KR20130105174A

KR20130105174A - 고온성 베타-글루코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드 컴파운드 엠씨, 컴파운드 와이 및 아글리콘 프로토파낙사디올 생산

Info

Publication number: KR20130105174A
Application number: KR1020120027382A
Authority: KR
Inventors: 오덕근; 이기웅
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-16
Filing date: 2012-03-16
Publication date: 2013-09-25
Also published as: KR101392987B1

Abstract

본 발명은 고온성 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 효소를 이용한 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 진세노사이드 컴파운드 와이(Ginsenoside compound Y), 진세노사이드 컴파운드 엠씨(Ginsenoside compound Mc)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고온성 디티오글로무스 툴기둠 (Dictyoglomus turgidum) 유래 베타 글루코시다아제를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이를 형질전환 된 미생물 및 이들을 이용하여 베타 글루코시다아제를 대량으로 얻는 제조방법, 그리고 상기 베타 글루코시다아제를 이용하여 희귀 진세노사이드인 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이, 컴파운드 엠씨를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

고온성 베타-글루코시다아제를 이용한 희귀 진세노사이드 컴파운드 엠씨, 컴파운드 와이 및 아글리콘 프로토파낙사디올 생산{Production of the rare ginsenosides compound Mc, compound Y, aglycon protopanaxadiol by a thermostable beta-glucosidase}

본 발명은 고온성 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 효소를 이용한 희귀 진세노사이드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 진세노사이드 기질과 고온성 디티오글로무스 툴기둠 (Dictyoglomus turgidum) 균주로부터 유래한 것으로 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내는 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용하여 높은 온도에서 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc 및 Rd의 글루코오스(glucose)만을 선택적으로 가수분해하고, 최종적으로 인삼에 존재하지 않는 희귀 진세노사이드인 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운트 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc)의 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

인삼에는 존재하지 않는 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨는 각각 진세노사이드 Rb₁, 진세노사이드 Rb₂ 진세노사이드 Rc에서 생산된다.

진세노사이드 Rb₁은 어글리콘 프로토파낙사디올의 기본 골격구조에 네 개의 글루코오스가 있고 그 부분을 선택적으로 가수분해 하면 어글리콘 프로토파낙사디올(하기 화학식 1 참조)가 만들어질 수 있다. 컴파운드 와이(20(S)-프록토파낙사다이올-20-O-알파-엘-아라비노피라노실 16-베타-디-글루코피라노사이드, 하기 화학식 2 참조)와 컴파운드 엠씨(20(S)-프록토파낙사다이올-20-O-알파-엘-아라비노퓨라노실 16-베타-디-글루코피라노사이드, 하기 화학식 3 참조)는 진세노사이드 Rb₂의 아라비노피라노시드(arabinopyranoside)와, 진세노사이드 Rc의 아라비노퓨라노시드 (arabinofuranoside)가 각각 분해되지 못하고 3번 탄소의 글루코오스가 가수분해 되면서 생산될 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

현재까지 진세노사이드 컴파운드 물질들은 면역 증강, 종양의 혈관신생 억제, 암세포 침윤 억제 및 암세포 증식 억제 등 여러 가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있어 건강식품 산업 분야에 있어서 점점 대량공급이 요구되고 있는 실정이며 따라서 안정적이고 효율적으로 생산할 필요성이 커지고 있다.

거기다 그 중 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올은 당이 글리코실화 되면 여러 가지 주요 진세노사이드 물질이 될 수 있다. 진세노사이드 컴파운드 물질은 온도 10~50℃ 범위의 중온성 효소를 이용하여 생산되고 있지만, 이 효소는 낮은 반응 온도에서 작용하기 때문에 미생물에 오염되기 쉽고 생산 수율도 낮은 문제점이 있다.

뿐만 아니라, 진세노사이드 컴파운드 와이(Y)와 엠씨(Mc)는 염증질환에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 현재까지 그 생산 방법이나 물질의 활성이 보고된 바 없고, 또한 자연계에서의 수득률이 상당히 낮아 이를 이용한 연구실적이 미비하다.

관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020030043168호에는 아스퍼질러스 나이저에서 유래한 셀룰라제, 또는 락타제 조성물 Y-AO를 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법에 관한 것이 기재되어 있고, 그 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은, 인삼에 다량 함유되어 있고 분리하기가 용이한 다이올계 사포닌을 용매에 용해시키고, 아스퍼질러스 나이저에서 분리한 셀룰라제 또는 락타제 조성물 Y-AO와 반응시켜 진세노사이드 컴파운드 케이를 생성하고, 이온교환수지 또는 수포화 부탄올로 용출 후 농축한 다음, 컬럼크로마토그래피로 분리하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법이라고 기재되어 있으며,

또 다른 관련 선행특허로 대한민국특허공개번호 제1020060120932호는 알파-갈락토시다제(α-galactosidase, melibiase)를 다이올(diol)계 진세노사이드(ginsenoside)와 반응시켜 인삼에 미량 존재하는 진세노사이드 F2 또는 인삼에 존재하지 않는 컴파운드(compound) K를 높은 수율로 생산하는 방법에 관한 것으로 보다 상세히는 다이올계 진세노사이드인 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd를 단독 또는 혼합하여 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 및 페니실리움(Penicillium) 속 유래 알파-갈락토시다제와 효소 반응시키는 방법으로 반응조건에 따라 진세노사이드 F2 또는 컴파운드 K를 제조하는 방법이 기재되어 있다.

