CN102782125B - 源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶蛋白质，上述蛋白质有一种活性，就是通过选择性地水解人参皂苷的特定位置结合化学键，将PPD类的皂苷转换成可被体内吸收的高活性物质。具体地，涉及构成上述蛋白质的氨基酸序列、编码上述蛋白质的核苷酸序列、包含上述核苷酸序列的重组载体、通过所述载体转化的转化体，涉及通过培养上述转化体来制备源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶的方法、利用上述蛋白质将PPD类的主要皂苷转换成小分子皂苷的方法、用于将PPD类皂苷转换成可溶性皂苷的包含上述蛋白质作为有效成分的组合物。

Description

源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶及其用途
技术领域
本发明涉及源自地杆菌属(Terrabacter sp.)的新型人参皂苷糖苷酶蛋白质，具体地，涉及构成上述蛋白质的氨基酸序列、编码上述蛋白质的核苷酸序列、包含上述核苷酸序列的重组载体、通过上述载体转化的转化体、通过培养上述转化体来制备地杆菌属人参皂苷糖苷酶的方法、利用上述蛋白质用于将PPD类的皂苷转换成体内可吸收状态的可溶性皂苷的组合物。
背景技术
皂苷是广泛存在于植物界的配糖体中不是糖的部分以多环式化合物构成的物质，包含人参或红参的主要生理活性成分的皂苷成分与其他植物中所发现的皂苷具有不同的化学结构，因此命名为人参皂苷，意为人参(Ginseng)的糖苷(Glycoside)。
这种人参皂苷根据糖苷配基(aglycone)的结构分为原人参二醇类人参皂苷(Protopanaxadiol-type ginsenoside)，原人参三醇类人参皂苷(Protopanaxatriol-type ginsenoside)及齐墩果酸类人参皂苷(Oleanolic acid-type ginsenoside)。这三组又根据化合物结构中环的C-3、C-6及C-20位置上由糖苷键(glycosicid bond)的结合而附着的糖部位(糖苷配基)(sugar moieties(aglycones))的位置及数量来分类，其中Rg1、Re、Rb1、Rc及Rb2是在所有皂苷中占90％以上的主要人参皂苷(major ginsenoside)(园林(Park)，2004)，据记载这些因分子过大，使得经口给药人体之后很难直接被吸收。这种主要人参皂苷为了在体内(in vivo)有效体现出生理活性而需要去糖基化(deglycosylated)转换过程(Tawab等人，2003；Akao等人，1998)。
另一方面，含Rg3、Rh2以及化合物K(compound K)等的小分子形态(minor form)人参皂苷优异的药理效果在近数十年间被公诸于世。随着这些研究结果的发表，具有更为优越的药理作用的人参皂苷F2、Rg3、Rh1、Rh2及化合物K(compound K，C-K)等小分子人参皂苷方面的研究越来越多，对提高这种小分子形态的特定人参皂苷含量的方法这一方面的需求也日益迫切。
据报道，其中原人参二醇类人参皂苷Rh1及Rh2在F9畸胎瘤细胞(F9 teratocarcinoma)培养试验中具有强有力的诱导肿瘤细胞再分化的作用(Lee等，Proc.6th，国际人参研讨会(Intl.Ginseng symp.)，127，1993)，另据报道，B16黑色素瘤细胞，MK-1(胃癌细胞)(Matsunaga等，化学(Chem)，药物公报(Pharm.Bull.)，38，3480，1990)及卵巢癌细胞(HRA)(Kikuchi等，英国抗癌药物(AnticancerDrugs.England.)，2，63，1991)等多种癌细胞中体现出强有力的增殖抑制活性。但Rh2等是存在于红参中的微量皂苷，上述优秀的药理活性尽管吸引了很多学者进行大批量生产方法方面的研究，却至今没能研究出有效的大批量生产方法。
关于人参皂苷F2，据报道F2具有抑制肿瘤细胞的增殖，倒转肿瘤细胞及细菌中所表现出来的多重耐药性等效果(韩国生物药学会刊28(1)，35，成宗焕等，1997)，当经口给药人参皂苷时，被普雷沃菌(Prevotellaris)等肠内细菌所代谢并吸收，它们的代谢产物F2发挥药效。但是如此有用的F2也仅仅微量存在于部分种类的人参当中，很难收集大量的试样，且代谢过程中与多种二次代谢产物同时产生，因此单独纯化高纯度的F2存在困难。
一直以来为了生产微量皂苷-小分子人参皂苷，提出了利用化学分解方法(De Mayo等，加拿大化学杂志(canad.J.Chem.)，43，2033，1965)，酶方法(Kitagawa等，四面体快报(Terahedron Letters)，30，2283，1974)，及利用配糖体合成的方法(第10-2005-0007250号)等，但是上述方法均因 1)制备工艺上要经过多个步骤，2)制备过程中目标成分有损失，3)使用了不宜食用的催化剂，4)低收率等缺点而在大量生产上仍存在限制。
特别是酶方法中可使用的酶的种类有人参皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)，α-L-吡喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinopyranosidase)，α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)，α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)等酶据报道对Rb1，Rb2，Rc及Re等主要人参皂苷具有生物转换功能。但这也存在无法大量生产及费用高等问题。
不仅如此，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、α-L-吡喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinopyranosidase)、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)、α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)也不是都具有将主要人参皂苷转换成小分子人参皂苷的活性。例如，本发明人已确认来源于氯酚节杆菌A6(Arthrobacter chlorophenolicusA6)的β-葡萄糖苷酶并没有人参皂苷的生物转换活性。还有，现有的已知酶，例如已知具有向Rb1的转换能力的酶-β-葡萄糖苷酶A据说可转换为Rb1，尽管具有人参皂苷的生物转换活性，其活性也是微不足道的。
另外，韩国专利申请第10-1999-0045180号提供了利用皂苷α-糖苷酶分解PPD类人参皂苷的皂苷糖基进而制备人参皂苷Rh2的方法。上述发明的皂苷α-糖苷酶将人参皂苷Rd转换成人参皂苷F2，将人参皂苷F2转换成人参皂苷Rh2。而且还能用人参皂苷Rb1与Rc制备Rh2。然而据实施例3所记载，上述皂苷α-糖苷酶是在含有麦麸和人参粉末的培养基上加入曲菌培养出来之后去除菌体生产出来的，因此存在收率低，作为大量生产方法没有效率，制备成本高，制备过程中损失掉目标成分等缺点。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明人为了开发易于大量获得人参等植物体内微量存在的小分子形态(minor form)人参皂苷的方法而做了大量的努力，从地杆菌属菌株中获得将主要形态的人参皂苷转换成小分子人参皂苷的人参皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)基因的同时，还确认了克隆上述基因表达的重组酶可以选择性水解主要人参皂苷的特定分子结合，将所述主要人参皂苷转换成生理活性及生物吸收率高的小分子人参皂苷，从而完成了本发明。
