KR20110031023A

KR20110031023A - 로다노박터 진세노시디뮤탄스 ｋｃｔｃ２２２３１ｔ 유래의 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20110031023A
Application number: KR1020090088734A
Authority: KR
Inventors: 안동선; 김성건; 이성택; 임완택; 최창호
Original assignee: 한국생명공학연구원; 한국과학기술원
Priority date: 2009-09-18
Filing date: 2009-09-18
Publication date: 2011-03-24
Also published as: KR101098027B1; CN102762738B; CN102762738A; WO2011034406A3; US8877463B2; WO2011034406A2; US20120190063A1

Abstract

본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스(Rhodanobacter ginsenosidimutans) KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 이 단백질은 진세노시드의 특정 위치 결합 본드를 선택적으로 가수분해하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌을 체내 흡수 가능한 고활성 물질로 전환하는 활성을 가지고 있다. 보다 구체적으로, 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 제조하는 방법, 상기 단백질을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 메이저 사포닌을 체내 흡수 가능한 마이너 사포닌 형태로 전환하는 방법 및 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물에 관한 것이다.

PPD 타입, 로다노박터 진세노시디뮤탄스, 사포닌, 진세노사이드, 진세노시드 글리코시다제

Description

로다노박터 진세노시디뮤탄스 ＫＣＴＣ２２２３１Ｔ 유래의 진세노시드 글리코시다제 및 이의 용도{Ginsenoside glycosidase from Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T and use thereof}

본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스(Rhodanobacter ginsenosidimutans) KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제(Ginsenoside Glycosidase) 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 상기 단백질을 구성하는 아미노산 서열, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 배양하여 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 제조하는 방법, 상기 단백질을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 메이저 진세노사이드를 체내 흡수 가능한 마이너 진세노사이드 형태로 전환하는 방법 및 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리 화합물로 이루어진 물질을 의미하며, 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견되는 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드(Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드(Protopanaxadiol-type ginsenosides), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드(Protopanaxatriol-type ginsenosides), 및 올레아놀린산계 진세노사이드(Oleanolic acid-type ginsenosides)의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 C-3, C-6 및 C-20 위치에 글리코시딕 결합(glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties(aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드이다. 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Gypenoside XVII, Compound O, Compound Mc1, F2, Compound Y, Compound Mc, Rg3, Rh2, C-K가 포함된다.

또한, 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮다. 따라서, 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해서 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 마이너 진세노사이드로 전환시키는 과정이 필요하다. 즉, 메이저 진세노사이드는 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 글루코스를 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다(Tawab et al., 2003; Akao et al., 1998). 메이저 진세노사이드에는 Rg1, Re, Rb1, Rc 및 Rb2 등이 포함되며, 마이너 진세노사이드에는 F2, Rg3, Rh1, Rh2 및 화합물 K, C-K, Mc, Mc1(compound K, C-K, Mc, Mc1)등이 포함된다.

마이너 진세노사이드 중 Mc1은 주로 홍삼에 미량 함유되어 있는 진세노사이드로서, 진통작용, 코티코스테론 분비 촉진작용, 신장 사구체 비대 억제 작용, 간세포의 지질과산화 억제 작용, 골수세포, DNA, RNA, 단백질 및 지질 합성촉진작용 등의 기능이 있는 디올계열의 진제노사이드 Rc를 섭취했을 때 체내 대사물질로서 컴파운드 Mc1이 생성된다. 컴파운드 Mc1은 그 양이 너무나 미미해 다각도의 약리 활성적 연구가 시행되지 못하고 있다.

또한, 마이너 형태의 진세노사이드 F2는 종양세포에 대한 증식억제, 종양세 포나 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 효과 등이 있는 성분으로 이미 알려져 있다(한국생약학회지 28(1), 35, 성종환 등, 1997년). 진세노사이드 F2는 인삼 자체에는 극미량이 포함되어 있다. 또한, 체내에 사포닌이 투여되면 화합물 K가 최종적으로 생성되는 데, 진세노사이드 F2는 화합물 K가 생성되기 전의 중간체 화합물이다. 따라서, 진세노사이드 F2를 대량으로 얻는 것은 매우 어려운 기술로 인정되고 있다.

한편, 기존에 알려진 진세노사이드 F2의 제조방법으로는 다이올계 사포닌을 효소인 나린지나제로 가수분해시켜 제조하거나 쥐에 경구투여 후 대장에서 분해산물로 생성되는 진세노사이드 F2를 분리하는 방법이 있다. 그러나 이 방법들은 수율이 극히 낮을 뿐만 아니라 여러 가지 2차 대사산물이 생성되어 진세노사이드 F2를 고순도로 정제하기가 어렵다(Koizumi 등, Chem. Pharm. Bull. 30(7):2393, 1982년; Karikura 등, Chem. Pharm. Bull. 이의 대량 생산 방법에 대해 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 현재까지 효과적인 대량생산 방법에 대해서는 정립되지 못하고 있다.

또한, 진세노사이드 F2는 종양세포에 대한 증식 억제, 종양세포 및 세균에서 나타나는 다제내성을 반전시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있으며(한국생약학회지 28(1), 35, 성종환 등, 1997), 인삼 진세노사이드의 경구 투여 시, 프레보텔라리스(Prevotellaris)와 같은 장내 세균에 의해 대사되어 흡수되며, 이들의 대사산물인 F2가 약효를 나타낸다고 알려져 있다. 그러나 이처럼 유용한 F2도 역시 일부 인삼의 종류에 미량으로만 존재하여 다량의 시료를 수득하기 어려우며, 대사 과정 에서 여러 가지 2차 대사산물과 함께 생성되기 때문에 F2만을 고순도로 정제하는 데 어려움이 존재하여 왔다.

미량의 진세노사이드인 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법(De Mayo 등, canad. J. Chem., 43, 2033, 1965), 효소적 방법(Kitagawa 등, Terahedron Letters, 30, 2283, 1974), 및 배당체 합성을 이용한 방법(제10-2005-0007250호) 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있었다.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)가 있으며, 이와 같은 효소를 이용한 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었다. 그러나 이들 역시 대량 생산 방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.

뿐만 아니라, β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L- arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명자들은 Arthrobacter chlorophenolicus A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인한 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다.