이에 본 발명자는 희귀 진세노사이드의 전환을 개발하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 고온성 미생물인 디티오글로무스 툴기둠 (Dictyoglomus turgidum) 균주에서 고온성 베타-글루코시다아제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로 형질전환 된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 생산한 다음, 순수 분리된 진세노사이드 Rb1의 글루코오스를 분해하여 진세노사이드 Rd, F₂, 컴파운드 케이를 거쳐 어글리콘 프로토파낙사디올를 제조함과 동시에 진세노사이드 Rb2 및 Rc의 3번 탄소에 붙은 글루코오스 두 분자를 선택적으로 가수분해하여 컴파운드 와이와 엠씨를 제조함으로써 단시간에 고수율로 제조되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명은 고온성 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 함유한 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운트 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc)의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 희귀 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운드 와이(Compound Y), 또는 컴파운드 엠씨(Compound Mc)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서,

상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 서열번호 4에 기재된 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등을 유도하여 본 발명에서 목적하고자 하는 효과를 얻을 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 효소 범위에 포함된다.

또 본 발명은 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서,상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 서열번호 3에 기재된 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등을 유도하여 본 발명에서 목적하고자 하는 효과를 얻을 수 있는 모든 돌연변이체도 본 발명의 유전자 범위에 포함된다.

또 본 발명은 베타-글루코시다아제를 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택된 진세노사이드 또는 이들의 혼합물 또는 미삼 추출물과 반응시켜 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고온성 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 함유한 희귀 진세노사이드(Rare ginsenoside) 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 희귀 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올(Aglycon protopanaxadiol), 컴파운트 와이(Compound Y) 및 컴파운드 엠씨(Compound Mc) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 한다.

통상적으로, 베타-글루코시다아제는 동식물 및 미생물 등에 다양하게 존재하며 글루코시드나 소당류의 글리코시드 결합을 가수분해 하여 당과 어글리콘을 생성하는 효소로, 아릴, 아미노, 알킬기와 붙어있는 글루코시드나 시아노제닉 글루코시드, 그리고 올리고당 혹은 이당류를 가수분해하는 역할을 한다. 또한, 상기 효소는 물질대사의 조절에 있어 탄수화물의 생성이나 파쇄 등의 기본적인 역할을 수행한다(Pack. et al., (2007) J. Microbiol. Biotechnol. 17, 454-460). 이러한 베타 글리코시다아제의 최적 활성온도는 30 ~ 50℃ 이다.

그러나 본 발명의 희귀 진세노사이드 제조용 조성물은 이보다 높은 온도에서 최적의 효소 활성을 나타내는 고온성 베타-글루코시다아제를 함유하며, 이 고온성 베타-글루코시다아제 최적 활성온도가 70~95℃인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제는 고온성 미생물인 디티오글로무스속에 속하는 미생물, 바람직하게는 디티오글로무스 툴기둠 (Dictyoglomus turgidum) 균주로부터 유래한 것으로 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

일반적으로 중온성 베타-글루코시다아제와 본 발명의 디티오글로무스 계열의 균주에서 유래한 베타-글루코시다아제의 차이점은 아미노산의 조성에서 차이가 난다. 중온성의 베타 글루코시다아제는 시스테인 (Cys)의 함량이 낮고 또한 아르기닌/라이신 (Arg/Lys)의 비율이 낮다. 이것은 일반적으로 고온성 효소가 열에 안정함을 설명할 수 있는 대표적인 요인이다 (Themostable -galactosidase from the archaebacterium Sulfolobus solfataricus purification and properties.Eur. J. Biochem 187,321-328 (1990)).