(二)技术方案
本发明的目的是提供源自地杆菌属(Terrabacter sp.)的新型人参皂苷糖苷酶(Ginsenoside glycosidase)蛋白质。
本发明的另一目的是提供编码上述蛋白质的核苷酸。
本发明的再一目的是提供包含上述核苷酸的重组载体。
本发明的再一目的是提供通过所述载体转化的转化体。
本发明的再一目的是提供源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶的制备方法，包括步骤：对通过载体转化的转化体进行培养，所述载体包含编码上述源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶基因；用所述培养出的转化体生产人参皂苷糖苷酶；以及回收上述生产出的人参皂苷糖苷酶。
本发明的另一目的是提供利用源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶将PPD类的皂苷转换成可溶性皂苷的方法。
本发明的再一目的是提供包含源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶蛋白质作为有效成分的用于将PPD类皂苷转换成易被体内吸收的可溶性皂苷的组合物。
(三)发明的效果
本发明的源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶显示出了其将人参皂苷转换成易被体内吸收状态的优异活性，虽然人参皂苷的药理效果已得到认证，但以往也只能从天然成分中微量生产因此其利用受限，而源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶能够大量生产制备小分子人参皂苷。
此外，对通过重组载体转化的转化体进行培养，所述重组载体包含编码上述人参皂苷糖苷酶的基因，从而能够进行大量生产，广泛应用于工业上。
附图的简单说明
图1示出了PPD类及PPT类人参皂苷的种类。
图2示出了关于Bgl-gyp17纯化的SDS-PAGE分析。
M，样本泳道(分子量标准)；泳道1，诱导前全部细胞；泳道2，诱导后全部细胞；泳道3，包函体；泳道4，可溶化的包涵体；泳道5，复性的包涵体；泳道6，根据镍离子组氨酸捕获柱(Nickel-chargedHis Trap column)纯化的蛋白质；泳道7，根据rTEV去除的六组氨酸标签。
图3示出了利用Bgl-gyp17，对主要类型人参皂苷Rb1、Rb2及Rc进行生物学转换的TLC分析结果。
图4示出了利用Bgl-gyp17，对主要类型人参皂苷Rb1、Rb2及Rc进行生物学转换时，生物学转换产物随时间变化的HPLC分析结果的照片。
图5示出了利用Bgl-gyp17的主要类型人参皂苷Rb1、Rb2及Rc的生物学转换路径。
图6示出了由大肠杆菌纯化的重组BGL-GYP17的稳定性及活性中pH(A)及温度(B)的影响。在下面pH2至10的缓冲液(50mM)范围内分析活性中pH的效果，使用pHPGlc2.0mM确认。
缓冲液：KCl-HCl(pH2)，甘氨酸-HCl(pH3)，乙酸钠(pH4及5)，磷酸钠(pH6及7)，Tris-HCl(pH8及9)及甘氨酸-氢氧化钠(pH10)。
在稳定性方面为了确认pH的影响，将50mM缓冲液中的酶溶液，于4℃下培养24小时，根据标准分析方法分析残基活性。活性的热依赖性利用4℃及90℃的温度范围在50mM磷酸钙缓冲液中分析。在不同温度下于50mM磷酸钙缓冲液内培养酶当量30分钟，完成了热稳定性分析。用冰块将试样冷却10分钟后，根据标准分析方法确认残存活性。
图7示出了基于种系进化学标准，分析Gsoil3082T菌株及相关的放线菌内细菌的16S rRNA序列。上述树是使用Kimura(1983)双参数距离矩阵(two-parameter distance matrix)与成对删除(pairwisedeletion)的同时，使用邻接法(neighbor-joiing method)(Saitou & Nei，1987)制备的。70％以上的自举(Bootstrap)值(以1000个复制品的百分比显示)是用不连续点(branch points)显示的。标尺(bar)表示每1000个核苷酸中10个核苷酸的取代。
图8显示：含bgl-gyp17的质粒载体。
具体实施方式
作为达到上述目的的一个方面，本发明提供源自地杆菌属(Terrabacter sp.)的人参皂苷糖苷酶(以下与“人参皂苷糖苷酶蛋白质”及“本发明的蛋白质”混用)蛋白质。
人参皂苷糖苷酶蛋白质被认为是分解葡萄糖苷的一种酶，如属于二糖类的一种的麦芽糖(maltose)、蔗糖(sucrose)及松二糖(turanose)等的。这种人参皂苷糖苷酶在不同的生物种内表现出多种多样的活性，其活性程度及功能每种酶都有所不同。优选地，本发明的人参皂苷糖苷酶是源自地杆菌属微生物的酶，可将主要形态的人参皂苷转换成小分子形态，这归功于上述酶所具有的可以选择性水解结合在人参皂苷第三位碳的葡萄糖(glucose)的能力。人参皂苷糖苷酶早已广为人知，但是关于由地杆菌属(Terrabacter sp.)微生物中分离出来的人参皂苷糖苷酶的具体活性及功能却尚无报道。特别是源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶可以将人参皂苷Rb1、Rb2及Rc转换成多种小分子形态的化合物这一事实是本发明首次提出的。更优选地，本发明中的人参皂苷糖苷酶可以从被推断为地杆菌属新种的Gsoil3082中分离出来，且上述菌株已保藏国际保藏机构韩国生命工学研究院生物资源中心(KCTC)，保藏号是KCTC19421T，其序列显示为SEQ ID NO：1。
本发明中用于鉴定新基因的微生物是地杆菌属微生物，本发明人最初分离出来的新种—地杆菌Gsiol3082菌株是在韩国抱川地区的人参种植地鉴定的。利用上述菌株完成了16S rRNA基因序列分析和根据表现型分析的种系进化分析(phylogenetic analysis)，结果证实了上述被鉴定的菌株是放线菌门(Actinobacteria Phylum)地杆菌属的新种，并证实上述菌株具有将Rb1转换成绞股蓝皂苷XVⅡ(gypenosideXVⅡ，gyp XVⅡ)的转换作用，进一步确认了其具有转换成绞股蓝皂苷LXXV(gypenoside LXXV，gyp LXXV)的能力。此外，其还具有将人参皂苷Rb2转换成化合物Y(compound Y)，将化合物O(compound O)转换成化合物Y，还证实了其具有将人参皂苷Rc转换成化合物Mc(compound Mc)，将化合物Mc1(compound Mc1)转换成化合物Mc的能力。本发明人为了鉴定具有上述活性的酶，利用fosmid文库试剂盒(fosmid library kit)研究上述新菌株，克隆了Bgl-gyp17。
本发明的蛋白质表示构成源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶的氨基酸序列(多肽序列)，优选地，上述地杆菌可以是本发明人公开的新种Gsoil3082。从上述菌株分离出来的人参皂苷糖苷酶氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列，优选地，不仅仅是上述序列，还包括与上述序列有70％以上同源性的氨基酸序列、优选地具有80％以上同源性、更优选地具有90％以上同源性、又更优选地具有95％以上的同源性、最优选地具有98％以上同源性的氨基酸序列且实质上具有人参皂苷糖苷酶活性的序列。如果具有这种同源性的序列实质上就是与人参皂苷糖苷酶具有相同或相应的生物学活性的氨基酸序列，部分具有缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列的蛋白质也包括在本发明的范围内是显而易见的。
