CN109790553B - 芝麻素酚或芝麻素酚糖苷的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于寻求一种芝麻素酚糖苷及芝麻素酚的新的制造方法。本发明提供一种芝麻素酚糖苷及/或芝麻素酚的制造方法，其包括切断芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键的步骤。

Description

芝麻素酚或芝麻素酚糖苷的生产方法

技术领域

本发明涉及芝麻素酚或芝麻素酚糖苷的生产方法。

背景技术

芝麻(Sesamum indicum)是芝麻科芝麻属的一年生植物。芝麻是具有约6000年历史的最古老的栽培油料植物，可在世界各地栽培。已知芝麻自古以来即为贵重食品，是有益于健康的食品。尤其，芝麻的种子、由芝麻种子制得的油、芝麻种子的萃取物被广泛利用。芝麻种子所含的成分约50％为脂质，其主要成分为以油酸及亚油酸为主体的甘油三酯。此外，含有作为芝麻种子中的特殊成分的芝麻木脂素。

木脂素为植物的二次代谢物，为2分子的具有C₆C₃骨架的苯丙素类化合物主要经由其8-8′位聚合(8,8′-键)而成的化合物。木脂素被认为有助于植物中的活体防御机构。芝麻中所含的木脂素被称为芝麻木脂素，有芝麻素、芝麻素酚、芝麻林素、松脂及芝麻林素酚(非专利文献1)。为芝麻木脂素之一的芝麻素，具有多彩的生理活性，从芝麻种子或芝麻种子的榨粕中分离精制的方法已经实用化。

已知几种芝麻木脂素作为糖苷而存在于植物中。在芝麻木脂素中芝麻素酚具有高抗氧化活性。芝麻素酚在芝麻种子中以芝麻素酚糖苷存在，就芝麻素酚糖苷来说，有芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚单葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄葡萄糖苷，SDG(1,6))以及芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)等。

此外，芝麻素酚也可在芝麻油的精制步骤中通过酸催化剂反应而由芝麻林素生成。芝麻素酚具有强抗氧化活性，且被报导具有对健康有益的生理活性(非专利文献2)。芝麻素酚的生理活性通过除去糖部分的糖苷配基而发挥。

此外，芝麻油制造时产生的芝麻榨粕虽含有芝麻素酚糖苷，却未被有效灵活应用。如果能将芝麻素酚糖苷水解得到为糖苷配基的芝麻素酚，则能够以廉价的芝麻榨粕为原料生产芝麻素酚。作为从芝麻素酚糖苷取得芝麻素酚的方法，已开发使用真菌曲霉(Aspergillus)属微生物的方法(专利文献1)，或使用芽孢杆菌属及肠球菌属菌的混合培养物的发酵法(专利文献2)。然而，这些方法为使芝麻素酚糖苷完全分解而需要长时间等，因而效率低。此外作为从芝麻素酚糖苷中取得芝麻素酚的方法，揭示使用源自属于类芽孢杆菌(Paenibacillus)属的细菌KB0549株的β-葡萄糖苷酶的方法(专利文献3，非专利文献3)。该酶将芝麻素酚糖苷的β-1,2-糖苷键及β-1,6-糖苷键以及芝麻素酚-葡萄糖间β-糖苷键切断。在以STG为底物的情况下，β-1,2-糖苷键比β-1,6-糖苷键优先水解。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2005-23125

专利文献2：日本特开2006-61115

专利文献3：日本特开2008-167712

非专利文献

非专利文献1：Biochemical Systematics and Ecology 13,133-139(1985)

非专利文献2：J.Agric.Food Chem.,64,4908-4913(2016)

非专利文献3：PLOS ONE,8,e60538(2013)

发明内容

在如上状况下，寻求芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的新的生产方法。

本发明人等为解决上述课题而重复深入研究的结果，发现来自曲菌的为糖苷水解酶的AOBGL11p具有将芝麻素酚三葡萄糖苷水解而生成芝麻素酚及芝麻素酚糖苷的活性等，从而完成了本发明。

即本发明如下。

(1)一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的制造方法，其特征在于，包括以下步骤，即，使选自以下(a)～(c)中的蛋白质与具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷反应，而使底物芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的步骤：

(a)由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(c)含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质。

(2)根据上述(1)所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷为选自芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚单葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))以及芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)中的任一种。

(3)根据上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷为芝麻素酚三葡萄糖苷(STG)。

(4)根据上述(1)或(2)所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

(6)一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的制造方法，其特征在于，包括以下步骤，即，在宿主细胞内，使来自非人转化细胞的酶试剂与具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷接触，将底物芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解，其中非人转化细胞导入了选自以下(a)～(e)中的多核苷酸：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)编码下述蛋白质的多核苷酸：由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(d)编码下述蛋白质的多核苷酸：含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(e)编码具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸可与由互补的碱基序列所构成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，其中该互补的碱基序列是与由序列号1的碱基序列所构成的多核苷酸互补。