상기 디티오글로무스 툴기둠은 박테리아(Bacteria)계; 디티오글로미(Dictyoglomi)문; 디티오글로미(Dictyoglomi)강; 디티오글로말레스(Dictyoglomales)목; 디티오글로마세에(Dictyoglomaceae)과: 디티오글로무스(Dictyoglomus)속에 속하는 균주로, 상기 디티오글로미강의 미생물은 러시아의 캄차카반도 알칼라인 화산의 온천수에서 자라고 특이한 80 ℃근처에서 최적의 생장을 나타낸다(Svetlichnii, V. A, et al., Mikrobiologiya, 57, 435-441, 1988). 특히 디티오글로무스 툴기둠 균주는 50 ~ 80℃, pH는 5.9 ~ 8.3에서 최적의 생장을 나타내는 혐기성 그람 음성(Anaerobic gram-negative type)으로 알려져 있다(Saiki, A. et al., International Journal of systematic Bacteriology, 35, 253-259, 1985).

상기 디티오글로무스 툴기둠 균주로부터 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제를 수득하는 것은 1) 균주로부터 직접 분리정제하거나, 2) 균주로부터 베타-글루코시다아제 유전자를 클로닝하여 재조합 발현벡터에서 발현시키고 이를 정제하여 수득할 수 있다. 이렇게 미생물로부터 효소를 얻는 과정은 당업계의 통상적인 방법에 의한다(Sambrook, J. and Russell, D.W. Molecular Cloning 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, 2001).

이렇게 수득된 고온성 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 80에서 효소활성 측정시 pH 4.8 내지 6.5의 범위에서 약 60% 이상의 상대활성을 나타내고, pH 5.0내지 5.8의 범위에서 약 80% 이상의 상대활성을 나타내고, pH 5.5 부근에서 최대 상대활성을 나타낸다(도 1a). 또한, pH 5.5에서 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제의 효소활성 측정 시 70 내지 87℃ 범위에서 약 80% 이상의 상대활성을 나타내고, 75 내지 85℃의 범위에서 약 90% 이상의 상대활성을 나타내고, 80 부근에서 최대 상대활성을 나타낸다(도 1b). 또한, 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제의 효소활성의 온도안정성 측정 시, 효소활성 반감기가 온도 70℃에서는 2955분, 75℃는 1402분, 80℃는 682분, 85℃는 112분, 그리고 90℃에서는 25분으로 나타난다.(도 2).

또한, 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제를 함유한 희귀 진세노사이드 제조용 조성물은 인삼의 주요 다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 와 반응시킬 때, 고온 70 내지 95℃에서 반응속도를 빠르게 조절하여 단시간에 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 와이 및 엠씨가 고수율로 생성되는 작용효과를 나타낸다.

본 발명은 고온성 베타-글루코시다아제를 기질로서 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd 이들 중에서 하나 이상 선택되어 혼합된 혼합물을 반응용매 중에서 반응시켜 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 고온성 베타-글루코시다아제는 고온성 미생물인 디티오글로무스(DIctyoglomus)속에 속하는 미생물, 바람직하게는 디티오글로무스 툴기둠 (DIctyoglomus turgidum) 균주로부터 유래한 것으로 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서는, 가) 디티오글로무스 툴기둠 균주의 게놈DNA(genomic DNA)와 서열번호 1 및 2의 프라이머를 가지고 PCR을 실시하여 고온성 베타-글루코시다아제 유전자(서열번호 3)를 포함하는 DNA 절편을 증폭한 다음; 나) 증폭된 고온성 베타-글루코시다아제 유전자를 포함하는 DNA 절편에 제한효소 NdeI 및 XhoI를 처리한 후 플라스미드 벡터 pET-28a(+)에 클로닝하여 재조합 발현 벡터 pET-28a(+)/베타-글루코시다아제를 제작하고; 다) 이를 통상적 형질전환방법으로 대장균 BL21(DE3) ER2566 균주에 형질전환 한 후; 라) 고온성 베타-글루코시다아제 유전자로 형질전환 된 대장균을 배양한 다음 과발현을 유도하여 고온성 베타-글루코시다아제를 생산하고; 및 마) 발현된 고온성 베타-글루코시다아제 효소 단백질을 분리하여 정제한다.

상기에서 베타-글루코시다아제 효소는 상기 베타 글루코시다아제 효소 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환 된 대장균을 배양하고, 베타-글루코시다아제 효소의 발현을 유도하며, 발현된 효소 단백질을 분리 및 정제하는 과정으로 베타-글루코시다아제를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 마) 과정에서 발현된 고온성 베타-글루코시다아제 효소 단백질을 분리하는 과정은, (a) 상기 미생물 배양액을 파쇄하고; (b) 상기 세포 파쇄물을 원심분리하여 상등액을 얻고; (c) 이로부터 얻은 상등액을 여과하는 과정으로 효소액을 분리하여 (d) 분리 히스트랩 어피니티 크로마토그래피 컬럼(Affinity chromatography)으로 흡착시키고 (e) 이미다졸(imidazole)로 일루트(elute)하여 활성 부분을 받아 분리하여 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 과정에서는 상기 미생물 배양액을 50mM 인산염 완충액(50mM phosphate buffer)를 넣고 세포 파쇄기(sonicator)를 사용하여 세포를 파쇄하는 것이 바람직하고, 상기 (c) 과정에서는 0.45㎛ 내외의 여과지 등을 사용하여 여과시키는 것이 바람직하며, 상기 (e) 과정에서는 250mM 이미다졸을 사용하여 Flow를 1mL/min으로 흘려주는 것이 바람직하다.