本发明的另一方面，提供编码源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶的核苷酸。
本发明的核苷酸是编码源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶的核苷酸，优选地，上述地杆菌可以从本发明人所公开的新种Gsoil3082中分离出来。编码从上述菌株分离出来的人参皂苷糖苷酶的核苷酸序列是由序列号2所示的核苷酸序列，优选地，不仅仅是上述序列，还包括与上述序列有70％以上同源性的序列、优选地具有80％以上同源性、更优选地具有90％以上同源性、又更优选地具有95％以上的同源性、最优选地具有98％以上同源性的序列且实质上具有人参皂苷糖苷酶活性的序列。优选地，本发明的基因被发明人命名为bgl-gyp17，上述基因包含长度为1770bp的核苷酸，编码由589个氨基酸构成的多肽。
本发明中的术语“同源性”用于表示与野生型(wild type)蛋白质的氨基酸序列的相似程度，包括本发明的编码人参皂苷糖苷酶的序列及与上述序列有着百分比以上相同序列的序列。这种同源性的比较可用肉眼或用容易购买的比较程序来完成。市售的计算机程序能够以百分率(％)来计算出两个以上序列间的同源性，同源性(％)可以对相邻的序列计算。
本技术领域的技术人员很容易理解这种同等的蛋白质，其通过人工改变来维持设定水平以上的同源性的同时还保留本发明所期望的蛋白质活性。因此，本发明的人参皂苷糖苷酶包含野生型氨基酸序列变异体，所谓“变异体”是指对于天然氨基酸序列或核苷酸序列，通过一个或一个以上氨基酸残基或核苷酸序列缺失、插入、非保守性或保守性取代，或者它们的组合来获得具有不同序列的蛋白质或获得具有不同序列的核苷酸。
本发明的又一方面，提供包含编码源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶的核苷酸的重组载体。
本发明中术语“载体”是在适当的宿主细胞中能够表达目标蛋白质的表达载体，指包含必需调节要素的基因制备物，其可操作的连接使基因插入物表达。优选地，本发明可制备含编码人参皂苷糖苷酶的基因的重组载体，通过将上述重组载体转化(transformation)或转染(transfection)到宿主细胞来获得本发明的人参皂苷糖苷酶。本发明的优选实施例通过fosmid文库(fosmid library)筛选的同时鉴定能够编码人参皂苷糖苷酶的ORF，并将其插入到pHis-Parallell表达载体中制备重组载体(图8)。
并且，将用上述方法制备的重组载体转化到大肠杆菌之类的宿主细胞中，这样可以制备转化体，本发明的优选实施例中将上述重组载体转化到El.coliC41(DE3)细胞上，由此诱导人参皂苷糖苷酶的表达。
本发明中的重组载体可以通过将本发明的基因连接(插入)到适当的载体中获得。插入到本发明基因中的载体没有特别的限制，只要能在宿主体内被复制即可。例如，可使用质粒DNA，噬菌体DNA等。质粒DNA的具体示例包括pCDNA3.1+(表达载体(Invitrogen))等商业性质粒。本发明中所使用的载体的另一示例有大肠杆菌来源质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118及pUC119)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源质粒(pUB110及pTP5)及酵母来源质粒(YEp13、YEp24及YCp50)。噬菌体DNA的具体例子有噬菌体(Charon4A、Charon21A，EMBL3、EMBL4、gt10、gt11及ZAP)。另外，也可以使用逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)或牛痘病毒(vaccinia virus)等动物病毒，杆状病毒(baculovirus)等昆虫病毒。本发明的优选实施例是插入到pHis-Paralle11载体中制备重组载体。
并且作为本发明的载体，可使用连接基因表达活化蛋白质(例如B42等)的融合质粒(fusion plasmid，例如pJG4-5)，这种融合质粒中虽然有GST、GFP、His-tag、Myc-tag等，但本发明的融合质粒不会被限定在上述示例中。本发明的优选实施例中为了更容易地纯化及回收所表达的人参皂苷糖苷酶而使用了附加了6个组氨酸序列的六组氨酸标签(hexahistidine tag，6x his tag，His6tag)。
为了将本发明的基因插入载体中，可以使用将纯化的DNA用适当的限制酶切断并插入适当的载体DNA的限制位点或克隆位点的方法。本发明的基因必须可操作地连接在载体中。为此，本发明的载体除了包含启动子及本发明的基因外还可以包含增强子(enhancer)等顺式元件(cis element)，剪接信号(splicing signal)，聚A加尾信号(poly A addition signal)，选择标记(selection marker)，核糖体结合序列(ribosome binding sequence，SD sequence)等。选择标记的例子有氯霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)，新霉素抗性基因等，但根据上述示例而可操作连接的附加构成要素不受到限制。
本发明再一方面，提供通过包含编码人参皂苷糖苷酶的核苷酸的载体转化的转化体。
本发明中使用的术语“转化(transformation)”是指将DNA引入到宿主体内使DNA作为染色体的因子或通过染色体整合完成复制，通过将外界DNA引入到细胞内人为导致遗传性变化的现象。本发明可以使用任何转化方法，很容易根据业内通常用的方法来完成。通常用的转化方法有CaCl2沉淀法，通过CaCl2方法中使用叫做DMSO(dimethylsulfoxide，二甲亚砜)的还原物质来提高效率的哈纳汉(Hanahan)法，电穿孔法(electroporation)，磷酸钙沉淀法，原生质融合法，使用碳化硅纤维的搅拌法，农杆菌介导转化法，利用PEG的转化法，葡萄糖硫酸酯、脂质体及干燥/抑制介导转化法等。
本发明的用于转化包含编码人参皂苷糖苷酶基因载体的方法并不局限于上述例子，可以自由使用业内通常使用的转化或转染方法。
将目标基因—包含编码人参皂苷糖苷酶的基因引入到宿主体内即可获得本发明的转化体(transformant)。宿主，只要是能够表达本发明的基因，不受特别的限制。本发明中使用的宿主的特定例子有大肠杆菌(E.coli)等埃希氏菌(escherichia)细菌；枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等芽孢杆菌(bacillus)细菌；恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)等假单胞菌(pseudomonas)细菌；酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、栗酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)等酵母；动物细胞及昆虫细胞。本发明中使用的大肠杆菌菌株的具体例子有CL41(DE3)、JM109及HB101，枯草芽孢杆菌菌株的具体例子有WB700及LKS87，本发明的优选实施例中以大肠杆菌细胞CL41(DE3)作为宿主细胞制备了通过含人参皂苷糖苷酶的载体转化的转化体。
