CN102762738B - 源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途 - Google Patents

源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102762738B
CN102762738B CN201080046283.3A CN201080046283A CN102762738B CN 102762738 B CN102762738 B CN 102762738B CN 201080046283 A CN201080046283 A CN 201080046283A CN 102762738 B CN102762738 B CN 102762738B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ginsenoside
protein
nucleic acid
saponin
present
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080046283.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102762738A (zh
Inventor
安东善
金成健
李成宅
林完泽
崔昌浩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB filed Critical Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Publication of CN102762738A publication Critical patent/CN102762738A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102762738B publication Critical patent/CN102762738B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01071—Glucan endo-1,2-beta-glucosidase (3.2.1.71)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01075—Glucan endo-1,6-beta-glucosidase (3.2.1.75)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01088—Beta-L-arabinosidase (3.2.1.88)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种源自Rhodanobacter ginsenosidimutans (Rhodanobacter ginsenosidimutans)KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)蛋白质及其用途，该蛋白质对人参皂苷的特定位置结合键进行选择性水解而具有将PPD类皂苷转化为去糖基化(deglycosylation)的体内可吸收的高活性物质的活性。更具体地涉及一种构成蛋白质的氨基酸序列、编码所述蛋白质的核酸序列、包含所述核酸序列的重组载体、用所述载体转化的转化子、培养所述转化子来制备源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的方法、利用所述蛋白质将PPD(protopanaxadiol)类主皂苷转化成体内可吸收的稀有皂苷形态的方法、以及用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收形态的皂苷的转化用组合物，所述蛋白质作为有效成分包含在所述PPD类皂苷。

Description

源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途
技术领域
本发明涉及一种源自Rhodanobacter ginsenosidimutans(Rhodanobacter ginsenosidimutans)KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶(Ginsenoside Glycosidase)蛋白质及其用途，更具体地涉及一种构成蛋白质的氨基酸序列、编码所述蛋白质的核酸序列、包含所述核酸序列的重组载体、用所述载体转化的转化子、培养所述转化子来制备源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的方法、利用所述蛋白质将PPD(原人参二醇(protopanaxadiol))类主皂苷转化成体内可吸收的稀有皂苷形态的方法、以及用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收形态的皂苷的转化用组合物，所述蛋白质作为有效成分包含在所述PPD类皂苷。
背景技术
皂苷是植物界广泛存在的配糖体中非糖部分以多环化合物构成的物质，人参或红参中作为主要生理活性成分包含的皂苷成分-三萜皂苷(triterpene saponin)的化学结构与其它植物中发现的皂苷不同，因此为了区分这样的人参皂苷和其它植物界皂苷，表示人参配糖体(Ginseng Glycoside)的含义，将其称为人参皂苷(Ginsenoside)。
根据糖苷配基(aglycone)的结构，人参皂苷可分为原人参二醇类人参皂苷(Protopanaxadiol-type ginsenosides)、原人参三醇类人参皂苷(Protopanaxatriol-type ginsenosides)以及齐墩果酸类人参皂苷(Oleanolic acid-type ginsenosides)三种类型。这样的三组再根据化合物结构中环的C-3、C-6以及C-20位置由糖苷键(glycosicid bond)结合的糖部位(糖苷配基)(sugar moieties(aglycones))的位置及数量被分类。齐墩果酸类人参皂苷的基本骨架是5环，这里只有人参皂苷Ro且其糖苷配基是齐墩果酸(oleanolic acid)。目前，已分离了40余种以上的人参皂苷，而其大部分是原人参二醇类人参皂苷。原人参二醇类人参皂苷包含Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、绞股蓝皂苷XVII、化合物O、化合物Mc1、F2、化合物Y、化合物Mc、Rg3、Rh2以及C-K。
并且，占人参皂苷的90％以上的是人参主皂苷，但其因尺寸大而在体内的吸收率很低。因此，为了加强人参皂苷的药效，需要将人参主皂苷转化成相对更好吸收且药效更优异的稀有人参皂苷的过程。即，为了在体内(in vivo)有效地显示生理活性，人参主皂苷需要去糖基化(deglycosylation)的转化过程(Tawab等人，2003；Akao等人，1998)。人参主皂苷包含Rg1、Re、Rb1、Rc以及Rb2等，稀有人参皂苷包含F2、Rg3、Rh1、Rh2以及化合物K、C-K、Mc、Mc1(化合物K，C-K，Mc，Mc1)等。
稀有人参皂苷中，Mc1是主要在红参中微量存在的人参皂苷，其在摄取具有镇痛作用、皮质脂酮分泌促进作用、肾小球肥大抑制作用、肝细胞的脂质过氧化抑制作用、骨髓细胞、DNA、RNA、蛋白质以及脂质合成促进作用等功能的二醇类人参皂苷Rc时，作为体内代谢物生成化合物Mc1。由于化合物Mc1的量非常少，因此不能进行多方面的药理活性研究。
并且，稀有人参皂苷F2被认为是具有抑制肿瘤细胞的增殖、逆转肿瘤细胞或细菌中显示的多重耐药性的效果等的成分(韩国生药学杂志28(1)，35，成钟焕等人，1997年)。人参皂苷F2在人参自身中的含量极少。并且，向体内给药皂苷时，最终会生成化合物K，而人参皂苷F2是生成化合物K之前的中间化合物。因此，获得大量人参皂苷F2被认为是非常难的技术。
