020

GCATCAMGG GCTTCCATAC CTATCCTTTC GATTGGCAGC CAGGGTATAT TAAATGGTAT 1050 1080

gtagacggtg TTTTGAAACA TACCGCCACC GCGAATATTC CGAGTACGCC AGGCAAAATX 1110 1140

ATGATGAATC TATGGAACGG AACCGGAGTG GATGACTGGT TAGGTTCTTA TAATGGAGCG 1170 1200

AATCCGTTGT ACGCTGAATA TGACTGGGTA AAATATACGA GCAATTAATA TGATTGCAGC 1230

TGGGCATGAG CTTTTTAGTC CAGTCCAGGC ATGCAAGCTT ou um seu análogo ou uma sequência dele

Cada um dos nucleotídeos da sequência atrás representado pelas abreviaturas qeralmente usadas, i»e» A representa ademina T representa timidina B representa guamina C representa citosina

Mo presenia contesto, o termo "análogo" pretende desiguar um fragmento de DMA que apresenta uma ou várias modificações na sequência de nucleotideos, as modificações sendo de carácter tal que o fragmento de DNA modificado é capas de codificar uma (1,3—1,4)—β—g1ucanase híbrida tendo propriedades de estabilidade à temperatura como definido atrás» As modificações incluem, e„g», substituições de bases que não afectam a sequência de aminoácidos resultante codificada pelo fragmento de DMA, substituições de pares de bases isolados resultando na codificação de aminoácidos funcionalmente equivalentes, delações e adições» No presente contexto, o termo !isubsequência" designa uma sequência de DMA que compreende parte da sequência de DMA apresentada atrás ou outras sequências de DMA do invento e que reteve a sua capacidade de expressar uma (1,3-1,4>-B~glucanase tendo propriedade de estabilidade à temperatura como definido atrás, incluindo subsequências que foram tornadas análogas por modificação como exposto atrás» O fragmento de DMA codificador da <1»3-1,4>~fè~glucanas© ou uma parte dele pode ser sujeito a mutagenisação, e=g» por tratamento com radiação ultravioleta, radiação ionisante ou um mutagénio químico como seja mitomicina C, 5-bromo-uraci1o, metilmetano-sulfonato, hidroxilamina, mostarda de azoto ou um <V · nitrofurano de modo a alterar algumas das propriedades do produto do gene expresso a partir de sequência mutagenizada sem afectar substancial mente a activida.de ensifflática e as propriedades de termoestabilidade do produto do gene» Espeeialmente, mutagénese dirigida é útil para melhorar a termoestábi1 idade, o pH óptimo para a actividade enzimática e outras propriedades úteis da (1,3-í ,4)-j3~glucanase = 0 fragmenta de DNA do invento pode ser um que tenha sido modificado por substituição, adição, inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos na sequência com a finalidade de estabelecer uma sequência que, quando expressa num organismo hospedeiro adequado, resulte na produção de uma (1,3-1,4)-fâ-glucanase tendo as propriedades de estabilidade térmica definidas atrás.

Também, ainda num outro aspecto, o presente invento está relacionado com um método para a produção de uma (1,3-1,4)--B-glucanase termoestável compreendendo a cultura de um microorga-nismo em que um fragmento de DNA como descrito atrás foi introduzido de modo a que o microorganismo seja capaz de produzir a (i,3-1,4)-β-glucanase termoestável, a cultura sendo efectuada em condições que levam à produção de (1,3-1, 4 )-|3-gI ucanase termoestável e recuperação da (1,3-1,4)~e-glucanase a partir da cultura.

Vectores de expressão adequados para a produção de í 1,3-í ,4)-B~glucana.se ou uma. parte dela são os vectores que quando da transfarmação de um organismo hospedeiro são capazes de se explicarem no organismo hospedeiro. 0 vector pode ser um que é capaz de replicaçlo autónoma, como seja um plasmideo, ou um que seja replicada com a cromossoma do hospedeiro, como seja um bacteriófsgo. São exemplos de vectores adequados, que têm sido largamente empregues, pBR322 e vectores relacionados assim como vectores pUC a similares. Exemplos de bacteriófagos adequados

incluem Μ13 Γ. Exemplos de vectores de levedura de replicação autónoma são aqueles vectores portadores da parte do DMA 2μ de levedura que é responsável pela replicação autónoma» 0 organismo portador do vector tendo o fragmento de DMA do invento ou parte dele pode ser qualquer organismo que seja capaz ou expressar o referido fragmento de DNA» 0 organismo é de preferência um microorganisma tal como uma levedura ou uma bactéria» As leveduras tais como espécies de Succharomyces possuem algumas propriedades inerentes que podem ser de grande vantagem na produção de proteínas extracelulares» Normalmente, as leveduras secretam apenas muito poucas proteínas para o meio em que são cultivadas» έ portanto relativamente fácil isolar e purificar uma proteína recombinante produzida em levedura se esta proteína puder ser secretada pela célula de levedura. Para se obter secreção da C1,3-1 ,4)-j3-glucanase termoestável um peptídeo sinal deve ser ligado ao extremo N-terminal da enzima» A enzima invertase produzida por levedura é uma das poucas proteínas de levedura que são secretadas pela célula de levedura e é portanto antecipado que o peptídeo sinal da invertase de levedura é adequado para permitir o transoore para fora da célula de levedura da C133-15 4)-β-glucanase termoestável,

Nd entanto os microorganismos gram-positivos assim como as bactérias gram—negativas podem ser empregues como organismos hospedeiros» especialmente, é útil uma bactéria gram—negativa como seja E.çqIí, mas também podem ser usadas bactérias gram-posi" tivas tais como B»subtilis e outros tipos de microorganismos tais como fungos ou outros microorganismos usados para produzir produtos de DNA recombinante»

Quando se usa um microorganisroo para a expressão do fragmento de DNA do invento, as condições de cultura dependerão

Jt- v

tipícamersts do tipo de microorganismo empregue e uma pessoa familiarizada c.om a matéria saberá qual o método de cultura a escolher e como optimizsr este método»

Ainda um outro aspecto o invento está relacionado com uma planta capaz de expressar o fragmento de DNA como descrito atrás» Pode ser vantajoso construir uma planta que seja capaz de expressar nos seus grãos e rebentos uma (1,3--1,4)~|â"-glucanase termoetével uma vez que isto pode eliminar a necessidade de adição da enzima, e»g» à massa durante o processo de brassagem» De preferência a planta é cevada, centeio, trigo, arroz ou milho ou qualquer outra planta usada na produção de cerveja, derivados do café, alimentos ou outros processos de produção em que seja necessária a degradação de fS-glucanos por <1,3-1,4)-B-glucanases.

Uma planta com uma actividade de C1,3-1,4>-í5-glucanase aumentada em comparação com a planta na sua forma natural é, e.g. vantajosa como material de partida para a produção de cerveja devido a um aumento de actividade da β—glucanase que conduzirá a uma menor quantidade de jl-glucanos no mosto que torna ma is fácil a filtração e melhora a qualidade do produto final» Assim, o presente invento está relacionado com uma construção genética útil na produção de uma (1,3-1,4)-fê-glucanase termoestável conforme definido atrás, i.s. uma (1,3-1,4>-B-glucanase codificada por um fragmento de DNA como descrita atrás cuja construção engloba 1) uma sequência reguladora funcionalmene ligada a 2) um fragmento de DNA como definido atrás codificador da (1,3-1,4>-β--glucanase, possivelmente incluindo uma sequência nucleotídica codificadora de um peptideo sinal e 3) uma sequência de DNA de terminação da transcrição, funcionalmente ligada ao fragmento de DNA de 2)» A construção genética útil para a produção de uma íi,3-í„4>-R-glucanase do invento, ou uma parte dela., é preferen-cialmente usada na construção de uma planta tendo uma aclividade de f!-glucanase aumentada comparado com a planta que não contem a construção genética„ No entanto, isto não necessita de ser o caso uma vez que uma planta expressando o fragmento de DNA do invento pode ter uma activida.de de β—glucanase mais baixa mas uma actividade de β-glucanase que é mantida a temperaturas elevadas. Quando se constrói uma planta produtora de uma β-glucanase tolerante- â temperatura e possivelmente tendo uma maior actividade de β—glucanase relativamente à planta não midificada, a construção genética deverá ser activa num tecido ou célula em que seja necessária (1,3-1,4>-β-glucanase para a actividade pretendida ou a partir da qual a β-glucanase possa ser transportada para o local de actividade. A construção genética deve ser inserida em ligação com um outro gene de < i ,3-i54>“|S~glueanase cu em lugar deste pode ser inserida sob o controle da sequência reguladora de um gene vegetal de modo a que seja necessária uma sequência reguladora adicional. No entanto, em certas plantas tais como milho, arroz e trigo não está presente nenhum gene de <1,3-1,4>-B~glucanase e será portanto necessário, para se obter a expressão do gene da β-glucanase inserido, introduzir sequências reguladoras para controlar a expressão do gene da β-glucanase inserido ou, como alternativa, empregar outras sequências reguladoras na planta para controlar a expressão. A introdução de DNA numa célula vegetal pode e.g. ser efsctuada por irtjecçãc? directa de DNA nos protoplastos nus ou introduzindo partículas de DNA revestido r,a célula ou protoplasto. A sequência reguladora contida nas construções genéticas atrás definidas é de preferência um promotor vegetal, como ;\Λ *'%

seja um promotor vegetal constitutivo ou regulável. Quando a construção genética é para ser usada numa planta modificada gsnéticamnete, o promotor é de preferência um promotor activo numa planta o qual pode ser promotor CailV ,· o promotor NOS ou o promotor da (1,3-1,4)-β-giucanase»

Os exemplos dos promotores são ilustrativos, outras sequências podem desempenhar as mesmas funções. A sequência de terminação da transcrição de construção genética é uma sequência de nucleotídeos capas de terminar a transcrição de um fragmento de DMA do gene e proporcionar um sinal de poliademilação sé de preferência servida de uma planta, i.e. sendo uma sequência de terminação da transcrição vegetal. A construção genética pode ainda ser dotada de uma marca que permite a selecção da construção genética numa célula vegetal para a qual foi transferida. Existem várias marcas que podem ser usadas em células, particularmente marcas que propro— cionam resistência a antibióticos. Estas marcas incluem resistência a S418, higromiclna. bleomicina, camamícina e gentamicina.

Nos últimos anos, fez-se um esforço considerável para desenvolver métodos úteis para a construção de novas plantas ou células vegetais tendo propriedades especificas e desejáveis e existe agora uma série de tais métodos baseados em tecnologia de DNA recombinante e sistemas adequados de transformação de plantas. é considerado que as plantas do invento, e.g. plantas tendo as propriedades descritas atrás, podem ser construídas por tais métodos. O principio básico na construção de plantas genéticamente modificadas é inserir informaao genética no genoma da planta de modo a obter—ser uma manutenção estável do material genético inserido.

Existem várias técnicas para a inserção de informação genética, os dois princípios sendo a introdução directa da informação genética e a introdução da informação genética usando um sistema vector bacteriano. Assim, um outro aspecto, o presente invento está relacionado cocn a introdução de um gene ma is uma construção genética conforme definida atrás no genoma de uma planta tal como aveia, cevada, arroz, trigo, centeio ou milho.

Quando se constroem células vegetais com nova informação genética, estas células podem ser cultivadas e mantidas- de acordo com métodos de cultura de tecidos bem conhecidos tais como cultura das células num meio de cultura adequado suplementado com os f.actores de crescimento necessários tais como aminoácidos, hormonas vegetais, vitaminas, etc.

