KR101919091B1 - 혼합 효소를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물 및 이를 이용한 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물 및 이를 이용한 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법에 관한 것이다.

Description

혼합 효소를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물 및 이를 이용한 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법{COMPOSITION FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXATRIOL COMPRISING MIXED ENZYME AND METHOD FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXATRIOL USING THE SAME}

본 발명은 혼합 효소를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물 및 이를 이용한 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법에 관한 것이다.

현재까지 어글리콘 프로토파낙사트리올은 면역 증강, 염증 완화, 암세포 침윤 억제 및 암세포 증식 억제 등 여러 가지 우수한 효능을 지니고 있는 것으로 알려져 있으나 제조방법이 거의 개발되지 않아 산업화에 한계가 있어 왔는바, 안정적이고 효율적인 제조방법에 대한 필요성이 커지고 있는 실정이다.

이러한 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법에 대한 종래 기술로, 대한민국 등록특허 제10-1408985호에서는 페니실리움 아귤레툼(Penicillium aculeatum) 균주 유래 β-글루코시다아제를 처리함으로써 어글리콘 프로토파낙사트리올을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 Rh1을 기질로 하는 경우에 한해, 어글리콘 프로토파낙사트리올의 제조가 가능하다는 한계가 있다.

그밖에 일부 고온균 유래 β-글리코시다아제를 처리하여 어글리콘 프로토파낙사트리올을 제조하는 방법이 공지되어 있지만, 프로토파낙사트리올계 진세노사이드에 대한 어글리콘 프로토파낙사트리올의 수율이 80%를 넘지 못하는 한계가 있다.

본 발명은 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제; 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus ; Pf) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물을 제공한다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 2:3(w/v:w/v) 내지 100:3(w/v:w/v)일 수 있다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 0.25 mg/ml 내지 16.0 mg/ml일 수 있다.

상기 조성물은 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.

상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법을 제공한다.

상기 기질은 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 포함할 수 있다.

상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml일 수 있다.

상기 처리는 pH 4.5~7.0 및 70~100℃ 조건에서, 1시간 이상 수행되는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 혼합 효소로서 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 β-글리코시다아제를 최적 조성비로 이용함으로써, 70℃ 이상의 고온 반응을 통해 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시키면서, 동시에, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있는바, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 실시예 2에서 준비한 혼합 효소액을 기질로서, (a) 진세노사이드 Re 및 (b) 인삼잎 추출물 각각에 처리한 결과, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 실시예 3에서 준비한 혼합 효소액을 기질로서, (a) 진세노사이드 Re 및 (b) 프로토파낙사트리올계 사포닌 함유 인삼잎 추출물 각각에 처리한 결과, 진세노사이드 Re의 최적 농도 및 인삼잎 추출물 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예 4에서 준비한 혼합 효소액을 기질로서, (a) 진세노사이드 Re 및 (b) 인삼잎 추출물 각각에 처리한 결과, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 실시예 5에서 준비한 혼합 효소액을 기질로서, (a) 진세노사이드 Re 및 (b) 인삼잎 추출물 각각에 처리한 결과, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

본 발명자들은 어글리콘 프로토파낙사트리올의 신규 제조방법에 대한 지속적인 연구를 수행한 결과, 고온성 미생물인 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum; Dt) 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus; Pf) 유래 β-글리코시다아제를 클로닝하여 재조합 발현 벡터 및 이로부터 형질전환된 미생물을 제작하고, 이를 이용하여 효소액을 각각 생산한 다음, 효소들을 최적 조성비로 함유하는 혼합 효소액을 기질에 처리함으로써 어글리콘 프로토파낙사트리올을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본원 명세서 내 "어글리콘 프로토파낙사트리올(Aglycone protopanaxatriol; APPT)"또는 "진세노사이드 APPT"라 함은 하기 화학식 1로 표시된다:

[화학식 1]

상기 어글리콘 프로토파낙사트리올은 인삼 사포닌의 장내 세균 대사산물로서, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf, 진세노사이드 F1 등의 프로토파낙사트리올계 사포닌에서 람노오스 또는 글루코오스 부분이 가수분해되어 생성될 수 있다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제; 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus ; Pf) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물을 제공한다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 3로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 이때 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제의 최적 활성 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.5 내지 6.5이고, 최적 활성 온도는 70℃ 이상, 바람직하게 75℃ 내지 85℃이다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 높은 생산성으로 어글리콘 프로토파낙사트리올을 제조하기 위한 역할을 한다.