大肠杆菌等细菌作为宿主使用时，优选地，本发明的重组载体能在宿主体内进行自主复制，不仅如此，其由启动子、核糖体结合序列、本发明的基因及转录终止序列(transcription termination sequence)组成。本发明的启动子，只要使本发明的基因在大肠杆菌等宿主体内表达出来任何启动子都可以使用。例如可以使用trp启动子、lac启动子、PL启动子或PR启动子等大肠杆菌或噬菌体来源启动子，T7启动子等大肠杆菌感染噬菌体来源的启动子。也可以使用tac启动子等人工改变的启动子。
为了使本发明中所回收的目标蛋白质的纯化更为容易，质粒载体可根据需要进一步包括其它序列。上述可进一步包括的序列可以是用来纯化蛋白质的标签序列，例如，谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白质(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)及六组氨酸(hexahistidine；Quiagen，美国)等，最优选为六组氨酸(hexahistidine)，但纯化目标蛋白质所需的序列种类并不受上述示例的限制。本发明的优选实施例中为了容易纯化目标蛋白质，使用了六组氨酸标签。
并且，通过含有上述融合序列的载体表达出来的融合蛋白质的情况下，可用亲和性色谱法纯化。例如，谷胱甘肽-S-转移酶融合的情况下，可以利用此酶的底物谷胱甘肽，利用6x His的情况下，以Ni-NTA His-结合树脂柱(Novagen，美国)能够容易地回收所需的目标蛋白质。
本发明的另一方面，提供源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶的制备方法。优选地，所述制备方法包括下列三个步骤来完成的：(a)对通过载体转化的转化体进行培养，所述载体包含编码人参皂苷糖苷酶的核苷酸；(b)用上述培养出的转化体生产人参皂苷糖苷酶；(c)回收上述生产出的人参皂苷糖苷酶。
本发明的表达人参皂苷糖苷酶的方法如上所述，并可利用业内通常使用的方法来培养由上述方法转化的宿主细胞。例如，表达上述人参皂苷糖苷酶的转化体可以在多种多样的培养基内培养，可以实施分批补料(fed-batch)培养及连续培养等，但本发明的转化体的培养方法并不受上述示例的限制。并且，为了宿主细胞的生长，技术人员可根据已制备出的转化体的种类来选择培养基中所要包含的适宜的碳源并采用适当的培养条件，以调节培养时间与量。
选择合适的宿主细胞，并在培养基上培养，目标蛋白质被成功转化的转化体就会生产人参皂苷糖苷酶，并根据载体的构成及宿主细胞的特征分泌到宿主细胞的细胞质内、细胞周质间隙(periplasmic space)或细胞外。并且，目标蛋白质可表达为可溶性状态或不溶性状态，而本发明的实施例确认了被bgl-gyp17基因编码的蛋白质是以不溶性状态表达出来的。
在宿主细胞内或外表达的蛋白质可用通常方式纯化。纯化方法有如下几种：盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如，利用丙酮、乙醇等的蛋白质分段沉淀)、透析，凝胶过滤、离子交换、反相柱色谱法等色谱分析法及超滤等。可以单独或组合使用上述方法来纯化本发明中的蛋白质。
用上述方法分离的人参皂苷糖苷酶可在存在人参皂苷的体外(in-vitro)或体内(in-vivo)系统中生产易吸收的小分子形态人参皂苷。
本发明的又一方面，提供利用地杆菌属人参皂苷糖苷酶将PPD类的皂苷转换成体内易吸收状态的可溶性皂苷的方法以及提供包含源自地杆菌属的人参皂苷糖苷酶蛋白质作为有效成分的用于将PPD类的皂苷转换成易被体内吸收的可溶性皂苷的组合物。
用作本发明起始物质的PPD类的皂苷，可以用分离及纯化状态的皂苷，也可以用人参或红参粉末或提取物中所包含的皂苷。也就是说，可以将含有皂苷的人参或红参粉末或提取物作为起始物质来实施本发明的方法。本发明使用的人参种类很多，有高丽参(Panaxginseng)、西洋参(P.quinquefolius)、三七参(P.notoginseng)、竹节参(P.japonicus)、三叶草(P.trifolium)、珠子参(P.pseudoginseng)及越南参(P.vietnamensis)等，但并不局限于这几种。
如背景技术所述，皂苷根据糖苷配基(aglycone)的构造可分为原人参二醇类人参皂苷(Protopanaxadiol-type ginsenosides)、原人参三醇类人参皂苷(Protopanaxatriol-type ginsenosides)及齐墩果酸类人参皂苷(Oleanolic acid-type ginsenosides)三种类型，本发明中PPD类皂苷指的是原人参二醇类人参皂苷。利用本发明的源自地杆菌属人参皂苷糖苷酶的情况下，可转换成可溶性皂苷，本发明中使用的“可溶性皂苷”这一术语意味着按顺序水解人参皂苷中的第3位碳，将体内难以吸收的主要形态(major form)人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Rg1及Re)转换成相对易被体内吸收的小分子形态(minor form)人参皂苷(F2、Rg3及Rh1)、化合物O、化合物Y、化合物Mc1、化合物Mc、化合物K、绞股蓝皂苷XVⅡ或绞股蓝皂苷LXXV。
优选地，这种转换是通过生物转化(bioconversion)来实现的，通过连续或非连续地选择性水解人参皂苷的第3位碳来完成这一过程。本发明的蛋白质可将业内所熟知的所有PPD类的人参皂苷转换成易吸收的小分子形态(minor form)，优选地本发明中蛋白质完成生物转化的例子包括将人参皂苷Rb1转换成绞股蓝皂苷XVⅡ，将绞股蓝皂苷XVⅡ转换成绞股蓝皂苷LXXV，将人参皂苷Rb2转换成化合物Y(compound Y)，将化合物O(compound O)转换成化合物Y(compound Y)，将人参皂苷Rc转换成化合物Mc(compound Mc)，以及将化合物Mc1(compound Mc1)转换成化合物Mc(compound Mc)等方法。进一步地，这种生物转化的起始物质为人参皂苷Rd、F2的情况下，可转换成化合物K，起始物质为人参皂苷Rg3的情况下，可转换成PPD，人参皂苷Rh2的情况下，可转换成PPD。
更详细说明，将含有本发明的蛋白质的组合物加入到人参皂苷Rb1的情况下，生产出绞股蓝皂苷LXXV，确认了其中间产物是绞股蓝皂苷XVⅡ。并且，将人参皂苷Rd作为起始物质来处理本发明的蛋白质的情况下，生产出化合物K，确认了其中间产物为F2。并且，将Rg3作为起始物质来处理本发明的蛋白质的情况下，在生产出PPD的同时，确认了其中间产物为人参皂苷Rh2。起始物质为Rb2的情况下，通过本发明的蛋白质的处理，确认了通过化合物O(Notoginsenoside L)生产出化合物Y(Notoginsenoside)，起始物质是人参皂苷Rc时，确认了通过化合物Mc1(Notoginsenoside L)生产出化合物Mc(Notoginsenoside)。这些过程都可以通过本发明的蛋白质水解人参皂苷关联化合物的第3位碳来完成，通过上述水解产生的生成物(人参皂苷衍生物)比反应物质易于被体内吸收。
这种生物转化最终可依赖反应物质或酶的浓度来调整最终生成物的量。优选地，酶的浓度为0.01mg/ml的情况下，大部分Rb1转换成gyp XVⅡ，而酶的浓度为0.1mg/ml的情况下，可将反应进行至LXXV。