Conforme mencionado anteriormente, é especialmente vantajoso usar a < 1,3—1,4>—β—glucanase termoestável do invento· na produção de cerveja. Durante o processo de amassadura, os β-glucanos são extraídos do malte levando a um aumento da viscosidade da massa. Para reduzir a quantidade de β-glucanos na massa e no caldo, a í1,3-1,4>-$-gIucanase termoestável deverá ser adicionada durante o processo de amassadura. Nalgunas fábricas de cerveja o processo de amassadura é efectuado como um processo de vários passos em que a temperatura é gradualmente aumentada até uma temperatura máxima de 76°C.

Noutras fábricas de cerveja, o processo de amassadura é efectuado a uma temperatura fixa, tipicamente num intervalo de 5Θ ã 65°. A <1,3-1,4>~$~glucanase presente na cevada fica inactiva-da a cerca de 55 °C e os produtos comercialmente disponíveis tais •26- t r R ' como Cereflo (um produto enzimático composto compreendendo uma (1,3-i ,4)-{l-glucana.se comercializado pela Novo-Nordisk A/S, Dinamarca) fica inactivado a cerca de 67°C.

Devido à elevada termoestábilidade e elevada actividade específica da (i ,3-i ?4)~{í-glucanase do presente invento, a adição de uma quantidade muito mais inferior desta enzima é suficiente para se conseguir a degradação dos {5-glucanos na amassadura,

R

Enquanto e necessário adicionar 4 mg de Cereflo por kg de malte para degradar os jl-glucanos presentes numa amassadura típica, pode-se antecipar que uma quantidade muito mais inferior da < 1,3-1 ,4)-|3-giucanase tsrmoestávsl do presente invento ê suficiente para se conseguir o mesmo resultado» Pensa-se que uma quantidade de C1,3-i ,4>-f5-giucanase termoestável tio baixa quanto 2Φ ug/kg de malte ou mesmo menos seja suficiente para degradar os β-glucanos numa amassadura típica»

Assim, o inventa está ainda relacionado com um método de degradação de í 1 ,3-1,4>-ji-glucanos num substrato, método esse que se caracteriza pela sujeição do substrato è acção de uma quantidade eficaz de uma i 1,3-1,4>-j3-gIucanâse termoestável como descrito atrás durante um período de tempo adequado a uma temperatura de 65*C ou superior, a quantidade de (1 »3-1,4)-|s-glucanase sendo no máximo 2ΘΦ pg, de preferência no máximo 1Θ0 pg, mais preferível no máximo 5Θ pg, ainda mais preferível no máximo 20 pg e ainda o mais preferido no máximo 15 pg por kg de substrato» 0 substrato contendo β-glucanos pode estar na forma sólida ou liquida e pode compreender diferentes tipos de grãos tais como aveia, ou cevada, ou partes ou misturas deles» A enzima < 1,3-1,4>-fl-glucanase pode ser adicionada na forma purificada ou como parte de uma mistura contendo outras enzimas ou materiais subsidiários, a enzima sendo de preferência

s°Iufailisada= Também a enzima pode estar contida no substrato par ter sido incorporada na planta através da engenharia genética» 0 invento será agora descrito com referência aos desenhos juntos e aos Exemplos que se seguem» LEGENDAS DAS FI6URA5

Figura 1. Construção de um vector de expressão e secreção para '-J £»çoli contendo o gene híbrido bgl-Hl. bgl-As gene da (1,3-1,4)- —B—glucanase de B«amv1o1iauefaciens. hgl—Ms gene da <i,3-1,4)-B--glucanase de B.macerans» Para detalhes ver Exemplo 1»

Figura 2» Construção de um vector de expressão e secreção em E.colj contendo o gene híbrida bgl-H2» bgl-As gene da (1,3-1,4)--B-glucanase de B«amvloliouefaciens. bgl-Ms gene da (1,3-1,4)-B-—glucanase de B»macera-ns» Para detalhes ver Exemplo 1»

Figura 3» Estrutura do gene bgl-Hl« a: Sequência de nucleotídeos do gene bgl-Hl e sequência de aminoácidos derivada da pre-B-glu-canase híbrida consistindo no peptídeo sinal e no extremo amina da B-glucanase de B.amvloliguefaciens e na metade carboxi-termi- ^ nal da B-glucanase de B»macerans» 0 sitio EcoRV usado para usplicing11 está. indicado» A seta indica o sítio de clivagem da peptidase sinal» bs Diagrama do gen bgl—Hl e detalhes da região de fusão SPs peptídeo sinal w Figura 4» Estrutura do gene bçl-H2. as Sequência de nucleotídeos do gene bgl-H2 e sequência de aminoácidos derivada de pre-ft-glu-canase híbrida consistindo no peptídeo sinal e na metade amino--terminal da 0-glucanase de B»macerans e a metade carbaxi-termi-nal da proteína de B.amvloliguefaciens» 0 sítio EcoRI usado para

"splicing" está indicado»

Uma seta indica o sítio de clivagem da peptidase sinal» A sequãncia da região 3' não codificadora nSo está apresentada, bs Diagrama do gene bgl~H2 s detalhes da região de fusão» SPs peptídeo sinal»

Figura 5» SDS—ΡΑΒΕ de amostras contendo B~glocanases híbridas e B-g.lucana.se de B-macerans» Fainas l-3s 2 pg? 5 pg e 1 pg de B~glucana.se purificada, Fainas 4s amostra contendo 50 pg de proteína do sobrenadante e faina 5% 16Θ pg de extracto celular de células E»coli transformadas por pUC-H2« Faina &s 2 pg de B-glucanase da B»macarans parcialmente purificada» Faixa 7s i pg de B-glucanase purificada de B,macerans»

Figura 6, Actividade da B-glucanase híbrida Hl de bacillus e enzimas parentais em extratos brutos de células de E»coli trans-génicas após incubação durante vários períodos de tempo a 70°C, Ph 650» A actividade foi expressa como percentagem da actividade no tempo 0»

Figura 7» Actividade da B-glucanase híbrida Hl de Bacillus e enzimas parentais em extractos brutos (ver Materiais e Métodos) de células da E»coli transgénicas após incubação durante vários-períodos de tempo .a 65 °C, ρΗ 6,0» A actividade foi expressa como percentagem de actividade no tempo O»

Figura 8= Cinética da termo-inactivação das B~glucanases híbridas Hi e H2 de Bacillus a 65°C, pH 5,5 em comparação com a B-glucanase de B.amyloliauefaciens. As enzimas de Amyloliquefa-ciens e Hl foram dissolvidas numa concentração de i pg/ml em Na-acetato 40 mH, ρΗ 5,5, 10 mH CaC 10 e 5Θ ugml de albumina do soro bovino, A preparação de enzima H2 foi dissolvida numa concentração proteica de 0,75 mg/ml num tampão idtntico. 2* -29-

Λ

·' :·; Λ

Re t i r aram-se amostras periodicamente e testaram-se quanta è actividade de β-glucanase residual.

Figura 9. A dependência da pH da actividade das β-glucansses híbridas Hl e H2 de Bacillus. as reacções foram efectuadas com 1-6 pg de β-glucanase Hl e 7-70 p.g da preparação de β-glucanase H2 nos seguintes tampõess Na-acetato 4® mM, pH 3,6-5,6ρ 4Θ mM k/Na fosfato, pH 6-8 e 40 mH T ris-HCl , pH 8 , 4-S 5 8. A actividade foi determinada com o ensaio Biocon usando β-glucano azo-cevada como substrato (McCIeary, 1988). w

Figura 10. Actividade de 0-glucanase híbrida Hl de Bacillus e de enzimas parentais em extracios brutos de células transgénicas de E.coli após incubação durante vários períodos de tempo a 65*C, pH 4,0. A actividade foi expressa como percentagem da actividade no tempo 0.

Figura 11. A dependência do pH da estabilidade da jl-glucanase de Bacillus a 55°C 2 pg de β-glucanase híbrida Hl, 375 pg de proteína da preparação de β-glucanase híbrida H2, 2 pg de β-glLicanase de B.macerans ou 10 pg de β-glucanase de B.amv1o1iquefaciens foram testados com 10 mM CaCl e 5€s ^ig/ml de albumina do soro bovina em tampão Na-acetato 40 mM ajustado aos valores de pH indicados na gama de 3,6 a 5,6 ou em tampão k/Na fosfato 40 mH ajustado aos valores de pH indicados na gama de 6,0 a 8,θ. Após incubação durante lha 55 °C a actividade residual foi medida com o método ft <ver Materiais e Métodos).

Figura 12» Melhoramento de estabilidade térmica das B-glucanases híbridas de Bacillus na presença de CaCl7, 0,1 ug da enzima híbrida Hl de Bacillus ou 750 ug da preparação da enzima híbrida H2 foi dissolvido em 1 ml de tampão Na-acetato 40 mM pH 5,5 com ou sem CaCl2 5Θ mM e suplementado com 50 μι/ml de albumina do sor bovina» Após incubação durante 3Θ min» às tempera tu ras indicadas determinou-se a actividade residual»

Figura 13» Cinética de termo-inactivação das β-glucanases híbridas H3, H4, H5 e Hó de Bacillus a 65°C, pH 4,1 em comparação com β-glucanases nativas purificadas de B»amvlQliouefaciens» B.macerans e B.subtil is» as enzimas foram dissolvidas a. uma concentração de Φ,Ι pg/mi em tampão Na-acetato 4Θ mM, ρΗ 4,1, 10 mM CaCl_, Retiraram-se amostras periodicamente e testaram-se quanto à actividade de β-glucanase residual,

Figura 14= Cinética de termo-inactivação das β-glucanases híbridas H3, H4, H'5 e Hó de Bacil lus a 7@°CS pH 6,0 em comparação com as β-glucanases nativas purificadas de B.amy1o1iouefaciens. B.macerans e B«subtilis. as enzimas foram dissolvidas numa concentração de 0,1 mg/ml em tampão Na-acetato 40 mM, pH 5,5 1 €s mM CaCl^» As amostras foram retiradas periodicamente e testadas quanto è actividade de β-glucanase residual.

Figura 15» A concentração de β-glucanos residuais do malte durante a formação das misturas consistindo em 50 g de malte finamente picado e 200 ml de água contendo 5 pg de β-glucanase híbrida H3, 5 pg de β-glucanase híbrida de B.subtil is e nehuma β-glucanase, respectivamente e de β-glucanos residuais em solução consistindo em soluções de 5Θ ml de β-glucanos <1,5 mg/ml) em 1Θ® ml de tampão Na-acetato, pH 5,5, 5 mM MgCl^, aos quais foram adicionados 250 g de β-glucanase de B.subtil is e glucanase híbrida H3, respectivamente» Retiraram-se amostras periodicamente e testaram-se quanta aos β-glucanos residuais»

C

MATERIAIS E MÉTODOS

Estirpes, plasmídeos e meios de crescimento Células E.coli DH5xs F ? endAl, hsel R17 ír^ , ιη^+) , supE44, thil, A, recAl, gyrA9ê-, relAl, o8€sdlacZ, AMlO (Hanahan, 1985), foram usadas para a propagação de plasmídeos e para a expressão de genes da B—gluc-anse» Os vsctores compreenderam pBR-322 (Bolívar et al», 1977) e pUC19 (Vanish-Perron et al., 1985) ê portador» 0 plasmídeo recombinante pE81 (Borriss et al„, 1985) é portador de uma inserção com o gene da B-glucanase de B»amyloliquefaciens e pUC13-M é portador de uma inserção de DNA com o gene da β-glucanase de B.macerans que é idfntico è inserção do plasmídeo pUC19 134 (Borriss et al», 1988)« Os meios s condiçSes de crescimento foram como anteriormente (Borriss st al», 1988).