另一方面，现有技术中已知的人参皂苷F2的制备方法有将皂苷用作为酶的柚苷酶水解来制备或对鼠进行经口给药后在大肠中分离作为分解产物生成的人参皂苷F2的方法。但是，这些方法的收率极低，而且由于产生多种二次代谢产物，难以以高纯度纯化人参皂苷F2(Koizumi等，化学与药学公报30(7)：2393，1982年；Karikura等，化学与药学公报)。尽管对生成大量人参皂苷F2的方法进行了很多研究，但是现在还没有确立有效的大量生产方法。
并且，人参皂苷F2被认为具有抑制肿瘤细胞的增殖、逆转肿瘤细胞以及细菌中显示的多重耐药性的效果(韩国生药学杂志28(1)，35，成钟焕等人，1997年)，并且经口给药人参皂苷时，被口普雷沃菌(Prevotellaris)等肠内细菌代谢并被吸收，它们的代谢产物F2显示药效。但是，这样有用的F2同样仅仅微量存在于部分人参种类，难以收获大量的试料，在代谢过程中与多种2次代谢产物一起生成，因此在仅将F2以高纯度纯化方面存在困难。
用于生产作为微量人参皂苷的稀有人参皂苷的方法公开有化学分解方法(De Mayo等，加拿大化学杂志，43，2033，1965)、酶方法(Kitagawa等，四面体快报，30，2283，1974)以及利用了配糖体合成的方法(第10-2005-0007250号)等，但是上述方法由于1)在制备工艺上需要经过多个步骤，或2)在制备过程中目标成分消失，3)使用不宜食用的催化剂，或4)显示低收率，因此在大量生产上仍然有局限性。
尤其在酶方法中可使用的酶的种类有β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、α-L-吡喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinopyranosidase)、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)以及α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)，对利用这样的酶的人参主皂苷的生物转化(biotransformation)进行了很多研究。但是，这些作为大量生产方法同样不够有效，并且具有产生很多费用的问题。
不仅如此，即使属于β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、α-L-吡喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinopyranosidase)、α-L-呋喃阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase)以及α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)，也不是都具有将人参主皂苷转化成稀有人参皂苷的活性。例如，本发明人确认过被认为是源自Arthrobacter chlorophenolicus A6的β-葡萄糖苷酶没有人参皂苷的生物转化活性。并且，现有技术中已知的酶，例如已知具有向Rb1的转化能力的酶-β-葡萄糖苷酶A，即使具有人参皂苷的生物转化活性，其活性也微乎其微。
并且，第10-1999-0045180号韩国专利申请公开了一种用皂苷α-葡萄糖苷酶分解PPD类人参皂苷的皂苷糖基来制备人参皂苷Rh2的方法。所述发明的皂苷α-葡萄糖苷酶将人参皂苷Rd转化成人参皂苷F2，并且将人参皂苷F2转化成人参皂苷Rh2。并且，可以从人参皂苷Rb1和Rc制备Rh2。但是，根据实施例3的记载，所述皂苷α-葡萄糖苷酶需要在包含有麦麸和人参粉末的培养基里放入曲菌进行培养，去除菌体来进行生产。因此，具有因显示出低收率而作为大量生产方法不够有效，制备成本高，在制备过程中目标成分消失的缺点。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明人为了开发出将人参等植物体中微量存在的稀有形态(minor form)的人参皂苷容易地、高收率地大量收获的方法而潜心研究的结果，从Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T菌株收获了具有从主要形态的人参皂苷到稀有人参皂苷的生物转化活性的人参皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)基因。本发明人发现将该基因进行克隆而表达的重组酶选择性地水解主皂苷的特定分子键，使其生物转化成生理活性和生物吸收率高的稀有人参皂苷，从而完成了本发明。
(二)技术方案
本发明的目的在于提供一种源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶(ginsenosideglycosidase)蛋白质。
本发明的另一个目的在于提供一种编码所述蛋白质的核酸。
本发明的又一个目的在于提供一种包含所述核酸的重组载体。
本发明的又一个目的在于提供一种用所述载体转化的转化子。
本发明的又一个目的在于提供一种制备源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的方法，包括：培养用载体转化的转化子的步骤，所述载体包含编码所述源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的核酸；用所述培养的转化子生产人参皂苷糖苷酶的步骤；以及回收所述生产的人参皂苷糖苷酶的步骤。
本发明的又一个目的在于提供一种利用源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶来将PPD类的皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的方法。
本发明的再一个目的在于提供一种用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的转化用组合物，所述PPD类皂苷包含所述蛋白质作为有效成分。
(三)有益效果
本发明的源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶显示出将皂苷转化成体内容易吸收形态的优异活性，并且能够大量生产及制造稀有人参皂苷，所述稀有人参皂苷的药理效果得到了认证但因其从自然只能微量生产而在利用上受限。并且，通过培养转化子可大量生产，产业上可多种应用，所述转化子用包含编码所述人参皂苷糖苷酶的核酸的重组载体来转化。
附图说明
图1示出了PPD(protopanaxadiol)类人参皂苷的种类。
图2示出了PPT(protopanaxatriol)类人参皂苷的种类。
图3示出了用于bgl3054纯化的SDS-PAGE分析结果。
(M，分子量标记；泳道1，诱导前全部细胞；泳道2，表达诱导后无细胞提取液；泳道3，细胞破碎后沉淀物；泳道4，由Nickel-charged His捕获柱纯化的蛋白质；泳道5，DEAE阴离子交换柱后被纯化的蛋白质；泳道6，DEAE阴离子交换柱后被纯化的蛋白质；泳道7，用rTEV去掉了His6标签的蛋白质)
图4是显示bgl3054蛋白质的生物转化活性的TLC照片。
图5是显示bgl3054蛋白质的生物转化反应路径的示意图。
图6是显示纯化自E.coil的Bgl3054随pH变化的稳定性及活性的图表。
图7是显示纯化自E.coil的Bgl3054随温度变化的稳定性及活性的图表。
图8是显示根据本发明的Bgl3054蛋白质的Km和Vmax的双倒数图(double reciprocal graph)。
图9图示了包含Bgl 3054的质粒载体。
图10示出了利用Bgl 3054的Rb1→Rd→F2随时间变化的生物转化进程的HPLC分析结果。
图11示出了利用Bgl 3054的Rb2→Rd→F2随时间变化的生物转化进程的HPLC分析结果。
图12示出了利用Bgl 3054的Rb1→Mc1随时间变化的生物转化进程的HPLC分析结果。
