KR101427882B1 - 플라보박테리엄 존소니에 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 Ｒｄ 및 Ｆ2의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 인삼사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 F2를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) 유래의 신규한 진세노사이드 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 인삼사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 인삼사포닌인 진세노사이드 Rd 또는 F2로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다.

Description

플라보박테리엄 존소니에 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 이용한 진세노사이드 Ｒｄ 및 Ｆ2의 제조방법{Production of ginsenoside Rd and ginsenoside F2 using novel ginsenside glycosidase derived from Flavobacterium johnsoniae}

본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 인삼사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 F2를 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) 유래의 신규한 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 이용한 것으로, 상기 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 인삼사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 인삼사포닌인 진세노사이드 Rd 또는 F2로의 전환용 조성물, 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체에 관한 것이다.

사포닌은 식물계에 널리 존재하는 배당체에서 당이 아닌 부분이 여러 고리화합물로 이루어진 물질을 의미한다. 인삼 또는 홍삼에 주요 생리활성 성분으로 포함된 사포닌 성분인, 트리테르펜사포닌(triterpene saponin)은 타 식물에서 발견된 사포닌과는 화학 구조가 상이하므로 이러한 인삼 사포닌을 타 식물계 사포닌과 구별하기 위해서 인삼(Ginseng) 배당체(Glycoside)란 의미로 진세노사이드 (Ginsenoside)라고 부른다.

진세노사이드는 아글리콘(aglycone)의 구조에 따라 프로토파낙사이다이올계(Protopanaxadiol-type, PPD 타입) 진세노사이드, 프로토파낙사트라이올계 (Protopanaxatriol-type, PPT 타입) 진세노사이드 및 올레아놀린산계(Oleanolic acid 타입) 진세노사이드의 세 가지로 분류될 수 있다. 이러한 세 그룹은 다시, 화합물 구조 중 고리의 3번 탄소, 6번 탄소 및 20번 탄소 위치에 글리코시딕 결합 (glycosicid bond)에 의해 부착되는 당 부위(아글리콘)(sugar moieties (aglycones))의 위치 및 수에 따라 분류된다. 올레아놀린산계 진세노사이드의 기본골격은 5환상이고, 여기에는 유일하게 진세노사이드 Ro가 있고, 그 아글리콘은 올레아놀릭산(oleanolic acid)이다. 현재, 40여종 이상의 진세노사이드들이 분리되었고, 이들 대부분은 PPD 타입의 진세노사이드이다. PPD 타입의 진세노사이드에는 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII), 화합물 O(Compound O), 화합물 Mc1(Compound Mc1), F2, 화합물 Y(Compound Y), 화합물 Mc(Compound Mc), Rg3, Rh2, C-K가 포함된다. PPT 타입의 진세노사이드에는 Re, Rg1, Rf, Rg2, Rh1 등이 포함된다.

또한, 건삼에서의 진세노사이드의 90% 이상을 차지하는 것은 메이저 진세노사이드이나 이는 1,000 달톤 부근의 큰 사이즈로 인하여 생체 내에서의 흡수율이 매우 낮다. 따라서 진세노사이드의 약효를 증대시키기 위해서 메이저 진세노사이드를 상대적으로 흡수도 잘 되며 약효도 더 뛰어난 마이너 진세노사이드로 전환시키는 과정이 필요하다. 즉, 메이저 진세노사이드는 인 비보(in vivo)에서 효과적으로 생리적 활성을 나타내기 위하여 당을 구성하는 글루코스, 아라비노스, 람노스, 자일로스 등을 제거(deglycosylated)하는 전환과정이 요구된다. 메이저 진세노사이드에는 Rg1, Re, Rb1, Rb2 및 Rc 등이 포함되며, 미량으로 존재하는 생체에 가용성인 마이너 진세노사이드(희귀 진세노사이드)에는 Rd, F2, Rg3, Rh1, Rh2, 지페노사이드(gypenoside,Gyp) XVII, 지페노사이드 LXXV 및 화합물 K, C-K, Mc, Mc1(compound K, C-K, Mc,Mc1)등이 포함된다.

진세노사이드 Rd 및 F2는 항암 효과, 항산화 효과, 동맥경화증 치유, 신경보호효과 등 여러 가지 약제학적 효능을 가지고 있는 것으로 알려졌다. 메이저 진세노사이드 중 Rd는 신경 줄기 세포의 별아교세포로의 분화를 촉진시키고(Shi et al., 2005, Life Sciences 76, 983-995), 저산소증/재산소화에 의한 타이로신 키나아제 단백질의 활성화를 억제하고(Dou et al., 2001, Planta Medica 67, 19-23), 노화-촉진 마우스에서 노화-연관성 산화 손상을 감소시키며 (Yokozawa et al., 2004, Journal of Pharmacy and Pharmacology 56, 107-113), 마우스에서 카인산(kainic acid)-유도 폐사를 감소시키고(Lee et al., 2003, Planta Medica 69, 230-234), 혈관 평활근 세포에서의 수용체- 및 저장-작동적 Ca²⁺ 채널을 통한 칼슘 진입을 차단한다(Guan et al., 2006, European Journal of Pharmacology 548, 129-136).

특히, 마이너 진세노사이드 중 F2는 주로 인삼의 잎에 소량 함유되어 있으나 근에는 극미량 함유되어 있는 진세노사이드로서, 항암효과, 항산화 효과가 알려져 있으며 마이너 진세노사이드 중에서도 그 약리작용이 거의 알려지지 않은 물질이다. 진세노사이드 F2의 알려진 효능으로는 치매의 개선(한국공개특허 제10-2009-0083780호), 유방암 줄기세포에서 자가소화작용(autophagy)을 동반하는 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 통한 항증식 활성(Mai TT et al., Cancer Lett. 2012 Aug 28;321(2):144-53) 및 아토피 피부염에 대한 개선 효과 등이 있다. 이와 같이 F2는 여러 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이지만, 인삼에 미량 존재하므로 이와 같이 미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드를 대량 생산할 수 있는 방법이 필요하다.