Encimas e reagentes

Os nucleotídeos radioactivos foram da New England Nuclear, Boston, Hasschusetts» As endonucleases de restrição, fosfatase de intestino de vitela e DNA-ligase de T4 foram da Boehringer Mannheim, Mannheim, KLBermany« A DNA-polimerase da T7

TM modificada (Sequenase ) foi da United State Biochemical Corporation, Cleveland, Ohio, USA» Um "Kit” de Seneclan^ foi da BIO 1®1 Inc», La Jo 11a, Califórnia, USA» O β-glueano de cevada assim como o "Kit” de ensaia da B~glucanase foram adquiridos à Biocon, Boronia, Victoria, Australia, Liquenano foi preparado a partir de Cetraria islandica como descrito anteriormente (Borriss, 1981)»

Transformação preparadas para

As células de E«coli foram cultivadas e τ· " #y a transformação como descrito por Lederberg ê':'Go'Hèn < 1974) e as células competentes foram guardadas congeladas como descrito por Thomsen (1983).

Purificação de DNA

Preparou-se DNA de plasmídeo a partir de E»coli pelo método da Hatton e Sakaki (1986)= Fragmentos de DNA especificas gerados por digestão com endonucleases de restrição foram separados por eleciroforese em gel de agarose e purificados da matrix

TM de gel usando um “kit” Genaclen de acordo com as recomendações do frabicante.

Determinação das sequências de DNA

TM

Usou-se DNA-polimerase de T7 modificada (Sequenase ) para determinação da sequência de nucleotideos à volta de junções de splicing dos genes da β-glucanase híbrida» As reacções foram efectuadas como descrito por Zhang et al», (1988)» purificação e análise de enzimas

Para determinação da termoestabilidade da enzima híbrida Hl e das enzimas parentais de células E.coli portadoras do plasmídeo pUCí3~Hl, os plasmideos pEBl e pUC13-M foram cultivadas em meios para leveduras com triptona (10 g de triptona, 5 g de extracto de levedura, 5 g de NaCl por 1) a 37*C durante 16 a 20 horas» fts células foram lisadas por sonicação (sonicador MSE) e após clarificação do lisado por centrifugação, a estabilidade da fl-glucanase foi analisada por incubação da mistura de reacção contendo um amostra do lisado clarificado durante vários períodos de tempo a 65°C ou. 70’:‘C seguido da deiernsinação da actividade de [5~glucanase residual»

A purificação da β-glucanase dos''êxtráctos celulares como descrito em Borriss et al.? (1988) foi usada para as enzimas parentais e enzima híbrida Hl« Devido ao baixo rendimento da β-glucanase H2 esta enzima não foi purificada até à homogeneidade. A precipitação de extractos celulares brutos com sulfato de amónio enriqueceu esta β-glucanase até uma activida.de específica de i0?4 U/mg (Í0,4 nwnolss de glucose mg . m *). A concentração proteica foi determinada de acordo com Bradford (197Θ) usando albumina de soro bovina como padrão. As preparações de enzima foram analisadas por SDS-PA6E <Laemmli5 197@>„

Ensaios de β-glucanase Método As A mistura de reacção consistiu em i ml de liguenano ou β-glucano de cevada a &¥57 (p/v) em tampão Na-acetato 4® mM5 pHós05 com ou sem 1% mM CaCl^. A reacção foi iniciada pela adição de 0,1 ml de solução de enzima e a incubação decorreu a 37°C durante 20 min» A reacção foi parada pela adição de 0,5 ml de ácido 3,5-dinitra-salicilica e a quantidade de açucares redutores foi medida usando a formulação de reagentes descrita por Miller <1959). A actividade específica foi expressa em umoles de glucose libertada por min. e ng de proteína. Método βϊ Como alternativa, usou-se azo-β—glucanos de cevada como substrato para análise da actividade de β-giucanase CMcCIea-ry5 1988). Os tampões empregues forams acetato de sódio 40 mM, pH 3só“5sóp fosfato de sódio-potássio 40 mM, pH ó-B? 40 mM Tris-HCl5 pH 8,4-8,8.

Ensaios de placas

As células E.coli foram incubadas em meio sólido

contendo €$,2% <p/v) de 1iguenamo» A colaraçla coai Θ,2% <p/v) de vermelho do Congo revelou, uma zona rans par ente à volta das cólonias que expressam β-glucanase.

Medidas restricfcivas

Todas foram efectuadas contendo matéria as experiências que envolveras} DNA recombinante em condições laboratoriais BL1 e os desperdícios 1 biológico foram autoclavados» EXEMPLO 1

CONSTRUÇÃO DOS PLASMÍDEOS pUCÍ3-Hl E pUCÍ9-H2 PORiADORES DOS 6ENES HÍBRIDOS DE β-SLUCANASE

Os genes e proteínas ds.s (5-glucanase de B»amyIoliquefa— ciens e de B.macerans são altamente homólogos» No centro dos genes está um sítio de restrição EcoRV único foi usado como ponto de fusão na construção dos genes híbridos de fí-glucanase.

Construção de pUCi3~H! <Fig»í)

Um fragmento EcoRV que contem a região delimitane 5' e a região codificadora da metade amino-terminal do gene da β-glu-canase de B»amvloiiauefaciens foi isolado a partir do plasmídeo pEBl ÍBoriss et al_», .1985) e ligado ao fragmento grande EcoRV- -EcoRI de pUC13-M codificador da metade carbaxi—terminal das enzimas de B«macerans dando assim origem ao plasmídeo pUC13-Hl portador do gene híbrido bgl-Hi» As células E»coli DH5a transformadas com pUC13—Hi são resistentes à ampicilina»

Construção de pUC19-H2 (Fig»2)

Para a construção do gene recombinante recíproco, o gene da jl-glucanase de B«macerans foi removido como um fragmento EcoRI-PstI do plasmídeo pUCÍ3-M e reclonado em pBR 322 dando origem ao plasmídeo pBR-MACl a partir do qual foi purificado o fragmento pequeno EcoRV e fundido com o fragmento grande EcoRV do plasmídeo pEGi» Cora a inserção na orientação correcta o plasmí-deo foi designado pEB~H2 e as- células E»coli transformadas com o plasmídeo foram seleccionadas em meio contendo tetraciclina, 0 gne híbrido foi removido de pEB-H2 como um fragmento EcoRI-BglII

plasmí. e reclonado em pUC-19 digerido com EcoRX—BamHP par a dar o deo pUCÍ9—H2= EXEMPLO 2 A ESTRUTURA DOS GENES HÍBRIDOS DE is-SLUCANASE bgi-Hl e bgl-H2

Na Floura 3 está apresentado α fragmenta para. a expressão do gene recombxnante bgl-Hl» A construção cantem 469 pb da região delimitante 75 pb codificadoras do peptídeo sinal e 321 pb codificadores da metade amino-terminal da B-glucanase de B„amyIo-1 iquefaciens. Este segmento de DNA de 86-5 pb foi fundida na mesma grelha de leitura com a região codificadora da metade carboxi-terminal assim como com 54 pb da região delimitante 3' do gene da jS-glucanase de B.macerans. 0 outro recorabinante, bgl~H2, (Fig.4) consiste em 99 pb da região delimitante 5', 75 pb codificadores do peptídeo sinal e 315 pb codificadoras da metade amino-terminal da B-glucanase de B.macerans. este fragmento de 489 pb foi fundido na mesma grelha de leitura com um segmenta de DNA de 321 pb codificador da metade carfaoxi-terminal da fi-glucanase de B.amyloliauef adens e aproxi-madamente 1,5 k da região delimitante 3'» ou ambas»

As construções de plasmídeo foram analisadas por digestão com enzimas de restrição, determinação da sequência ds DíMA ã volta das junções de "splicing" 37-

EXEMPLO ANALISE DOS PRODUTOS DE BENEB HÍBRIDOS CODIFICADOS POR P?JCÍ3~HÍ E pUC19—H2

As células de E «roli DH5» foram transformadas com pUC13-HÍ ou pUC19~H25 respectivaments e os genes- híbridos da f3~glucanases usados na. transformação foram espressos ne st as-células de E«coli= A β-glucanase híbrida Hl foi purificada de .se de B«macsrans-confirmado que a acordo com o processo usado para a (5-glucan (Borriss et al = ? 19885« Por SD3~P-A8E foi -a com a sul Coomassie H2 foi apenas i°Á do rodusir uma prepara- Β-glucanase migra como uma única banda corad íFig«5)= 0 rendimento da encima híbrida obtido para a encima Hl e muito baixo para p ção cromatográfieamenie pura (Tabela I)„ %

Γ AbELA

Expressão de B-glucana.se ess células E.coli transformadas com pUC13-Hi e pUC19—H2S respectivamente

Actividade de [3-q lu.canass (umole de glucose ml de cu1 tura * „ m i n ^)

PlasiTiidso Células

So b ren ad an te pUCi3-Hí PUC19-H2 67,5 7,« €?,€* 6 'n.d. n.d.-não detectável

As células foram cultivadas em meio de levedura com triptona com agitação intensiva 2© h a 37*C. Após centrifugação <5©©©xg, 1© min), o sobrenadante foi usado directamente para ensaio da actividade ensimática. Q sedimento foi lavado, ressus- penso em acetato 4© nsMf pH s soniçado em gelo 4x20 seg, com um

Sonicador Branson e classificado por centrifugação. A actividade especifica da jl-glucanase Hl foi determinada como sendo 3700 -1 pmoles de glucose mg que é comparável à actividade especifica de f!-gIucanases de Baci 11 us IHET B376 (133© umoles de glucose -1 . -1. mg .min ) (Borriss et al., í98o) e de B.macerans (003© pmoles —.1 —*3

Tabela Ϊ1) mm de glucose mg 3min A)* Para caracterização do produto do gene bgl-H2 usou-se um sxtracto enriquecido com uma actividade específica de 1©.4 umoles de glucose mg”*. TAtíELft 11

Parâmetros cinéticos das R-giucanases híbridas e parentais R-glucanase

Substrato Híbrido í Híbrido 2 Macerans Amyloliquefaciens

Glucano 1 V Re1ativo Uiâ X 1 1 1 Liquenano 0,77 0, iá8 0 ? 73 1,1 Glucano 1,25 K (mq/ml) m 15és7 0 3 B3 i 3 JÍ Liquenano í 5 y5 1 ? 54 £5 5 ô7 1 * Cf

Actividade especifica (umole glucose mg i,srsin ^ > "i1 —y O/ 1Θ ã. 5 * (!) 503€ (2) <1> extracta celular enriquecido (2) Borriss e Zemek, 19B1

Especificidade do substrato 'w'*’

As enzisas híbridas Hl s Ηϋ degradam í 1,3-1,4)—{3— -glucano de cevada assim como liquenano e os valores de v‘ ma λ determinados com ambos os substratos não diferem significativamente (Tabela II), Os valores de km para ambas as proteínas-híbridas foram determinadas usando R-glucano de cevada ou liquenano como substrato.

Cinéticas ds termoinactivação das β—glucanase híbridas A termoestábilidade das β-glueanases híbridas em coniparaçãD com as enzimas parentais de B.am^doliqusfaciens e de B.macerans foi estudada medindo a cinética de termoinactivação de β-gXucanase em amostras de lisados classificados de células E-coli DH5a trasnformadas com os plasmídeos pUC13-HÍ, pEB-H2, pEOl e pUC13-M codificadores dos (J-glucanases recombinantes Hl, H2, de B»amyloXiguefaciens e de B»macerans respectivamente. A estirpe de E.coli transformada com pl)C13-HÍ foi depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o Número de Acesso DSH 5461= A estirpe de E»coli transformada com pEG~H2 foi depositada na Deutsche Sammlung vor? Mikroorganismen com o No» da Acesso DSM 5460= A estirpe de E=coli transformada com pEGl foi depositada Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o No= de Acesso DSM 5459 e a estirpe de E-coli transformada com pUC13~H foi depositada na Deutsche Samisulung von Mikroorganismen coai o No = de Acesso L>3r! 5462»

As amostras (geralemnte na gama de concentrações 0,3-1 mg de proteína/ml) foram incubadas em 10 mM CaCl^, 4© mH Na-ace-tato, pH 6,0 a 70°C e removidas amostras periódicamente para determinação da actividade de B-glucanase residual <Fig»ó>» Os resultados desta análise revelaram que a semi-vida da (1—glucanase Hl é significativamente superior (50% de inactivaçSo em 1S,5 min») as semi-vidas das enzimas parentais de B.amvloliquefaciens (4 min.) e de B.macerans (9 min=)= A B-glucanase H2 sofreu termo-inactivação com uma semi-vida inferior a 2 min. e é portanto mais sensível ao calor do que as enzimas parentais» Ouando a análise foi efectuada a 65°C (Fig»7) a enzima, híbrida Hl permaneceu estável durante mais de 30 min» enquanto que a semi-vida da 0 enzima derivada de B.amvloliquefaciens fax de cerca de 25 min» a de B.macerans intermédia entre as duas» A enzima Hí purificada permaneceu estável durante mais de uma hora quando analisada a 65 °C, pH6,0, enquanto a enzima H2 parcialmente purificada foi irreversivelmente termo-inactivada em 20-25 min. íFig.8). A cinética de inactivaçlo da enzima purificada de B.amvloliquefaciens é apresentada como referência» Consistentemente, a enzima híbrida Hl foi significativamente activada quando testada após 5 min» a 65o—7€í°C (figuras 6-8).