또한, 한국 특허출원 10-1999-0045180은 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입 진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 Rh2를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 F2를 진세노사이드 Rh2로 전환시킨다. 또한, 진세노사이드 Rb1과 Rc로부터 Rh2를 제조할 수도 있다. 그러나 실시예 3에 기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야 한다. 따라서, 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실된다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 진세노사이드를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드에서 마이너 진세노사이드로의 생전환 활성을 가지는 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득했다 본 발명자들은 이 유전자를 클로닝하여 발현시킨 재조합 효소가 메이저 진세노사이드의 특정 분자결합을 선택적으로 가수분해하여 생리활성과 생흡수율이 높은 마이너 진세노시드로로 생전환시킨다는 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단계; 및 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계를 포함하는 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase)(이하, '본 발명의 단백질' 또는 '진세노시드 글리코시다제'와 혼용) 단백질을 제공한다.

본 발명에서 용어, '진세노시드 글리코시다제' 또는 '진세노시드 글리코시다제 단백질'은 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는 효소인 글리코시다제의 일종으로써 진세노사이드의 전환활성을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 활성의 정도 및 기능은 효소마다 차이가 있다.

본 발명의 단백질은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T로부터 유래된 효소로서, PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환시킬 수 있는 전환 활성을 가진다. 보다 바람직하게, 본 발명의 단백질은 PPD 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소를 선택적으로 가수분해할 수 있는 능력을 가진다.

본 발명의 신규 핵산을 동정하기 위한 미생물은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 미생물로서, 본 발명자들은 KCTC22231T 균주를 대한민국 포천 지역에 있는 인삼밭에서 분리하였다.

본 발명의 단백질은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 구성하는 아미노산 서열(폴리펩타이드 서열)을 가지며, 상기 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 서열로서, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 아미노산 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함한다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노시드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 핵산은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산이며, 상기 균주로부터 분리된 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 기재된 핵산이며, 상기 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지는 서열, 바람직하게는 80% 이상의 유사성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 유사성, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상의 유사성, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 핵산이 코딩한 단백질이 진세노시드 글리코시다제의 활성을 갖는 핵산을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산은 본 발명자들에 의해 bgl3054(이하, 'BGL 3054'와 혼용)로 명명되었고, 상기 핵산은 1299bp 길이의 핵산을 포함하며 433개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

본 발명의 용어 '유사성'이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 유사성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 유사성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 일정 수준 이상의 유사성이 유지되는 동시에 본 발명에서 목적하는 단백질의 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 단백질은 야생형의 아미노산 서열 변이체 및 염기 서열 변이체를 포함하는데,'변이체'란 천연 아미노산 서열 또는 염기 서열에 대해 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기 또는 염기 서열이 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 갖는 단백질 또는 상이한 서열을 갖는 핵산을 의미한다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, '벡터'란 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다. 본 발명은 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 제조된 재조합 벡터를 숙주 세포에 형질전환 (transformation) 또는 형질감염 (transfection) 시킴으로써, 본 발명의 단백질을 수득할 수 있게 된다. 본 발명의 구체적인 실시예에 서는 포스미드 라이브러리(fosmid library)를 통하여 스크리닝하는 한편, 진세노시드 글리코시다제를 코딩할 수 있는 ORF를 동정하여 이를 pHis-Parallell 발현 벡터에 삽입함으로써 재조합 벡터 pHisBGL3054를 제조하였다(도 7).

본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 핵산을 적당한 벡터에 연결 (삽입)하여 획득할 수 있다. 본 발명의 핵산이 삽입될 벡터는 그것이 숙주 안에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지는 않는다. 예를 들어, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 사용될 수 있다. 플라스미드 DNA의 구체적인 예로는 pCDNA3.1+ (Invitrogen) 같은 상업적인 플라스미드를 포함한다. 본 발명에 사용된 플라스미드의 다른 예로는 대장균 유래 플라스미드 (pYG601BR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)-유래 플라스미드 (pUB110 및 pTP5) 및 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50)가 있다. 파아지 DNA의 구체적인 예로는 λ-파아지 (Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11 및 λZAP)가 있다. 또한, 리트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus) 또는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus)와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스 (baculovirus)와 같은 곤충 바이러스가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 pHis-Parallel1 벡터에 삽입하여 재조합 벡터 pHisBGL3054를 제조하였다.

아울러 본 발명의 벡터로서, 핵산 발현 활성화 단백질 (예를 들어, B42같은)이 연결된 융합 플라스미드 (fusion plasmid, 예를 들어, pJG4-5)가 사용될 수 있 으며, 이러한 융합 플라스미드에는 GST, GFP, His-tag, Myc-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 융합 플라스미드가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 발현된 진세노시드 글리코시다제를 용이하게 정제 및 회수하기 위하여 6개의 히스티딘 서열을 부가한 헥사히스티딘 태그(hexahistidine tag, 6x his tag, His₆ tag)를 사용하였다.

본 발명의 핵산을 벡터로 삽입하기 위해, 정제된 DNA를 적당한 제한효소로 절단하여 적당한 벡터 DNA의 제한 부위 또는 클로닝 부위에 삽입하는 방법이 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, Bgl 3054 유전자는 화살표로 표시된 BamHI과 HindIII으로 절단된 사이에 삽입되었다.

본 발명의 핵산은 벡터에 작동 가능하게 연결되어 있어야 한다. 본 발명의 벡터는 프로모터 및 본 발명의 핵산 외에 인핸서 (enhancer)와 같은 시스 요소 (cis element), 스플라이싱 시그널 (splicing signal), 폴리 A 추가 시그널 (poly A addition signal), 선택 마커 (selection marker), 라이보좀 결합 서열 (ribosome binding sequence, SD sequence) 등을 추가로 포함할 수 있다. 선택 마커의 예로, 클로람페니콜 저항 핵산, 암피실린 저항 핵산, 디하이드로폴레이트 환원효소(dihydrofolate reductase), 네오마이신 저항 핵산 등이 사용될 수 있으나, 상기 예들에 의해 작동 가능하도록 연결되는 추가적 구성요소가 제한되는 것은 아 니다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, '형질전환 (transformation)'이란 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 일반적으로 형질전환 방법에는 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 있다.

본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 형질전환 시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

목적 핵산인 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 숙주로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.

숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균 (E. coli)과 같은 에스케리키아 (Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)같은 바실러스 (Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)같은 슈도모나스 (Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

본 발명에 사용될 수 있는 대장균 균주의 구체적인 예로는 CL41(DE3), BL21 및 HB101이 있으며, 바실러스 서브틸리스 균주의 구체적인 예로는 WB700 및 LKS87이 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 대장균 세포 CL41(DE3)을 숙주 세포로 하여 진세노시드 글리코시다제를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하였다.

대장균과 같은 세균이 숙주로서 사용될 때, 본 발명의 재조합 벡터는 숙주 내에서 자율적인 복제를 할 수 있고, 프로모터, 라이보좀 결합서열, 본 발명의 핵산 및 전사 종료 서열 (transcription termination sequence)로 구성되어 있다.

본 발명의 프로모터는, 본 발명의 핵산을 대장균과 같은 숙주에서 발현하도 록 하는 한 어떠한 프로모터도 사용될 수 있다. 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR 프로모터 같은 대장균 또는 파아지-유래 프로모터; T7 프로모터 같은 대장균 감염 파아지-유래 프로모터가 사용될 수 있다. 또한 tac 프로모터 같은 인공적으로 변형된 프로모터도 사용될 수 있다.

본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 벡터는 필요에 따라 다른 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 추가로 포함될수 있는 서열은 단백질 정제용 태그 서열일 수 있으며, 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 헥사히스티딘(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 헥사히스티딘(hexahistidine)일 수 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 헥사히스티딘 태그을 사용하여 정제를 용이하게 하였다.

또한, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질의 경우, 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 헥사히스티딘이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 원하는 목적 단백질을 용이하게 회수할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제의 제조 방법을 제공한다. 바람직하게 상기 제조 방법은, (a) 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단계; 및 (c) 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명의 진세노시드 글리코시다제를 발현시키는 방법은 상기 서술된 바와 같으며, 상기의 방법으로 형질전환된 숙주 세포는 당업계에서 사용되는 통상적인 방법으로 배양할 수 있다. 예를 들면, 상기 진세노시드 글리코시다제를 발현하는 형질전환체는 다양한 배지에서 배양할 수 있으며, 페드-배치(fed-batch) 배양 및 연속 배양 등을 수행할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 형질전환체의 배양방법이 제한되는 것은 아니다. 또한, 숙주 세포의 생장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.

적절한 숙주 세포를 선택하여 배지 조건을 조성하여 주면 목적 단백질이 성공적으로 형질전환된 형질전환체는 진세노시드 글리코시다제를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주 세포의 특징에 따라 생산된 진세노시드 글리코시다제는 숙주 세포의 세포질 내, 페리플라즈믹 스페이스(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비 될 수 있다. 또한 목적 단백질은 가용성 형태 또는 불용성 형태로 발현될 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는 bgl3054 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 가용성 형태로 발현되는 것을 확인하였다(표 1).

숙주 세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산 나트륨 침전 등), 용매 침전(예를 들어, 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 컬럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다.

상기의 방법으로 분리된 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 진세노사이드가 존재하는 인 비트로(in-vitro) 또는 인 비보(in vivo) 시스템에서 용이 흡수가 가능한 가용성 사포닌을 생산할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 출발물질로 이용되는 PPD 타입의 사포닌으로는, 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포 함되어 있는 사포닌을 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

배경기술에서 언급한 바와 같이 진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계 진세노사이드(Protopanaxadiol-type ginsenosides), 프로토파낙사트라이올계 진세노사이드(Protopanaxatriol-type ginsenosides), 및 올레아놀린산계 진세노사이드(Oleanolic acid-type ginsenosides)의 세 가지로 분류될 수 있으며, 본 발명의 PPD 타입의 사포닌이란 프로토파낙사다이올계의 진세노사이드를 의미한다.

본 발명의 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 이용하는 경우, 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환시킬 수 있는데, 이는 특정 위치의 글리코시딕 결합을 선택적으로 가수분해가능하여 PPD 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소를 순차적으로 가수분해함으로써 체내 흡수가 어려운 메이저 형태(major form)의 PPD 타입 사포닌(예를 들어, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc)을 상대적으로 체내 흡수가 용이한 마이너 형태(minor form)의 가용성 사포닌(예를 들어, 진세노사이드 F2, Mc1)으로 전환시킬 수 있음을 의미한다.

바람직하게 이러한 전환은 생전환(bioconversion)을 통해 이루어지며, 연속 또는 비연속적으로 PPD 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소를 선택적으로 가수분해함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 단백질은 당업계에 알려진 모든 PPD 타입의 사포닌을 흡수가 용이한 마이너 형태(minor form) 가용성 사포닌으로 전환시킬 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 단백질에 의한 생전환의 예로는 진세노사이드 Rb1을 Rd로 전환 또는 전환된 Rd를 F2로 전환, 진세노사이드 Rb2를 Rd로 전환, 전환된 Rd를 F2로 전환, 진세노사이드 Rc를 컴파운드 Mc1으로 전환하는 방법이 모두 포함된다.

보다 상세하게, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 진세노사이드 Rb1 및 Rb2에 투여하는 경우, Rd와 F2를 순차적으로 생산하였다. 또한, 진세노사이드 Rc를 출발물질로하여 본 발명의 단백질을 처리하는 경우, 컴파운드 Mc1를 생산하는 것을 확인하였다. 이들은 모두 본 발명의 단백질이 PPD 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소를 가수분해함으써 수행될 수 있으며, 상기와 같은 가수분해를 통해 생성된 생성물질(진세노사이드 유도체)은 반응물질에 비해 체내 흡수가 용이하다.

본 발명의 단백질은 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환시키기 위한 효소로서, 활성 및 안정성이 유지할 수 있는 한 다양 한 온도 및 pH 조건에서 사용될 수 있으며, ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, DTT 및 머캅토에탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속 및 화학 제재를 함께 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 효소 특성을 분석하였는바 37℃이하에서 효소의 안정성이 탁월하였으며, 40-55℃에서 효소의 활성이 높았고, pH 5.5-7.5에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월하였다 (도 6a 및 도 6b).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제를 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌으로부터 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물을 제공한다.