미량으로 존재하는 마이너 진세노사이드를 생산하기 위한 방법으로 화학적 분해 방법, 효소적 방법 및 배당체 합성을 이용한 방법 등이 제시되어 왔으나, 상기와 같은 방법들은 1) 제조 공정상 여러 단계를 거쳐야 하거나, 2) 제조과정에서 목적하는 성분이 소실되며, 3) 식용에 부적합한 촉매를 사용하거나, 4) 낮은 수율을 나타내어 여전히 대량생산에 한계가 있었다.

특히 효소적 방법 중, 사용될 수 있는 효소의 종류로 β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase),α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)가 있으며, 이와 같은 효소를 이용한 메이저 진세노사이드의 생전환(biotransformation)에 대해 많은 연구가 있었다. 그러나 이들 역시 대량 생산방법으로서는 효과적이지 못하고, 많은 비용이 발생하는 문제가 있다.

뿐만 아니라, β-글루코시다제(β-glucosidase), α-L-아라비노피라노시다 제(α-L-arabinopyranosidase), α-L-아라비노퓨라노시다제(α-L-arabinofuranosidase), α-L-람노시다제(α-L-rhamnosidase)에 속한다고 해도 모두 메이저 진세노사이드를마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 것은 아니다. 예를 들어, 아스로박터 클로로페노리쿠스(Arthrobacter chlorophenolicus) A6에서 유래한 것으로 알려진 베타 글루코시다제에는 진세노사이드의 생전환 활성이 없음을 확인된 바 있다. 또한, 기존의 알려진 효소들, 예컨대, Rb1으로의 전환능력이 있다고 알려진 효소인 베타-글리코시다제 A는 진세노사이드의 생전환 활성이 있다 하여도 그 활성이 미미하였다. 즉, 상기 효소들은 그 유래 등에 따라 기질 및 최종 산물에 차이가 있다.

또한, 한국등록특허 제10-0329259호는 사포닌 알파-글루코시다제로 PPD 타입진세노사이드의 사포닌 당기를 분해하여 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 발명의 사포닌 알파-글루코시다제는 진세노사이드 Rd를 진세노사이드 F2로 전환시키고, 진세노사이드 F2를 진세노사이드 Rh2로 전환시킨다. 또한, 진세노사이드 Rb1과 Rc로부터 Rh2를 제조할 수도 있다. 그러나 상기 특허의 실시예 3에기재된 바에 따르면 상기 사포닌 알파-글루코시다제는 맥부와 인삼분말이 포함되어 있는 배지에 국균을 넣어서 배양하고 균체를 제거하여 생산해야하는 단점이 있다.따라서, 낮은 수율을 나타내어 대량생산방법으로 효과적이지 못하며 제조원가가 많이 들며, 제조과정 중 목적하는 성분이 소실될 수 있다는 단점이 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼 등의 식물체에 미량으로 존재하는 마이너 형태(minor form)의 희귀 진세노사이드를 용이하게 고수율로 다량 수득하기 위한 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 플라보박테리엄 존소니에 KACC11414^T 균주로부터 메이저 형태의 진세노사이드에서 마이너 진세노사이드로의 생전환 활성을 가지는 진세노사이드 글리코시다제(ginsenoside glycosidase) 유전자를 수득하고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 진세노사이드 글리코시다제가 메이저 진세노사이드인 Rb1 및 지페노사이드 XVII를 각각 Rd 및 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있음을 확인하여 마이너 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 대량생산할 수 있는 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질 전환체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신규한 진세노사이드 글리코시다제(Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "PPD(protopanaxadiol) 타입의 사포닌"은 담마란 (dammarane)계 사포닌으로, 비 당부분(aglycone)에 붙어있는 수산기(-OH)의 숫자가 2개인 진세노사이드를 의미하며, 이의 예로 Rb1, Rb2, Rb3, Rc, Rd, Ra3, Rg3, Rh2, Rs1, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII) 또는 Rs2가 있다. 본 발명의 목적상 PPD 타입의 사포닌은 상기 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의해 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로 전환될 수 있는 사포닌을 모두 포함한다. 본 발명의 실시예에서는 대표적으로 Rb1 및 지페노사이드 XVII가 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제의 활성에 의하여 각각 진세노사이드 Rd 및 진세노사이드 F2로 전환될 수 있음을 확인하였다. 상기 PPD 타입의 사포닌은 바람직하게는 Rb1 또는 지페노사이드 XVII이나, 이에 제한되지 않는다.