Efeito do pH na actividade e estabilidade das BB-glucanases híbridas A gama de pH para actividade óptima da β-glucanase híbrida Hl foi de 5,6 a 6,6 enquanto que a da enzima híbrida H2 foi pH 7.»Θ a 8,0 <Fig.!?)» Para comparação, a gama óptima de pH para a actividade enzimática das {3-glucanases de B.amvloliquefaciens e B.ffiacsrans foi de pH 6,0 a 7,0 e de pH 6,0 a 7,5, respec-tivamerste (resultados não apresentados)« A Fig«9 também mostra que a enzima híbrida Hl retem 50% da sua actividade a pH 4,8 e que H2 retem 50% da sua actividade a pH 5,6» Os valores correspondentes para as enzimas parentais são pH 5,2 (B.amyloliquefa-ciens) e pH 5,5 (B.macerans).

Uma outra característica é a estabilidade da enzima em função ao pH» Quando a cinética da termo-inactivação das β-glu-canases nos e:<tractos brutos foi seguida a pH 4,0 e a uma temperatura de 65°C a enzima híbrida Hl permaneceu estável durante mais de 3Θ min» enquanto a β-glucanase de B.amvloliquefaciens tinha uma semi-vida de 2€* min» e a de H.macerans de apenas 12 min» (Fig»10)» Esta característica foi examinada para as β—glu— canases híbridas e parentais por incubação a 55°C durante 1 h na gama ds pH 3 a 9, seguida da determinação da actividade enzimáti-ca residual CFig» í í > = Parece que a β-glucanase Hl é estável entre pH 3»6 e 7,0, enquanto a β-glucanase H2 tem uma gama de pH de estabilidade muito estreita, pH 5,6 a 6,$3» Ambas as B-gluca-nases parentais são instáveis abaixo de pH 4,8 e acima de pH 6,0 <Bamvloliouefaciens) ou pH 6,5 (B.macerans) » 4.4.

Os efeitos de Ca na termoestábilidade 0 efeito do Ca na estabilidade das β-glucanases híbridas foi analisada num ensaia de 30 min s pH 5,5 e temperaturas variando de 45°C a 75 °C» dos resultados desta análise, mostrados na Fig-12 pode ser deduzida a temperatura para 50% de inactivação num ensaio de 30 min».

Parece claramentew que os iSes Ca t'ê'm efeito estabiiizanta em ambas as enzimas híbridas» As tmeperaturas para 50% de inactivação aumentam cerca de õ°C para ambas as β-glucana- 4"4* ses híbridas na presença de 10 mM Ca » 0 mesmo efeito estabili- zante dos iSes Ca1 também se encontrou, para as duas enzimas parentais» EXEMPLO 4 CONSTRUÇÃO DAS β-GLUCANASES HÍBRIDAS H3, H4, H5 e Hó»

Produziu-se quatro <1,3-1,4)-B~glucanases construindo genes de fusão híbridos codificadores das glucanases usando uma técnica de reacção de cadeias com plimerase de acordo com o processo descrito por Yon & Fried (1989), Nucleic Acid Res», 17, 4895 e Horton et al» <1989) Gene 77, 61-68» Os genes de fusão compreendem sequências de DNA do gene da β-glucanase BE20/78 de B,amv1o1iouefaciens e do gene da β-glucanase E138 de B»macerans. -43- * >:

Qs genes de fusSo foram inseridos no plasmldeo pTZ19R (Mead et al., 1986, Protein Enginearing, 1, 67-74)» Os quatro plasmídeos recombinantes resultantes foram designados pTZÍ9R-H3, pTZi9R--H4, pTZ19R“H5 e pTZ19R-H6, respectivamente. Os plasmídeos foram usados para transformação de E.coli DH5«„ As células hospedeiras foram cultivadas em meio minimo até à fase estacionária para se obter expressão dos genes da fl-glucanase» As enzimas híbridas resultantes foram designadas H3, H4, H5 e H6 respectivamente» A enzima H3 tem a fórmula Al>ó-M indicando que é uma enzima híbrida compreendendo 16 aminoáeídos da parte N-terminal da (1,3-1,4)-(3--glucanase madura de B.amylolicmefaciens a qual substituiu os correspondentes 16 aminoácidos da parte N-terminal da (1,3-1,4)-•~(3~glucanase madura de B.ínacerans.

As enzimas híbridas H4-H6 foram construídas de modo semelhante substituindo 36, 78 e 152 aminoé.cidos, respectivamente da parte N-terminal da (1,3-1,4)-(3-glucanase madura de B.macerans com o correspondente número de aminoácidos da parte N-terminal da B-glucanase de B.amyloliguefaciens. Assim, as quatro enzimas híbridas construídas têm um extremo N-terminal derivado da (1,3-1,4)-{3-glucanase de B.affiyloliguef adens. Ainda, todas as enzimas híbridas são sintetizadas com o peptídeo sinal da (3-glu-canase de B.amyloiiqugfaciens» A estirpe de E.coli portadora de pTZ19R-H3 codificando a enzima híbrida H3 foi depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o No» de Acesso DSM 579€*, a estirpe de E.coli transformada com pTZ19R—H4 codificando a enzima híbrida H4 foi depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o No. de Acesso DSM 5791, a estirpe de E.coli transformada com pTZ19R-H5 codificando a enzima híbrida H5 foi depositada na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen com o No» de Acesso DSM 5792 e a estirpe de E.coli portadora do plasmldeo pTZ19R-H6 codificador da 44-

enzima híbrida H6 foi depositada na Deutsche Sammiung von Mikroar-ganismsn com o No» de Acesso DSH 5793» As quatro estirpes atrás referidas foram depositadas em 9 de Fevereiro de 199@.

EXEMPLO

PURIFICAÇÃO E CARACTERϊZftçSO DAS BLUCANASES HÍBRIDAS H3, H4, H5 E H6

As enzimas híbridas codificadas pelos genes de fusão híbridos foram caracterizados por determinação da sua temperatura óptima, pH óptimo, actividade específica e termoestabilidade. Estas caracterisitcas foram comparadas com as correspondentes caracteristicas da enzima híbrida Hl como aqui descrito atrás e das β-glucanases nativas de 8acillus conforme produzidas pelos seguintes Bacillus spp» s B.amv 1 oliauefaciens BE2W78, B.macerans EI38 e uma B.subtil is sp» Células E.coli transformadas com os plasmídeos portadores dos genes codificadores das referidas (3-glucanase de B. amy 1 o 1 iaue f ac iens (pEBÍ) e Js-glucanass de B.macerans CpUCi3-M>, respectivamente foram cultivadas em meio mínimo até à fase estacionária para se obter a expressão dos produtos dos genes da B—glucanase»

Um a cinco litros do meio de cultura resultante do crescimento das células de E,coli atrás transformadas expressando as is-glucanases híbridas H3, H4, H5 s Hé das (3-glucanases nativas de B.amylol iauef ac iens e de B. tnacerans foram clarificados por centrifugação e filtração através de um filtra de 0,8 pm. Os sobrenadantes clarificados foram concentrados para 1ΘΘ ml ultrafiltração» Após diafiltração contra Na—acetato 20 ρΗ5,θ, 5 mM CaC^s o sobrenadante bruto foi aplicado numa coluna de permuta catiónica CM-Bepharose* Após lavagem, a coluna foi por mM, eluida com acetato de sódio 5Θ mM, pB 5 5 Θ, 50 mM NaCl

mM V? - -45- V? - -45-

>5" 1 Γ·

CaCl2» A β-glucanase obtida por este esquema de purificação estava substancial mente pura., mas geralmente as fracções contendo actividsde de 0-glucanase foram reunidas s concentradas para 2-5 ml e sujeitas a cromatografia de permeação molecular numa coluna de Sephacryl 5266 HR (2,5xó0 cm) em acetato de sódio 2Θ mH, pH 5,0, 5 mM CaCI0. As fracções do pico da £~glucanase foram usadas para análise da termoestábilidade das encimas puras» 0 rendimento de fl~g lucanase pura estava na gama de 0, 5-25 mg por Ixtro de meio de cultura» A enzima nativa de 8.subtilis foi um produto comercial (1,3-1,4)~B—glucanase <CerefloK 2€«M_, Novo-Nordisk A/S, Bsgs-vaerd, Denmark). Como primeiro passo de purificação este produto foi concentrado cinco vezes seguido de diafiltração contra o6 mH Tris—HC1, pH 8 e cromatografia de permuta aniónica (Whatman uE 53). A proteína não ligada foi concentrada e o tampão foi mudado para acetato de sódio 20 mH, pH 5,0, 5 míi CbCI^ por filtração. Posterior purificação foi conseguida por cromatografia de permuta catiónica em CH52 (Whatman). As fracções contendo actividsde de js—qlucanase foram reunidas, concentradas e sujeitas a cromatogra— fia de permeação molecular em Sephacryl 5206 HR» Obteve—se aproximadamen te 1Θ6 mg de fl—glucanase de 8. subti l is pura a partir de 1 litro de Cereflo" 200L.