본 발명의 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제는 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태로 전환시키는 우수한 활성을 나타내며, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드를 대량으로 생산 및 제조할 수 있다. 또한, 상기 진세노시드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 배양함으로써 대량생산이 가능하여 산업적으로 다양하게 사용할 수 있다..

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 포스미드 라이브러리 스크리닝 및 전장 염기서열 분석

CopyControl Fosmid Library Production Kit(Epicentre, U.S.A)를 제조사의 방법에 따라 사용하였다. 로다노박터 진세노시디뮤탄스 KCTC22231T의 게놈 DNA(genomic DNA)를 약 40Kb 단편으로 임의적으로 절단하였다. Pulse Field Gel Electrophoresis에 의해 적은 양을 전기영동함으로써, 절단된 DNA 크기를 측정하고 DNA를 블런트 엔드(blunt end), 5'-인산화 말단(5'-phosphorylated end)으로 제조하기 위해 말단-회복(end-repair)시켰다. LMP(low melting point) 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 40Kb 이상인 말단-회복된 DNA를 선별하였다. LMP 아가로즈 겔로부터 블런트-엔드 DNA를 정제하였고 pCC1FOS 벡터 내에 라이게이션(ligation)시켰다. MaxPlax lambda packaging extract kit(Epicentre, U.S.A.)로 인 비트로(in vitro) 패키징을 수행하였다. 마지막으로 생성물을 10mM MgSO₄를 포함하는 LB 브로스(broth)에서 600nm일 때 O.D 값이 0.6이 될 때까지 배양한 대장균(E.coli) EPI300-T1^R 내로 형질전환시켰다. 감염된 박테리아를 37℃에서 20분간 흡수시켰고, 클로람페니콜(chloramphenical) 12.5㎍/ml 및 27μ-X-gal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucoside)을 포함하는 LB 플레이트 상에 도말하고, 37℃에서 배양하였다. 16-20 시간 배양 후, 파란색을 나타내는 클론(진세노시드 글리코시다제 생산 추정 클론)을 선별하고, 동일한 플레이트 상에서 한 번 더 활성을 확인하였다. 확인 후, 추정되는 클론을 클로람페니콜 12.5㎍/ml을 포함하는 0.2ml의 LB 브로스에서 37℃, 24시간 동안 배양하였다.

진세노사이드-가수분해능을 분석하기 위하여 TLC 분석을 이용하였다. 진세노사이드 Rb1을 Rd로 전환시키는, pbgl3054-p1 포스미드 클론으로 추정되는 포스미드 DNA를 세포 배양으로부터 동정하여, 제조사의 방법에 따라 FosmidMAX DNA purification 키트(Epicentre)를 이용하여 정제하였다. 정제된 포스미드 DNA를 전장 시퀀싱(full sequencing) 분석하였다. 트랜스포존(transposon)의 삽입은 HyperMu^™<KAN-1> Insertion Kit(Epicentre, U.S.A)를 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. MUKAN-1 FP-1 [5'-CTGGTCCACCTACAACAAAGG-3'(서열번호 3)] 및 RP-1 [5'-AGAGATTTTGAGACAGGATCCG-3'(서열번호 4)]인 두 프라이머를 양쪽 방향으로 사용하여 선택적 삽입 클론을 시퀀싱함으로써 완전한 서열을 수득하였는데, 이는 상기 키트 내에 삽입되는 HyperMu 트랜스포존의 말단 유사성 영역을 포함하고 있다. 주형으로 ABI PRISM^™ Bigdye^™ Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 DNA 염기서열결정 반응을 수행하였다. ABI 3730XL caillary DNA Sequencer(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 데이터를 수집하고 분석하였다

실시예 2. bgl3054 의 분자 클로닝 , 발현 및 정제

(2-1) bgl3054의 분자 클로닝, 발현

유전 코드 1(genetic code 1)을 사용하여 pbgl3054-p1의 어셈블 DNA(assembled DNA) 서열을 Vector NTI v10.0 (Invitrogen Inc.)로 분석하였다. 진세노시드 글리코시다제의 ORF를 찾아내고, 다음의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 주형 pbgl3054-p1 DNA를 PCR을 통해 증폭하였다.

정방향 프라이머:

5'- CGG ATC CAA TGG GCC TGG GAC GCC GGC GT -3' (서열번호 5)

역방향 프라이머:

5'- CGG AAG CTT TCA GGC GGG CTG CGG TGC -3' (서열번호 6)

상기 증폭된 단편을 pHis-Paralle1 발현 벡터(EcoRI 및 HindIII 제한 부위를 도입하여 사용), 재조합 TEV 프로테아제(rTEV)를 포함하는 His₆(hexahistidine) 융 합 단백질 발현 벡터 pHis-Parallel1에 순차적으로 클로닝하였다. 그 다음, 재조합 벡터 pHisBGL3054을 E.coli C41(DE3) 세포에 도입하였다.

(2-2) bgl3054의 클로닝 및 발현 결과

진세노시드 글리코시다제는 진세노사이드 Rb1를 Rd로 전환하는 능력을 나타내었으며, 따라서 본 발명자들은 상기 ORF를 bgl3054로 디자인하였다. bgl3054의 추정 아미노산 서열은 433개의 잔기를 가지며, 49kDa의 분자량을 나타내었다.

(2-3) bgl3054의 정제

과발현 플라스미드를 함유하는 E.coli C41(DE3)를 O.D 값이 600nm에서 0.6이 될 때까지 37℃, LB-앰피실린 배지에서 배양하였고, 12시간 동안 0.5mM 아이소프로필-β-D-싸이오갈락토피라노사이드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)로 처리함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 박테리아 세포를 4℃에서 20분 동안 5,000xg로 원심분리함으로써 수득하였다. 50mM 인산나트륨(sodium phosphate), 5mM EDTA, 및 1% Triton X-100(pH 7.0)(현탁 용액)으로 구성된 용액 세포 펠렛을 재현탁하였고, 초음파처리(ultrasonification)하였다. 진세노시드 글리코시다제는 불용체를 형성하지 않고 모두 수화되었으며 진세노시드 글리코시다제를 50mM 인산나트륨 내에서 1mg/ml Rb1 용액과 반응시켰고, TLC 분석을 수행하였다.