具体实施方式
作为实现上述目的的一个方面，本发明提供一种源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶(ginsenoside glycosidase)(以下，与“本发明的蛋白质”或“人参皂苷糖苷酶”混用)蛋白质。
在本发明中，术语“人参皂苷糖苷酶”或“人参皂苷糖苷酶蛋白质”是将二糖类以上的链式多糖类的糖苷分子键水解的酶-糖苷酶的一种，只要具有人参皂苷的转化活性，则对其种类没有特别限制，并且各个酶的活性程度及功能存在差异。
本发明的蛋白质是源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的酶，具有能够将PPD类的皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的转化活性。更优选地，本发明的蛋白质具有能够将PPD类皂苷的第20位或第3位碳上结合的糖基选择性地水解的能力。
所述糖基优选的是吡喃葡萄糖糖苷(glucosylpyranoside)或吡喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)，但并不限于此。
用于鉴定本发明的新核酸的微生物是Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T微生物，本发明人在位于韩国抱川地区的人参田里分离了KCTC22231T菌株。
本发明的蛋白质具有构成源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的氨基酸序列(多肽序列)，所述氨基酸序列优选的是序列号2所示的序列，不仅仅是所述序列，与所述序列具有70％以上同源性的氨基酸序列、优选的是80％以上的同源性、更优选的是90％以上的同源性、较更优选的是95％以上的同源性、最优选的是98％以上的同源性的氨基酸序列，包含实质上具有人参皂苷糖苷酶的活性的蛋白质。并且，作为具有这样的同源性的序列只要是实质上与人参皂苷糖苷酶相同或具有相应的生物学活性的氨基酸序列，具有部分序列缺失、变形、取代或增加的氨基酸序列的蛋白质变异体也属于本发明的范围内是显而易见的。
另一方面，本发明提供一种编码源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的核酸。
本发明的核酸是编码源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的核酸，编码从所述菌株分离的人参皂苷糖苷酶的核酸优选的是序列号1所示的核酸，不仅仅是所述序列，与所述序列具有70％以上同源性的序列、优选的是80％以上的同源性、更优选的是90％以上的同源性、较更优选的是95％以上的同源性、最优选的是98％以上的同源性的序列，包含实质上核酸编码的蛋白质具有人参皂苷糖苷酶的活性的核酸。
根据本发明的一实施例，本发明的核酸被本发明人命名为bgl3054(以下，与“BGL3054”混用)，所述核酸包含1302bp长度的核酸，编码由433个氨基酸构成的多肽。
本发明的术语“同源性”用于表示与野生型(wild type)蛋白质的氨基酸序列或编码所述野生型蛋白质的碱基序列的相似程度，包含与本发明的氨基酸序列或碱基序列具有如上所述的百分数以上的相同序列的序列。这样的同源性比较可通过肉眼或容易购买的比较程序来进行。市售的计算机程序可以将两个以上序列间的同源性以百分数(％)计算，同源性(％)可相对于相邻的序列进行。
本领域的技术人员容易理解，通过这样的人为改变维持一定水平以上的同源性的同时，保有本发明的目标蛋白质活性的等同的蛋白质。因此，本发明的蛋白质包含野生型氨基酸序列变异体及碱基序列变异体，“变异体”是指对于天然氨基酸序列或碱基序列，一个或更多个氨基酸残基或碱基序列由于缺失、插入、非保守性或保守性取代或其组合而具有不同的序列的蛋白质或具有不同序列的核酸。
再一方面，本发明提供一种包含编码源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的核酸的重组载体。
本发明中，“载体”是指作为能够在适当的宿主细胞中表达目标蛋白质的表达载体，包含可操作地连接的必要调节要素以表达核酸插入物的核酸构建体。本发明能够制备包含编码人参皂苷糖苷酶的核酸的重组载体，通过所述制备的重组载体转化(transformation)或转染(transfection)宿主细胞，能够收获本发明的蛋白质。在本发明的具体实施例中，通过fosmid文库(fosmid library)进行筛选，同时鉴定能够编码人参皂苷糖苷酶的ORF并将其插入至pHis-Parallell表达载体，从而制备了重组载体pHisBGL3054(图9)。
本发明的重组载体可通过将本发明的核酸连接(插入)在适当的载体而获得。将插入本发明的核酸的载体只要其在宿主内能够被复制就没有特别的限制。例如，可使用质粒DNA、噬菌体DNA等。质粒DNA的具体例子包含pCDNA3.1+(Invitrogen)等商业质粒。本发明中使用的质粒的另一例子有源自大肠杆菌质粒(pYG601BR322、pBR325、pUC118以及pUC119)、源自枯草杆菌(Bacillus subtilis)质粒(pUB110和pTP5)以及源自酵母菌质粒(YEp13、YEp24以及YCp50)。噬菌体DNA的具体例子有λ-噬菌体(Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11以及λZAP)。并且，还可以使用逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)或牛痘病毒(vaccinia virus)等动物病毒，以及杆状病毒(baculovirus)等昆虫病毒。本发明的具体实施例中，插入pHis-Parallell载体而制备了重组载体pHisBGL3054。
而且，作为本发明的载体可使用连接有核酸表达活性化蛋白质(例如，B42等)的融合质粒(fusion plasmid，例如，pJG4-5)，而这样的融合质粒可适用GST、GFP、His-tag以及Myc-tag等，但是本发明的融合质粒不限于上述例子。为了易于纯化及回收在本发明的具体实施例中表达的人参皂苷糖苷酶，使用了增加了6个组氨酸序列的六组氨酸标签(hexahistidine tag，6x his tag，His6tag)。
为了将本发明的核酸插入载体，可使用将纯化的DNA用适当的限制酶切断并插入适当的载体DNA的限制位点或克隆位点的方法。根据本发明的具体实施例，Bgl 3054基因插入在用箭头表示的以BamHI和HindIII切断的位点之间。
本发明的核酸需要可操作地连接在载体上。本发明的载体除了启动子和本发明的核酸之外，还可以包含增强子(enhancer)等顺式元件(cis element)、剪接信号(splicing signal)、多聚A加尾信号(polyA addition signal)、选择标记(selection marker)、核糖体结合序列(ribosome binding sequence，SD sequence)等。作为选择标记的例子，可使用氯霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)、新霉素抗性基因等，但是可操作地连接的增加构成要素不限于上述例子。
又一方面，本发明提供一种用包含编码人参皂苷糖苷酶的核酸的载体转化的转化子。
本发明中使用的术语“转化(transformation)”是指将DNA引入宿主，DNA作为染色体因子或通过染色体整合可进行复制，将外部DNA引入细胞内而人为引起遗传变化的现象。
本发明的转化法可使用任意的转化法，可根据本领域的通常的办法容易地进行。一般，转化方法有：CaCl2沉淀法、CaCl2方法中使用称为DMSO(dimethyl sulfoxide)的还原物质来提高效率的Hanahan方法、电穿孔法(electroporation)、磷酸钙沉淀法、原生质体融合法、利用了碳化硅纤维的搅拌法、农杆菌介导转化法、利用PEG的转化法、葡萄糖硫酸酯、脂质体以及干燥/抑制介导的转化法等。