상기 PPD 타입의 사포닌은 분리 및 정제된 형태의 사포닌을 이용할 수도 있고, 또는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드들을 이용할 수도 있다. 즉, 사포닌을 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 화기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 Rd"는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소에 글루코스(glucose)가 두 개 결합(glc → glc)되어 있고 20번 탄소에 글루코스(glucose)가 한 개 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 말한다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 F2"는 PPD 타입의 사포닌의 기본 탄소 골격에 있어, 3번 탄소 및 20번 탄소에 글루코스(glucose)가 하나씩 결합되어 있는 형태의 마이너 진세노사이드를 의미하며, 진세노사이드 Rb1 및 지페노사이드 XVII 등에 비하여 당류가 제거되어 체내 흡수가 용이한 형태의 진세노사이드를 말한다. 상기 진세노사이드 F2는 항암, 항산화 효과를 가지므로, 암과 같은 질병의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 물질이나, 미량으로 존재하는 문제가 있다. 따라서 상기와 같은 Rd 및 F2의 유용성에 비추어 대량생산할 필요가 있으며, 이때 진세노사이드 Rd 또는 F2로 전환시킬 수 있는 적절한 효소를 규명해야 한다. 다만, 같은 글리코시다제에 속하는 효소라 하더라도 그 효소 활성이 글루코시다제, 셀룰라제와 같이 다양한 효소 활성을 나타낼 수 있으므로, 진세노사이드 Rd 또는 F2로 전환시키는 활성을 지닌 적절한 효소를 규명해야할 필요성이 있다. 이에 본 발명자들은 이와 같은 활성을 갖는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 동정하여 그 기능을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "진세노사이드 글리코시다제(Ginesenoside glycosidase)"는 이당류 이상의 사슬형 다당류의 글루코시드 분자결합을 가수분해하는 분해하는효소를 의미한다. 진세노사이드 글리코시다제의 활성 정도 및 기능은 효소 종류마다 차이가 있다. 본 발명의 목적상 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로의 전환활성을 갖는 효소이면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 의미할 수 있다. 상기 진세노사이드 글리코시다제는 상기 진세노사이드 글리코시다제를 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 유사성이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 핵산 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 유사성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 플라보박테리엄 존소니에(Flavobacterium johnsoniae) KACC 11414^T에서 유래한 효소로서 베타-글루코시다제(β-glucosidase) 활성을 가져, 두 개의 글루코스 또는 글루코스가 치환된 분자를 연결하는 β1->2, β1->4, β1->6 결합을 분해할 수 있어, 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 Rd 또는 F2로 전환시킬 수 있다. 다만, 베타-글루코시다제 활성을 가지는 효소라고 하여도 모두 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환할 수 있는 활성을 가지고 있는 것은 아니며, 진세노사이드의 특정 탄소에 위치한 어떠한 당기를 자르는 활성을 지니는지 여부는 규명되어야 한다. 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제가 진세노사이드 20번 탄소의 바깥쪽 당기를 잘라 마이너 진세노사이드인 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로 전환시키는 용도는 알려진바 없다.

상기 진세노사이드 글리코시다제는 특히 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소의 바깥쪽 글루코스에 대한 선택적 가수분해능을 가진다. 본 발명의 상기진세노사이드 글리코시다제를 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 제조되는 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법이라면 제한없이 포함될 수 있다. 대표적으로 본 발명의 실시예에서, 진세노사이드 Rb1을 진세노사이드 Rd로 전환하여 진세노사이드 Rd 제조하고, 지페노사이드 XVII을 진세노사이드 F2로 전환하여 진세노사이드 F2를 제조하는 것을 확인하여, PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소의 글루코스에 대한 선택적 가수분해로 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있음을 확인하였다.

구체적으로, 상기 진세노사이드 글리코시다제는 Rb1의 경우, Rb1의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가져 20번 탄소에 위치한 두 개의 글루코스 모이어티(glucose moiety) 중 바깥쪽 글루코스(outer glucose)를 가수분해하여, 진세노사이드 Rd로 전환시킬 수 있으며, 상기 지페노사이드 XVII의 20번 탄소의 두 개의 글루코스 모이어티 중 바깥쪽 글루코스를 가수분해하여, 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 진세노사이드 Rd의 제조는 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd로의 전환 과정을 포함하고, 진세노사이드 F2의 제조는 지페노사이드 XVII로부터 진세노사이드 F2로의 전환 과정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 제조하는 방법은 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하는 단계를 포함한다.

본 발명에서, 용어 "벡터"는 적당한 숙주 세포에서 목적 단백질을 발현할 수있는 발현 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 핵산 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.

본 발명의 형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다.

상기의 방법으로 형질전환된 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질을코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체는 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜서 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있는 활성을 지니며, 바람직하게는 PPD 타입의 사포닌인 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd로 전환활성 또는 지페노사이드 XVII로부터 진세노사이드 F2로 전환시킬 수 있는 활성을 지닌 형질전환체를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 숙주는 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은에스케리키아(Escherichia)속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)같은바실러스(Bacillus)속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)같은 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균; 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae),스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)같은 효모; 동물세포 및 곤충 세포가 있다.

또한, 상기 형질전환체를 배양하여 수득한 배양물을 이용하여 PPD 타입의 사포닌을 전환시켜 진세노사이드 Rd 또는 F2를 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양물"은 상기 형질전환체를 공지된 미생물 배양방법에따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 진세노사이드 글리코시다제를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체의 배양물은 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제를 포함하여, 진세노사이드 Rb1을 진세노사이드 Rd로 전환 또는 지페노사이드 XVII를 진세노사이드 F2로의 전환시킬 수 있는 활성을 가지는 배양물을 의미하나, 이에 제한되지않는다.

본 발명의 실시예에서는 플라보박테리엄 존소니에 KACC 11414^T로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 진세노사이드 글리코시다제를 분리 및 정제하였고, 이를 BglF3로 명명하였다(실시예 1). 상기 BglF3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 2,235bp 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 744개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드를 코딩한다.

또한, BglF3는 베타-글루코시다제의 효소 활성을 지녀, PPD 타입의 진세노사이드인 Rb1의 20번 탄소에 위치한 바깥쪽 글루코스를 분해하여 진세노사이드 Rd로 전환시키고, 지페노사이드 XVII의 20번 탄소에 위치한 바깥쪽 글루코스를 분해하여 진세노사이드 F2로 전환시키는 활성을 지님을 확인함으로써, 20번 탄소에 위치한 글루코스에 대하여 선택적 가수분해능이 있는 것을 확인하였다(도 3a, 3b 및 도 5).