또한, 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미하며, 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 4로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 산물일 수 있다. 이때 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 활성 pH는 4.5 내지 7.0, 바람직하게 5.0 내지 6.0이고, 최적 활성 온도는 70℃ 이상, 바람직하게 90℃ 내지 100℃이다. 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제는 프로토파낙사트리올계 사포닌, 특히, 진세노사이드 Re에서 람노오스 또는 글루코오스 부분을 효과적으로 가수분해시켜 높은 수율로 어글리콘 프로토파낙사트리올을 제조하기 위한 역할을 한다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Dt 유래 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 Dt 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 또는 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하고, 미생물 내에서 과발현된 Pf 유래 β-글리코시다아제를 수득하여 사용하는 것이 바람직하며, 구체적으로 수득된 Pf 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하여 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 재조합 벡터로서, 유전자 재조합을 위하여 당업계에서 사용되고 있는 플라스미드 벡터라면 어느 벡터를 사용해도 무방하고, 구체적으로 pET-24a(+) 또는 pET-24a 플라스미드를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 형질전환된 미생물로서, 재조합 벡터로 형질전환하여 목적하는 단백질을 과발현하는 시스템으로 당업계에 사용되고 있는 미생물이라면 어느 미생물을 사용해도 무방하고, 구체적으로 대장균 BL21(DE3) 균주를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제를 추가로 분리 및 정제하는 과정은 ⅰ) 상기 미생물의 배양액 내 세포를 파쇄하는 단계; ⅱ) 상기 세포 파쇄물을 1차 원심분리하여 1차 상등액을 얻는 단계; ⅲ) 상기 1차 상등액을 고온 열처리한 후 2차 원심분리하여 2차 상등액을 얻는 단계; 및 ⅳ) 상기 2차 상등액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, ⅰ) 단계에서 파쇄는 프렌치 프레서 등 당업계 공지된 기기를 사용하여 15,000 lb/in² 내외의 범위에서 수행될 수 있고, ⅲ) 단계에서 고온 열처리는 70 및 10분 내외로 수행될 수 있으며, ⅳ) 단계에서 여과는 0.45 ㎛ 내외의 여과지를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 2:3(w/v:w/v) 내지 100:3(w/v:w/v)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 2:3(w/v:w/v) 내지 4:1(w/v:w/v)인 것이 보다 바람직하고, 인삼잎 추출물을 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비는 4:1(w/v:w/v) 내지 100:3(w/v:w/v)인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제는 이러한 최적 조성비를 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다. 이때, Pf 유래 β-글리코시다아제의 함량이 너무 적은 경우에는, 프로토파낙사트리올계 사포닌, 특히, 진세노사이드 Re에서 람노오스 또는 글루코오스 부분을 효과적으로 가수분해시킬 수 없는 한계가 있어 어글리콘 프로토파낙사트리올의 제조에 수율이 저하(80% 미만)되는 문제점이 있고, Dt 유래 β-글리코시다아제의 함량이 너무 적은 경우에는, 어글리콘 프로토파낙사트리올의 제조에 생산성이 저하되는 문제점이 있다.

또한, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 0.25 mg/ml 내지 16.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 4.0 mg/ml 내지 8.0 mg/ml인 것이 보다 바람직하고, 인삼잎 추출물을 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 6.0 mg/ml 내지 16.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제는 이러한 총 농도를 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.

이때, 총 농도라 함은 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제의 농도(w/v)와 Pf 유래 β-글리코시다아제의 농도(w/v)를 합한 값이다.

또한, 상기 조성물은 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다. 구체적으로 상기 기질은 진세사이드 Re를 단독으로 포함할 수도 있고, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물일 수 있다. 구체적으로, 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼의 열매, 뿌리, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명에서는 삼 추출물로, 프로포타낙사트리올계 사포닌을 다량 함유하는 인삼잎 추출물을 사용하였는바, 일반적으로 버려지는 인삼잎을 재활용할 수 있다는 측면에서 경제적인 이점을 가진다.