또한, 상기 베타-글루코시다아제는 기질로서 진세노사이드 Rb1 , Rb2 , Rc, Rd의 다이올계 사포닌을 사용하며, 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨 제조 시 각각 선택되어 혼합된 혼합물을 사용할 수 있다.

이때 반응 용매는 인산염-시트릭산 (phosphate/citrate) 완충액과 같은 완충용액의 고온성 베타-글루코시다아제 효소 및 기질간의 반응은 pH 4.0~8.0, 바람직하게는 pH 4.5~7.0, 보다 바람직하게는 pH 5.5에서 수행하고, 온도 70~98℃, 바람직하게는 70~87℃, 보다 바람직하게는 효소의 온도 안정성을 고려하여 80℃에서 진행하는 것이 바람직하다.

본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 제조방법에 따르면, 고온에서 안정한 한 가지 효소를 이용하여 순수한 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 또는 이들의 혼합물을 사용했을 때 각각 희귀 진세노사이드인 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 와이, 엠시 또는 이들의 혼합물을 제조할 수 있다.

본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 함유한 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨의 제조용 조성물 및 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용한 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이 및 컴파운드 엠씨의 제조방법에 따르면, 고온성 디티오글로무스 툴기둠 (Dictyoglomus turgidum) 균주로부터 유래한 고온성 베타-글루코시다아제가 높은 온도에서도 안정한 활성을 나타내어 반응 속도가 빨라지며, 글루코오스를 제외한 나머지 당에 대해 낮은 기질 특이성으로 인하여 인삼 추출물에 존재하는 주요 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd를 각각 다른 물질로 전환시킴으로써 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운드 와이 그리고 컴파운드 엠씨를 빠르고 선택적으로 생산하여 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 베타-글루코시다아제의 pH(a) 및 온도(b)에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 베타-글루코시다아제의 온도에 대한 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 사용된 베타-글루코시다아제의 진세노사이드 물질과 생성된 진세노사이드 물질의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과와 순수 분리된 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 기질로 하여 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산량을 나타낸 것으로, (a 및 b) 진세노사이드 Rb1의 전환, (c 및 d)는 진세노사이드 Rb2의 전환, (e 및 f)는 진세노사이드 Rc의 전환, (g 및 h)는 진세노사이드 Rd의 전환을 나타낸 그림이다.
도 4는 미삼 추출물을 기질로 하여 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제에 의한 희귀 진세노사이드의 생산량을 나타낸 것이다.(Mc: 진세노사이드 컴파운드 엠씨; Y: 진세노사이드 컴파운드 와이; K: 진세노사이드 컴파운드 케이; APPD: 어글리콘 프로토파낙사다이올)
도 5는 본 발명의 베타-글루코시다아제의 의해 전환되는 진세노사이드를 그림으로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고온성 베타- 글루코시다아제를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 고온성 베타-글루코시다아제를 제조하기 위하여, 먼저 디티오글루머스 툴기둠 균주로부터 유래한 베타-글루코시다아제 유전자를 분리하였다.

구체적으로, 이미 유전자 염기서열과 아미노산 서열이 특정되어 있는 디티오글루머스 툴기둠 균주를 선발하고, 게놈 DNA를 추출하였다. 또한, 이 균주의 베타-글루코시다아제 유전자의 염기서열 [서열목록 참조; 진뱅크 수탁번호 YP_002352162(Genebank Accession No. YP_002352162)]을 기초로 하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 정방향 및 역방향의 두 개의 프라이머를 각각 제작하였다.

그 다음 상기 게놈 DNA 및 프라이머들을 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 실시하여 베타-글루코시다아제의 해당 유전자(서열번호 3)의 염기서열을 증폭하였다. 상기 과정으로 증폭된 베타-글루코시다아제 유전자 절편을 제한효소 NdeI 및 XhoI을 사용하여 플라스미드 벡터 pET-28a(+)(Novagen사)에 삽입하는 과정으로 본 발명의 재조합 발현 벡터 pET-28a(+)/베타-글루코시다아제를 제작하였다.

또한 상기와 같이 제작한 재조합 발현 벡터는 통상적인 형질전환 방법에 의하여 대장균 BL21(DE3) ER2566 균주에 형질전환 하였으며, 상기 형질전환된 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-28a(+)/베타-글루코시다아제 균주로 명명하였다. 또한 상기 형질전환 된 대장균은 20% 글리세린(glycerine) 용액을 첨가하여 배양을 실시하기 전에 냉동 보관하였다.