下面通过实施例更详细地说明本发明。但这些实施例只是为了举例说明本发明，本发明的范围并不受这些实施例的限制。
实施例1.新菌株Gsoil3082的分类学特性分析
在R2A中培养30℃ Gsoil3082。将细胞培养3天后用Nikon light显微镜观察细胞的形态，并完成了如伯杰氏系统细菌学手册(Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology)上所记载的革兰氏染色法(gramstain)、厌氧培养(anaerobic grouth)及酶活性(catalase activity)等常规的生理学或生物化学特性分析。利用API 20NE、API ID32 GN及API ZYM试验试剂盒(bioMerieux)分析了碳能源的使用及酶活性。在不同的温度条件(4、15、20、25、30、37、42及45℃)及多种pH值(pH 4.5-10.0的范围内pH各变化0.5)下培养菌株，之后每5天为单位进行测定。
30℃下测定营养琼脂(nutrient agar)及TSA(trypticase soy agar，胰酶大豆琼脂)中的生长。利用蒙特罗-巴里恩托斯(Montero-Barrientos)等方法完成了化学分类分析(Chemotaxonomicanalysis)。
为了确认其它细菌与Gsoil3082菌株的系统发生学连贯性而分析了16S rRNA基因的比率，上述分析是利用27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)(SEQ ID NO：3)及1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)(SEQ ID NO：4)通用引物(universal primers)通过PCR扩增来完成的，并用Solgent测序(大田，韩国)。使用SeqMan软件(DNASTAR)收集16S rRNA基因全序列，在NCBI数据库完成比对(登录号：EU332827)。从基因库获得分类学上有关联的16S rRNA基因序列。利用Kimura双参数(two-parameter)模型，以系统学树判断遵循基因序列的菌株的系统学位置。通过使用具有1000复制为基础的引导程序值的MEGA3程序，使用邻接(neighbor-joining)方法构筑系统学树。使用光敏生物(photobiotin)标记DNA探测器及微量稀释孔(micro-dilution well)，以Ezaki等的方法测定荧光光度(fluorometrically)，完成DNA-DNA混合。在各试样中去掉最高值及最低值，利用剩余值计算同源性。
Gsoil3082特性
通过4次筛选，从抱川人参种植地鉴定了能够将主要人参皂苷转换成小分子人参皂苷的20个新的细菌菌株(Rhodanobacter ref.60)。将所鉴定的上述菌株之一命名为Gsoil3082，并最早确认了本菌株能将人参皂苷Rb1水解成gyp XVⅡ及gyp LXXV。通过HPLC及NMR分析研究人参皂苷Rb1的生物转化路径的结果表明，Gsoil3082菌株通过连续水解人参皂苷Rb1的C-3位置末端葡萄糖及内部葡萄糖，能够将人参皂苷Rb1转换成gyp XVⅡ及gyp LXXV。并且，为了查明Gsoil3082菌株的分类学位置，通过多相方法(polyphasic approach)分析了其特性，完成了人参皂苷糖苷酶的基因克隆。
鉴定的菌株显示出革兰氏阳性(gram-positive)、好氧性(aerobic)、非运动性(non-motile)、非孢子形成(non-spore-forming)及短杆状(short-rod-shaped)。基于16S RNA的系统学分析确认它属于放线菌门(phylum)的地杆菌属，表现出与肿大地杆菌DSM20308T(T.tumescens DSM20308T)(98.4同源性)最高的同源性，其次表现出与土壤地杆菌PPLBT(T.terrae PPLBT)(98.2)及埃罗类托姆地杆菌5516J-36T(T.aerolatum 5516J-36T)(98.0)的较高同源性(参照图8)。基因组DNA的G+C量为68.2mol％。化学分类数据(chemotaxonomicdata)[人甲基萘醌(major menaquinone)-MK-8(H4)，主要极性脂质(main polar lipids)(磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、双磷脂酰甘油(diphosphatidylglycerol)与磷脂酰肌醇(phophatidylinositol))与主要脂肪酸-异-C15:0(major fatty acid-iso-C15:0)，反异--C15:0(anteiso-C15:0)与异-C16:0(iso-C16:0)]是证明Gsoil3082属于地杆菌属的有力证据(表1)。但根据DNA-DNA混合分析结果，鉴于Gsoil3082T及肿大地杆菌DSM20308T、土壤地杆菌PPLBT及埃罗类托姆地杆菌5516J-36T菌株之间混合值分别为43、34及31，Gsoil3082就应该分类为新种(Wayne等人，1987)。
而且通过生理学及生物化学试验确认了它与其它地杆菌属菌株存在形态学差异(表2)。因此，最早被本发明人鉴定的地杆菌属Gsoil3082以新种菌株保藏为生物资源中心(KCTC)的KCTC19421T，并命名为人参皂苷突变地杆菌(Terrabacter ginsenosidimutans sp.)。
表1
Gsoil3082T菌株及其它相关菌株的脂肪酸轮廓
菌株：1，人参皂苷突变地杆菌Gsoil 3082T；2，肿大地杆菌DSM 20308T；3，火山石地杆菌LR-26T(T.lapilli LR-26T)；4，土壤地杆菌PPLBT；5，埃罗类托姆地杆菌5516J-36T。
第3柱的数据来自Lee等人(2008)，第2、4和5柱的数据来自Weon等人(2008)。脂肪酸量少于总量的1.0％的没有显示。
总特性2包括异-C15:1和/或C13:03-OH的任意组合。
总特性3包括异-C15:02OH和/或C16:0ω7c的任意组合。
表2
Gsoil3082T菌株及其它相关菌株的生物化学特性
菌株：1，人参皂苷突变地杆菌Gsoil 3082T(Terrabacterginsenosidimutans Gsoil3082T)；2，肿大地杆菌DSM 20308T；3，火山石地杆菌LR-26T；4，土壤地杆菌PPLBT；5，埃罗类托姆地杆菌5516J-36T。
在第2-4柱的数据来自Lee等人(2008)，在第5柱的数据来自Weon等人(2008)。
+，阳性；-，阴性；W，弱反应；V，在研究中可变；ND，没有可用数据
代谢物的结构鉴定
获得代谢物(1)，其是白色粉末状，用HR-ESIMS测定时从m/z947.5581获得分子离子峰值[M+H]+，分子式相当于C48H83O18(分子量947.5579)。如表3所示，代谢物(1)的1H和13C NMR光谱值与现有文献中发表的Gyp XVⅡ最为接近。HMBC光谱(异核远程相关光谱，Heteronuclear multiple bond correlations spectrum)中在δH5.14(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″)观测到的甲基质子信号(methyl protonsignal)和C-20(δC 83.9)碳信号(carbon signal)及在δH 4.95(1H，d，J＝7.2Hz，H-1′)观测到的甲基质子信号与C-3(δC 89.3)碳信号表现出相关性(crrrelation)，使一个葡萄糖残基可同时分配(assign)到C-20及C-3。剩余的葡萄糖在HMBC光谱值上δH 5.11(1H，d，J＝7.2Hz，H-1″′)的甲基质子信号与C-6″(δC 70.7)碳信号表现出相关性(crrrelation)，从而可知固定在C-6″。于是代谢物(1)被确认为Gyp XVⅡ。