상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml일 수 있다. 구체적으로, 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 기질 내 진세노사이드 Re의 최적 농도는 1.0 mg/ml인 것이 바람직하고, 프로토파낙사트리올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물을 기질로 사용한 경우, 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도 역시 1.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도를 상기 범위 내로 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum ; Dt) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자; 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus ; Pf) 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물을 제공한다.

상기 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.

또한, 상기 Pf 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 것뿐만 아니라, 이의 기능적 동등물, 즉, 상기 서열에 하나 이상의 치환, 결손 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적을 달성하는 모든 돌연변이체를 포함하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법은 상기 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함한다.

상기 조성물은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 Pf 유래 β-글리코시다아제를 포함하거나, 서열번호 3으로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 Pf 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 포함하는 것으로, 구체적인 내용에 대해서는 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명에 따른 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법에서 사용되는 상기 기질은 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로 진세사이드 Re를 단독으로 포함하는 기질을 사용할 수도 있고, 진세노사이드 Re, 진세노사이드 Rg1, 진세노사이드 Rg2, 진세노사이드 Rh1, 진세노사이드 Rf 및 진세노사이드 F1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사트리올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물을 기질로 사용할 수도 있다.

구체적으로, 삼 추출물은 인삼, 홍삼, 미삼, 백삼, 피직삼 및 곡삼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 삼의 열매, 뿌리, 줄기 또는 잎을 을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 본 발명에서는 삼 추출물로, 프로포타낙사트리올계 사포닌을 다량 함유하는 인삼잎 추출물을 사용하였는바, 일반적으로 버려지는 인삼잎을 재활용할 수 있다는 측면에서 경제적인 이점을 가진다.

상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml일 수 있다. 구체적으로, 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 기질 내 진세노사이드 Re의 최적 농도는 1.0 mg/ml인 것이 바람직하고, 프로토파낙사트리올계 사포닌을 함유하는 삼 추출물을 기질로 사용한 경우, 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도 역시 1.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도를 상기 범위 내로 유지함으로써, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.

상기 처리는 pH 4.5~7.0 및 70~100℃ 조건에서, 1시간 이상 수행될 수 있다. 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 5.0~6.5인 것이 바람직하고, pH 5.5~6.0인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 75~100℃인 것이 바람직하고, 80℃인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 조건을 유지함으로써, 사용되는 효소들을 모두 최적으로 활성화시킬 수 있어, 최종적으로 어글리콘 프로토파낙사트리올을 고생산성 및 고수율로 제조할 수 있다.

또한, 상기 처리는 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 1시간 내지 4시간인 것이 바람직하고, 프로토파낙사트리올계 사포닌을 함유하는 인삼잎 추출물을 기질로 사용한 경우, 1시간 내지 11시간인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 처리를 위한 반응시간 내에서, 기질 내 진세노사이드 Re 또는 프로토파낙사트리올계 사포닌은 어글리콘 프로토파낙사트리올로 모두 전환될 수 있다. 이때, 상기 처리를 위한 반응시간이 상기 범위 미만인 경우에는 어글리콘 프로토파낙사트리올의 생산성이 너무 낮은 문제점이 있고, 상기 처리를 위한 반응시간이 상기 범위를 초과하더라도 어글리콘 프로포파낙사트리올의 생산성은 크게 증가하지 아니하므로 공정 효율이 저하되는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따르면, 혼합 효소로서 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 균주 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 균주 유래 β-글리코시다아제를 최적 조성비로 이용함으로써, 70℃ 이상의 고온 반응을 통해 반응 배지에서 다양한 오염원을 배제시키면서, 동시에, 어글리콘 프로토파낙사트리올을 높은 생산성과 높은 수율로 제조할 수 있는 바, 의약, 식품 및 화장품 등 다양한 산업 분야에서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 딕티오클로무스 툴기듐 (Dictyoglomus turgidum; Dt ) 유래 β-글리코시다아제 및 파이로코커스 퓨리오서스( Pyrococcus furiosus; Pf ) 유래 β-글리코시다아제의 발현

(1) 재조합 발현 벡터 및 형질전환 미생물의 제작

본 발명에서는 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제를 제조하기 위하여, 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)의 유전자로부터 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 분리하고, 이를 과발현하기 위한 재조합 발현 벡터를 제작하였다.