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, PPD 타입의 사포닌의 체내 흡수가 용이한 형태의 가용성 사포닌인 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물을 제공한다.

상기 PPD 타입의 사포닌, 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 형질전환체 또는 이의 배양물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 지니므로 마이너 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2의 생산에 있어 유용하게 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되

는 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을

포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터가 도입된 형질전환체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 코딩하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 핵산을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 진세노사이드 글루코시다제를 코딩하는 핵산은 진세노사이드 글루코시다제의 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 핵산인 한 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 상기 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열뿐만 아니라 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80%이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열로서 실질적으로 진세노사이드 글리코시다제의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다. 상기 유사성은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 진세노사이드를

체내 흡수가 용이한 형태의 가용성인 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있으며, 이 단백질은 활성 및 안정성이 유지될 수 있는 한 다양한 온도 및 pH 조건에서 사용될 수 있으며, ZnCl₂, MnCl₂, CaCl₂, CoCl₂, MgCl₂, EDTA, NaCl, KCl, CuCl₂, SDS, EDTA, DTT 및 머캅토에탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 금속 및 화학 제재를 함께 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다(표 2).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 진세노사이드 글리코시다제의 효소 특성을 분석하여 37℃ 이하에서 효소의 안정성이 탁월하였고, 효소의 활성은 37℃에서 탁월한 반면 45℃에서 35% 감소하였다. 또한, pH 6.0에서 효소 활성이 탁월하였고pH 5.0-8.0에서 효소의 안정성이 80% 이상 유지된 것을 확인하였지만 pH 10.0에서는 효소활성이 95%까지 감소되었고, pH 4.0에서는 30%까지 감소되었다(도 2a 및 2b).

본 발명의 신규한 진세노사이드 글리코시다제는 PPD 타입의 사포닌을 체내 흡수가 용이한 형태인 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2로 전환시키는 우수한 활성을 나타내어, 그 약리 효과가 입증되었음에도 천연에서 미량으로만 생산되어 이용에 제한이 따랐던 마이너 형태의 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 대량으로 생산 및 제조하는데 이용될 수 있다.

도 1은 BglF3 정제를 위한 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것이다.
M, 단백질 분자량 마커; lane 1, 발현이 미유도된 조추출물(uninduced crude extract); lane 2, 발현이 유도된 조추출물(induced crude extract); lane 3, GST-결합 아가로스 레진(GST-bind agarose resin)에 의해 정제된 GST-BglF3 효소분획물; lane 4, 트롬빈(thrombin)에 의해 절단된 GST-BglF3.
도 2a는 BglF3의 pH에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이고, 도 2b는, 온도에 따른 안정성 및 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 재조합 BglF3에 의한 진세노사이드 Rb1(a) 및 지페노사이드 XVII(b)의 생전환 활성을 나타내는 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다. S,사포닌 표준(saponin standards); C-K, 화합물 K(compound K)
도 4는 재조합 BglF3에 의한 진세노사이드 Rb1과 지페노사이드 XVII를 진세노사이드 Rd와 진세노사이드 F2로 각각 생전환하는 반응 경로를 나타내는 모식도이다.
도 5는 재조합 BglF3에 의해 진세노사이드 Rb1(1.0, 2.5 및 5.0 mg/ml)을 진세노사이드 Rd로 생전환하는 활성을 나타내는 TLC 분석 결과이다.
S, 사포닌 표준(saponin standards); C-K, 화합물 K(compound K); 1.0 mg/ml Rb₁ 반응혼합물 : 레인 1, 2; 2.5 mg/ml Rb₁ 반응혼합물: 레인 3, 4, 5, 6; 5.0 mg/ml Rb₁ 반응혼합물: 레인 7, 8, 9, 10, 11; 반응시간: 1, 0.5h; 2, 1.5h; 3, 1h; 4, 3h; 5, 12h; 6, 20h; 7, 1h; 8, 3h; 9, 20h; 10, 48h; 11, 72h.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 실험방법 및 준비

실시예 1-1: 화학물질(chemical) 준비

진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rg1, Rg3(S), F2 및 C-K는 Dalian Green Bio사(Dalian, China)로부터 구입하였으며 진세노사이드 XVII는 An et al(Appl Environ Microbiol 2010;76:5827-5836)에서 기술된 방법으로 본 실험을 위하여 제작하였다. 본 발명에서 사용된 모든 화학물질들은 적어도 분석 시약 등급이었다.

실시예 1-2: 숙주세포, 발현벡터 및 배지

본 발명의 진세노사이드 글리코시다제를 클로닝하기 위하여 플라보박테리엄 존소니에 KACC11414^T를 30℃의 호기성 상태의 R2A agar(BD, USA)에서 배양하였다. 유전자 복제와 발현을 위해 대장균 BL21(Escherichia coli, DE3)과 pGEX 4T-1 플라스미드(GE Healthcare, Waukesha, WI, USA)를 100 mg/L 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB(Luri-Bertani) 배지에 접종하여 배양을 실시하였다.

실시예 1-3: TLC(Thin-layer chromatography)분석

TLC는 용매로서 CHCl₃-CH₃OH-H₂O(70:30:5, vol/vol, lower phase)를 사용하여 60F₂₅₄ 실리카 겔 플레이트(Merck, Germany)를 사용하여 수행하였다. TLC 플레이트 상의 스팟은 10%(vol/vol) H₂SO₄를 가지고 전개시킨 다음, 110℃에서 5분 동안 가열하여 검출하였다.