代谢物(2)是在用HR-ESIMS测定时从m/z 785.5089获得分子离子峰值[M+H]+，分子式相当于C42H73O13(分子量785.5051)。如表3，虽然代谢物(2)的1H与13C NMR光谱值和代谢物(1)相似，但缺少相当于一个葡萄糖的质子和碳信号。还有，1H与13C NMR光谱上只有两个异头质子信号(anomeric proton signal)在δH 5.09(1H，d，J＝7.8Hz，H-1″)及5.06(1H，d，J＝7.6Hz，H-1′)中观测到，它们各与C-1″(δC 98.3)及C-1′(δC 105.5)表现出相关性(correlation)，这暗示着代谢物(2)中有两个葡萄糖。13C NMR光谱上观测到的代谢物(2)中C-3(δC 78.5)的化学位移(chemical shift)较代谢物(1)(δC 89.3)更为鲜明，这意味着代谢物(2)的C-3上有一个自由羟基(free hydroxyl group)。从而代谢物(2)被确认为Gyp LXXV。
表3
人参皂苷Rb1代谢物1和2的1H-和13C-NMR数据
实施例2.fosmid文库筛选及测序
按照制备公司的方法完成了CopyControl Fosmid文库产物试剂盒(CopyControl Fosmid Library Production kit)(Epicentre，美国)。将地杆菌属Gsoil3082的基因组DNA(genomic DNA)任意切断成约40Kb的片段。最初根据脉冲电场凝胶电泳(Pulse Field GelElectrophoresis)少量电泳(running)，测定切断的DNA大小，为了将DNA制备成平末端(blunt end)及5′-磷酸化末端(5′-phosphorylated end)进行了末端修复(end-repair)。通过LMP(lowmelting point)琼脂糖凝胶电泳挑选40Kb以上的末端修复的DNA大小。由LMP(low melting point)琼脂糖凝胶来纯化平末端DNA并连接(ligation)到pCC1FOS载体内。用MaxPlax lambda包装提取物试剂盒(MaxPlax lambda packaging extract kit)(Epicentre，美国)完成了体外(in vitro)包装。最后在含10mM MgSO4的LB肉汤(broth)中O.D值为600时将生成物转化到已培养的大肠杆菌(E.coli)EPI300-T1R内，直至成为0.6。在37℃环境下使其吸收20分钟受感染的细菌，并涂抹在含12.5ug/ml氯霉素(chloramphenical)及27ulX-gal(5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-β-D-葡萄糖苷(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside))的LB盘上，在37℃下培养。培养16-20小时后，将呈蓝色的克隆(用于生产推定人参皂苷糖苷酶的克隆)挑选出来，在相同的LB盘上再一次确认其活性。确认之后在含有12.5ug/ml氯霉素的0.2ml的LB肉汤中在37℃下培养上述克隆体24小时。为了分析人参皂苷-水解能，利用了TLC分析。
从细胞培养中鉴定能将人参皂苷Rb1转换成gyp XVⅡ的被推断为pbg1-gin18fosmid克隆体的Fosmid DNA，根据制备公司的方法利用FosmidMAX DNA纯化试剂盒(Epicentre)进行纯化。对纯化的fosmid DNA进行全序列(full sequencing)分析。转座子(transposon)反应的插入是根据制备公司的方案使用HyperMu KAN-1＞InsertionKit(Epicentre，美国)完成的。向两个方向使用MUKAN-1 FP-1[5′-CTGGTCCACCTACAACAAAGG-3′](SEQ ID NO：5)及RP-1[5′-AGAGATTTTGAGACAGGATCCG-3′](SEQ ID NO：6)这两个引物，对选择性插入的克隆进行测序，从而获得完整的序列，上述试剂盒内包含被插入的HyperMu转座子的末端同源性区域。将ABIPRISMTM BigdyeTM循环测序预反应试剂盒作为模板完成了DNA测序反应。用ABI3730XL毛细管DNA测序仪(ABI3730XL capillary DNASequencer)收集数据并分析。
实施例3.重组BGL-GYP17的分子克隆、表达及纯化
(3-1)重组BGL-GYP17的分子克隆和表达
使用遗传密码1(genetic code1)以美国国立生物技术信息的ORFFINDER(National Center for Biotechnology Information′s ORFFINDER)分析了pbg1-gin18的组装DNA(assembled DNA)序列。对预期的ORF使用BLASTP找出推断为人参皂苷糖苷酶的ORF，使用下一个寡核苷酸引物，利用PCR扩增pbg1-gin18 DNA模具。
正向引物：
5′-CG GAA TTC ATG GAT CCC TAC GAG GAC CCC-3′(SEQID NO：7)
逆向引物：
5′-CCC AAGC TT ACC CCG GGA CGA CGA GGC3′(SEQ IDNO：8)
(上述引物序列中的下划线部分分别表示EcoRI及HindⅢ的限制酶切断位点)
将上述增幅的片段按顺序克隆到pHis-Paralle1表达载体(引入EcoRI及HindⅢ限制位点来使用)以及含重组TEV蛋白酶(rTEV)的六组氨酸(hexahistidine)融合蛋白质表达载体中。然后将重组pHis-Parallel1引入到E.coli C41(DE3)细胞中。
(3-2)bgl-gyp17的克隆及表达结果
重组人参皂苷糖苷酶表现出将人参皂苷Rb1转换成gyp XVⅡ的能力，因此本发明人将上述ORF设计成bgl-gyp17。bgl-gyp17的推断氨基酸序列拥有589个残基，显示出分子量68kDa。
(3-3)重组BGL-GYP17的纯化
在37℃下将含过表达质粒的E.coli C41(DE3)于LB-氨苄青霉素培养基中培养至O.D值由600nm变成0.6为止，并用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)处理12小时，从而诱导蛋白质的表达。在4℃下用5,000xg离心分离20分钟获得细菌细胞。对由50mM磷酸钠(sodium phosphate)，5mM EDTA及1％Triton X-100(pH7.0)(悬浊液)组成的溶液细胞颗粒进行再悬浊并进行超声处理(ultrasonification)。重组人参皂苷糖苷酶表达为不溶性状态的包涵体(inclusion body)，因此对经过超声处理的溶解物进行颗粒化(4℃，30分钟，20,000xg)，用无Triton X-100的悬浊液进行两次洗涤。在室温下用含有50mM磷酸钠，5mM EDTA及8M尿素(urea)(pH8.0)的溶液搅拌包涵体溶解过夜。离心分离(20,000xg，30分钟，4℃)后，用40倍体积(volumes)的含有50mM磷酸钠、5％甘油、0.05％聚乙二醇及0.5mM氯化钠(sodium chloride)的复性缓冲液(refolding buffer)稀释已被溶解的蛋白质，然后在4℃下复性24小时。