실시예 2:고온성 베타- 글루코시다아제의 발현

본 발명에서는 베타-글루코시다아제를 대량 생산하기 위하여, 냉동 보관된 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-28a(+)/베타-글루코시다아제 균주를 LB 배지 50ml 가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여 600nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕 배양기에서 진탕 배양하였다. 그 다음 상기 배양액을 다시 LB 배지 500ml가 들어있는 2L의 삼각 플라스크에 첨가하여 600nm에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하고 상기 과정 중에서 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 조정하였다. 여기에 0.1mM IPTG(isopropyl-beta-thiogalactoside)를 첨가하여 상기 과발현된 효소의 생산을 유도하였으며 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하였다.

또한 상기와 같이 생산된 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 정제하기 위하여, 상기 형질전환 된 균주의 배양액을 4,000g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리하고 100mM 인산염-시트릭산 완충용액 (phosphate/citrate buffer, pH 5.5)을 첨가하여 상기 세포 용액을 파쇄기(sonicator)로 파쇄하였다. 상기 세포 파쇄물은 다시 13,000xg 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 분리 히스트랩 어피니티 크로마토그래피 컬럼으로 흡착시키고 이미다졸로 일루트하여 활성 부분을 받아 분리하여 희귀 진세노사이드의 생산에 사용될 수 있는 효소액으로 분리하였다.

실시예 3:고온성 베타- 글루코시다아제의 pH 및 온도 변화에 따른 활성도 조사

본 발명에서는 상기 실시예 1-(2)에서 분리한 고온성 베타-글루코시다아제가 인삼에 주로 존재하는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd에 미치는 영향을 다음과 같이 확인하였다.

가. 고온성 베타- 글루코시다아제의 효소 활성 측정

본 발명에서는 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드(pNPGlc)을 기질로 사용하여 측정하였다. 구체적으로, 상기 반응 전에 1.0 mM ,4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드, 50 mM 인산염-시트릭산 완충용액(pH 5.5) 및 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 희석하여 총 부피 200㎕이 되게 섞은 다음 온도 80℃에서 10분 동안 반응을 진행시켰다. 여기에 다시 2M 탄산나트륨을 첨가하여 상기 반응을 정지시켰다. 이때 사용된 4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드의 양과 효소 반응으로 인하여 생성된 4-니트로페놀 양은 420 nm에서의 흡광도를 측정하여 산정하였고, 효소 단위(Unit)는 1 마이크로몰(mole)의 4-니트로페놀을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. 또한, 효소의 단백질 농도는 소혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 기준으로 한 브래드포드(Bradford) 방법을 사용하여 산정하였다.

나. 고온성 베타- 글루코시다아제에 대한 pH 효과 조사

먼저 상기 효소에 대한 pH 효과를 조사하기 위하여, 진세노사이드 기질 Rd를2차 증류수에 녹인 후 0.4 단위(units)/ml 효소가 함유된 인산염/시트릭산 완충용액을 pH 4.0에서부터 8.0까지의 범위에서 반응시켰다. 이때, 상기 반응은 온도 80℃에서 10분 동안 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시키고 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 도 1a에 나타난 바와 같이, 최적 pH는 5.5인 것을 확인할 수 있었다.

다. 고온성 베타- 글루코시다아제에 대한 온도 효과 조사

또한 상기 효소에 대한 온도 효과를 조사하기 위하여, 온도 70에서 90℃까지의 범위에서 진세노사이드 기질 Rd와 0.4 단위(units)/ml의 효소가 함유된 인산염/시트릭산 완충용액(pH 5.5)을 사용하여 각각 10분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음, n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시키고 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과 도 1b에 나타난 바와 같이, 최적 온도는 80℃인 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 베타-글루코시다아제의 pH(A) 및 온도(B)에 따른 효소 활성도를 비교하여 나타낸 것이다.

라. 고온성 베타- 글루코시다아제의 온도 안정성 조사

본 발명에서는 고온성 베타-글루코시다아제의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 온도 70에서 90℃까지의 범위에서 진세노사이드 기질 Rd와 0.4 단위(units)/ml의 효소가 함유된 인산칼륨/시트릭산 완충용액(pH 5.5)을 사용하여 각각 효소 활성이 절반으로 줄어드는 시간까지 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 다음, n-부탄올을 처리하여 반응을 종료시키고 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 측정하였다.