그 결과, 진세노시드 글리코시다제 Bgl3054는 진세노사이드 Rb1을 Rd를 거쳐 F2로 전환시켰다. 상기 진세노시드 글리코시다제 Bgl3054 코딩 핵산은 bgl3054로 디자인된 것이었다. 그러므로 bgl3054을 Nickel-charged HisTrap 컬럼(HisTrap HP, 5ml bed volume, Gel health) 상에 로딩하였고, 4℃에 버퍼 A(50mM 인산나트륨, pH 7.0)로 사전-평형(pre-equilibrated)을 맞추었다. 버퍼 A로 레진(resin)을 세척하였고, 결합된 단백질을 200mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 버퍼 A로 용출하였다. HisTrap 컬럼에 따른 rTEV로 배양함으로써 단백질로부터 His6-태그를 분리하였고, 30ml DEAE-셀룰로오즈 DE-52(Whatman)을 포함하는 컬럼 상에서 50mM 인산나트륨, pH 7.0 및 300mM NaCl로 추가적인 정제를 수행하였다. 단백질의 유사성은 10% SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색(Coomassie Blue staining)에 의해 측정되었다. 정제된 단백질을 10mg/ml 농도로 Amicon Ultra-15 필터(Millipore, U.S.A)를 사용하여 pH 7.0에서 50mM 인산나트륨으로 투석하였고, 사용시까지 -80℃에 저장하였다.

50mM 인산나트륨, pH 7.0에서 정제된 His6-태그된 단백질을 사용하여 효소 분석 및 동역학 분석을 수행하였다. 겔-여과 분석(Gel-filtration analysis)을 Sepharose 6 10/300GL (GE Healthcare) 컬럼 상에서 수행하였다. Bio-Rad filtration standards(catalog no. 151-1901)를 사용하여 측정하였다. 그 결과 효소 정제 스킴을 표 1에 나타내었다.

정제 단계	부피	단백질 농도	총 단백질	특이적 활성	총 활성	정제	수율
정제 단계	(ml)	(mg/ml)	(mg)	(U/mg)	(U^a)	(Fold)	(%)
조추출물	30	27.8	834	6.71	5596	1.00	100
Ni 정제	108	1.9	205.2	10.57	2168	1.57	39
DEAE-셀룰로오스 정제	126	0.93	117.18	10.99	1288	1.64	23

^aone unit(U) of beta-glucosidase was defined as the amount of enzyme liberating 1 μM/min of p-nitrophenyl.

본 발명자들은 상기 표 1에 기재된 바와 같이 본원 bgl3054 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 가용성 형태로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

(2-4) bgl3054의 정제 결과

Superose 6 10/300 GL(GE Healthcare) 상에서 겔 여과로써 측정된 천연 진세노시드 글리코시다제의 분자량은 49kDa이었고, SDS-PAGE에 의한 분석은 50kDa였다. 이러한 결과는 진세노시드 글리코시다제가 모노머 단백질이라는 것을 의미한다(도 3)

실시예 3. 효소 특성 분석

2.0mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 포함하는 pH 7.0, 50mM 인산 나트륨 버퍼 90 μl에 대해 특이 활성을 측정하였고, 반응 개시 전 10 μl 희석 정제 효소와 37℃에서 20분 동안 반응시켜 배양하였다. 1M Na₂CO₃ 0.1ml로 5 분 동안 처리하여 반응을 종료시키고, 405nm에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 분비를 즉각적으로 측정하였다. 활성 유닛(one unit of activity)을 분당 p-니트로페놀 1 μmol의 분비량으로 정의하였다. 특이 활성은 단백질 밀리그램(milligram)당 유닛으로 발현되었다. Bio-Rad 단백질 분석 염색 시약 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 모든 분석은 적어도 세 번 이상 수행하였다.

(3-1) pH 변화에 따른 효과 측정

pH가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다.

기질은 2.0 mM pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)을 사용하였고, 하기와 같은 버퍼(50 mM)를 사용하여 pH를 조절하였다.

pH 2 내지 10의 범위: KCl-HCl (pH 2), 글라이신-HCl (pH 3), 아세트산 나트륨(pH 4 및 5), 인산 나트륨(pH 6 및 7), Tris-HCl (pH 8 및 9) 및 글라이신-수산화나트륨(pH 10)

또한, pH가 효소 안정성에 미치는 효과를 측정하였다. 4 ℃, 24시간 동안 상기 언급된 버퍼 각 각에서 효소를 배양한 후, 50mM 칼륨(potassium) 버퍼 내에서 pHPGlc을 분석함으로써 pH 변동에 따른 효소 안정성을 측정하였다. 표준 분석 방법에 의해 잔기 활성을 분석하여 최적 pH에서 수득된 활성 확률로서 결과를 도 6a에 나타내었다.

도 6a를 참고하면, bgl3054는 pH 5.5-7.5에서 효소의 안정성 및 활성이 탁월하였으며, pH 7.0에서 가장 높은 활성을 나타내었다(도 6a).

(3-2) 온도 변화에 따른 효과 측정

온도가 효소 활성에 미치는 효과를 측정하였다. 4-90 ℃로 온도를 조절하였으며, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma) 2.0mM을 사용하여 5분 동안 최적 pH에서 50mM 인산 칼륨 버퍼 내 온도 의존적 활성을 분석하였다.

또한, 동일 온도 범위 내에서 30분 동안 인산 칼륨 버퍼 50mM 내 효소 당량을 배양함으로써 온도 안정성 분석을 수행하였다. 이는 10 분간 얼음으로 샘플을 냉각한 후, 표준 분석 방법에 의해 측정된 잔존 활성을 확인함으로써 수행한 후, 그 결과를 도 6b에 나타내었다.

그 결과, Bgl3054의 활성은 40-55 ℃에서 최고치를 보인 반면에, 열 안정성 실험 결과 37 ℃이하의 온도에서는 안정한 것으로 드러났으나, 45 ℃에서는 30분 경과 후 50% 가량의 활성을 상실하였다. 그 결과, Bgl3054의 활성은 40-55 ℃에서 최고치를 보인 반면에, 열 안정성은 37 ℃ 이하의 온도에서 안정화되었고, 특히 45 ℃에서는 거의 절반 가량의 안정성을 상실하였다 (도 6b).