Temperatura óptima para H3-H6

As preparações puras atrás descritas das quatro enzimas a testar e das quatro enzimas referência contendo 166 pg de enzima purificada por ml foram díluidas para conterem uma quantidade de enzima que nas condições do ensaio resultou em valores-mensuráveis (6,5-1,5 pg por ml). as misturas de reacção consistiram em 1 ml de substrato (6,5 mg/ml de liquenano; em tampão Na-acetato 166 mH» pH ó,6 suplementado com 50 μα/mi de albumina

4ò~* de soro bovina e Φ,1 ml das preparações- de enzima adequadamente diluidas» As misturas de re-acçao foram incubadas- durante 10 minutos às seguintes temperaturas? 25, 37, 5β, 55, 6Θ, 65, 7Θ, 75s 80 e 85°C e a reacção foi parada pela adição de 0,5 ml de ácido 3,5—dinitro-salicilica. Determinou-se as temperaturas óptimas e as gamas de temperatura dentro das quais pelo menos 90% da actividade óptima foi exercida e os resultados estão apresentados na Tabela? TABELA ΪΙΪ

Temperatura óptima para as glacansses H3—H6, Hl e nativa de Bacillus |S-g lucanase

temperatura tiama de temperatura com >/90% óptima, C'C de actividade óptima, °C H3 65 nrir* **τπΓ JJ" / U H4 7Θ 55-70 H5 cr Uw 55-7Θ H6 55 5Θ—65 Hl cr cr o·-) 50-65 B.subtil is ET ET ϋϋ 5Θ-65 B o macerans i tzr GJ 60-70 B.amy1olique- faciens 55 5Θ-65 correspondente

Em adição, a enzima H3 tinha uma actividade residual a 80°C de 75% da actividade óotima e a 85 °C a

actividade residual foi de

Entre as enzimas híbridas testadas» H4 tem uma tempera-tLU--a óptima superior a qualquer uma das enzimas nativas <70°C> e Λ @nsiras. H3 apresentou a. gama de temperaturas mais larga dentro qual 90% ou mais da actividade óptima foi retida <55~75°C>, gsta enzima também tinha o limite de temperatura mais elevado para pelo menos 90% de actividade relativa à sua actividade áptiraa . pH óptimo para H3-H6

mesmas quatro de pH

Nestas experências a actividade enzimática das pr@parações· de enzimas descritas atrás incluindo as en2Í.mas refertncia foram testadas a diferentes valores variando de 3,6 a 8,0«

No ensaio usou-se azo-B-giucano de cevada como substrato? 20© μΐ i:ís solução de substrato foram misturados com 200 μΐ de s{3luçSes tampão 1©θ mti tendo valores de pH adequados e contendo 10-1©© ng das preparações de enzimas purificadas. Dentro da gama de pH 3?6 a 6,0 usaram-se tampões de Na—acetato e dentro da gama de 6?! a 8?0 usou—se Tris-acetato. u tempo de ensaio foi de 10 minutos» 0 pH óptimo e o intervalo de pH dentro do qual pelo menos 90% da actividade óptima estava presente foram determinados para cada preparação de enzimas. Ainda foi calculada a actividade das enzimas a pH 5?© relativamente à actividade a pH óptimo» Estes resultados de ensaios estão resumidos na tabela abaixo;

TABELA IV e natxya gacillus ρΗ óptimo para as ji-glucanases H3-H6, Hi gama de pH uom Actxvida.de a pH 5,0 >/90% de acti- relativa à do pH β-gluca-nase pH óptimo vidade óptima óptimo 6,5 H3 7,0 6,5-7,0 107» 637» H4 6,5 5 , 9-7,6 15>; 70% H5 7,0 5,9-7,6 307 887 . rt 1 6 , í-J 5?9-óg5 50% 807 Hí 5,9 5,5-6,5 557 867 B.subtil is ó 5 5 5,9-6,5 197 75% B.macerans 7,6 5,9-7,6 87 567 Bamy lai ique-faciens 6,5 5,9-7,0 30% 69%

Os pHs óptimos para as quatro enzimas a testar estavam na gama ue q,u a / , fet» h pH 5,0 enzimas H5 e apresentaram actividades relativamente às dos seus pHs óptimos que excederam ^ os correpondentes valores para as três enzimas nativas de Bacii- lus indicando uma sensibilidade inferior ãs condições de pH não óptimo. 0 limite inferior de pH para retenção de pelo menos 9Θ% de actividade foi de 5,9 para todas as enzimas a testar que é semelhante para as enzimas nativas» Os resultados desta expe-riência indicam portanto que através da construção de enzimas híbridas compreendendo poiipeptídeos de < 1,3-i ,4>~í5~glucanases de B.amvloliguefaciens e de B»macerans pode-se obter maior tolerância a condições acídicas»

A actividade específica das js-giucanases H3-HÓ foram determinadas essencial mente como aqui descr anteriarraente usando as preparações de enzimas purificadas numa concentração de 10© pg de proteína B-glucanase par ml de tampSa de Na-acetato 2© (TtM, pH ó s Θ suplementado com 5 mM CaCl0. As misturas de reacção o ^ foram incubadas a 25 ε 5Θ 0, respectivamente durante 20 minutos após o que foi determinado a actividade especifica em termos de umoies de glucose libertados por mg da enzima por minuto» Os resultados estio representados na tabela abaixo»

TABELA V

Actividades específicas das β-glucanases de H3-H6, Hl e nativa de Bacillus (pmole de glucose mg enzima purificada”1.min-1>

Actividade específica a B-glucanase 25 °C 50-C H3 79© 1700 H4 85© 2ó00 H5 615 1890 H6 2040 3750 Hl 213Θ 3690 B = subtilis 1420 2600 B.macerans 35© 118Θ B»amy1o1iqueí aciens 1320 2490 A partir dos? resultados parece que a 2D°0 a enzima hibrida Hó tem uma actividade específica que é significativamente superior à de qualquer uma das enzimas parentais de Bacillus © à de fl-glucanase de 6»subtil is» Seralmente, as actividades especificas a 50°C foram 1.,5-3 vezes superior aos valores a 25°C» Também a esta temperatura a actividade específica de Hé excedem a das enzimas parentais assim como da jl-glucanase nativa de Bacil-lus subtilis» A enzima híbrida Hl também apresentou uma actividade específica elevada a ambas as temperaturas da mesma ordem de grandeza da enzima H6, A termoestabilidade da B-glucanase híbrida H3-H6

As termoestabilidade das enzimas híbridas purificadas foram determinadas em comparação com as das enzimas nativas purificadas de Bacillus spp» atrás mencionados essencialmente de acordo com o processo descrito no Exempla 3» As actividades enzimáticas foram testadas a 65*C, pH 4,í e a 70°C, pH 6,©, as concentrações das enzimas foram í©0 μ/ml do tampão de ensaio» Colheram-se amostras das misturas de reacção nos intervalos de tempo indicados nas Figuras 13 e 14 em que os resultados estão resumidos»

Parece que as BB-glucanasss híbridas H3, H4 e H5 em comparação com as enzimas nativas apresentaram uma estabilidade extremamente alta a 65C=C e a pH 4,1» Mais do que 9Ô% da actividade da enzima inicial de H3 e H4 e 85% de H5 foram mantidas após 6© minutos» A 70*0 e pB 6»© actividade enzimática residual de H3 após 60 minutos foi de 85%, Pelo contrário., a actividade residual das enzimas nativas após 60 minutos a 65 °C e pH 4,1 foi de apenas cerca de 1©% para a <1,3-í,4)—B—glucanase de B»amv1olique-faeiens e de B« subtil is enquanto que a |5-glucanase de B»macerans foi completamente inacfcivada após 1© minutos» A 70°C e pH 6,© menos de 10% da actividade das enzimas de B.subtilis, B.macerans e B.amyloliquefaciens manteve-se após 6© minutos de incubação, EXEMPLO 6

Q EFEITO DA <1 ,3-i ,4')-B-GLUCANASE HÍBRIDA H3 NA HIDRÓLISE DE α-GLUCANO DE CEVADA DURANTE A AMASSADURA

Realizou—se uma experiência em que a eficácia da enzima híbrida H3 para degradar β—glucano de cevada durante o processo de amassadura foi comparado com a eficácia de um produto fi-gluc-s-nase comercial» A mistura de amassadura consistiu em 50 g de malte finamente triturado a que se adicionou 2ô® ml de égua da torneira pré-aquecida <37*0» A esta mistura de substrato adicionou-se 5 pg da preparação purificada da enzima H3 misturando bem» Como testemunhas preparar.am-se duas misturas de amassadura semelhantes a uma das quais foi adicionado uma quantidade do produto β-glucanase comercial Cereflo ' 200L íNovo-Nordisk ft/S) contendo 5 pg de β-glucanase de Baci11ussufatilis» A última mistura de amassadura serviu como testemunha negativa sem qualquer adição de β-glucanase» As misturas assim preparadas foram deixadas a 37pC durante cerca de 50 minutos para iniciar a trituração após que foram aquecidas à curva de temperatura indicada na Fig»i5 até 175 minutos. Durante o período entre &5 e 185 minutas retiraram-se amostras das misturas nos intervalos indicados na Fig.15, após este período de trituração outras amostras foram removidas após 4,6 e 24 horas»

As amostras retiradas fofam imediatamente arrefecidas em gelo e centrifugadas a 40*C após o que os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos e incubados durante 15 minutos em água fervente para inactivar as enzimas» As amostras foram então testadas relativamente ao β-glucano residual usando & formação de de fliutòipor''’ injecção de Jorgensen íCarlsberg Res» completos com calcofluor e análise acordo com o processo descrito por Commun», 1988, 53, 277-285 e 287-296)

Os resultados das experiências da trituração estão resumidos na Fig.15 que mostra as quantidades de [i-glucanos residuais nas misturas de trituração acima» Parece claramente que a adição de {J-glucanases resultou em quantidades significati-vamente mais baixas de 15-glucanos nas misturas comparado com a testemunha negativa» Enquanto o produto fi-qlu.canase comercial cessou de hidrolisar mais β-glucano quando a temperatura excedeu cerca de 67 °C a enzima híbrida H3 adicionada na mesma concentração degradou contínuamente β-glucanos durante todo o período de incubação independentemente das condições de temperatura. A enzima H3 era tão activa que a quantidade de β-gluca-nos após a terminação do processo de trituração foi inferior a mg por litro comparado com cerca de 16Φ® mg na mistura testemunha negativa e cerca de 600 mg por litro na mistura com a (2-glucanase comercial de B. subtil is» Após 24 horas de trituração e repouso não se encontrou práticamente resíduos deiectáveis de fi-glucanos na mistura a que se adicionou a enzima híbrida H3.

Durante a mesma experiência as quantidades da fê-gluca-nos residuais foram analisadas em soluções de β-glucanos puros a que se adicionou 250 pg de fê-glucanase híbrida H3 e β-glucanase de B.subtil is» respectivamente» As soluções consistiram em 50 ml de β-glucano íl,5 mg/ml) em Na-acetato 10$ mM, pH 5,5, 5 mM

CaCl^* as soluções foram pré-aquecidas a 37°C antes da adição das enzimas» 53·

Referências:

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Claims (7)