구체적으로, Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자(Genebank 번호: YP002352162, 서열번호 3) 및 Pf 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자(Genebank 번호: AAC25555, 서열번호 4)를 증폭하기 위한 적절한 프라이머를 제작하였다. 그리고, 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum) 및 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)를 각각 배양하여 이로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 추출한 각각의 유전체 DNA로부터 적절한 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 Dt 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자 및 Pf 유래 β-글리코시다아제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다. 재조합 발현 벡터는 pET-24a(+) 및 pET-24a를 사용하였으며, 제한효소 없이 ligation하여 제작한 재조합 발현 벡터를 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-24a/β-글리코시다아제로 명명하였다.

그런 다음, pET-24a(+)/β-글리코시다아제 및 pET-24a/β-글리코시다아제를 대장균 BL21(DE3) ER2566에 형질전환하고, 형질전환된 재조합 대장균은 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/β-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a/β-글리코시다아제 균주로 명명하였다. 형질전환된 재조합 대장균은 진세노사이드 ATTP의 제조를 위한 배양을 실시하기 전에는 20% 글리세린 용액을 첨가하여 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

(2) Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 발현 및 정제

효소들의 단백질 발현을 위하여, (1)에서 냉동 보관된 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a(+)/베타-글리코시다아제 균주와 E. coli BL21(DE3) ER2566 pET-24a/베타-글리코시다아제 균주를 각각 LB 배지 50 ㎖가 들어있는 250 ㎖의 플라스크에 접종하여 600 ㎚에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 37℃의 진탕배양기에서 진탕 배양하였다. 그 다음 배양액을 다시 LB 배지 500 ㎖가 들어있는 2ℓ의 삼각 플라스크에 첨가하여 600 ㎚에서의 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하였고, 이때, 교반 속도는 200 rpm, 배양 온도는 37℃로 조정하였다. 여기에 0.1 mM IPTG(isopropyl-beta-thiogalactoside)를 첨가하여 단백질이 과발현된 효소들의 제조를 유도하였으며 교반 속도는 150 rpm, 배양 온도는 16℃로 조정하였다.

이후 이러한 효소들을 정제하기 위하여, 형질전환된 균주들의 배양액을 4,000×g 로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 다음 상기 세포 용액을 프렌치 프레서로 15,000 lb/in²에서 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 다시 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 고온인 75℃에서 10분 동안 열처리한 다음, 이로부터 얻은 열 처리물을 13,000×g 로 4℃에서 20분 동안 다시 원심분리하였다. 그 결과 얻은 상등액은 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 진세노사이드 APPT의 제조에 사용될 수 있는 효소액으로 준비하였다.

실시예 2: Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비 확인

본 발명에서는 진세노사이드 APPT를 제조함에 있어, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비를 확인하기 위해, 기질로서, 진세노사이드 Re 0.4 mg/ml 및 프로토파낙사트리올계 사포닌 1.0 mg/ml가 함유된 인삼잎 추출물 각각에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0) 및 혼합 효소액을 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이때, Dt 유래 β-글리코시다아제(농도 범위: 0.0~6.0 mg/ml) 및 Pf 유래 β-글리코시다아제(농도 범위: 1.0~0.0 mg/ml)의 조성비를 다양하게 하여 준비하였다.

도 1은 실시예 2에서 준비한 혼합 효소액을 기질로서, (a) 진세노사이드 Re 및 (b) 인삼잎 추출물 각각에 처리한 결과, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 1(a)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Re를 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비는 0.6 mg/ml:0.9 mg/ml 내지 2.4 mg/ml:0.6 mg/ml, 바람직하게 1.2 mg/ml:0.8 mg/ml인 것으로 확인된다. 또한, 도 1(b)에 나타난 바와 같이, 인삼잎 추출물을 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 조성비는 4.0 mg/ml:1.0 mg/ml 내지 6.4 mg/ml:0.25 mg/ml, 바람직하게 5.6 mg/ml:0.5 mg/ml인 것으로 확인된다.

실시예 3: 기질 내 진세노사이드 Re 또는 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도 확인

본 발명에서는 진세노사이드 APPT를 제조함에 있어, 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도를 확인하기 위해, 먼저, 진세노사이드 Re에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 1.2 mg/ml 및 Pf 유래 β-글리코시다아제 0.8 mg/ml을 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이때, 기질 내 진세노사이드 Re의 농도(0.0~2.0 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.