用于转化包含编码本发明的人参皂苷糖苷酶的核酸的载体的方法不局限于上述例子，可没有限制地使用本领域中通常使用的转化或转染方法。
可通过将包含编码目标核酸-人参皂苷糖苷酶的核酸的重组载体引入宿主，获得本发明的转化子(transformant)。
宿主只要使本发明的核酸表达就没有特别的限制。本发明中可使用的宿主的特定例子有：大肠杆菌(E.coli)等埃希氏菌(Escherichia)属细菌；枯草杆菌(Bacillus subtilis)等杆菌(Bacillus)属细菌；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等假单胞菌(Pseudomonas)属细菌；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等酵母；以及动物细胞和昆虫细胞。
可用于本发明的大肠杆菌菌株的具体例子有：CL41(DE3)、BL21和HB101，枯草杆菌菌株的具体例子有WB700和LKS87，在本发明的具体实施例中将大肠杆菌细胞CL41(DE3)作为宿主细胞制备了被转化成包含人参皂苷糖苷酶的载体的转化子。
在将大肠杆菌等细菌作为宿主使用时，本发明的重组载体可在宿主内进行自主复制，由启动子、核糖体结合序列、本发明的核酸以及转录终止序列(transcription termination sequence)构成。
本发明的启动子，只要使本发明的核酸在大肠杆菌等宿主中表达，则任何启动子都可以使用。例如，可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子或PR启动子等大肠杆菌或源自噬菌体启动子、以及T7启动子等大肠杆菌感染源自噬菌体启动子。并且，还可以使用tac启动子等人工变形的启动子。
为了使本发明中回收的目标蛋白质的纯化容易，质粒载体可根据需要还包含其它序列，上述可追加包含的序列可以是蛋白质纯化用标签序列，例如，谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白质(NEB，美国)、FLAG(IBI，美国)和六组氨酸(hexahistidine；Quiagen，美国)等，但是目标蛋白质的纯化所需的序列种类不限于上述例子。在本发明的具体实施例中，使用六组氨酸标签来使纯化容易。
并且，在通过包含所述融合序列的载体表达的融合蛋白质的情况下，可通过亲和色谱法纯化。例如，在谷胱甘肽S-转移酶被融合的情况下，可利用作为该酶的底物的谷胱甘肽；在利用六组氨酸的情况下，可利用Ni-NTA His-结合树脂柱(Novagen，美国)容易地回收期望的目标蛋白质。
另一方面，本发明提供一种制备源自Rhodanobacterginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的方法。优选地，所述制备方法可包含以下步骤而进行：(a)培养用载体转化的转化子的步骤，所述载体包含编码人参皂苷糖苷酶的核酸；(b)从所述培养的转化子生产人参皂苷糖苷酶的步骤；以及(c)回收所述生产的人参皂苷糖苷酶的步骤。
本发明的表达人参皂苷糖苷酶的方法如上所述，由上述方法转化的宿主细胞可用本领域中通常使用的方法来培养。例如，表达所述人参皂苷糖苷酶的转化子可在多种培养基里培养，可进行补料分批(fed-batch)培养和连续培养等，但是本发明的转化子的培养方法不限于上述例子。并且，为了宿主细胞的生长而可被包含在培养基中的碳源，可根据被制备的转化子的种类由本领域技术人员适当地选择，并且可采用适当的培养条件，以调节培养时机和量。
选择适当的宿主细胞并提供培养基条件时，目标蛋白质被成功转化的转化子，将生产人参皂苷糖苷酶。根据载体的结构和宿主的特征被生产的人参皂苷糖苷酶可在宿主细胞的细胞质内、壁膜间隙(periplasmic space)分泌或向细胞外分泌。并且，目标蛋白质可以以可溶性形态或不溶性形态表达。
在宿主细胞内或外表达的蛋白质可用通常的方式纯化。纯化方法的例子有：盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如，使用丙酮或乙醇等的蛋白质分段沉淀等)、透析、凝胶过滤、离子交换、反相柱色谱分析法等色谱分析法、以及超滤等方法，可单独或组合适用所述方法来纯化本发明的蛋白质。
利用由上述方法分离的人参皂苷糖苷酶，可生成在人参皂苷存在的体外(in-vitro)或体内(in vivo)系统中容易吸收的皂苷。
再一方面，提供一种利用源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人参皂苷糖苷酶来将PPD类的皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的方法。
本发明中用作起始原料的PPD类皂苷，可利用分离及纯化形态的皂苷，或可利用包含于人参或红参粉末或提取物的皂苷。即，本发明的方法可通过将包含皂苷的人参或红参粉末或提取物用作直接起始原料来实施。本发明中利用的人参可使用公知的多种人参，包含：高丽参(Panax ginseng)、西洋参(P.quiquefolius)、三七参(P.notoginseng)、竹节参(P.japonicus)、三叶参(P.trifolium)、珠子参(P.pseudoginseng)和越南参(P.vietnamesis)，但并不限于此。
如背景技术中所涉及的，根据糖苷配基(aglycone)的结构，人参皂苷可分为原人参二醇类人参皂苷(Protopanaxadiol-typeginsenosides)、原人参三醇类人参皂苷(Protopanaxatriol-typeginsenosides)以及齐墩果酸类人参皂苷(Oleanolic acid-typeginsenosides)三种类型，本发明的PPD类皂苷是指原人参二醇类人参皂苷。
在利用本发明的源自Rhodanobacter ginsenosidimutansKCTC22231T的人参皂苷糖苷酶的情况下，可将其转化成体内容易吸收的形态的皂苷，而这意味着由于可对特定位置的糖苷键进行选择性的水解，可依次对结合在PPD类皂苷的第20位或第3位碳上的糖基进行水解，从而可将体内吸收困难的主要形态(major form)的PPD类皂苷(例如，人参皂苷Rb1、Rb2和Rc)转化成相对体内容易吸收的稀有形态(minor form)的皂苷(例如，人参皂苷F2和Mc1)。
优选地，这样的转化通过生物转化(bioconversion)来实现，通过连续或非连续地对结合在PPD类皂苷的第20位或第3位碳的糖基进行选择性水解来实现。
所述糖基优选的是吡喃葡萄糖糖苷(glucosylpyranoside)或吡喃阿拉伯糖苷(arabionopyranoside)，但并不限于此。
本发明的蛋白质可将本领域已知的所有PPD类皂苷转化成容易吸收的稀有形态(minor form)皂苷，优选地，通过本发明的蛋白质的生物转化的例子包含将人参皂苷Rb1转化成Rd或将转化的Rd转化成F2、将人参皂苷Rb2转化成Rd、将转化的Rd转化成F2、将人参皂苷Rc转化成化合物Mc1的全部方法。
更具体地，本发明的具体实施例中，在将包含本发明的蛋白质的组合物添加到人参皂苷Rb1及Rb2时，依次生产了Rd和F2。并且，在将人参皂苷Rc作为起始原料处理本发明的蛋白质时，发现生产了化合物Mc1。这些都可以通过本发明的蛋白质对结合在PPD类皂苷的第20个或第3个碳的糖基进行水解来进行，通过如上所述的水解而生成的生成物质(人参皂苷衍生物)，与反应物质相比，体内容易吸收。
本发明的蛋白质是用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的酶，只要能够维持活性和稳定性可在各种温度和pH条件下使用，并且可以一起使用选自以下组的一种以上金属和化学制剂，该组由ZnCl2、MnCl2、CaCl2、CoCl2、MgCl2、EDTA、NaCl、KCl、CuCl2、SDS、DTT和巯基乙醇组成，但并不限于此。