도 2는 본 발명의 베타-글루코시다아제의 온도 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다. 상기 도 2의 그래프에서 온도 표기는 70℃ (●),75℃ (○), 80℃ (▲), 85℃ (△), 및 90℃ (■)로 각각 나타내었다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 온도 70℃에서는 2955분, 75℃는 1402분, 80℃는 682분, 85℃는 112분, 그리고 90℃에서는 25분 경과 시 상기 효소 활성이 절반으로 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

마. 고온성 베타- 글루코시다아제가 순수 분리된 진세노사이드 Rb ₁ , Rb ₂ , Rc 및 Rd 에 미치는 활성 조사

상기 본 발명의 고온성 베타-글루코시다아제 효소가 순수 분리된 진세노사이드 Rb₁, Rb₂, Rc 및 Rd와 반응할 때 관찰되는 영향을 조사하기 위하여, 기질로 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 각각 0.5mg/ml씩 사용하였다. 또한, 상기 효소는 0.4단위(Unit)/ml씩 Rd는 1.6단위(Unit)/ml이 사용되었으며, 온도 80℃에서 각각 6,8,8 그리고 12시간 동안 진행시켰다. 반응이 끝나면 n-부탄올을 첨가하여 반응을 종료시키고, 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소의 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb₁은 진세노사이드 Rd, F₂, 컴파운드 케이를 거쳐 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol)로(도 3a와 b 참조), 진세노사이드 Rb₂는 컴파운드 와이(Y)로(도 3c 및 d 참조), 진세노사이드 Rc는 컴파운드 엠씨(Mc)로(도 3e 및 f 참조), 진세노사이드 Rd는 F₂를 거쳐 컴파운드 케이와 컴파운드 케이를 거쳐 프로토파낙사다이올로 각각 전환되는 것을 확인하였다(도 3g 및 h 참조).

실시예 4:고온성 베타- 글루코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 생산

본 발명에서는 상기 고온성 베타-글루코시다아제 효소를 이용한 희귀 진세노사이드의 생산 방법을 개발하기 위하여, 상기 효소의 최적 pH (pH 5.5) 및 효소활성이 절반으로 줄어든 시간을 고려한 온도(80℃)에서 각각 순수 기질인 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd 0.4단위(Unit)/ml, 1.6단위(Unit)/ml를 가지고 각각 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올 0.25mg/ml, 컴파운드 와이 0.40mg/ml 및 컴파운드 엠씨 0.32mg/ml을 생산하였다. 그리고 미삼 추출물(농도 10%)과 효소 6.4단위(Unit)/ml을 가지고 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올, 컴파운트 와이, 컴파운드 엠씨의 시간별 생산량을 측정하였다.

현재까지 희귀 진세노사이드를 생산한 사례로는 설포로버스 엑시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)의 베타-글리코시다아제가 있다.

엑시도칼다리우스(Sulfolobus acidocaldarius)의 베타-글리코시다아제는 각각 Rb₁, Rb₂, Rc, Rd을 반응하였을 때 각각 컴파운드 케이 0.53 mg/ml(94%), 컴파운드 와이 0.56 mg/ml (80%) 및 컴파운드 엠씨 0.70 (100%) mg/ml을 생산하였다.

그러나 본 발명에 따른 고온성 베타-글루코시다아제를 사용하면 각각 Rb1, Rb2, Rc, Rd 0.5mg/ml을 사용했을 때 어글리콘 프로토파낙사디올 0.25mg/ml(95%), 컴파운드 와이 0.40mg/ml(99%) 및 컴파운드 엠씨 0.32mg/ml(94%) 를 생산할 수 있다. 그리고 미삼추출물로 전환된 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올 1.17mg/ml(60%), 컴파운드 와이 0.76mg/ml(93%) 및 컴파운드 엠씨 0.88mg/ml(99%)를 생산할 수 있으며, 더욱이 한 가지 효소를 사용하여 진세노사이드 어글리콘 프로토파낙사디올 , 컴파운드 와이, 컴파운드 엠씨를 생산한 것은 보고된 바 없다.

따라서 본 발명의 디티오글로무스로부터 분리한 베타-글루코시다아제가 희귀 진세노사이드 생산에 우수한 효과를 나타냄을 알 수 있다.