도 2(a)는 실시예 3에서 준비한 혼합 효소액을 진세노사이드 Re에 처리한 결과, 진세노사이드 Re의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2(a)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Re를 기질로 이용한 경우, 기질 내 진세노사이드 Re의 최적 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml, 바람직하게 1.0 mg/ml인 것으로 확인된다.

다음으로, 인삼잎 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 1.2 mg/ml 및 Pf 유래 β-글리코시다아제 0.8 mg/ml을 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이때, 인삼잎 추출물 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도(0.0~2.0 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.

도 2(b)는 실시예 3에서 준비한 혼합 효소액을 인삼잎 추출물에 처리한 결과, 인삼잎 추출물 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 2(b)에 나타난 바와 같이, 프로토파낙사트리올계 사포닌 함유 인삼잎 추출물을 기질로 이용한 경우, 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 최적 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml, 바람직하게 1.0 mg/ml인 것으로 확인된다.

실시예 4: Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도 확인

본 발명에서는 진세노사이드 APPT를 제조함에 있어, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도를 확인하기 위해, 진세노사이드 Re 1.0 mg/ml에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비를 3:2로 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이때, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도(0.0~8.0 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.

도 3(a)는 실시예 4에서 준비한 혼합 효소액을 진세노사이드 Re에 처리한 결과, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3(a)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Re를 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도는 4.0 mg/ml(2.4 mg/ml 및 1.6 mg/ml)인 것으로 확인된다.

다음으로, 프로토파낙사트리올계 사포닌 1.0 mg/ml 함유 인삼잎 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 조성비를 56:5로 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 10분 동안 열처리하였다. 이때, Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도(0.0~15.25 mg/ml)를 다양하게 하여 준비하였다.

도 3(b)는 실시예 4에서 준비한 혼합 효소액을 인삼잎 추출물에 처리한 결과, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3(b)에 나타난 바와 같이, 인삼잎 추출물을 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액 내 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 최적 총 농도는 15.25 mg/ml(14.0 mg/ml 및 1.25 mg/ml)인 것으로 확인된다.

실시예 5: 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간 확인

본 발명에서는 진세노사이드 APPT를 제조함에 있어, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인하기 위해, 진세노사이드 Re 1.0 mg/ml에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 2.4 mg/ml 및 Pf 유래 β-글리코시다아제 1.6 mg/ml를 포함하는 혼합 효소액을 80℃ 조건에서 4시간 동안 열처리하였다.

도 4(a)는 실시예 5에서 준비한 혼합 효소액을 진세노사이드 Re에 처리한 결과, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4(a)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Re를 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간은 1 시간 이상, 바람직하게 4 시간인 것으로 확인된다.

다음으로, 프로토파낙사트리올계 사포닌 1.0 mg/ml 함유 인삼잎 추출물에, 50 mM 시트레이트/포스페이트(citrate/phosphate) 완충용액(pH 6.0)과, Dt 유래 β-글리코시다아제 14.0 mg/ml 및 Pf 유래 β-글리코시다아제 1.25 mg/ml를 포함하는 혼합 효소액을 80℃에서 12시간 동안 열처리하였다.