(3-3) 금속 및 화학 제재 변화에 따른 효과 측정

진세노시드 글리코시다제를 실온에서 30분 동안 ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, DTT, SDS 및 머캅토에탄올 1mM 및 10mM(최종농도)에서 배양하였고, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 기질로 사용하여 활성을 측정하였으며, 결과값은 화합물이 결여된 경우에 수득된 활성에 대한 퍼센트로 나타내어 표 1에 도시하였다.

대부분의 금속 이온 및 킬레이트 제제가 효소 활성에 거의 영향을 주지 않음을 알 수 있으며, SDS는 10mM 이상의 농도에서 활성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

	1mM(%)		10mM(%)
NaCl	103.6	±3.1	114.6	±3.5
KCl	105.5	±3.9	141.9	±5.2
MgCl₂	103.3	±1.9	70.7	±1.3
MnCl₂	106.8	±2.4	86.9	±1.9
CoCl₂	102.6	±3.7	134.6	±4.8
ZnCl₂	91.8	±3.2	119.1	±4.2
CaCl₂	98.9	±3.8	140.7	±5.5
CuCl₂	92.4	±3.5	129.7	±5.0
SDS	57.3	±4.1	152.0	±11.0
EDTA	108.5	±0.7	27.0	±0.2
β-Mercaptoethanol	108.9	±0.9	34.5	±0.3
DTT	108.8	±2.4	86.8	±1.9
Control	100.0	±2.7	100.0	±2.7

(3-4) 기질 변화에 따른 효과 측정

PNP 계열 기질이 free한 상태에서는 노란색을 나타내지만 다양한 당들과 결합하면 무색을 나타내는 원리를 이용하여 글루코시다제 계열 효소들의 특성을 확인할 수 있다. 예를 들어, PNPGlc는 PNP와 글루코오스를 베타결합으로 합성한 물질로 무색이지만 베타-글루코오스에 의해 분해되어 free한 PNP가 생성되면 노란색을 나타내는바 PNPGlc를 기질로 사용하여 색의 변화가 있으면 그 효소가 베타-글루코오스임을 알 수 있다. 또한, PNP-β-D-갈락토피라노시드(PNP-β-D-galactopyranoside)를 분해하여 노란색을 나타내면 β-D-galactopyranosidase활성을 가짐을 알 수 있다. 기질의 특성 뿐만 아니라. 농도에 따라 색이 더 짙어지므로 분광기를 이용하면 효소의 농도 측정도 가능하다.

이에, 본 발명의 Bgl3054이 가지고 있는 활성을 분석하고자 하기와 같은 방법으로 기질 선호도를 분석하였다.

1분 당 o-니트로페놀(o-nitrophenol) 또는 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 방출로서 정의된 1 활성 유닛으로, 기질 선호도를 분석하기 위해 크로모게닉 ONP(chromogenic ONP) 및 PNP(p-nitrophenyl) 기질 2.0 mM을 사용하여 50mM 인산 나트륨 버퍼에서 37 ℃에서 5분 동안 배양하였다.

분석된 기질(Sigma)은 PNP-β-D-글루코피라노시드(PNP-β-D-glucopyranoside), PNP-β-D-갈락토피라노시드(PNP-β-D-galactopyranoside), PNP-β-D-퓨코피라노시드(PNP-β-D-fucopyranoside), PNP-N-아세틸-β-D-글루코스아마이드(PNP-N-acetyl-β-D-glucosaminide), PNP-β-L-아라비노피라노시드(PNP-β-L-arabinopyranoside), PNP-β-D-만노피라노시드(PNP-β-D-mannopyronoside), PNP-β-D-자일로피라노시드(PNP-β-D-xylopyranoside), PNP-α-D-글루코피라노시드(PNP-α-D-glucopyranoside), PNP-α-L-아라비노퓨라노시드 (PNP-α-L-arabinofuranoside), PNP-α-L-아라비노피라노시드 (PNP-α-L-arabinopyranoside), PNP-α-D-람노피라노시드 (PNP-α-D-rhamnopyranoside), PNP-α-D-만노피라노시드 (PNP-α-D-mannopyranoside), 및 PNP-α-D-자일로피라노시드 (PNP-α-D-xylopyranoside), 및 o-니트로페놀[ONP]-β-D-글루코피라노시드(o-nitrophenol[ONP]-β-D-glucopyranoside), ONP-β-D-갈락토피라노시드(ONP-β-D-galactopyranoside), ONP-β-D-퓨코피라노시드(ONP-β-D-fucopyranoside) 및 ONP-β-D-갈락토피라노시드(ONP-β-D-galactopyranoside)였다.

그 결과, Bgl3054는 ONP-β-D-퓨코피라노시드(ONP-β-D-fucopyranoside)에서 가장 높은 활성을 보였고 그 다음으로 PNP-β-D-퓨코피라노시드(PNP-β-D-fucopyranoside), ONP-β-D-글루코피라노시드 (oNP-β-D-glucopyranoside), ONP-β-D-갈락토피라노시드(ONP-β-D-galactopyranoside), PNP-β-D-글루코피라노시드 (PNP-β-D-glucopyranoside), PNP-α-L-아라비노피라노시드 (PNP-α-L-arabinopyranoside), PNP-β-D-갈락토피라노시드(PNP-β-D-galactopyranoside)의 순으로 활성을 보였다.

이는 Bgl3054이 β-D-글루코시데이즈 활성뿐만 아니라 β-D-퓨코피라노시다제, β-D-글루코피라노시다제 와 α-L- 아라비노피라노시다제 활성도 가진다는 것을 의미한다. 특히, 진세노사이드 Rb2를 진세노사이드 Rd로 전환할 수 있는 것은 본 효소가 α-L- 아라비노피라노시드 활성도 갖고 있으므로 진세노사이드 Rb2의 20번 탄소에 연결된 α-L-arabinopyranosidic 결합을 끊을 수 있기 때문이며, 이때 진세노사이드 Rd가 생성되는 것이다(표 3).