根据本发明的具体实施例，经分析本发明的酶特性，在37℃下酶的稳定性卓越，在40℃～55℃下酶的活性高，在pH5.5～7.5下酶的稳定性及活性卓越(图6及图7)。
又一方面，本发明提供一种用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的转化用组合物，所述PPD类皂苷包含源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶作为有效成分。
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是，这些实施例仅用于例示性地实施本发明，本发明的范围不限于这些实施例。
发明的实施方式
实施例1.Fosmid文库筛选及全碱基序列分析
根据制造公司的方法，使用了CopyControl Fosmid LibraryProduction Kit(Epicentre，U.S.A)。以约40Kb断片任意切断Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的基因组DNA(genomic DNA)。通过脉冲场凝胶电泳(Pulse Field GelElectrophoresis)使少量电泳，从而测定切断的DNA尺寸，并且对DNA进行了末端修复(end-repair)，以制备平末端(blunt end)和5′-磷酸化末端(5′-phosphorylated end)。通过LMP(low melting point)琼脂糖凝胶电泳筛选了40Kb以上的末端修复的DNA。从LMP琼脂糖凝胶纯化了平末端DNA并使其连接(ligation)在pCC1FOS载体内。用MaxPlax lambda packaging extract kit(Epicentre，U.S.A.)进行了体外(in vitro)封装。最后，将生成物转化在大肠杆菌(E.coli)EPI300-T1R内，所述大肠杆菌(E.coli)被培养在包含10mM MgSO4的LB液体培养基(broth)中，直至600nm时O.D值为0.6。在37℃下吸收被感染的细菌20分钟，涂抹在包含12.5μg/ml氯霉素(chloramphenical)和27μ-X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)的LB板上，在37℃下进行培养。培养16-20小时后，筛选呈蓝色的克隆(人参皂苷糖苷酶推定克隆)，在同一板上再一次确认了活性。确认后，将推定的克隆在包含12.5μg/ml氯霉素的0.2ml LB培养基中，在37℃下培养了24小时。
为了分析人参皂苷的水解能力，利用了TLC分析。从细胞培养中鉴定了将人参皂苷Rb1转化成Rd的、推定为pbgl3054-p1Fosmid克隆的Fosmid DNA，根据制造公司的方法利用FosmidMAX DNA纯化试剂盒(Epicentre，美国)进行了纯化。对纯化的Fosmid DNA进行了全序列(full sequencing)分析。用HyperMuTM<KAN-1>InsertionKit(Epicentre，美国)根据制造公司的方案进行了转座子(transposon)的插入。在两侧方向使用MUKAN-1FP-1[5′-CTGGTCCACCTACAACAAAGG-3′(序列号3)]和MUKAN-1RP-1[5′-AGAGATTTTGAGACAGGATCCG-3′(序列号4)]两个引物对选择性插入克隆进行序列扩增来获得全序列，而其包含被插入上述试剂盒内的HyperMu转座子的末端同源性区域。作为模板使用ABIPRISMTM、BigdyeTM、循环测序预反应试剂盒(Cycle Sequencing ReadyReaction Kit)(Applied Biosystems，福斯特市，加拿大)来进行DNA碱基序列测定反应。用ABI 3730XL caillary DNA测序仪(AppliedBiosystems，福斯特市，加拿大)收集数据并进行分析。
实施例2.bgl3054的分子克隆、表达和纯化
(2-1)bgl3054的分子克隆和表达
使用遗传密码1(genetic code1)对pbgl3054-p1组装DNA(assembled DNA)序列用Vector NTI v10.0(Invitrogen公司)进行了分析。找出人参皂苷糖苷酶的ORF，然后使用寡核苷酸引物对模板pbgl3054-p1DNA通过PCR进行了扩增。
正方向引物：
5′-CGG ATC CAA TGG GCC TGG GAC GCC GGC GT-3′(序列号5)
逆方向引物：
5′-CGG AAG CTT TCA GGC GGG CTG CGG TGC-3′(序列号6)
将所述扩增断片依次克隆在包含pHis-Parallel表达载体(引入EcoRI和HindIII限制位点来使用)和重组TEV蛋白酶(rTEV)的His6(hexahistidine)融合蛋白质表达载体pHis-Parallel 1上。之后，将重组载体pHisBGL3054引入到E.coli C41(DE3)细胞。
(2-2)bgl3054的克隆和表达结果
人参皂苷糖苷酶显示出了将人参皂苷Rb1转化成Rd的能力，因此本发明人用bgl3054设计了所述ORF。bgl3054的推定氨基酸序列具有433个残基，显示了49kDa的分子量。
(2-3)bgl3054的纯化
将含有过表达质粒的E.coli C41(DE3)在37℃下，在LB氨苄青霉素培养基中进行培养，直到O.D值在600nm下为0.6，用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)处理12小时来诱导了蛋白质表达。在4℃下以5,000xg离心分离20分钟收获了细菌细胞。在50mM磷酸钠(sodium phosphate)、5mM EDTA以及1％Triton X-100(pH7.0)(悬浮溶液)构成的溶液中对细胞颗粒进行了再悬浮，并进行了超声处理(ultrasonification)。人参皂苷糖苷酶不形成不溶物而全部被水化，在50mM磷酸钠中，使人参皂苷糖苷酶与1mg/ml的Rb1溶液进行反应，进行了TLC分析。
结果，人参皂苷糖苷酶Bgl3054使人参皂苷Rb1经Rd转化成F2。所述人参皂苷糖苷酶Bgl3054编码核酸是由bgl3054设计的。因此，将bgl3054加载在Nickel-charged His Trap柱(His Trap HP，5ml床体积，Gel health)上，在4℃下用缓冲液A(50mM磷酸钠，pH7.0)进行了预平衡(pre-equilibrated)。用缓冲液A清洗了树脂(resin)，将结合的蛋白质用包含200mM咪唑(imidazole)的缓冲液A溶出。根据HisTrap柱培养rTEV，将His6-标签从蛋白质分离，并且在包含30ml DEAE纤维素DE-52(Whatman)的柱上，以50mM磷酸钠、pH7.0以及300mM NaCl进行了另外的纯化。通过10％的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(Coomassie Blue staining)测定了蛋白质的同源性。纯化的蛋白质以10mg/ml浓度、使用Amicon Ultra-15过滤器(Millipore，美国)、在pH7.0下、用50mM磷酸钠进行了透析，在-80℃下储藏直至使用。
使用50mM磷酸钠以及在pH7.0下纯化的带上His6-标签的蛋白质来进行了酶的分析和动力学分析。在Sepharose 610/300GL(GEHealthcare)柱上进行了凝胶-过滤分析(Gel-filtration analysis)。使用伯乐过滤标准(目录第151-1901)(Bio-Rad filtration standard(catalogno.151-1901))进行了测定。将得到的酶纯化图表显示在表1中。
表1