도 4(b)는 실시예 5에서 준비한 혼합 효소액을 인삼잎 추출물에 처리한 결과, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4(b)에 나타난 바와 같이, 인삼잎 추출물을 기질로 이용한 경우, 혼합 효소액을 기질에 처리하는 최적 시간은 1 시간 이상, 바람직하게 7 시간 이상, 보다 바람직하게 11시간인 것으로 확인된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXATRIOL COMPRISING MIXED ENZYME AND METHOD FOR PRODUCING AGLYCONE PROTOPANAXATRIOL USING THE SAME <130> 1062061 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 749 <212> PRT <213> Dictyoglomus turgidum <400> 1 Met Ser Val Asp Ile Lys Lys Leu Ile Ser Gln Met Thr Leu Glu Glu 1 5 10 15 Lys Ala Ser Leu Cys Ser Gly Leu Asp Phe Trp His Thr Lys Pro Ile 20 25 30 Glu Arg Leu Gly Ile Pro Ser Ile Arg Met Ser Asp Gly Pro His Gly 35 40 45 Leu Arg Lys Glu Glu Thr Met Phe Ser Lys Thr Val Pro Ala Thr Cys 50 55 60 Phe Pro Thr Ala Val Thr Ile Ala Ala Ser Trp Asp Lys Ser Leu Ala 65 70 75 80 Glu Lys Met Gly Lys Ala Ile Gly Glu Glu Cys Gln Ala Glu Asn Val 85 90 95 Gln Ile Leu Leu Gly Pro Gly Val Asn Ile Lys Arg Ser Pro Leu Cys 100 105 110 Gly Arg Asn Phe Glu Tyr Tyr Ser Glu Asp Pro Leu Leu Ala Gly Glu 115 120 125 Leu Ala Ala His Phe Ile Lys Gly Val Gln Ser Glu Gly Val Gly Thr 130 135 140 Ser Leu Lys His Phe Ala Ala Asn Asn Gln Glu His Arg Arg Leu Thr 145 150 155 160 Val Asn Ala Ile Ile Asp Glu Arg Thr Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Glu Arg Ala Val Lys Glu Ala Lys Pro Trp Thr Val Met Cys 180 185 190 Ser Tyr Asn Arg Val Asn Gly Thr Tyr Ala Ser Glu Asn Glu Phe Leu 195 200 205 Leu Thr Lys Val Leu Lys Glu Glu Trp Gly Phe Glu Gly Phe Val Val 210 215 220 Ser Asp Trp Gly Ala Val Asn Asp Arg Val Met Gly Leu Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Asp Leu Gln Met Pro Tyr Asp Gly Gly Tyr Gly Asp Lys Lys Ile 245 250 255 Ile Glu Ala Val Lys Ser Gly Lys Ile Pro Glu Glu Val Leu Asp Arg 260 265 270 Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ile Val Phe Lys Ala Ile Glu Asn Lys 275 280 285 Lys Glu Asn Ala Thr Tyr Asp Lys Glu Thr His His Lys Ile Ala Arg 290 295 300 Glu Ile Ala Arg Glu Cys Phe Val Leu Leu Lys Asn Glu Gly Asp Ile 305 310 315 320 Leu Pro Leu Lys Lys Glu Gly Lys Ile Ala Leu Ile Gly Ala Phe Ala 325 330 335 Lys Asn Pro Gln Ile Gln Gly Gly Gly Ser Ala His Val Asn Pro Thr 340 345 350 Met Val Asp Asp Ala Val Glu Glu Ile Arg Lys Met Val Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Glu Ile Leu Tyr Ala Asp Gly Tyr His Ile Glu Lys Asp Glu Val 370 375 380 Asp Glu Arg Leu Ile Glu Glu Ala Lys Glu Val Ala Lys Val Ala Asp 385 390 395 400 Val Val Val Ile Phe Ala Gly Leu Pro Glu Arg Tyr Glu Ser Glu Gly 405 410 415 Phe Asp Arg Pro His Met Lys Met Pro Glu Ser His Asn Arg Leu Ile 420 425 430 Glu Glu Ile Ser Lys Val Asn Glu Asn Leu Val Val Val Leu Ser Asn 435 440 445 Gly Ala Pro Ile Glu Met Pro Trp Leu Glu Lys Pro Lys Ala Ile Leu 450 455 460 Glu Thr Tyr Arg Gly Gly Gln Ala Trp Gly Gly Ala Val Ala Asp Val 465 470 475 480 Leu Phe Gly Val Val Ser Pro Ser Gly Lys Leu Pro Glu Thr Phe Pro 485 490 495 Lys Lys Leu Ser Asp Asn Pro Ser Tyr Leu Phe Phe Pro Gly Glu Asp 500 505 510 Asp Arg Val Glu Tyr Arg Glu Gly Ile Phe Val Gly Tyr Arg Tyr Tyr 515 520 525 Asp Lys Lys Glu Met Glu Val Leu Phe Pro Phe Gly Tyr Gly Leu Ser 530 535 540 Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Ser Asp Leu Lys Leu Asp Lys Lys Glu Met 545 550 555 560 Arg Asp Asp Glu Val Leu Lys Val Ser Val Lys Val Lys Asn Thr Gly 565 570 575 Lys Val Lys Gly Lys Glu Val Val Gln Leu Tyr Val Arg Asp Val Glu 580 585 590 Ser Ser Tyr Ile Arg Pro Glu Lys Glu Leu Lys Gly Phe Glu Lys Val 595 600 605 Glu Leu Glu Pro Gly Glu Glu Lys Glu Val Val Phe Tyr Leu Asp Lys 610 615 620 Arg Ala Phe Ala Phe Tyr Asn Ile Asp Ile Lys Asp Trp Tyr Val Glu 625 630 635 640 Asp Gly Asp Phe Glu Ile Leu Ile Gly Lys Ser Ser Arg Asp Ile Val 645 650 655 Leu Arg Asp Lys Val Phe Val Lys Ser Thr Thr Lys Ile Lys Arg Thr 660 665 670 Tyr His Ile Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ile Met Arg Asp Pro Ile Ala 675 680 685 Trp Glu Lys Phe Lys Asp Ile Leu Gln Gln Phe Ala Ser Ala Phe Pro 690 695 700 Ala Phe Ser Ser Glu Glu Ala Ile Met Asn Phe Ala Glu Met Met Lys 705 710 715 720 Tyr Met Pro Leu Arg Ser Leu Ile His Phe Gly Gln Gly Lys Ile Thr 725 730 735 Pro Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Arg Glu Leu Asn Ser 740 745 <210> 2 <211> 472 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 2 Met Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly Phe 1 5 10 15 Gln Phe Glu Met Gly Leu Pro Gly Ser Glu Val Glu Ser Asp Trp Trp 20 25 30 Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser Gly 35 40 45 Asp Leu Pro Glu Asn Gly Pro Ala Tyr Trp His Leu Tyr Lys Gln Asp 50 55 60 His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly Ile 65 70 75 80 Glu Trp