실시예 2: 신규한 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)의 제조

실시예 2-1: 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 메이저 진세노사이드를 마이너 진세노사이드로 전환시킬 수 있는 신규한 진세노사이드 글리코시다제를 제조하기 위하여, 먼저 플라보박테리엄 존소니에 KACC 11414^T균주로부터 신규한 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)를 규명하였으며,이를 BglF3로 명명하였다.

구체적으로, 플라보박테리엄 존소니에(KACC 11414^T) 균주를 선발하고, 이의 게놈 DNA를 추출하였다. 이의 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 정방향 프라이머(서열번호 3)와 역방향 프라이머(서열번호 4)를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

프라이머	서열(5'->3')	서열번호
정방향 프라이머	CGGGATCCaaaaacaaaatgatatacctttctgc	서열번호 3
역방향 프라이머	CCCCTCGAGttatttaattgtgaagttaatttcc	서열번호 4

상기 반응으로 증폭된 단편을, 글루타티온 S-트랜스퍼라제가 삽입되어 있는 플라스미드 벡터 pGEX4T-1(GE Healthcare, USA)에 EzCloning Kit(Enzynomics)를 이용하여 삽입하여, 본 발명의 재조합 발현 벡터 pGEX-bglF3 진세노사이드 글리코시다제를 제작하였다. 상기 재조합 발현 벡터를 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환(transformation)시켰다.

실시예 2-2: 진세노사이드 글리코시다제(gincenoside glycosidase)의 발현

실시예 2-1의 진세노사이드 글리코시다제를 대량 생산하기 위하여, 상기 형질전환된 균주를 앰피실린(Ampicillin)이 첨가된 LB 배지에서 600㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하고, 흡광도가 0.6일때 최종 0.1mM IPTG (isopropyl beta-D-thiogalactoside) 농도가 되도록 첨가하여 진세노사이드 글리코시다제의 발현을 유도하였다.

18℃에서 24시간 동안 추가로 배양하여 균주가 정체기(staionary phase)에 들었을 때, 균주의 배양액을 10,000xrpm으로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고, 50mM 인산나트륨 버퍼(Sodium phosphate buffer, 5mM EDTA, 1% Triton X-100)로 두 번 세척한 다음, 5mM 인산나트륨버퍼(pH 7.0)에 현탁하였다. 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 12000 x rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리한 다음, 수용성인 진세노사이드 글리코시다제를 진세노사이드 생산에 사용될 수 있는 상등액으로부터 획득하였다. 상기 GST가 융합된 진세노사이드 글리코시다제 단백질을 GST-융합 아가로스 레진(GST-bind agarose resin, resin, Elpis Co. Ltd., Daejeon, Korea)으로 분리 정제하였다. 분리정제된 진세노사이드 글리코시다제를 10% SDS-PAGE 및 EZ-겔 염색용액(EZ-Gel staining solution, Daeillab Co. Ltd., Korea)으로 분석하였다. 이때, 상기 진세노사이드 글리코시다제 BglF3의 아미노산 개수는 744개이며, 상기 Bgl F3의 아미노산 서열을 서열번호 1로 표시하였다. GST fusion 단백질은 약 81.8kDa의 분자량을 나타내었다(도 1).

실시예 3: 진세노사이드 글리코시다제(BglF3) 효소 특성 분석

기질인 PNPG(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside)를 포함하는 50mM 인산 나트륨 버퍼(pH 6.0)를 사용하여 37℃에서 상기 정제된 BglF3의 특이 활성을 측정하였다. 1M Na₂CO₃ 0.1ml로 5분 동안 처리하여 반응을 종료시키고, 405nm에서 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 분비를 즉각적으로 측정하였다. 활성 유닛(one unit of activity)을 분당 p-니트로페놀 1μmol의 분비량으로 정의하였다. 특이 활성은 단백질 밀리그램(milligram)당 유닛으로 발현되었다. Bio-Rad 단백질 분석 염색 시약 프로토콜을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.

정제된 BglF3의 특이활성을 분석하기 위한 표준화 반응 및 효소활성에 대한 pH변화, 온도변화, 금속 및 화학물질의 효과를 측정하였다. 효소의 기질 선호도(substrate preference)는 크로모제닉 o-니트로페닐(ONP, o-nitrophenyl) 및 p-니트로페닐(PNP, p-nitrophenyl)-글리코시드를 사용하여 시험하였다. 동역학 연구(kineitc studies)는 기질로서 p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside와 진세노사이드 Rb1을 0.1mM 이내 5.0mM의 농도 범위에서 사용하여 새롭게 정제한 효소를 가지고 수행하였다. 모든 분석은 세 번 이상 수행하였다. 매개변수(K _m and V _max )는 Wang et al(J Biotechnol 2011;156:125-133.)에 의해 기술된 방법으로 측정하였다.

그 결과, 진세노사이드 글리코시다제(BglF3)는 pH 6.0에서 효소의 활성이 탁월하며 pH 5.0 내지 8.0에서 효소의 안정성을 80% 이상 유지하는 것으로 나타났다. 반면, pH 10.0에서는 효소 활성이 95%까지, pH 4.0에서 30%까지 감소하였다(도 2a). 온도에 따른 영향을 측정한 결과, 본 발명의 진세노사이드 글리코시다제(BglF3)는 37℃에서 최고의 활성을 나타내었으며, 열 안정성 실험 결과 37 ℃ 이하의 온도에서는 안정한 것으로 나타났다. 다만, 45℃에서는 35%의 효소활성을 상실하였다(도 2b).