β-葡糖苷酶的一个单位(U)被定义为对硝基酚1μM/min释放的酶量(aone unit(U)of beta-glucosidase was defined as the amount ofenzyme liberating 1μM/min of p-nitrophenyl)。
(2-4)bgl3054的纯化结果
在Superose 610/300GL(GE Healthcare)上作为凝胶结果测定的天然人参皂苷糖苷酶的分子量是49kDa，根据SDS-PAGE的分析是50kDa。这样的结果表明人参皂苷糖苷酶是单体蛋白质(图3)。
实施例3.酶特性分析
对包含2.0mM pNPGlc(对硝基酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)的pH7.0、50mM磷酸钠缓冲液90μl进行了特异活性的测定，反应开始前使其与10μl稀释纯化酶在37℃下反应20分钟而进行了培养。用0.1ml的1M Na2CO3处理5分钟并结束反应，在405nm下立即测定了对硝基酚(p-nitrophenol)的浓度。将一个活力单位(one unit of activity)定义为每分钟释放1μmol对硝基苯酚的量。特异活性以单位/蛋白质毫克(milligram)表示。使用Bio-Rad蛋白质分析染色试剂测定了蛋白质浓度。所有分析至少进行三次以上。
(3-1)根据pH变化的效果测定
测定了pH对酶活性的影响效果。
底物使用了2.0mM pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)，使用以下的缓冲液(50mM)调节了pH。
pH2～10的范围：KCl-HCl(pH2)、甘氨酸-HCl(pH3)、醋酸钠(pH4和5)、磷酸钠(pH6和7)、三羟甲基氨基甲烷-HCl(pH8和9)和甘氨酸-氢氧化钠(pH10)。
并且，测定了pH对酶稳定性的效果。在4℃下，在上述涉及的各个缓冲液中培养酶24小时后，在50mM钾(potassium)缓冲液中分析pHPGlc，从而测定了根据pH变动的酶稳定性。根据标准分析方法分析残留物活性并作为以最佳pH下收获的活性几率将结果显示在图6。
参考图6，bgl3054在pH5.5～7.5下的酶的稳定性和活性卓越，在pH7.0下显示出最高的活性(图6)。
(3-2)根据温度变化的效果测定
测定了温度对酶活性的影响效果。将温度调节到4～90℃，使用2.0mM pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)，在最佳pH下在50mM磷酸钙缓冲液中分析温度依赖性活性5分钟。
并且，在相同的温度范围内，在50mM的磷酸钾缓冲液内培养酶当量30分钟，从而进行了温度稳定性分析。用冰冷却样品10分钟后，通过根据标准分析方法确认测定的残余活性来进行，将结果显示在图7中。
其结果，Bgl3054的活性在40～55℃显示出最高值，而热稳定性实验结果在37℃以下温度显示为稳定的，但是在45℃下经过30分钟后丧失了大约50％的活性。其结果，Bgl3054的活性在40～55℃显示出最高值，而热稳定性在37℃以下温度稳定，特别在45℃下几乎一半的稳定性丧失(图7)。
(3-3)根据金属和化学制剂变化的效果测定
将人参皂苷糖苷酶在室温下、在1mM和10mM(最终浓度)的ZnCl2、MnCl2、CaCl2、CoCl2、MgCl2、EDTA、NaCl、KCl、CuCl2、DTT、SDS和巯基乙醇下进行30分钟培养，将pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)用作底物来测定了活性，结果值以对化合物缺少的情况下收获的活性的百分数显示在表1中。
可知，大部分的金属离子和鳖合剂对酶活性几乎没有影响，并可确认SDS在10mM以上的浓度下显示出了活性抑制效果。
表2
(3-4)根据底物变化的效果测定
可利用PNP类底物在游离(free)状态下呈黄色，但与其它多种糖类结合时呈无色的原理，确认葡萄糖苷酶类酶的特性。例如，PNPGlc是PNP和葡萄糖通过β结合合成的物质，是无色的，但当其由β-葡萄糖分解生成游离的PNP时呈黄色，因此将PNPGlc作为底物使用，有颜色变化，则可知该酶是β-葡萄糖。并且，当分解PNP-β-D-半乳糖吡喃糖苷(PNP-β-D-galactopyranoside)而呈黄色时，可知具有β-D-半乳糖吡喃糖苷酶。不仅是底物的特性，由于随着浓度颜色会加深，因此利用分光仪还可以测定酶的浓度。
对此，为了分析本发明的Bgl3054具有的活性，用如下的方法分析了底物偏好性。
1活性单位被定义为每分钟释放的邻硝基苯酚(o-nitrophenol)或对硝基苯酚(p-nitrophenol)，为了分析底物偏好性，使用2.0mM的显色ONP(chromogenic ONP)和PNP(p-nitrophenyl)底物，在50mM磷酸钠缓冲液中在37℃下培养了5分钟。
分析的底物(Sigma)是：PNP-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-β-D-glucopyranoside)、PNP-β-D-吡喃半乳糖糖苷(PNP-β-D-galactopyranoside)、PNP-β-D-吡喃岩藻糖苷(PNP-β-D-fucopyranoside)、PNP-N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷(PNP-N-acetyl-β-D-glucosaminide)、PNP-β-L-吡喃阿拉伯糖苷(PNP-β-L-arabinopyranoside)、PNP-β-D-吡喃甘露糖苷(PNP-β-D-mannopyronoside)、PNP-β-D-吡喃木糖苷(PNP-β-D-xylopyranoside)、PNP-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-α-D-glucopyranoside)、PNP-α-L-呋喃阿拉伯糖苷(PNP-α-L-arabinofuranoside)、PNP-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(PNP-α-L-arabinopyranoside)、PNP-α-D-吡喃鼠李糖苷(PNP-α-D-rhamnopyranoside)、PNP-α-D-吡喃甘露糖苷(PNP-α-D-mannopyranoside)、PNP-α-D-吡喃木糖苷(PNP-α-D-xylopyranoside)、邻硝基酚[ONP]-β-D-吡喃葡萄糖苷(o-nitrophenol[ONP]-β-D-glucopyranoside)、ONP-β-D-吡喃半乳糖糖苷(ONP-β-D-galactopyranoside)、ONP-β-D-吡喃岩藻糖苷(ONP-β-D-fucopyranoside)和ONP-β-D-吡喃半乳糖糖苷(ONP-β-D-galactopyranoside)。
其结果，Bgl3054在ONP-β-D-岩藻吡喃糖苷(ONP-β-D-fucopyranoside)中显示了最高的活性，其次以PNP-β-D-吡喃岩藻糖苷(PNP-β-D-fucopyranoside)、oNP-β-D-吡喃葡萄糖苷(oNP-β-D-glucopyranoside)、ONP-β-D-吡喃半乳糖糖苷(ONP-β-D-galactopyranoside)、PNP-β-D-吡喃葡萄糖糖苷(PNP-β-D-glucopyranoside)、PNP-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(PNP-α-L-arabinopyranoside)和PNP-β-D-吡喃半乳糖糖苷(PNP-β-D-galactopyranoside)的顺序显示了活性。