Ala Arg Ile Phe Pro Lys Pro Thr Phe Asp Val Lys Val Asp 85 90 95 Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro Glu 100 105 110 Ser Thr Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ile Ala Asn Met Glu Ala Leu Glu 115 120 125 His Tyr Arg Lys Ile Tyr Ser Asp Trp Lys Glu Arg Gly Lys Thr Phe 130 135 140 Ile Leu Asn Leu Tyr His Trp Pro Leu Pro Leu Trp Ile His Asp Pro 145 150 155 160 Ile Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp Leu 165 170 175 Asp Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala 180 185 190 Tyr His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu Pro 195 200 205 Asn Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe Pro 210 215 220 Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn Leu 225 230 235 240 Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser Glu 245 250 255 Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu Ala 260 265 270 Glu Glu Tyr Lys Asp Glu Val Glu Glu Ile Arg Lys Lys Asp Tyr Glu 275 280 285 Phe Val Thr Ile Leu His Ser Lys Gly Lys Leu Asp Trp Ile Gly Val 290 295 300 Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu Val 305 310 315 320 Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala Lys 325 330 335 Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu Gly 340 345 350 Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro Met 355 360 365 Ile Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg Pro 370 375 380 His Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys Glu 385 390 395 400 Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn Tyr 405 410 415 Glu Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val Asp 420 425 430 Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe Arg 435 440 445 Glu Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu Ala 450 455 460 Asp Leu Lys Phe Val Thr Arg Lys 465 470 <210> 3 <211> 2250 <212> DNA <213> Dictyoglomus turgidum <400> 3 atgagtgtgg atataaaaaa gctcatatct caaatgaccc ttgaggaaaa ggcaagcctt 60 tgttctgggc ttgacttttg gcatacaaaa cccattgaaa gacttggaat accatctata 120 agaatgtcgg atggtcctca tggacttaga aaagaagaaa ccatgtttag taagactgtt 180 cctgctacat gcttccctac tgctgtaact attgcagcat cctgggataa atcccttgct 240 gagaagatgg gaaaggctat tggcgaagaa tgccaggctg aaaatgtaca aatactcctt 300 ggacctggag ttaacataaa aagatctccc ctttgtggaa gaaactttga atactactct 360 gaagatccac tccttgcagg agaacttgca gcccatttta ttaagggagt acaaagtgag 420 ggagtaggaa cttctcttaa acattttgca gcaaacaacc aagaacatag aaggcttact 480 gtaaatgcca tcattgacga gagaaccttg agagagattt atctttctgc ctttgagagg 540 gcagtaaaag aggcaaaacc atggaccgtt atgtgctcat acaatagagt aaatgggact 600 tatgcatcag agaatgaatt tcttctcaca aaggtattga 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catgtttgga tattcttggt ctggtttcca gtttgagatg 60 ggactgccag gaagtgaagt ggaaagcgac tggtgggtgt gggttcacga caaggagaac 120 atagcatcag gtctagtaag tggagatcta ccagagaacg gcccagcata ttggcacctc 180 tataagcaag atcatgacat tgcagaaaag ctaggaatgg attgtattag aggtggcatt 240 gagtgggcaa gaatttttcc aaagccaaca tttgacgtta aagttgatgt ggaaaaggat 300 gaagaaggca acataatttc cgtagacgtt ccagagagta caataaaaga gctagagaaa 360 attgccaaca tggaggccct tgaacattat cgcaagattt actcagactg gaaggagagg 420 ggcaaaacct tcatattaaa cctctaccac tggcctcttc cattatggat tcatgaccca 480 attgcagtaa ggaaacttgg cccggatagg gctcctgcag gatggttaga tgagaagaca 540 gtggtagagt ttgtgaagtt tgccgccttc gttgcttatc accttgatga cctcgttgac 600 atgtggagca caatgaacga accaaacgta gtctacaatc aaggttacat taatctacgt 660 tcaggatttc caccaggata tctaagcttt gaagcagcag aaaaggcaaa attcaactta 720 attcaggctc acatcggagc atatgatgcc ataaaagagt attcagaaaa atccgtggga 780 gtgatatacg cctttgcttg gcacgatcct ctagcggagg agtataagga tgaagtagag 840 gaaatcagaa agaaagacta tgagtttgta acaattctac 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Claims (10)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum; Dt) 유래 β-글리코시다아제; 및
   서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 이루어진 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus; Pf) 유래 β-글리코시다아제를 포함하는
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물로서,
   상기 조성물은 진세노사이드 Re 또는 인삼잎 추출물을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것이며,
   상기 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β글리코시다아제 및 Pf 유래 β글리코시다아제의 조성비는, 2:3(w/v:w/v) 내지 4:1(w/v:w/v)이고,
   상기 인삼잎 추출물을 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β글리코시다아제 및 Pf 유래 β글리코시다아제의 조성비는, 4:1(w/v:w/v) 내지 64:2.5 (w/v:w/v)인 것을 특징으로 하는,
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   상기 Dt 유래 β-글리코시다아제 및 Pf 유래 β-글리코시다아제의 총 농도는 0.25 mg/ml 내지 16.0 mg/ml인
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml인
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물.
   