금속의 진세노사이드 글리코시다제(BglF3) 활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, 금속이온인 DTT 또는 β-mercaptoethanol에는 영향을 받지 않았고, Na⁺, K⁺또는 Mg²⁺에서는 양성효과를 나타낸 반면, 1mM과 10mM의 Mn^{2 +}, Co^{2 +}, Zn^{2 +}, Ca^{2 +}, Cu^{2 +} 또는 Hg²⁺에서는 효소활성이 억제되었다. 또한 EDTA와 SDS도 BglF3의 활성을 억제하였다(표 2).

Metal ions or reagents	Relative activity ±SDa(%)
	1mM	10mM
NaCl	143.9 ± 1.6	108.2 ± 1.5
KCl	128.2 ± 3.5	110.2 ± 1.6
MgCl2	152.6 ± 3.3	112.5 ± 3.4
MnCl2	53.3 ± 1.0	39.7 ± 2.4
CoCl2	58.8 ± 3.5	44.3 ± 2.7
ZnCl2	4.7 ± 1.7	2.9 ± 2.5
CaCl2	92.5 ± 2.6	81.0 ± 1.9
CuCl2	6.3 ± 1.4	6.0 ± 2.0
HgCl2	0	0
SDS	39.9 ± 3.2	1.98 ± 1.7
EDTA	76.4 ± 2.7	69.9 ± 3.7
β-Mercaptoethanol	93.8 ± 1.7	91.9 ± 1.8
DTT	96.0 ± 4.1	97.9 ± 3.4
Control	100 ± 2.6	100 ± 1.5

또한, 본 발명의 재조합 BglF3의 동역학 분석을 수행한 결과, p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside에 대하여 Km 및 Vmax는 각각 0.91±0.02 mM 및 5.75±0.12μmol-min^-1mg of protein^{- 1}였으며, 진세노사이드 Rb1에 대해서는 각각 2.84±0.05mM 및 0.71±0.01μmolmin^-1mg of protein^-1 이었다.

실시예 4: 진세노사이드 글리코시다제 BglF3 의 진세노사이드 특이적 전환 능력 평가 및 분석

진세노사이드 20번 탄소(C-20) 부위에 부착된 글루코스 가수분해에 대한 효소의 특이성 및 선택성을 분석하기 위하여, 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd, 지페노사이드 XVII, Rg3(S), Re, Rg1, F2를 기질로 사용하였다.

50mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.0)에 0.2mg/ml의 농도로 존재하는 BglF3를 상기 9가지 기질이 1.0mg/ml의 농도로 존재하는 50mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.0)와 동량의 부피로 37℃에서 반응시켰다.

또한, BglF3의 분해활성을 측정하기 위하여 0.2mg/ml의 BglF3, 50mM 인산 나트륨 버퍼(pH 7.0) 및 기질인 Rb1(1.0, 2.5 및 5.0mg/ml)을 포함하는 각 반응 혼합물을 37℃에서 배양하였다. 상기 샘플들은 적절한 간격으로 수거하여, 수용액-포화된 부탄올 동량 부피를 첨가함으로써 반응을 종결시켰다. n-부탄올 분획을 건조하여 증발시키고, 잔기를 CH₃OH에 용해시켜 TLC(thin layer chromatography)로 분석하였으며, 그 결과를 도 3 및 5에 각각 나타내었다.

그 결과, 진세노사이드 Rb1의 경우 시간이 경과할수록 진세노사이드 Rd로 더욱더 전환되었고(도 3a), 지페노사이드 XVII의 경우 진세노사이드 F2로 전환되었으며, 4시간 뒤에는 지페노사이드 XVII 모두 진세노사이드 F2로 전환되는 결과를 보였다(도 3b).

이러한 결과는 진세노사이드 Rb1의 경우 진세노사이드 Rb1의 20번 탄소 위치에 존재하는 두 글루코스 모이어티에서 말단 글루코스(outer glucose)가 절단됨으로써 진세노사이드 Rd로 전환되고, 지페노사이드 XVII(Gypenoside XVII, Gyp XVII)의 경우 지페노사이드 XVII의 20번 탄소 위치에 존재하는 두 글루코스 모이어티에서 말단 글루코스(outer glucose)가 절단됨으로써 진세노사이드 F2로 전환되는 것을 나타내는 것이다(도 4).

또한, 산업적인 규모면에서 BglF3 활용가능성을 평가하기 위하여 고농도의 진세노사이드 Rb1을 기질로 사용하였을 때, BglF3에 의한 진세노사이드 Rb1의 진세노사이드 Rd로 전환은 2.5mg/ml 진세노사이드 Rb1에서 20시간 이내에, 5.0mg/ml 진세노사이드 Rb1에서 70시간 이내에, 모두 Rd로 전환되는 결과를 보였다(도 5).

이러한 결과는 본 발명의 진세노사이드 글루코시다제를 이용하여 정제된 진세노사이드 혼합물을 기질로 이용하여 진세노사이드 Rd를 대량생산할 수 있음을 나타내는 것이다.