1. lã» - Processo para a preparação de uma (1,3-1,4)--β-glucana.se termoestável caracterizado por compreender cultivar— -se um microrganismo em que se introduziu um fragmento de DNft de um modo tal que o microrganismo seja capaz de exprimir a íl,3-~1 ,4>-|5-glucanase termoestável, sendo a cultura efectuada em condições conducentes- â produção da (1 ,3—1 ,4>—fS—glucanase termo-estável e à recuperação da C1»3-1?4)-B-glucanase termoestável da cultura de modo a originar < i ,3-l,4>-fl-glu.canase termoestável que retem pelo menos 50% da sua actividade após 10 minutos ou mais de incubação em CaCl0 5—10 mH, acetato de Na 20-40 mM, a um pH de ó?© ou inferior e a uma temperatura de 65°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de 0,05 mg a 1 mg de {1,3-1,4)-β-g Iu.cana.se por ml, entendendo-se a actividade da (í ,3-1,4)-|s-glucanase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações β-g iicosá. dicas em í 1,3-1,4>-|5-glucanos» 2ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carácter izado por o microrganismo ser uma bactéria» 31» - Processa de acordo com a Reivindicação 2, carac-terizado por o microrganismo ser uma bactéria çram negativa. 4â» - Processo de acordo com a R‘eivindicação 2, carac-terizado por a bactéria gram negativa ser uma estirpe E.coli» 51» - Processo de acorda com a Reivindicação 4, carac-terizado por a estirpe E.coli ser a estirpe E.coli que alberga o plasmideo ptlDi3-Ht, depositada na ‘‘Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen" (Colecção ftlemS de Micorganismos) sob o nS de depósito DSM 5461, ou mutantes ou variantes da mesma. -57- 6â= - Processo de acorda com a Reivindicação 4 , carac-terizado por a estirpe E.coli ser a estirpe E.coli que alberga, o plasmideo pTZÍ9R-H3, depositado na “Deutsche Sammlung von Mikroor— ganismen11 (Colecção Alemã de Micorganismos) sob o n2 de depósito DSM 579D, ou mutantes ou variantes da mesma.
2. 71. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, carac-terizado por a estirpe E.coli ser a estirpe E.coii que alberga o plasmideo pTZ19R—H4, depositado na "Deutsche Sammlung von Mikroor— ganismen" (Colecção Alemã de Micorganismos) sob o nQ de depósito DSM 5791, ou mutantes ou variantes da mesma.
3. 81. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, carac-terizado por a estirpe E.coli ser a estirpe E.coli que alberga o plasmideo pTZ19R-H5, depositada na "Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen" (Colecção Alemã de Micorganismos) sob o n2 de depósito DSM 57925 ou mutantes ou variantes da mesma.
4. 91. - Processo de acordo com a Reivindicação 4, carácter izado por a estirpe E.coli ser a estirpe E.coli que alberga o plasmideo pTZÍ9R-Hó, depositado na “Deutsche Sammlung von Mikroor ganismen" (Colecção Alemã de Micorganismos) sob o n‘2 de depósito DSM 5793, ou. mutantes ou variantes da mesma. 1Θ1. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizatio por o microrganismo ser uma levedura. ílã. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac-terizado por a levedura, ser da espécie Sa.ccharomvces.
5. 121. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac· .erizado por a espécie Saccharomvces ser a Saccha.romvces cereví: ;iae. 13â. - Processo de acordo com á Reivindicação 1, caracterizado por se prepa.rar uma í i ,3— 1,4)-(5-glucanase termoes-tável que retem pelo menos 5&7. da sua actividade após 10 minutos de incubação em CaC-I^ 5-10 mH, acetato de Na 20-40 mH, a um pH de 6.0 ou inferior e a uma temperatura de 70°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de θ,3 mg a 1 mg de í1,3-1,4)—β—glucanase por ml, entendendo-se a ac ti vidade da <1,3-1,4>-B-glucanase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações β-glicosídicas em <1,3-i,4>-B-glucanos, 14*1, - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4)-β-g 1 ucans.se termoes- tável que retem pelo menos 5€»% da sua ac ti vidade após 15 minutos de incubação em CaCl0 5-í€i mH, acetato de Na 20—40~mM, a um pH de £·* 6.0 ou inferior e a uma temperatura de 65°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de €»,05 mg a 1 mg de < 1,3-1,4)-(5-glucanase por ml, entendendo-se a actividade da {1,3-i ,4)-B~glu.canase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações β-glicosídicas em í1,3-1,4)-B-glucanos. 15ã. - Processo de acorda com a Reivindicação 14, caracterizado por se preparar uma í1,3-1,4)-B-glucanase termoes-tável que retem pieio menos 50% da sua actividade após 15 minutos de incubação em CaCl„. ίβ mH, acetato de Na 40 stíM, a um pH de 6,0 ou inferior e a. uma temperatura de 70°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de 0,3 mg a 1 mg de < i ,3-1,4)~B-glucanase por mi, entendendo-se a actividade da < 1,3-1,4)-j!-glucanase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações β-glicosxdicas em (1,3-i,4)-&-glucanos. 16§, - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma 1,3-1,4)—β—glucanase termoes-tável que retem pela menos 50% da sua actividade após 18 minutos

   de incubação em CaCl2 5-l€* mH, acetato de Nà"20-4@ mM, a um pH de 6,0 ou inferior e a uma temperatura de 65 °C ou superior* tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de ©,β5 mg a 1 mg de (1,3-1,4>—β-glucanase por ml* entendendo-se a actividade da í1,3-1*4>-p-glucanase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações |5-glicosídicas em C1 ,3-154>-8-glucanos« i7ê= - Processo de acordo com a Reivindicação 16, caracterizado por se preparar uma í 1,3-1,4>-|5-glucanase termoes-tável que retem pelo menos 50% da sua actividade após 1Θ minutos de incubação em CaCl.7 10 mM, acetato de Na 4Θ mM, a um pH de 6,0 ou inferior e a uma temperatura de 70 °C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de 0,3 mg a 1 mg de í1,3-1,4)-B-glucanase por ml, entendendo-se a actividade da < 1,3-1,4)~B~glucana.se como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações B-glicosidicas em í 1,3-1,4>-fi-gTucanos» 18ã. - Processa de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por se preparar uma C1,3-1,4)-{5-g2ucanase iermoes-tável que retem pelo menos 85% da sua actividade após 3€* minutos de incubação em Ca0Io 5-1Θ mM, acetato de Na 2Θ-4Θ mM, a um pH de 6.0 ou inferior e a uma temperatura de 65°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de 0,05 mg a 1 mg de ( 1,3-1,4>-j$-glucanase por ml, entendendo-se a actividade da (1,3-1,4>-f!-giucanase como a capacidade da enzima para hidro-lisar ligações jl-glicosídicas em (1,3-1,4)-|3-glucanos« 19§, - Procssso de acordo com a Reivindicação 18, caracterizaao por se preparar uma (1,3-1,4>~B-giucanase termoes-tável que retem pelo menos 85% da sua actividade após 60 minutos de incubação em CaCI2 5-1Θ mM, acetato de Na 20-4Θ mM, a um pH de 6.0 ou inferior e a uma temperatura de 65°C ou superior, tendo a solução incubada uma gama de concentração de enzimas de 0,05 mg a

   a íraP®cidade da enzima para hidro-em Cí53-j,4}-í3~glucanos =

   1 mg de (i, 3-1 , 4) -β-g lucans.se da (i,3-1,4>-B-giucanase como lisar ligações β-glicosídicas 20â« - Processo de acordo com 5 Reivindicação 18 ou. 19, caracterizado por se preparar uma <1,3-1,4>-»-glucanase termoes-tável que retem pelo menos 85% da SUat actividade após incubação em CaCl2 5-1Ô mM, acetato de Na 20~4® mH? a um pH de 4,1 e a uma temperatura de é-j-C5 tendo a solução incubada uma gama de concentração ds enzimas de 0,1 mg de (1,3-1,4>-B-glucanase por ml, en tendendo—se a actividade da como a capacidade da enzima para hidra lisar ligações }3—glicosídicss em < 1,3-15 4) ~!5-g 1 ucanos« 2iã» - Processo de acordo com a Reivindicação 20, caractarizado por se preparar uma (1,.3-1,4)-15-910030336 termoes— tável que retem pelo menos 90% da su.a actividade* 22ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4)~fS~glucanase termoes-tàvel que retem pelo menos 85% da sua actividade após 30 minutos de incubação em CaCI2 5-1® mil, acetato de Na 20-40 mM, a um pH de 6,0 e a uma temperatura de 70°C, tendo a solução incubada uma concentração de enzimas de €?,! mg de (1,3-1,4>-0-glucanase por ml» 23ã. - Processo de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4)-B-glucanase termoes-tável que retem pelo menos 90% da sua actividade após 3£t minutos de incubação» 24ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 22, caracterizado por se preparar uma í 1,3-1,4)-(3-glucanase

   Lerrootístâvsl qus retem pelo menos 85% da sua actividade apés 60 minutos de incuba.çg0s> 25ã.» - Processo de acordo com qualquer das Reivindicações 1, e 14 a 24, caracterizado por ss preparar uma (1,3-1, 4)~jS~ -glucanase termoestável que após 10 minutos de incubação a 65 °C e a um pH de 6=,0 em extractos de célula em bruto tem uma actividade relativa de β-glucanase de pelo menos i@0%. 26i» - Processo de acordo com a Reivindicação 25, caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4}-|s-glucanase termoes-tàvel que após 10 minutos de incubação a 65°C e a um pH de 6em extractos de célula em bruto tem uma actividade relativa de B-glucanase de pelo menos 110%, 27â„ - Processo de acordo com a Reivindicação 26? caracterizado por se preparar uma (153~i,4)-B-glucanase termoes-tâvel que apés 1Φ minutos de incubação a 65*0 e a um pH de ós0 em extractos de célula em bruto tem uma actividade relativa de B-glucanase de pelo menos 12θ%„ 28ã= - Processo de acordo com qualquer das Reivindicações i s 14 a 27? caracterizado por se preparar uma (1 ?3~1 *4)— ís--glucanase termoestável que compreende uma sequência de amino ácidos de fórmula em que A é um polipeptídeo constituído por 5 a 20© amino ácidos que são idênticos em pelo menos 75% aos resíduos de amino áciaos da parte N-terminal da (1,3-15 4 5 -fj~-g lu.canase do Baci 11 us affpíA··"·-—-quefaciens ou do Bacillus macerans tal como são representada® na~' Figuras 3 e 4S ε M è um polipeptídeo constituído por 5 a

   /5% aos resíduos de 1,4] í -β—g lucans.se do .cerans tal coma s:So BciCi11 us amy 1 o 1 iguefacisns ou da iíaci 1 lus macerans tal coma representados nas Figuras 3 e 4»

   PMfô · SO 60 .«o CÃA7ÍCAACG>AGAATCCCTGCACTA71ATCGAT7CG7CACCCACTTAAAGTT7TTCGACCAGCGTC71177AACGGCAC.ACACATGGAA , . 120 . .ISO . . 160 agccaggacgattttitaciggagacagtgaaagaaaagtatcatcaggcgtataaatgcacgaagaatatccaIacciacaitcagaaa . . 210 . . 240 . . 270 GAGtAlGGGCATAAGC7CACCAGTGACCAGCTGCrGTATTrAACUTTCACATACAAAGGGTAGTCMACAACTATAATEAAAãCGCm , , 300 . .330 . . 360 cctcgtattaattgtttcttccattcatatataggattgttacgcataaagcacgcaaaacctatctctctgtgctgatggiagtitagc 390 . .420 . . ASO TTlGTATTmAACAGAAGGATTA1CATTAT1TCGACCGATGTTCCCTnGAAAAGGATCAlGTATGATCAATAAAGAAAGCGTG1TCAA AM . . $10 5A0 aaaagggggaatgctaacatgaaaccagicttcctmttcitgtcaccggatigitIaícagtttgtgtcggatcacitctagtgtttcg MatLyaA£iV4lI.4ul.«uIiilauValThxCly!.aun>at1at5arLauCytGlyI].aThrSarSirValSar . . 570 . . 600 630 CC1CAAACAGGCGGA7CGTTT1TTGAACC711TAACAGC7A1AÁC7CCGCC71ATGGCAAAAAGC7GATGG11AC1CAAA7GGAGA1A7C Al*GIiiThiGlyGXySaiFhaPhaGluFroFbcAsnSarTytA»0$*l01yl*uTtpeinLyiAlaAipGlyTycSArAtn(UyAAp(1et ^ . 660 . . 690 . . 720 TTTAACSGCACTICGCGTGCIAATAACGTCICTATGACGICATTAGGTCAAATOCGTTTCCCCCTGACAAGTCCGICTTATAACAAGTTT IhaAmCyaThrTrpArtAlaAinAanValGarMatThrSicLauGIyÇluHalAriLtuAlalauIbrSarFreSarTyrAAnlyAni· . . 750 . 7B0 .610 CACTCCGOCCAAAACCCCTCGGTTCAAACATATGGCTATGGACTTTATGAAGTCAGAATGAAACCGGÇTAAAAACACAGGGATTGTTTGA A«2QraGlyGluAMAr(3azTaU;in7hrTytGlyIrteXyt.auTyrGluVAlAtAHaALyi2r«AlalyaAanThcGlyIlaValSar . . 640 . . É*õ*l£e70 . . 900 TCGTTCTTCACTTATACAGGTCGAACGGAGGGCACTGCTTGGGATG«CATTÍGAfATCGAATTTCTAGGAAAAGACACGACAAAAGTCCAG SaiIb«nkatbrIyrI)ti01y?r9ThrGl.uGlyThtrt6TfpAt>01uIlaAs(IlaGluIhaLaiiGlyLyaAi(7tk(Thr1.yaVaUUn . . 930 . . 960 . . 990 TTTAACTATTATACCAATGGGCT1CGCfiCTCATGAAAAGGTTATCTCTCTTGCCTTTGATCCATCAAAGGGCTTCCATACC7ATGC1TTC IhaAanTyrTyrThrAanGlyValGXyGlyHlaeiuLyaTAmtSvlUpGlyFbaAipMaSaiLyaGLyRKHUtltrTyzAUFha . . 1020 . . 1050 . . 1060 GATTCCCACCCACGGTATATTAAATGGUTCTAGACGGTGTTTTGAAACATACCGCCACCGC&AATATTCCGAGTACCCCAGGCAAAATT AapTrpGlníiaGl.yTytXt«Ly»TtpTytVaLAipGlyTaU,aTil.y»HlaT1iIAl»ThlAl»A»nILiProSatIfttFti>Glyty»Il· . . 1110 . . 1140 . . 1170 ATGATGAATCTATCCAACGGAACCGCACTCGATCACTGCnAGGtTCTTATAATCCACCGAATCCGTTGTACCCTGAATAtGACTGGGTA HaW1»tAaril»«TtI>A»t>Cl7lh£GlyVàlA»pA*p7rpLauGlySarIyrA«nGlyAl*Atnfri>l.auTyrAlaGluTyrAapIcpVal 1200 . . 1230 $n3ft¥ AAATA1ACGAGCAAT7AATATGATTGCAGCTGCCCAICAGCT7TTTAGTCCACrçCAGGCA7GCAAGCT7 LyflytTbrSarAao GENE HÍBRIDO CODIFICANDO A (1,3-1,4) -Ç-GLUCANASE Hl EeoRV EcoRI