这表示Bgl3054不仅具有β-D-葡萄糖苷酶的活性，而且还具有β-D-岩藻吡喃糖苷酶、β-D-吡喃葡萄糖苷酶和α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶的活度。特别是，人参皂苷Rb2能被转化成人参皂苷Rd是因为该酶还具有α-L-阿拉伯吡喃糖苷的活度，从而能将连接在人参皂苷Rb2的第20位碳上的α-L-吡喃阿拉伯糖基(α-L-arabinopyranosidic)键切断，此时生成人参皂苷Rd(表3)。
表3
并且，使用0.1mM至0.6mM的浓度的pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)进行了新纯化的酶的动力学分析。以405nm的吸光度在37℃下观察了20分钟。其结果数据使用由Cleland报告的Enzyme Kinetics Program决定Km和Vmax并显示。
对根据人参皂苷糖苷酶的pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)的水解的Km和Vmax，利用由Cleland报告的EnzymeKinetic program进行了计算，对pNPGlc(对硝基苯酚-β-D-吡喃葡萄糖苷；Sigma)分别显示了8.66(±0.99885)mM和0.3177(±0.01654)mmol*min-1*mg的protein-1(图8)。
实施例4.酶的特异性及选择性分析
为了分析结合在人参皂苷C-3和C-20位置的对葡萄糖水解的酶的特异性和选择性，将人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd和Rg3用作底物。将包含0.2U的酶、50mM磷酸钠缓冲液0.1％(w/v)(pH7.0)以及底物的各反应混合物在37℃下培养。以适当的间隔取出样品，添加同量体积的水溶液-饱和的丁醇，结束了反应。将正丁醇馏分进行干燥并蒸发，将残留物溶解于CH3OH进行TLC HPLC或NMR分析后，将其结果显示在图10、11和12中。
人参皂苷Rb1和Rb2的情况下，在Rb1的C-20位置上末端葡萄糖和吡喃阿拉伯糖苷分别被切断而转化成Rd，之后Rd在C-3位置末端的葡萄糖被切断而被转化成F2。确认了：人参皂苷Rc是C-3位置末端的葡萄糖被切断，从而被转化成了化合物Mc1(图5)。

Claims (16)

1.序列号2所示的氨基酸序列的人参皂苷糖苷酶蛋白质。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质对结合在PPD类皂苷的第20位或第3位碳的糖基具有选择性水解能力。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，所述糖基是吡喃葡萄糖糖苷或吡喃阿拉伯糖苷。
4.编码权利要求1所述蛋白质的核酸。
5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，所述核酸如序列号1所示。
6.包含权利要求4所述核酸的重组载体。
7.如权利要求6所述的重组载体，所述载体是pHisBGL3054，其具有图9中记载的酶切图谱。
8.由权利要求6所述重组载体转化的转化子。
9.如权利要求8所述的转化子，其特征在于，所述转化子是大肠杆菌(E.coli)。
10.制备权利要求1所述人参皂苷糖苷酶的方法，包括：
(a)培养如权利要求8的转化子的步骤；
(b)用所述培养的转化子生产人参皂苷糖苷酶的步骤；以及
(c)回收所述生产的人参皂苷糖苷酶的步骤。
11.利用如权利要求1所述的蛋白质来将PPD类皂苷转化成体内容易吸收的形态的稀有皂苷的方法。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述方法通过对结合在PPD类皂苷的第20位或第3位碳上的糖基进行水解来进行。
13.如权利要求12所述的方法，所述糖基是吡喃葡萄糖糖苷或吡喃阿拉伯糖苷。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述转化是选自以下组的一种以上：从人参皂苷Rb1或人参皂苷Rb2到人参皂苷Rd的转化、从人参皂苷Rd到人参皂苷F2的转化、以及从人参皂苷Rc到化合物Mc1的转化。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述转化是在pH5.5～7.5以及30～55℃的温度下进行。
16.用于将PPD类皂苷转化成体内容易吸收的形态的皂苷的转化用组合物，所述PPD皂苷包含权利要求1所述的蛋白质作为有效成分。
CN201080046283.3A 2009-09-18 2010-09-20 源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途 Expired - Fee Related CN102762738B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020090088734A KR101098027B1 (ko) 2009-09-18 2009-09-18 로다노박터 진세노시디뮤탄스 ｋｃｔｃ２２２３１ｔ 유래의 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도
KR10-2009-0088734 2009-09-18
PCT/KR2010/006502 WO2011034406A2 (ko) 2009-09-18 2010-09-20 로다노박터 진세노시디뮤탄스 k c t c 2 2 2 3 1 t 유래의 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102762738A CN102762738A (zh) 2012-10-31
CN102762738B true CN102762738B (zh) 2015-01-14

Family

ID=43759207

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080046283.3A Expired - Fee Related CN102762738B (zh) 2009-09-18 2010-09-20 源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8877463B2 (zh)
KR (1) KR101098027B1 (zh)
CN (1) CN102762738B (zh)
WO (1) WO2011034406A2 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101284707B1 (ko) * 2011-11-03 2013-07-23 강원대학교산학협력단 프로토파낙사디올 생합성 촉진용 조성물
CN103849672B (zh) * 2012-12-06 2017-06-06 中国科学院上海生命科学研究院 一组糖基转移酶及其应用
CN103146592B (zh) * 2013-01-31 2014-06-25 河南科技学院 一种转化人参皂苷Rb1生成Rd的酵母菌及其应用
CN104232723B (zh) * 2013-06-07 2021-03-26 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 一组糖基转移酶及其应用
US20150126463A1 (en) * 2013-11-04 2015-05-07 Hong Kong Baptist University Use of herbal saponins to regulate gut microflora
US10456436B2 (en) * 2013-11-04 2019-10-29 Wen Luan Wendy Hsiao Use of herbal saponins to regulate gut microflora
CN103966105B (zh) * 2013-11-28 2017-08-11 河南科技学院 一种转化人参皂苷Rg3生产Rh2的米曲霉、生产方法及应用