상기와 같은 결과들은 본 발명의 서열번호 1의 진세노사이드 글리코시다제가 PPD 타입의 사포닌을 효율적으로 전환시켜서 가용성 사포닌인 진세노사이드 Rd 또는 진세노사이드 F2를 효율적으로 제작할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Production of ginsenoside Rd and ginsenoside F2 using novel ginsenside glycosidase derived from Flavobacterium johnsoniae <130> PA120546KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 745 <212> PRT <213> Flavobacterium johnsoniae <400> 1 Met Lys Asn Lys Met Ile Tyr Leu Ser Ala Ala Leu Val Phe Ala Phe 1 5 10 15 Phe Thr Ser Cys Lys Asn Glu Thr Gln Thr Ser Ala Ser Asn Ser Ser 20 25 30 Gln Thr Glu Glu Tyr Val Gly Lys Glu Ile Ser Thr Asp His Asp Ala 35 40 45 Glu Ile Asp Lys Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu Lys Ile Gly 50 55 60 Met Leu His Gly Asn Ser Met Phe Ala Asn Ala Gly Val Lys Arg Leu 65 70 75 80 Gly Ile Pro Glu Leu Lys Met Ala Asp Gly Pro Leu Gly Val Arg Glu 85 90 95 Glu Ile Ser Arg Asp Asn Trp Ala Pro Ala Gly Trp Thr Asn Asp Phe 100 105 110 Ala Thr Tyr Tyr Pro Ala Gly Gly Ala Leu Ala Ala Thr Trp Asn Ala 115 120 125 Glu Met Ala His Thr Phe Gly Thr Ser Leu Gly Glu Glu Leu Arg Ala 130 135 140 Arg Asp Lys Asp Met Leu Leu Ser Pro Ala Ile Asn Met Val Arg Thr 145 150 155 160 Pro Leu Gly Gly Arg Thr Tyr Glu Tyr Met Ser Glu Asp Pro Phe Leu 165 170 175 Asn Lys Lys Ile Ala Val Pro Leu Val Val Gly Leu Gln Glu Lys Asp 180 185 190 Val Met Ala Cys Val Lys His Tyr Ala Ala Asn Asn Gln Glu Thr Asn 195 200 205 Arg Asp Phe Val Asp Val Gln Ile Asp Glu Arg Thr Leu Arg Glu Ile 210 215 220 Tyr Leu Pro Ala Phe Glu Ala Thr Val Lys Glu Ala Lys Ala Tyr Ser 225 230 235 240 Ile Met Gly Ala Tyr Asn Lys Phe Arg Gly Glu Tyr Leu Cys Glu Asn 245 250 255 Asp Tyr Met Leu Asn Lys Ile Leu Arg Asp Glu Trp Gly Phe Lys Gly 260 265 270 Val Val Val Ser Asp Trp Ala Ala Val His Ser Thr Ala Lys Ser Leu 275 280 285 Lys Asn Gly Leu Asp Ile Glu Met Gly Thr Pro Lys Pro Phe Asn Glu 290 295 300 Phe Phe Leu Ala Asp Lys Leu Ile Ala Ala Val Lys Ser Gly Glu Val 305 310 315 320 Ser Glu Lys Glu Ile Asp Leu His Val Lys Arg Ile Leu Arg Val Leu 325 330 335 Phe Gln Val Lys Ala Met Gly Gly Gly Glu Arg Ala Lys Gly Ser Ile 340 345 350 Ala Thr Glu Ala His Tyr Gln Asp Ala Tyr Lys Ile Ala Ala Glu Ala 355 360 365 Ile Ile Leu Leu Lys Asn Glu Asn Asn Ala Leu Pro Leu Lys Leu Asp 370 375 380 Gly Val Lys Ser Ile Ala Val Ile Gly Asn Asn Ala Thr Lys Lys Asn 385 390 395 400 Ala Leu Gly Gly Phe Gly Ala Gly Val Lys Thr Lys Arg Glu Val Thr 405 410 415 Pro Leu Glu Gly Leu Lys Asn Arg Leu Pro Ser Ser Val Lys Ile Asn 420 425 430 Tyr Ala Glu Gly Tyr Leu Glu Lys Tyr Glu Glu Lys Asn Lys Gly Asn 435 440 445 Leu Gly Asn Ile Thr Ser Thr Gly Pro Val Thr Ile Asp Lys Leu Asp 450 455 460 Pro Ala Lys Val Gln Glu Ala Val Glu Ala Ala Lys Lys Ser Asp Val 465 470 475 480 Ala Ile Ile Phe Ala Gly Ser Asn Arg Asp Tyr Glu Thr Glu Ala Ser 485 490 495 Asp Arg Arg Asp Leu His Leu Pro Phe Gly Gln Glu Glu Leu Ile Lys 500 505 510 Lys Val Ile Glu Ala Asn Pro Lys Thr Ile Val Val Met Ile Ala Gly 515 520 525 Ala Pro Phe Asp Leu Asn Glu Val Ser Gln Lys Ser Ser Ala Leu Val 530 535 540 Trp Ser Trp Phe Asn Gly Ser Glu Gly Gly Asn Ala Leu Ala Asp Val 545 550 555 560 Ile Leu Gly Lys Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Trp Thr Met Pro 565 570 575 Lys Gln Leu Lys Asp Ser Pro Ala His Ala Thr Asn Ser Phe Pro Gly 580 585 590 Asp Lys Ala Val Asn Tyr Ala Glu Gly Ile Leu Ile Gly Tyr Arg Trp 595 600 605 Phe Asp Thr Lys Asn Val Ala Pro Leu Tyr Pro Phe Gly Tyr Gly Leu 610 615 620 Ser Tyr Thr Thr Phe Ala Leu Asp Asn Ala Lys Thr Asp Lys Asp Ser 625 630 635 640 Tyr Ala Gln Asn Asp Val Ile Glu Val Thr Val Asp Val Lys Asn Thr 645 650 655 Gly Lys Val Asp Gly Lys Glu Val Val Gln Leu Tyr Thr Ser Lys Ser 660 665 670 Asp Ser Lys Ile Thr Arg Ala Ala Gln Glu Leu Lys Gly Phe Lys Lys 675 680 685 Ala Asp Val Lys Ala Gly Gly Ser Glu Lys Ile Thr Ile Lys Val Pro 690 695 700 Val Lys Glu Leu Ala Tyr Tyr Asp