   TAA HindU Τ1β« 1240 |ACT CCT TGG GAT GAG ATT GaT Pco Trp Asp Glu 11« Asp ATC GAA TTT CTA CGA AAA GAC? 11« Glu Ph« Uu Gty Lyt Asp| a

   Κ . . 30 . . 60 «0 GUrfcCACCTCCGATATACTATAATTACCCA6GTAAAATATTCCAACACCCTGGCTCCATAA0TTC6TTC*TAmAAAATCATITTC0 120 . .150 . .IDO AGGTGTATTATGAAAAAGAACTCacmtACACTGGTCAeCACATTTCC6TmCTTTGATT1TTTCTCTAACCllCT1TAGCGGGCAST ' H»t.L]r»Ly«Ly»5«rCytPhèThtL«uVtlI^tThrPh«Al»P>HÍ«tl»ori*I^»$»rVâlS«cAl*l*uAliGlyS»r . 210 . .240 . , ^ 270 ctcttctcgcaaccattaagttatittaatccgagtacatgggaaaaggcagaigggtaticcaaigggggggtgttcaattccacatgg V*lt%eItp01vfroL*u3trIyrfh*AinPioSttThrTrpGlul.y>AÍKAipGlyTyrSiiA>nGX>Cl7Vami«A*nCy«IhrI(p ,300 . . ÍJO . .360 CGTGCCAACAATGTTAATTTTACGAATCATGGAAAGCTCAAGCTGCGCTTAACGAGITcTgCGIACAACAAATTTCACTGCGCGGAGTAC AXAAXaAfnAinV«LAinni»ThiAroA*pG1.7!.yiI.auL73L»uGlyI.«uT1>rS*iSaxAlaTyrAtriL.y»Il1>tAaj£7iAl.*GliiTyr 390 . . «0 ASO CGATCAACGAACATTTACGGATACOGCCTGTACGAGGTCAGTATGAAGCCAGCCAAAAATACAGGAATTGTCTCATCCTTTTTCACGTaT Al»G»rThrA«nXl»Tyi<ílyIyrfl.yI.»iiTyiGluVil5»rM«tI.y*FíaAl*Xy«Ai6TftrClyIi«V*XS«xS«rFh«Ph«ThiTyr . . AM tttrtVii' .510 . . 5A0 ACAGCACCTCC1CATCGCACACAATGGGATGAAATAGÃTÁfcGAATmTGGGAAAAGACAClÂCGAAGGTTCAATTTAACTATTATACA Hufily2ceAliBiiOlythrGlnTi>pA4i£XuIl*Aipll«Gl.uI,hiLnGlyLyaA>]>nixnixLy»V«101nnt«A«oTyrTyxThx . . 570 . . 600 630 aaigocgcacgaaaccatgagaagttcgcggatctcggatttgatgcagccaatgcctatcatacgtatgcgttcgattggcagccaaac A(f>GXyAl*GlyAanBÍBCluLyirhaAl.*A(pL*«01yfh«A«|>AlMX>Aan*laTyrllaIhxTyzAla7b*AapTxfCl>i7roAllt . . 660 , . 690 . . 720 TCTATTAAATGOTATGTCGATgGGCAATIAAAACATACTGCAACAACCCAAATACCGGCAGCGCCGGGGAAAATCATGATGAATTTGTGG 8*lIl*Ly«IrpTyrVaU»p01jr01nL»uLy»Bi»It>rAlèThrI1)tClnIl»Tt*AlAAl»ProGlyLyaTl«Mat«ftA«nl.«uTrp . . 750 . , 760 010 AAIGGTACGGGTGTIOATGATIGGCTCGCTTCCTACAATGGCGTAAATCCGATATACGCTCAITACGACTGGATGCGcIaTaGAAAAAAA AjnSlyThrGlyV*lA»pA»pTrpL«uGlySarIytAinGlyVâlA»nfieTl»TyiAl*1!l»TyxA»pIrpM«tArjT7rA£âLyiLy» . . BAO . . 670 2300 TAATGTACAGAAAAGGATTTCCCTOGCGGAATCCTTTTTTGATTAAAACGAAATAATCCC........................AGATC1 ííítli: b GENE HÍBRIDO CODIFICANDO A (1,3-1,4)-^-GLUCANASE H2

   *

   29 â» - Processo de acordo com a Reivindicação 28 ? caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4)-15-9lucanase termces-távsl que compreende uma sequência de amino ácidas de fórmula A - M em que A é um polipeptídeo constituído por 5 a 2&® amino ácidos que são idênticos em pelo menos 85% aos resíduos de amino ácidos da parte N-terminal da <ts3~i,4>~B-glucanase do Bacillus amvloli-quefaciens ou do Baci11us macsrans tal como são representados nas Figuras 3 e 4, e M é um polipeptídeo constituído por 5 a 2Θ& amino ácidos que são idênticos em pelo menos 85% aos resíduos de amino ácido da parte Oterminal da (1,3-154)--{l~glucanase do Bacillus amvloliquefaciens ou do Bacillus macerans tal como são representados nas Figuras 3 e 4= 3&â„ - Processo de acordo coai a Reivindicação 29, caracterizado por se preparar uma (1,3-154)-0-glucanase termoes-távsl que compreende uma sequência de amino ácidos de fórmula A - M em que A é um polipeptídeo constituído por 5 a 2ΘΘ amino ácidos que são idênticos em pelo menos 9Θ% aos resíduos de amino ácidos da parte N-terminal da {1,3-1,4}-í5-glucanase do Bacillus amvloliquefaciens ou do Bacillus macerans- tal como são representados nas Figuras 3 e 4? e M ê um polipeptídeo constituído por 5 a 2ΘΘ amino ácidos que são idênticos em pelo menos 90% aos resíduos de amino ácido da parte C-terminal da Cí,3-i?4)-p-glucanase do Baci1lus amy1oliquefaciens ou do Bacillus macerans tal como são representados nas Figuras 3 s 4, í> 'Kr

   Λ· -66- 3iã. - Processa de acordo cora a Reivindicação 28-30, caracterizado por se preparar uma <1,3-1,4)-fi-g 1 ucanase termoes-tável era que A é ura paiipeptídeo constituído por 5 a 2ΦΘ araino ácidos que são idênticos em pelo menos 75%, de preferência era o pelo menos 85¾ e. em particular, era pelo menos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte N~terminal da (1,3-1,4)-fS-gIucanase do Bacillus aravloliguefaciens tal como ê representado na Figura 3» 32â« - Processo de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por se preparar uma (1,3-1, 43-ll-glucanase termoes-tável era que A é um polipeptídeo constituído por 16 amino ácidos que são’ idênticos era pelo menos 75%, de preferência em pelo menos 85% e, em particular, era pelo menos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte W-terrainal da (1,3-1,4)—β-glucanase do Bacillus aravloliguefaciens tal como é representado na Figura 3. 33â« - Processo de acorda com a Reivindicação 31, caracterizado por se preparar uma í 1,3-1,4>-fl-gl ucanase terraoes-tável em que A é um polipeptídeo constituído por 36 amino ácidos que são idênticos em pelo menos 75%, de preferência em pelo menos 85% e, era particular, era pela raenos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte N-termxnal da <1,3-i,4)-β-ο1ucanase do Bacillus aray1o1iquefaciens tal como é representado na Figura 3- 34a, - Processo de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por se preparar .uma < 1,3-1,4)-{S~glucanase termoes-tâvel em que A é ura polipeptídeo constituído por 78 amino ácidos que são idênticos em pelo menos 75%, de preferência era pelo menos 85% e, em particular, era pelo raenos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte N-terminal da < 1,3-1,4)-|3-glucanase do Bacil lus aravloliguefaciens tal como é representado na Figura 3= 351» - Processo de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por se preparar uma (1,3-1,4}-B-glucanase termoes-tável em que A é um polipeptídeo constituído por 107 amino ácidas que são idênticos em pelo menos 75%, de preferência em pelo menos 85% e, em particular, em pelo menos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte N-terminal da í i ,3-1,4)-f3-glucanass do Bacillus amyloliauef adens tal como é representado na Figura 3* 361» - Processo de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por se preparar uma < 1,3-1,4)-15-glucanase termoes-tável em que A é um polipeptídeo constituído por 152 amino ácidos que são idênticos em pelo menos 75%, de preferência em pelo menos 85% e, em particular, em pelo menos 90%, aos resíduos de amino ácidos da parte N-terminal da < 1,3-1,4)-{5-glucanase do Bacil lus amvloliemefaciens tal como é representado na Figura 3» 371= - Processo de acordo com a Reivindicação 1 e 13 a 36, caracterizado por se preparar uma í 1,3-i ,4)-|5-glucansse termoestável que contém um peptídeo-sinal ligado à extremidade N-terminal da enzima» 3Sã» - Processo de acordo com a Reivindicação 37, caracterizado por se preparar uma í1,3-1,4)-B-glucanase termoestável que contém um peptídeo-sinal derivado de uma levedura tal como a espécie Saccharomvces» 391» - Processo de acordo cc«m a Reivindicação 38, caracterizado por se preparar uma <1,3-1,4>-jl-glucanase termoestável que contém um peptídeo- sinal que é o peptídeo-sinal do factor-α da levedura, da fosfatase ácida da levedura ou da invertas© da levedura»