이상, 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점을 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Production of the rare ginsenosides compound Mc, compound Y, aglycon protopanaxadiol by a thermostable beta-glucosidase <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 gctagcatga gtgtggatat aaaaaagctc a 31 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 ctcgagttag ctattaagtt ctctcagtag gt 32 <210> 3 <211> 2250 <212> DNA <213> Dictyoglomus turgidum <400> 3 atgagtgtgg atataaaaaa gctcatatct caaatgaccc ttgaggaaaa ggcaagcctt 60 tgttctgggc ttgacttttg gcatacaaaa cccattgaaa gacttggaat accatctata 120 agaatgtcgg atggtcctca tggacttaga aaagaagaaa ccatgtttag taagactgtt 180 cctgctacat gcttccctac tgctgtaact attgcagcat cctgggataa atcccttgct 240 gagaagatgg gaaaggctat tggcgaagaa tgccaggctg aaaatgtaca aatactcctt 300 ggacctggag ttaacataaa aagatctccc ctttgtggaa gaaactttga atactactct 360 gaagatccac tccttgcagg agaacttgca gcccatttta ttaagggagt acaaagtgag 420 ggagtaggaa cttctcttaa acattttgca gcaaacaacc aagaacatag aaggcttact 480 gtaaatgcca tcattgacga gagaaccttg agagagattt atctttctgc ctttgagagg 540 gcagtaaaag aggcaaaacc atggaccgtt atgtgctcat acaatagagt aaatgggact 600 tatgcatcag agaatgaatt tcttctcaca aaggtattga aagaagaatg gggatttgaa 660 ggatttgtag tatccgattg gggagcagta aatgataggg taatgggact ttctgcagga 720 cttgatcttc aaatgcctta tgatggtgga tatggagaca aaaagatcat tgaggcagta 780 aaaagtggaa aaattcctga ggaggttctt gatagggctg tagaaagaat tcttaggatt 840 gtattcaagg caatagaaaa caaaaaagaa aatgccacct atgacaagga aactcatcat 900 aaaattgcaa gagagattgc aagggaatgt tttgtgcttc tcaaaaatga aggggacatt 960 cttccactga aaaaagaagg aaagattgca ttaataggag cctttgctaa gaaccctcaa 1020 atacaaggag gaggaagtgc ccatgtaaat ccaaccatgg tagatgatgc agtagaagag 1080 ataagaaaga tggtagaagg aaaggcagag attctttatg ccgatggata tcatatagaa 1140 aaggatgagg tagatgaaag acttatagag gaggcaaaag aggttgcaaa ggtagcggat 1200 gtggtggtaa tttttgcagg acttcccgaa agatacgaat cggaaggctt tgacaggcct 1260 cacatgaaga tgcctgaaag ccacaatagg ctaatagaag aaatctcaaa ggtaaatgaa 1320 aatcttgtgg tggtacttag caatggagca cctatagaga tgccatggtt agagaagcca 1380 aaggcaatcc ttgagaccta cagaggagga caagcctggg gaggagcagt tgcagatgtt 1440 ctttttggag tagtaagtcc ttctggaaag cttccagaga cctttccaaa gaagctaagt 1500 gataatccgt cttacttatt cttcccaggg gaggatgacc gagtagagta cagggaaggg 1560 atatttgtag gatataggta ttatgataag aaggagatgg aagtattgtt tccctttgga 1620 tatggtcttt cctatactac ctttgagtat tcagacttaa agcttgacaa gaaagagatg 1680 agagatgatg aagtacttaa ggtaagtgtg aaggtaaaga atacggggaa ggtaaaaggt 1740 aaagaagtag tgcagttata tgtgagggat gtggaaagta gctatataag gcctgagaag 1800 gagctaaagg gatttgagaa ggtagagctt gagccaggag aagaaaagga agtagtgttt 1860 tatcttgata agagggcttt tgccttctat aacatagaca taaaggattg gtatgtggag 1920 gatggagatt ttgagatatt aattgggaag tcatcaaggg atattgtgct aagggataaa 1980 gtatttgtta agtctaccac aaagataaag agaacttacc atattaattc tactattggg 2040 gatattatga gggaccctat agcatgggag aagtttaagg atatactaca gcagtttgca 2100 agtgcctttc ctgccttttc atcggaagaa gcaatcatga actttgcaga gatgatgaaa 2160 tacatgcctc ttcgaagcct tattcacttt ggtcaaggaa aaatcacacc agaaatagta 2220 gaaaacctac tgagagaact taatagctaa 2250 <210> 4 <211> 749 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 4 Met Ser Val Asp Ile Lys Lys Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Asp Phe Trp His Thr Lys Pro Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Ile Arg Met Ser Asp Gly Pro His Gly 35 40 45 Leu Arg Lys Glu Glu Thr Met Phe Ser Lys Thr Val Pro Ala Thr Cys 50 55 60 Phe Pro Thr Ala Val Thr Ile Ala Ala Ser Trp Asp Lys Ser Leu Ala 65 70 75 80 Glu Lys Met Gly Lys Ala Ile Gly Glu Glu Cys Gln Ala Glu Asn Val 85 90 95 Gln Ile Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg Ser Pro Leu Cys 100 105 110 Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ala Gly Glu 115 120 125 Leu Ala Ala His Phe Ile Lys Gly Val Gln Ser Glu Gly Val Gly Thr 130 135 140 Ser Leu Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu His Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 Val