在50mM磷酸钠中使复性的重组人参皂苷糖苷酶与1mg/mlRb1溶液发生反应，并完成了TLC分析。结果，人参皂苷糖苷酶将人参皂苷Rb1转换成gyp XVⅡ，上述人参皂苷糖苷酶编码基因设计成bgl-gyp17。因此，将复性的重组bgl-gyp17加载到镍离子组氨酸捕获(Nickel-charged HisTrap)柱(组氨酸捕获(HisTrap)HP，5ml床体积，凝胶健康(Gel health))中，在4℃下用缓冲液A(50mM磷酸钠，pH7.0)调节预平衡(pre-equilibrated)。用缓冲液A洗涤树脂(resin)，将结合蛋白质用含200mM咪唑(imidazole)的缓冲液A溶出。用组氨酸捕获(His Trap)柱通过rTEV处理使六组氨酸(His6)标签从该蛋白分离，在含30ml DEAE-纤维素DE-52(Whatman)的柱中用50mM磷酸钠、pH7.0及300Mm NaCl完成了进一步纯化。纯化后，蛋白质在其N-末端中包含了7-残基克隆人工制品(artifact)(GAMDPEF)。蛋白质的同源性是通过10％SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色(Coomassie Blue staining)测定的。将纯化的蛋白质以10mg/ml的浓度使用Amicon Ultra-15过滤器(Millipore，美国)在pH7.0下用50mM磷酸钠透析，使用前一直保存在-80℃环境中。
使用在50mM磷酸钠和pH7.0下纯化的六组氨酸-标签蛋白质完成了酶的分析及动力学分析。在琼脂糖(Sepharose)6 10/300 GL(GE医疗(GE Healthcare))柱中完成了凝胶-过滤分析(Gel-filtrationanalysis)。使用Bio-Rad过滤标准(Bio-Rad filtration standards)(目录号.151-1901(catalog no.151-1901))进行测定(表4)。
表4
BGL-gyp17的酶纯化方案
(3-4)重组BGL-GYP17的纯化结果
重组BGL-GYP17由包涵体恢复了9.3％，从而纯化了2.81-倍(表4)。在琼脂糖(Sepharose)6 10/300 GL(GE 医疗(Healthcare))柱上用凝胶-过滤测定的天然人参皂苷糖苷酶的分子量是56,000，根据SDS-PAGE分析的是64,000(图2)。这种结果表明人参皂苷糖苷酶是单体蛋白质。
实施例4.酶特性分析
在含2.0mM pNPGlc(对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)；Sigma)的pH7.0的磷酸钠缓冲液50mM中对90μl进行了特异活性测定，反应开始前在37℃下与10μl稀释纯化酶进行20分钟反应来进行培养。Na2CO31M中用0.1ml处理5分钟结束反应，405nm下即刻测定了对硝基酚(p-nitrophenol)的释放。一个活性单位(one unit of activity)定义为每分钟释放1μmol对硝基酚的酶量。特异活性用每毫克蛋白(milligram)单位表达。用Bio-Rad蛋白质分析染色试剂协议测定蛋白质浓度。所有分析至少进行了三次以上。
在下列缓冲液(50mM)内进行分析，用2.0mM pNPGlc测定pH对活性的效果。
pH2至10的范围：KCl-HCl(pH2)、甘氨酸-HCl(pH3)、醋酸钠(pH4及5)、磷酸钠(pH6及7)，Tris-HCl(pH8及9)及甘氨酸-氢氧化钠(pH10)
4℃下在上述各缓冲液中对酶进行培养24小时，然后在50mM钾(potassium)缓冲液内用pHPGlc分析测定了pH稳定性。用上述方法测定活性。
从最佳pH中获得的活性概率显示结果。
用pNPGlc 2.0mM在最佳pH，4℃及90℃温度范围下，在50mM磷酸钾缓冲液中对温度依赖性活性分析5分钟。在不同温度下，对在磷酸钾缓冲液50mM中的酶当量进行30分钟培养，从而完成了温度稳定性分析。用冰块对试样进行10分钟冷却之后确认了根据pNPGlc分析测定的残存活性。
也测定了几种金属及化学制剂的效果。室温下于HgCl2、MnCl2、CaCl2、CoCl2、MgCl2、EDTA、NaCl、KCl、CuCl2、SDS、ZnSO4、DTT及巯基乙醇1及10mM(最终浓度)中将人参皂苷糖苷酶培养30分钟，将pNPGlc作为底物测定活性，在化合物缺少的情况下获得的活性用百分比表示。
以每分钟邻硝基酚(o-nitrophenol)或对硝基酚(p-nitrophenol)的释放定义的1活性单位，使用显色ONP(chromogenic ONP)及PNP(对硝基苯基(p-nitrophenyl))底物2.0mM在37℃下5分钟后分析底物偏好度(substrate preference)。分析的底物(Sigma)有：
PNP-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-β-D-glucopyranoside)、
PNP-β-D-吡喃半乳糖苷(PNP-β-D-galactopyranoside)、
PNP-β-D-吡喃岩藻糖苷(PNP-β-D-fucopyranoside)、
PNP-β-D-氨基葡糖苷(PNP-β-D-glucosaminide)、
PNP-β-L-吡喃阿拉伯糖苷(PNP-β-L-arabinopyranoside)、
PNP-β-D-吡喃甘露糖苷(PNP-β-D-mannopyranoside)、
PNP-β-D-吡喃木糖苷(PNP-β-D-xylopyranoside)、
PNP-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-α-D-glucopyranoside)、
PNP-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(arabinofuranoside)
PNP-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(arabinopyranoside)、
PNP-α-D-吡喃鼠李糖苷(PNP-α-D-rhamnopyranoside)、
PNP-α-D-吡喃甘露糖苷(PNP-α-D-mannopyranoside)、及
PNP-α-D-吡喃木糖苷(PNP-α-D-xylopyranoside)、及
邻硝基酚[ONP]-β-D-吡喃葡萄糖苷(o-nitrophenol[ONP]-β-D-glucopyranoside)、ONP-β-D-吡喃半乳糖苷(ONP-β-D-galactopyranoside)、
ONP-β-D-吡喃岩藻糖苷(ONP-β-D-fucopyranoside)及
ONP-β-D-吡喃半乳糖苷(ONP-β-D-galactopyranoside)。
使用0.1mM至0.6mM浓度的pNPGlc，以新纯化的酶完成了动力学分析。以405nm的吸光度在37℃下观察20分钟，其结果数据是通过Cleland报道的酶动力学程序(Enzyme Kinetics Program)确认Km及Vmax来显示的。
结果，Bgl-gyp17是在磷酸钠缓冲液45℃，pH7.0时显示出最高的活性。酶是在37℃以下温度中趋于稳定，在45℃环境下培养30分钟后约有32％丧失了其活性(图6)。