기질	상대적 활성도(%)
pNP-α-D-glucopyranoside	0.6	±0.0
pNP-α-D-mannopyranoside	0
pNP-α-D-xylopyranoside	0.1	±0.1
pNP-α-L-arabinofuranoside	0.3	±0.1
pNP-α-L-arabinopyranoside	15.1	±0.7
pNP-α-L-rhamnopyranoside	0.0	±0.1
pNP-β-D-fucopyranoside	88.9	±0.3
pNP-β-D-glactopyranoside	12.9	±2.4
pNP-β-D-glucopyranoside	40.7	±0.9
pNP-β-D-glucosaminide	0
pNP-β-D-mannopyranoside	0
pNP-β-D-xylopyranoside	0.5	±0.3
pNP-β-L-binopyranoside	0
oNP-α-D-galactopyranoside	0.2	±0.1
oNP-β-D-fucopyranoside	100.0	±10.2
oNP-β-D-galatopyranoside	41.6	±1.1
oNP-β-D-glucopyranoside	78.0	±1.9

또한, 0.1mM 부터 0.6mM까지의 농도의 pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)를 사용하여 새로 정제된 효소의 동역학 분석을 수행하였다. 405nm의 흡광도로 37 ℃에서 20분 동안 관찰하였다. 그 결과 데이터는 Cleland에 의해 보고된 Enzyme Kinetics Program을 사용하여 Km 및 Vmax를 결정하여 나타내었다.

진세노시드 글리코시다제에 의한 pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)의 가수분해에 대한 Km 및 Vmax는 Cleland에 의해 보고된 Enzyme Kinetic program을 이용하여 계산 하였는데, pNPGlc(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside; Sigma)에 대해 각각 8.66(±0.99885) mM 및 0.3177(±0.01654) mmol*min^-1*mg protein^-1을 나타내었다(도 6c).

실시예 4. 효소의 특이성 및 선택성 분석

진세노사이드 C-3 및 C-20 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 효소의 특이성 및 선택성을 분석하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 및 Rg3을 기질로 사용하였다. 효소 0.2U, 50mM 인산 나트륨 버퍼 0.1%(w/v) (pH 7.0), 및 기질을 포함하는 각 반응 혼합물을 37 ℃에서 배양하였다. 샘플을 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH₃OH에 용해시켜 TLC HPLC 또는 NMR 분석을 수행한 후 그 결과를 도 8에 나타내었다.

진세노사이드 Rb1와 Rb2의 경우, Rb1의 C-20 위치에 말단 글루코스와 아라비노피라노사이드가 각각 절단됨으로써 Rd로 전환되었고, Rd는 그 후, C-3 위치 말단의 글루코스가 절단됨으로서 F2로 전환되었다. 진세노사이드 Rc는 C-3 위치 말단의 글루코스가 절단됨으로서 컴파운드 Mc1으로 전환됨을 확인할 수 있다(도 5).

도 1은 PPD(protopanaxadiol) 타입 진세노사이드의 종류를 나타낸 것이다.

도 2는 PPT(Protopanaxatriol) 타입 진세노사이드의 종류를 나타낸 것이다.

도 3은 bgl3054 정제를 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.

M, 분자량 마커; lane 1, 유도 전 전체 세포; lane 2, 발현 유도 후 Cell-free extract; lane 3, 세포 파쇄 후 침전물; lane 4, Nickel-charged His T rap column에 의해 정제된 단백질; lane 5, DEAE anion-exchange column 후 정제된 단백질; lane 6, DEAE anion-exchange column 후 정제된 단백질; lane 7, rTEV에 의해 His₆ 태그를 제거한 단백질

도 4는 bgl3054 단백질의 생전환 활성을 나타내는 TLC사진이다.

도 5는 bgl3054 단백질의 생전환 반응경로를 나타내는 모식도이다.

도 6a는 E.coli로부터 정제된 Bgl3054의 pH에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이고, 도 6b는 온도에 따른 안성성 및 활성을 나타내는 그래프이다.

또한, 도 6c는 본 발명에 따른 Bgl3054 단백질의 Km과 Vmax를 나타내는 이중역수그래프(double reciprocal graph)이다.

도 7은 Bgl3054을 포함하는 플라스미드 벡터를 도시한 것이다

도 8a는 Bgl 3054를 이용한 Rb1 → Rd →F2의 시간에 따른 생전환 경로에 대한 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.

도 8b는 Bgl 3054를 이용한 Rb2 → Rd → F2의 시간에 따른 생전환 경로에 대한 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.

도 8c는 Bgl 3054를 이용한 Rc → Mc1의 시간에 따른 생전환 경로에 대한 HPLC 분석결과를 나타낸 것이다.