Asn Ala Ile Ile Asp Glu Arg Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Glu Arg Ala Val Lys Glu Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys 180 185 190 Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Thr Tyr Ala Ser Glu Asn Glu Phe Leu 195 200 205 Leu Thr Lys Val Leu Lys Glu Glu Trp Gly Phe Glu Gly Phe Val Val 210 215 220 Ser Asp Trp Gly Ala Val Asn Asp Arg Val Met Gly Leu Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Asp Leu Gln Met Pro Tyr Asp Gly Gly Tyr Gly Asp Lys Lys Ile 245 250 255 Ile Glu Ala Val Lys Ser Gly Lys Ile Pro Glu Glu Val Leu Asp Arg 260 265 270 Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ile Val Phe Lys Ala Ile Glu Asn Lys 275 280 285 Lys Glu Asn Ala Thr Tyr Asp Lys Glu Thr His His Lys Ile Ala Arg 290 295 300 Glu Ile Ala Arg Glu Cys Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Asp Ile 305 310 315 320 Leu Pro Leu Lys Lys Glu Gly Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Phe Ala 325 330 335 Lys Asn Pro Gln Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala His Val Asn Pro Thr 340 345 350 Met Val Asp Asp Ala Val Glu Glu Ile Arg Lys Met Val Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Glu Ile Leu Tyr Ala Asp Gly Tyr His Ile Glu Lys Asp Glu Val 370 375 380 Asp Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Lys Glu Val Ala Lys Val Ala Asp 385 390 395 400 Val Val Val Ile Phe Ala Gly Leu Pro Glu Arg Tyr Glu Ser Glu Gly 405 410 415 Phe Asp Arg Pro His Met Lys Met Pro Glu Ser His Asn Arg Leu Ile 420 425 430 Glu Glu Ile Ser Lys Val Asn Glu Asn Leu Val Val Val Leu Ser Asn 435 440 445 Gly Ala Pro Ile Glu Met Pro Trp Leu Glu Lys Pro Lys Ala Ile Leu 450 455 460 Glu Thr Tyr Arg Gly Gly Gln Ala Trp Gly Gly Ala Val Ala Asp Val 465 470 475 480 Leu Phe Gly Val Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Pro Glu Thr Phe Pro 485 490 495 Lys Lys Leu Ser Asp Asn Pro Ser Tyr Leu Phe Phe Pro Gly Glu Asp 500 505 510 Asp Arg Val Glu Tyr Arg Glu Gly Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr 515 520 525 Asp Lys Lys Glu Met Glu Val Leu Phe Pro Phe Gly Tyr Gly Leu Ser 530 535 540 Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Ser Asp Leu Lys Leu Asp Lys Lys Glu Met 545 550 555 560 Arg Asp Asp Glu Val Leu Lys Val Ser Val Lys Val Lys Asn Thr Gly 565 570 575 Lys Val Lys Gly Lys Glu Val Val Gln Leu Tyr Val Arg Asp Val Glu 580 585 590 Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Glu Lys Glu Leu Lys Gly Phe Glu Lys Val 595 600 605 Glu Leu Glu Pro Gly Glu Glu Lys Glu Val Val Phe Tyr Leu Asp Lys 610 615 620 Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Asn Ile Asp Ile Lys Asp Trp Tyr Val Glu 625 630 635 640 Asp Gly Asp Phe Glu Ile Leu Ile Gly Lys Ser Ser Arg Asp Ile Val 645 650 655 Leu Arg Asp Lys Val Phe Val Lys Ser Thr Thr Lys Ile Lys Arg Thr 660 665 670 Tyr His Ile Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ile Met Arg Asp Pro Ile Ala 675 680 685 Trp Glu Lys Phe Lys Asp Ile Leu Gln Gln Phe Ala Ser Ala Phe Pro 690 695 700 Ala Phe Ser Ser Glu Glu Ala Ile Met Asn Phe Ala Glu Met Met Lys 705 710 715 720 Tyr Met Pro Leu Arg Ser Leu Ile His Phe Gly Gln Gly Lys Ile Thr 725 730 735 Pro Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Arg Glu Leu Asn Ser 740 745

Claims

베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 유효성분으로 포함하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운드 와이(Compound Y), 또는 컴파운드 엠씨(Compound Mc)인 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 희귀 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운드 와이(Compound Y), 또는 컴파운드 엠씨(Compound Mc)인 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드 제조용 조성물.
베타-글루코시다아제를 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, 및 Rd로 구성된 군으로부터 선택된 진세노사이드 또는 이들의 혼합물 또는 미삼 추출물과 반응시켜 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 희귀 진세노사이드는 어글리콘 프로토파낙사디올(aglycon protopanaxadiol), 컴파운드 와이(Compound Y), 또는 컴파운드 엠씨(Compound Mc)인 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.
제 7항에 있어서,
상기 반응은 70 내지 95℃ 범위에서 수행되는 것을 특징으로 하는 희귀 진세노사이드를 제조하는 방법.