Bgl-gyp17活性对多种化合物的效果的测定结果如表5。几乎所有金属离子及螯合物制剂对酶活性几乎无影响，但Hg2+离子强烈地抑制活性，SDS在10mM以上浓度中显示出抑制效果。为了调查Bgl-gyp17的底物的特异性，在含有pH7.0，2.0mMβα及β型p-NP(对硝基苯基(p-nitrophenyl))及ONP(邻硝基苯基(O-nitrophenyl))-糖苷酶的50mM磷酸钠缓冲液中37℃下进行培养。结果(表6)，人参皂苷糖苷酶对PNP-β-D-葡萄糖苷显示出了最大活性，其仅次于对ONP-β-D-葡萄糖苷的活性，除pNP-或ONP-β-D-吡喃岩藻糖苷之外对大部分pNP-或ONP-β-D-葡萄糖苷都显示不出活性。对pNPGlc被人参皂苷糖苷酶水解的Km及Vmax是使用Cleland报道的酶动力学程序(Enzyme Kinetic program)0-2mM底物确认的，根据上述程序测定的值对各个pNPGlc为4.24mM及0.10mmol*Min-1*mg的蛋白质-1(mmol*Min-1*mg of protein-1)。
表5
金属离子及化学制剂对纯化的重组BGL-GYP17活性的效果
表6
  底物   相对活性
  pNP-α-D-吡喃葡萄糖苷   1.12±0.214
  pNP-α-D-吡喃甘露糖苷   0
  pNP-α-D-吡喃木糖苷   0
  pNP-α-L-呋喃阿拉伯糖苷   0
  pNP-α-L-吡喃阿拉伯糖苷   0
  pNP-α-L-吡喃鼠李糖苷   0
  pNP-β-D-吡喃岩藻糖苷   6.98±0.063
  pNP-β-D-吡喃半乳糖苷   0
  pNP-β-D-吡喃葡萄糖苷   89.52±4.430
  pNP-β-D-氨基葡糖苷   0
  pNP-β-D-吡喃甘露糖苷   0
  pNP-β-D-吡喃木糖苷   0
  pNP-β-L-吡喃阿拉伯糖苷   0
  oNP-α-D-吡喃半乳糖糖苷   0
  oNP-β-D-吡喃岩藻糖苷   15.88±0544
  oNP-β-D-吡喃半乳糖糖苷   2.33±0.081
  oNP-β-D-吡喃葡萄糖苷   100.00±3.542
对ONPGlu的活性作为100％，而相应的比活度44.3U/mg。
实施例5.人参皂苷的酶性水解活性分析
为了分析重组酶对PPD类人参皂苷C-3及C-20位置上所附着的葡萄糖水解的特异性及选择性，将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd及Rg3作为底物使用。在37℃下培养含有酶0.2U及50mM磷酸钠缓冲液0.1％(w/v)(pH7.0)底物的各个反应混合物。以适当的间隔收集试样，添加相同体积的丁醇饱和水溶液来终止反应。干燥并蒸发正丁醇的流分，将残余物溶解在CH3OH中，进行TLC HPLC或NMR分析。
转换步骤依赖于反应溶液的浓度。酶的浓度低于0.01mg/ml时，人参皂苷Rb1 1mg/ml完全被水解，主要生成物为gyp XVII。人参皂苷Rb1在0.1mg/ml情况下，gyp XVⅡ可按顺序转换成gyp LXXV。这种酶浓度可直接将40mM可溶性包涵体稀释到pH7.5，50mM磷酸缓冲液中去，通过复性步骤完成。
人参皂苷Rd的情况下，通过切断Rd中C-3位置的末端葡萄糖，从而转换为F2，之后，F2切断其C-3位置的内部葡萄糖，从而进一步转换成C-K(化合物K(compound K))。
将人参皂苷Rg3作为底物使用的情况下，酶通过水解Rg3中C-3位置的末端葡萄糖来形成人参皂苷Rh2，进而通过切断Rh2内部的葡萄糖转换成PPD。
此外，本发明的酶会按顺序切断C-3位置的末端葡萄糖及内部葡萄糖，将Rb2及Rc通过C-O(化合物O(compound O))及C-Mc1(化合物Mc1(compound Mc1))转换成C-Y(化合物Y(compound Y))及C-Mc(化合物Mc(compound Mc))。
结果，重组Bgl-gyp17选择性水解附着在末端及内部的PPD类人参皂苷的C-3位置，从而将人参皂苷Rb1及gyp XVII转换成gypLXXV；将Rd及F2转换成C-K；将Rg3及Rh2转换成PPD；将Rb2及C-O转换成C-Y；将Rc及C-Mcl转换成C-Mc。
<附表1-(9)>
韩国生命工学研究院生物资源中心(KCTC)生物资源中心(BRC)
韩国生物技术研究机构(KIRIBB)
韩国大田市儒城区科学路111 305-806
电话：042-860-4629，传真：042-860-4625
大田广域市儒城区科学路111韩国生命工学研究院生物资源中心
                                                              
微生物保藏证明书
保藏日期：2009年09月15日
微生物已成功保藏于KCTC，保藏微生物可根据KCTC的规定分让给以研究及商业性为目的的国内外研究人员。
接近菌株不会受限，可分让并提供给所有申请者。
人参皂苷突变地杆菌Gsoil3082T/KCTC19421T
博士  李贞淑
细菌微生物管理人(Curator for Bacteria)
KCTC(韩国生命工学研究院生物资源中心(Korean Collection for Type Cultures))
生物资源中心(BRC)
生命工学研究院(KRIBB)
韩国305-806，大田市儒城区科学路111

Claims (11)

1.人参皂苷糖苷酶(Ginsenoside glycosidase)蛋白质，所述蛋白质由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列表示。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质对PPD(protopanaxadiol)类皂苷中第3位碳位置具有选择性水解作用。
3.编码权利要求1所述蛋白质的核酸。
4.如权利要求3所述的核酸，所述核酸由SEQ ID NO:2所示的序列表示。
5.包含权利要求3核酸的重组载体。
6.由权利要求5所述的载体转化的转化体。
7.如权利要求6所述的转化体，所述转化体是大肠杆菌(E.coli)。
8.制备权利要求1所述的人参皂苷糖苷酶的方法，包括如下步骤：
(a)培养权利要求7所述的转化体；
(b)用所述培养的转化体生产人参皂苷糖苷酶；
(c)回收所述生产出的人参皂苷糖苷酶。
9.利用权利要求1所述的蛋白质将PPD类的皂苷转化成可溶性皂苷的方法，所述可溶性皂苷的转化选自下组中的一种以上：
将人参皂苷Rb1转化成绞股蓝皂苷XVⅡ、将绞股蓝皂苷XVⅡ转化成绞股蓝皂苷LXXV、将人参皂苷Rb2转化成化合物Y、将化合物O转化成化合物Y、将人参皂苷Rc转化成化合物Mc、将化合物Mc1转化成化合物Mc，绞股蓝皂苷XVⅡ、绞股蓝皂苷LXXV、化合物O、化合物Y、化合物Mc和化合物Mc1的化学式如图5所示。
10.利用权利要求1的蛋白质将PPD类的皂苷转化成可溶性皂苷的方法，所述可溶性皂苷的转化选自下组中的一种以上：
人参皂苷Rd转化成化合物K、人参皂苷F2转化成化合物K、人参皂苷Rg3转化成人参皂苷Rh2，化合物K的化学式如图5所示。
11.用于将PPD类皂苷转化成可溶性皂苷的包含权利要求1的蛋白质作为有效成分的组合物，所述可溶性皂苷的转化选自下组中的一种以上：
将人参皂苷Rb1转换成绞股蓝皂苷XVⅡ、将绞股蓝皂苷XVⅡ转换成绞股蓝皂苷LXXV、将人参皂苷Rb2转换成化合物Y、将化合物O转换成化合物Y、将人参皂苷Rc转换成化合物Mc、将化合物Mc1转换成化合物Mc，人参皂苷Rd转换成化合物K、人参皂苷F2转换成化合物K、人参皂苷Rg3转换成人参皂苷Rh2，绞股蓝皂苷XVⅡ、绞股蓝皂苷LXXV、化合物O、化合物Y、化合物Mc、化合物Mc1和化合物K的化学式如图5所示。
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