<110> Korea ResearchInstitute of Bioscience and Biotechnology <120> Ginsenoside glycosidase from Rhodanobacter ginsenosidimutans KCTC22231T and use thereof <130> PA090249/KR <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl3054 <400> 1 ggcctgggac gccggcgtgc gtccatgatg agaggaaccc caatgaccaa cccgtttccg 60 caggacttcc tttggggcgt ggccaccgca ggccaccagg tggaaggcaa caacgtcaac 120 agcgatgtct ggttcctgga acaccttccg ggcaccattt tcgcggagcc gtccggggat 180 gccgtggacc actaccaccg gtaccgggag gatattgccc tgatcgccgg cctcggtttt 240 accagctacc ggttctccgt ggaatgggcc cggatcgaac cggaggaagg gcatttctcg 300 gtggctgcgc tggaccacta caagcgggtg ctcgaggcct gccgggagca cgggctgacg 360 ccggtggtca cgttccacca tttcgcgtca ccgctgtggc tgctccgttc gggcggctgg 420 gagggcgaac gcacgccgga gctgttcgcc cgctattgcg gccgggtcat ggcgcacctg 480 ggtgacctga tcggcgtcgc ctgcaccctg aacgagccca acctcccttg gctgctggag 540 tcattcggca tcggcgggga agcgccggag aaccgcggca aggtccccat gtgggcggct 600 gccgcacagc gcctgggcgt ggacgccagc acggttgccc cgttccagtt ctgctccacg 660 gaggccggct tcaacgttaa actcgcggcg cacaaggcgg ccaccgaagc aatcaaggca 720 caccgcccgg atctgcgcgt gggctggacc ttggccaact cggacatcca gtcggtcccc 780 ggcggcgaag aaatcgcggc ccaggtgcgc cgggacgtca acgagcggtt cctggaagcc 840 tcccgcggcg acgacttcgt gggcatccag acttacggcc gcaccgtgta cggcccggac 900 ggccacgctc cggctccgga aggcgtggcc gtcaaccaaa tgggcgagga aatctatccg 960 caagcgctgg aggccaccat ccgcgaggcc tggcgcgttg ccggcatccc ggtgatggtc 1020 accgagaacg ggttggccac ggaggatgac acgcagcggg tggcgtacct gcggacggcc 1080 gtcgacggcg ttgcttcctg ccttgcggac ggcatcgacg tccgcgggta catcgcctgg 1140 accgcgttcg ataacttcga gtggatcttc ggctacgggc ccaagttcgg cctgatcgcc 1200 gtcgaccgtt caacccagga acggactccc aaggagagcg cgcgctggct gggcaacttc 1260 gcccggcagc aggcaccggc ggaggcaccg cagcccgcct ga 1302 <210> 2 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Bgl3054 <400> 2 Gly Leu Gly Arg Arg Arg Ala Ser Met Met Arg Gly Thr Pro Met Thr 1 5 10 15 Asn Pro Phe Pro Gln Asp Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr Ala Gly His 20 25 30 Gln Val Glu Gly Asn Asn Val Asn Ser Asp Val Trp Phe Leu Glu His 35 40 45 Leu Pro Gly Thr Ile Phe Ala Glu Pro Ser Gly Asp Ala Val Asp His 50 55 60 Tyr His Arg Tyr Arg Glu Asp Ile Ala Leu Ile Ala Gly Leu Gly Phe 65 70 75 80 Thr Ser Tyr Arg Phe Ser Val Glu Trp Ala Arg Ile Glu Pro Glu Glu 85 90 95 Gly His Phe Ser Val Ala Ala Leu Asp His Tyr Lys Arg Val Leu Glu 100 105 110 Ala Cys Arg Glu His Gly Leu Thr Pro Val Val Thr Phe His His Phe 115 120 125 Ala Ser Pro Leu Trp Leu Leu Arg Ser Gly Gly Trp Glu Gly Glu Arg 130 135 140 Thr Pro Glu Leu Phe Ala Arg Tyr Cys Gly Arg Val Met Ala His Leu 145 150 155 160 Gly Asp Leu Ile Gly Val Ala Cys Thr Leu Asn Glu Pro Asn Leu Pro 165 170 175 Trp Leu Leu Glu Ser Phe Gly Ile Gly Gly Glu Ala Pro Glu Asn Arg 180 185 190 Gly Lys Val Pro Met Trp Ala Ala Ala Ala Gln Arg Leu Gly Val Asp 195 200 205 Ala Ser Thr Val Ala Pro Phe Gln Phe Cys Ser Thr Glu Ala Gly Phe 210 215 220 Asn Val Lys Leu Ala Ala His Lys Ala Ala Thr Glu Ala Ile Lys Ala 225 230 235 240 His Arg Pro Asp Leu Arg Val Gly Trp Thr Leu Ala Asn Ser Asp Ile 245 250 255 Gln Ser Val Pro Gly Gly Glu Glu Ile Ala Ala Gln Val Arg Arg Asp 260 265 270 Val Asn Glu Arg Phe Leu Glu Ala Ser Arg Gly Asp Asp Phe Val Gly 275 280 285 Ile Gln Thr Tyr Gly Arg Thr Val Tyr Gly Pro Asp Gly His Ala Pro 290 295 300 Ala Pro Glu Gly Val Ala Val Asn Gln Met Gly Glu Glu Ile Tyr Pro 305 310 315 320 Gln Ala Leu Glu Ala Thr Ile Arg Glu Ala Trp Arg Val Ala Gly Ile 325 330 335 Pro Val Met Val Thr Glu Asn Gly Leu Ala Thr Glu Asp Asp Thr Gln 340 345 350 Arg Val Ala Tyr Leu Arg Thr Ala Val Asp Gly Val Ala Ser Cys Leu 355 360 365 Ala Asp Gly Ile Asp Val Arg Gly Tyr Ile Ala Trp Thr Ala Phe Asp 370 375 380 Asn Phe Glu Trp Ile Phe Gly Tyr Gly Pro Lys Phe Gly Leu Ile Ala 385 390 395 400 Val Asp Arg Ser Thr Gln Glu Arg Thr Pro Lys Glu Ser Ala Arg Trp 405 410 415 Leu Gly Asn Phe Ala Arg Gln Gln Ala Pro Ala Glu Ala Pro Gln Pro 420 425 430 Ala <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for MUKAN-1 FP-1 <400> 3 ctggtccacc tacaacaaag g 21 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUKAN-1 RP-1 <400> 4 agagattttg agacaggatc cg 22 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pbgl3054-p1 DNA <400> 5 cggatccaat gggcctggga cgccggcgt 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pbgl3054-p1 DNA <400> 6 cggaagcttt caggcgggct gcggtgc 27

Claims

로다노박터 진세노시디뮤탄스(Rhodanobacter ginsenosidimutans) KCTC22231T 유래의 진세노시드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질.
제1항에 있어서, 상기 단백질은 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
제1항의 단백질을 코딩하는 핵산.
제4항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2로 표시되는 핵산.
제4항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2의 서열과 95% 이상의 유사성을 가지고, 진세노시드 글리코시다제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산.
제4항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 벡터는 pHisBGL3054로 도 7에 기재된 개열지도를 갖는 재조합 벡터.
제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제9항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(E.coli)인 형질전환체.
(a) 제9항의 형질전환체를 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 형질전환체로부터 진세노시드 글리코시다제를 생산하는 단 계; 및

(c) 상기 생산된 진세노시드 글리코시다제를 회수하는 단계

를 포함하는 제1항에 따른 진세노시드 글리코시다제의 제조방법.
제1항의 단백질을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로 전환하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 방법은 PPD 타입의 사포닌의 20번째 또는 3번째 탄소를 가수분해하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 전환은 진세노사이드 Rb1 또는 진세노사이드 Rb2로부터 진세노사이드 Rd로의 전환, 진세노사이드 Rd로부터 진세노사이드 F2로의 전환, 및 진세노사이드 Rc로부터 컴파운드 Mc1로의 전환으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 전환은 pH 5.5-7.5 및 온도 30-55 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 단백질을 유효성분으로 포함하는 PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌으로의 전환용 조성물.