6. 서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 딕티오클로무스 툴기듐(Dictyoglomus turgidum; Dt) 유래 β글리코시다아제; 및
   서열번호 4로 기재되는 염기 서열로 이루어진 유전자로부터 발현된 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus; Pf) 유래 β글리코시다아제를 포함하는 어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물로서,
   상기 조성물은 진세노사이드 Re 또는 인삼잎 추출물을 포함하는 기질에 처리하기 위한 것이며,
   상기 진세노사이드 Re를 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β글리코시다아제 및 Pf 유래 β글리코시다아제의 조성비는, 2:3(w/v:w/v) 내지 4:1(w/v:w/v)이고,
   상기 인삼잎 추출물을 기질로 사용한 경우, 상기 Dt 유래 β글리코시다아제 및 Pf 유래 β글리코시다아제의 조성비는, 4:1(w/v:w/v) 내지 64:2.5 (w/v:w/v)인 것을 특징으로 하는,
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조용 조성물.
   
7. 제1항, 제3항, 제5항, 제6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 기질에 처리하는 단계를 포함하는
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법.
   
8. 삭제
9. 제7항에 있어서,
   상기 기질 내 프로토파낙사트리올계 사포닌의 농도는 0.5 mg/ml 내지 2.0 mg/ml인
   어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 처리는 pH 4.5~7.0 및 70~100℃ 조건에서, 1시간 이상 수행되는 것인
    어글리콘 프로토파낙사트리올 제조방법.

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