Val Ala Ala Lys Lys Trp Thr Val 705 710 715 720 Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ile Lys Leu Gly Thr Ser Ser Arg Asp Ile 725 730 735 Lys Lys Glu Ile Asn Phe Thr Ile Lys 740 745 <210> 2 <211> 2238 <212> DNA <213> Flavobacterium johnsoniae <400> 2 atgaaaaaca aaatgatata cctttctgca gctttggttt ttgcattttt tacttcttgt 60 aaaaatgaaa cacaaacttc agcttcaaat tccagccaga ctgaagaata cgttgggaaa 120 gaaatcagta cagatcatga tgccgaaatt gacaaactga tttcgcagat gacattagaa 180 gaaaaaatag gaatgctcca cggaaacagc atgtttgcta atgcaggcgt gaaacgttta 240 ggaattccag aattaaaaat ggccgatggg ccattgggag ttcgcgaaga aatttcaaga 300 gacaattggg ctccggcagg atggacaaac gattttgcaa cgtattatcc ggcaggaggt 360 gctttagcag caacttggaa tgcagaaatg gcacatactt tcggaaccag tttaggagaa 420 gaattacgcg caagagacaa agacatgctc ctttcgccag cgatcaatat ggtaagaaca 480 ccgcttggag gaagaacgta cgaatacatg tcggaagatc cgtttttaaa taaaaaaata 540 gctgtgcctt tggttgttgg tttacaagaa aaagatgtaa tggcatgtgt aaaacactat 600 gcagcaaaca atcaggaaac aaatcgtgat tttgtcgatg tacaaattga cgaacgtaca 660 cttcgtgaaa tttatcttcc cgcttttgaa gctactgtaa aagaagcaaa agcatatagt 720 ataatgggcg cttataacaa atttagaggc gaatatttat gtgagaacga ttatatgctg 780 aataaaatcc ttcgtgacga atggggattt aaaggagttg tagtttcaga ttgggctgcg 840 gtgcattcaa cagcaaaatc tttgaaaaat ggtttagata ttgaaatggg aacaccaaaa 900 cctttcaacg aatttttctt agccgataaa ttaattgcag cagtaaaatc tggagaagtt 960 tctgagaaag aaattgatct tcatgtaaaa cgtattttaa gagttttatt tcaagtgaaa 1020 gcaatgggcg gaggcgagcg tgcaaaagga agcatcgcta ccgaagcgca ttaccaagac 1080 gcttacaaaa ttgcagcaga agcaattata ttgttaaaaa acgaaaacaa tgcactgcca 1140 ttaaaattag atggagttaa atctattgct gtaattggaa acaacgcaac aaagaaaaat 1200 gctttgggcg gatttggtgc cggagtaaaa acaaaaagag aagttacacc tcttgaaggt 1260 cttaaaaaca gattgccttc atcagttaaa atcaattatg ctgaaggata tttagagaaa 1320 tatgaggaga aaaataaagg aaatttagga aatattactt ctacaggacc agttacaatt 1380 gacaaattag atcctgcaaa agttcaggaa gctgtagaag ctgctaaaaa atctgatgtt 1440 gccattattt tcgcaggttc aaaccgtgat tacgaaacag aagcttcaga ccgtagagat 1500 ttacacctgc catttggaca agaagaatta atcaaaaaag taatagaggc aaatccaaaa 1560 acgattgtag taatgattgc cggcgctccg tttgatttga atgaagtaag ccagaaatca 1620 tcagctttag tttggagctg gttcaatggt tctgaaggcg gaaatgcttt ggctgatgtt 1680 attttaggaa aagtaaatcc gtcagggaaa ttaccttgga caatgccaaa acaactaaaa 1740 gattctcctg cacacgccac aaacagtttc cctggagaca aagcggttaa ttatgctgaa 1800 ggaatcttaa taggataccg ttggtttgat actaaaaacg tagcaccatt atatcctttt 1860 ggttacggat tatcatacac aactttcgca cttgataatg ccaaaacaga taaagattct 1920 tacgctcaaa acgatgtaat tgaagttacg gttgacgtta aaaacactgg aaaagtagac 1980 ggaaaagaag tagttcagtt gtatacttca aaatctgatt caaaaattac ccgtgcggca 2040 caagaattaa aaggattcaa aaaagcagat gtaaaagctg gcggttcaga aaaaataaca 2100 atcaaagttc cagtaaaaga attggcttac tatgatgttg ctgctaaaaa atggacagtt 2160 gagccaggaa aatatacaat taagttagga acttcttcta gagatattaa aaaggaaatt 2220 aacttcacaa ttaaataa 2238 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 3 cgggatccaa aaacaaaatg atataccttt ctgc 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 4 cccctcgagt tatttaattg tgaagttaat ttcc 34

Claims (8)

1. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 이용하여, 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd, 또는 지페노사이드 XVII로부터 진세노사이드 F2를 제조하는 방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 진세노사이드 글리코시다제 단백질은 PPD 타입의 사포닌의 20번 탄소에 대한 선택적 가수분해능을 가지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
   
3. 삭제
4. 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 진세노사이드 글리코시다제 (Ginsenoside glycosidase) 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터가 도입된 형질전환체, 또는 상기 형질전환체의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 진세노사이드 Rb1으로부터 진세노사이드 Rd, 또는 지페노사이드 XVII로부터 진세노사이드 F2로의 전환용 조성물.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제

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