KR20170047007A (ko) * 2015-10-22 2017-05-04 (주)아모레퍼시픽 효소적 방법에 의하여 인삼의 사포닌으로부터 진세노사이드 F2, 컴파운드 Mc 및 컴파운드 O를 선택적으로 제조하는 방법
KR101785809B1 (ko) * 2015-12-18 2017-10-18 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 마이너 진세노사이드의 제조방법
CN113430136B (zh) * 2021-07-09 2022-05-20 华中农业大学 菌株Rhodanobacter sp.LX-100及其在氧化有机硒或单质硒中的应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1105781C (zh) * 1999-03-17 2003-04-16 金凤燮 酶法改变人参皂甙糖基制备人参皂甙的方法
US7759101B2 (en) 2000-12-29 2010-07-20 Fengxie Jin Ginsenoside glycosidases hydrolyzing ginsenoside sugar moieties and uses thereof
CN1252083C (zh) 2004-07-29 2006-04-19 上海中药创新研究中心 20(S)－人参皂苷Rh2的合成方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rhodanobacter ginsenosidimutans sp. nov.,isolated from soil of a ginseng field in South Korea.;Dong-Shan An et al.;《International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology》;20091231;691-694 *
tudy of characteristics of ginseng saponin-converting bacteria isolated from soil of ginseng field.;AHN, DONG SEON;《KAIST (DEPARTMENT OF BIOLOGICAL SCIENCES) DOCTORAL THESIS》;20090228;摘要,第141页 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110031023A (ko) 2011-03-24
US20120190063A1 (en) 2012-07-26
WO2011034406A3 (ko) 2011-09-01
KR101098027B1 (ko) 2011-12-27
CN102762738A (zh) 2012-10-31
WO2011034406A2 (ko) 2011-03-24
US8877463B2 (en) 2014-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102762738B (zh) 源自Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T的人参皂苷糖苷酶及其用途
CN102782125B (zh) 源自地杆菌属的新型人参皂苷糖苷酶及其用途
EP1354944B1 (en) Ginsenoside glycosidase which hydrolyzes ginsenoside glycosyl and the use thereof
KR101433661B1 (ko) 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 ｆ2의 제조방법
EP2900813B1 (en) Novel udp-glycosyltransferase derived from ginseng and use thereof
KR102338008B1 (ko) 당사슬 연장에 촉매 작용하기 위한 한 그룹의 udp-글리코실트랜스퍼라제 및 이의 응용
EP2900812B1 (en) Novel udp-glycosyltransferase derived from ginseng and use thereof
Barber et al. Synthesis of cellulose by enzyme preparations from the developing cotton boll
Arend et al. Hydroquinone: O-glucosyltransferase from cultivated Rauvolfia cells: enrichment and partial amino acid sequences
JPH11332568A (ja) エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子
CN106011106B (zh) 一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物k的方法
KR101959848B1 (ko) 장수버섯 균사체를 이용한 희귀 인삼 사포닌의 제조방법
CN103602646B (zh) 一种最适反应温度提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
KR101771577B1 (ko) 로다노박터 진세노시디뮤탄스 유래의 알파-ｎ-아라비노퓨라노시다제 및 이의 용도
KR100412218B1 (ko) 20-Ｏ-β-Ｄ-글루코피라노실-20(Ｓ)-프로토파낙사디올의제조방법
EP3181695B1 (en) A method for producing a minor ginsenoside using a ginsenoside glycosidase
KR101781259B1 (ko) 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 지페노사이드 lxxv 생산 방법
CN112831481A (zh) 糖基转移酶以及催化糖链延伸的方法
CN115125266B (zh) 一种重组载体、转化体及其在五环三萜类化合物糖基化修饰中的应用
CN110157697A (zh) 一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备绞股蓝皂苷的方法
KR20220058286A (ko) 패니바실러스 무실라지노서스 유래 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도
US20040038367A1 (en) Novel xyloglucan oligosaccharide-degrading enzyme, polynucleotide encoding the enzyme, and method of preparing the enzyme
KR20230095539A (ko) 패니바실러스 무실라지노서스 유래 엔도-1,4-베타 글루코시데이즈 및 이의 용도
JP3113947B2 (ja) 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法
KR20140006372A (ko) 생귀박터 케디에이 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 마이너 진세노사이드의 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150114

Termination date: 20180920