   40ã. ~ Processo de acordo com s '"Reivindicação 37, caracterisado por se preparar uma C i ,3*-l ,4)-$-glucanase termoes-tável que contém um peptideo—sinal que é idêntico em pelo menos 75%3 de preferência em pelo menos 85% e, em particular, em pelo menos 90%, ao peptideo do Bacillus amylolicmefariang ao nível dos amino ácidos. 4iâ. - Processo de acordo com a Reivindicação 1, caracterisado por se preparar uma < 1,3-1,4)-B“-glucanase termoes-tável que compreende a seguinte sequência de amino ácidoss Gln-Thr-Gly-Gly-Ser-Phe*Phe-Glu-Pro*Phe-Asn-Ser-Tyr-Asn-Ser-Cly-Leu-Trp-Gln-Lys-Ala*Asp-Gly-Tyr-Ser-Asn-Gly-Asp-Met-Phe-Asn-Cys-Thr-Trp-Arg-AU-Asn-Asn-Val-Ser-Met-Thr-Ser-Leu-Gly-Glu*Mec-Arg-Leu-Ala>Leu-Thr-Sc r*Pro-Ser-Tyr-Asn-Lys-Phe-Asp»CyE-Cly-Glu-Asn-Arg-Ser*Val-Gln-Thr’Tyc-Cly-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Glu»Val*Arg-Met-Lys*Pro-Ala-Lys*Asn-Thr-Gly-Ile-Val-Ser-Ser*Phe-Phe-Thr-Tyr-Thr-Gly-Pro-Thi>Glu-Gly-Thr-Pro-Trp-Asp-Glu-lle-Asp-Ile*Glu*Phe-Leu*Cly*Lya-Asp-Thr-Thr*Lys-Val.Gln-Phe-Asn*Tyr-Tyr-Thr-Asn-Gly-Val*Cly-Gly-Hls-Clu*Lys-Val-Ile-Ser*Leu* Gly-Phe-Asp-Ala-Ser-Lys-Gly-Phe-His-Thr*Tyr-Ala-Phe-Asp*Trp-Gln-Pro-Cly-Tyr-ne-Lys-Trp-Tyr-Val-Asp-Gly-Val-Leu-Lya-His-Thr-Ala-Thr-Ala-Asn-Ile-Pro-Sec-Thr-Pro-Gly-Lys-Ile-Mec-Met-Asn-Leu-Trp-Asn-Gly-Thr-Gly-Val-Asp»Asp-Trp-Leu-Cly*Ser*Tyr-A$n*Cly-Ala-Asn-Pro-Leu*Tyr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Xrp-Val-Lys-Tyr-Thr-Ser-Asn ou seus análogos. 42â. Processo de acordo com a ' Reivindicação í, caraterizado por se preparar uma U,3-154>-p,-gIucanase termoes-tável que compreende a seguinte sequência de amino âcidoss Mec*Lys-Arg*Vfll-Leu-L£UíIle-Leu*Val-Thr-Cly.Leu-Phe-Hec-Ser-Leu-Cys-Cly-Ile-Thr-Ser-Ser-Val-Ser-Ala-Cln.Thr-Cly-Gly-Ser-Phe-Phe-Clu.Pro· Phe-Asn-Ser*Tyr-A«n-Ser-G!y-Leu-Trp-Gln-Ly«-Ala*Asp-Gly-Tyr*Ser ·Α5η· Gly*Asp-Met-Phe-Asn-Cys-Thr-Trp*Arg-Ala*Aan-Asn-Val-Ser-Mec*Thr-Ser- Lea-Gly*Clu*Het*Arg-Leu-Ala-Leu-Thr*Ser-Pro-Ser-Tyr-Asn-Lys-Phe-Asp- Cys-Cly-Clu-Asn*Arg*Ser-Val-Cln-Thr*Tyr*Cly-Tyr-Gly-Leu-Tyr-Glu-Val· Arg-Met-Lys-Pro-Ala-Lys-Asn-Thr-Gly-Ile-Val.Ser-SefPhe-Phe-Thr-Tyr- Thr-Cly-Pro-Thr-Glu-Cly-Thr-Pro-Trp*Asp-Clu-Ile-Asp-Ile-Clu-Phe-.Leu· Cly-Lye-Aap-Thr-Thr-Lys-Val-Cln-Phe-Asn-Tyr-Tyr-Thr-Asn-Cly-Vfll-Gly· Gly-Hls-Clu.Lys-Val-Ile-Ser-Leu*Gly*Phe-Asp-AlA-Ser-Lys-Cly-Phe-HÍ3- Thr-Tyr-Ala*Phe-Asp-Trp*Gln*Pro-Cly-Tyr-lle-Lys-Trp*Tyr*Val*A3p-Gly- Val-Líu-Lys-Hia-Thr-Ala-Thr-Ala-Asn-Ile-Pro-Ser-Tht-Pro-Cly-Lys-lle· Het*Mec-Asn-Uu-Trp*Asn-Gly-Thr-Gly-Val-Asp-Asp-Trp-Uu-Gly-Ser-Tyr- Asn-Cly-Ala-Asn-Pra-Leu-Tyr-Ala-Glu-Tyr*Asp-Trp-Val-Lys-Tyir-Thr-Ser- Asn ou seus análogos» 43§» - Processo para a preparação de um fragmento de DMA, caracterizado por se incluir no referido fragmenta uma sequência de nucleótidos codificando a <1,3-1,4)-B-glUCanaee termoe-=tável tal como foi definida nas Reivindicações 1, 13 a 4?» 44§„ ~ Processo de acordo com a. reivindicação 43 caracterxzado par se preparar um fragmento de DMA que compreende a seguinte sequência de nucleótidoss V

   ' 30 60 GAATTCAACO aagaatcgct gcactattat cgattcgtca cccacttaaa ctttttccac 90 120 CACCGTCTTT TTAACCCCAC ACACATCCAA AGCCACCACG ATTTTTTACT GGAGACAGTG 150 180 AAAGAAAAGT ATCATCAGGC GTATAAATGC ACGAAGAATA TCCATACCTA CATTGACAAA 210 2A0 GACTATGGGC ATAAGCTCAC CaGTGACGAG CTGCTGTATT TAACGATTCA CATAGAAAGG 270 300 ATACGATTGT TACGGATAAA GCAGGCAAAA GTAGTCAAAC AACTATAATG AAAGCCCTTT 330 360 CCTCCTATTA ATTGTTTCTT CCATTCATAT CCTATCTGTC TGTGCTGATG gtagtttacg 390 420 TTTGTATTTT TAACAGAAGG ATTATCATTA TTTCGACCCA TGTTCCCTTT GAAAAGGATC 450 480 atgtatgatc AATAAAGAAA gcgtgttcaa AAAAGGGGGA atcctaacat CAAACCAGTG

   510 540 TTCCTAATTC TTGTCACCCG ATTCTTTATC AGTTTGTCTG GGATCACTTC TAGTCTTTCG 570 600 GCTCAAACAC GCGGATCCTT TTTTCAACCT TTTAACAGGT ATAACTCCCC GTTATGCCAA 630 660 AAAGCTCATG gttactcam TGGAGATATC tttaactcca cttgccgtgc taataacgtc 690 720 tgtatgacct cattaggtga aatgcgtttg gcgctgagaa gtccgtctta taacaagttt 750 700 CACTGCCCCC AAAACCCCTG CCTTCAAACA TATGCCTATG GACTTTATGA ACTCAGAATG 810 840 AAACCCCCTA AAAACACAGC GATTGTTTCA TCGTTCTTCA CTTaTACAGG TCCAACGGAG 870 900 GGGACTCCTT GGGATCAGAT TCATATCGAA tttctagcaa aagacaccac aaaagtccag 930 960 TTTAACTATT ataccaatc-g ggttcgcggt catgaaaagg ttatctctct tggctttcat 990 1020 GCATCAAACG GCTTCCATAC CTATGCTTTG CATTGGCAGC CAGGGTaTAT TAAATGCTAT 1050 1080 GTAGACCCTC TTTTCAAACA taccgccacc gccaatattc ccactacgcc ACCCAAAaTT 1110 1140 atgaicaatc tatccaacgg aacccgagtg catcactcct taggttctta taatggaccg 1170 1200 AATCCGTTGT ACGCTCAATA TCACTCCCTA AAATATACGA GCAATTAATA TCaTTCCACC 1230 TGCCCATGAG CTTTTTAGTC CACTCCAGGC ATCCAAGCTT 45é« - U« organismo eucariàtic'o-'_mfprocariótico, caracterizado por ser capas de exprimir o fragmento de DMA tal cama fai definido na Reivindicação 32 ou 33« 46®. - Um organismo de acordo com a Reivindicação 45, caracterizada por ser um microrganismo* 47§. - Um microrganismo de acordo com a Reivindicação 46, caracterizada por ser uma. bactéria. 48ã» - Uma bactéria de acordo com a Reivindicação 47, caracterizada por ser uma bactéria gram-πegativa. 49â. - Uma bactéria de acordo com a Reivindicação 48, caracterizada por ser uma estirpe E.coli. 50ã. - A estirpe E.coli, caracterizada por albergar o plasmídeo pUCi3-*Hl depositado na “Deutsche Sammlung von Hikroor-ganismen" (Colecção Alemã de Microrganismos) sob o nS de depósito DSM 54éi, e mutantes ou variantes da mesma. plasmídeo ganismen" DSM 57905 plasmídeo ganismen” DSM 5791, 51ã« - A estirpe E.coli, caracterizada por albergar o pTZ19~H3 depositado na "Deutsche Sammlung von Mikraor-(Colecção Alemã de Microrganismos) sob o nS de depósito e mutantes ou variantes da mesma. 52ã. ~ A estirpe E.coli» caracterizada por albergar o pTZ19~H4 depositado na "Deutsche Sammlung von Mikroor-(Colecção Alemã de Microrganismos) sob o n2 de depósito e mutantes ou variantes da mesma. 53ã» ~ A estirpe E.coli, carac terizada por albergar c-plasmídeo pTZ19-H5 depositado na "Deutsche Sammlung von

   Mikroo rg an i eraen H (Colecção Alemã de Microrganismos) sob o n° de depósito DBM 5792, ε mutantes ou variantes da mesma, 541'. - A estirpe £,cali, caracterizada por albergar o plasmideo pTZ19-H6 depositado na "Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen" (Colecção Alemã de Microrganismos) sob o nQ de depósito DSM 5793, e mutantes ou variantes da mesma.
6. 551. - Um microrganismo de acordo com a Reivindicação 465 caracterizsdo por ser uma levedura. Sòã» — Uma levedura de acordo com a Reivindicação 55, caracterizsda por ser da espécie Saccharomvces, 571. ~ Uma levedura da espécie Saccharomvces de acordo com a Reivindicação 56, caracterizsda por ser a Saccha.romvces cerevisiae. 581, — Um organismo de acordo com a Reivindicação 45, caracterizado por ser uma planta escolhida do grupo formado por aveia, cevada, centeio, trigo, arroz ou milho.
7. 591. - Processo para degradar í 1,3~1,4)-í3-glucanos num substrato, caracterizado por compreender submeter-se o substrato à acção de uma quantidade eficaz de uma (1,3-1,4)-j2-glucanase tal como foi definida em qualquer uma das Reivindicações la 22, durante um determinado período de tempo, a uma temperatura de 65°C ou superior, sendo a quantidade de ¢1,3-1,4)-|Sg 1 ucanase de, no máximo, 2&Θ pg, de preferência de, no máximo, 1€»θμς, em particular de, no máximo, 5#pg ou, sobretudo de, no máximo, 20pq ainda, preferencialmente de, no máximo 15 pg por kg de substrato. -74-

   60ã» - Processo de acordo com a..- Reivindicação 59, caracterizado por o substrato compreender grãos em bruto de cevada ou aveia ou de outros grios, ou parte dos mesmos, não modificados» élã» - Processo de acordo com as Reivindicações 59 ou caracterizado por α substrato que compreenda os (1,3-1,4)--(3--glucanos ser misturado cosi um segundo substrato derivado do milho, arroz ou trigo compreendendo uma (1,3-1,4)-{3glucanase termoestával tal como foi definida em qualquer uma das Reivindicações 1, 13 a 33« 62â« - Processo para a produção de cerveja, caracterizado por a planta ser submetida a tratamento com uma (1,3-1,4)--(Sglucanase termoestável, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1, 13-33, durante a maceração, a uma temperatura de ó5*C ou superior e a um pH compreendido entre 4 e 5,5« 63â» - Processo de acordo com a Reivindicação 62, caracterizado por a temperatura ser de 70°C ou superior, 64ê« - Processo para a produção de rações para animais compreendendo P»—glucanos, caracterizado por as rações serem completadas com uma (1,3-1,4) -flglucanase termoestável, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-22, numa quantidade suficiente para se obter uma degradação significativa de β-glucanos no tracto gastrointestinal de um animal alimentado com a ração completada com a (1,3-1,4)-|5glucanase. òSâ» - Processo de acordo com -a - Reivindicação 64, caracterisado por as rações para animais serem peletiradas„ Lisboa, Í6 de Fevereiro de 199€t V