(7)根据上述(6)所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸为插入于表达载体的多核苷酸。

(8)根据上述(6)或(7)所述的方法，其特征在于，所述转化细胞选自转化植物、转化大肠杆菌、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

(9)根据上述(6)～(8)中任一项所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷选自芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚单葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))以及芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)中的任一种。

(10)根据上述(6)～(9)中任一项所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

(11)根据上述(6)～(10)中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

(12)一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的生产方法，其特征在于，包括培养非人类转化体，该非人类转化体导入了选自以下(a)～(e)中的多核苷酸：

(a)由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)编码下述蛋白质的多核苷酸：由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(d)编码下述蛋白质的多核苷酸：含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(e)编码具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸可与由互补的碱基序列所构成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，其中该互补的碱基序列是与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补。

(13)根据上述(10)所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸为插入于表达载体的多核苷酸。

(14)根据上述(12)或(13)所述的方法，其特征在于，所述转化体选自转化植物、转化大肠杆菌、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

(15)根据上述(12)～(14)中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

依照本发明的方法，可提供芝麻素酚及芝麻素酚糖苷的新的制造方法。

且通过选择反应条件，可制造各种芝麻素酚糖苷。本发明的一种实施方式中，通过选择酶浓度等反应条件，可使芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的生成量增加。此外，通过本发明的另一种实施方式，可使SDG(1,2)的生成量选择性地增加。

附图说明

[图1A]为AOBGL11的cDNA序列和氨基酸序列图。

[图1B]为AOBGL11的cDNA序列和氨基酸序列图。

[图2]A：为以pNP-β-G1c为底物的AOBGL11p的最佳温度的图。B：为以pNP-β-G1c为底物的AOBGL11p的最佳pH的图。C：为以pNP-β-G1c为底物的AOBGL11p的热稳定性的图。D：为以pNP-β-G1c为底物的AOBGL11p的pH稳定性的图。

[图3A]为AOBGL11的基因组DNA序列与cDNA序列的比较图。

[图3B]为AOBGL11的基因组DNA序列与cDNA序列的比较图。

[图4]为芝麻素酚三葡萄糖苷的水解反应图。反应时间为1小时。A：10倍稀释的BGL11-1粗酶液，B：未稀释的BGL11-1粗酶液，C：C-1粗酶液。

具体实施方式

以下详细说明本发明。以下的实施方式为用于说明本发明的例示，但本发明的宗旨并非仅限于此实施方式。本发明在不脱离其主旨的范围内，能够以各种方式实施。此外，本说明书中引用的全部文献及公开公报、专利公报的其他专利文献，均作为参考而编入本说明书中。且本说明书包含2016年9月23日申请的作为本案优先权主张基础的日本专利申请(特愿2016-186066号)的说明书及图示所记载的内容。

此外，以下将作为底物的芝麻素酚糖苷称为“底物芝麻素酚糖苷”，也将作为生成物的芝麻素酚糖苷称为“生成芝麻素酚糖苷”。并且也将两者统称为“芝麻素酚糖苷”。

“AOBGL11p”为糖苷水解酶家族3(GH3)的β-葡萄糖苷酶，其cDNA序列示于序列号1，氨基酸序列示于序列号2，基因组DNA序列示于序列号3。

1.芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法

本发明提供一种芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法，包括以下步骤，即，使选自以下(a)～(c)中的蛋白质(以下称“本发明的蛋白质”)与芝麻素酚糖苷反应，而将至少1个糖苷键水解的步骤：

(a)由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质；

(c)含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有将含至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性的蛋白质。

上述(b)或(c)所述的蛋白质，典型而言，为由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的变异体，然而也包括例如使用“Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A LaboratoryManual Vol.4,Cold Spring H arbor Laboratory Press 2012”、“Ausubel,CurrentProtocols in Molecu lar Biology,John Wiley&Sons1987-1997”、“Nuc.Acids.Res.,10,6 487(1982)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)”、“Gene,34,315(1985)”、“Nuc.Acids.Res.,13,4431(1985)”、“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)”等所记载的部位特异的变异导入法而人为可取得的方法。

作为“由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质”，可列举在序列号2的氨基酸序列中，例如1～83个、1～80个、1～75个、1～70个、1～65个、1～60个、1～55个、1～50个、1～49个、1～48个、1～47个、1～46个、1～45个、1～44个、1～43个、1～42个、1～41个、1～40个、1～39个、1～38个、1～37个、1～36个、1～35个、1～34个、1～33个、1～32个、1～31个、1～30个、1～29个、1～28个、1～27个、1～26个、1～25个、1～24个、1～23个、1～22个、1～21个、1～20个、1～19个、1～18个、1～17个、1～16个、1～15个、1～14个、1～13个、1～12个、1～11个、1～10个、1～9个(1～数个)、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加的数，一般而言越小越好。

此外，作为此种蛋白质，可列举具有与序列号2的氨基酸序列有90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上序列同一性的氨基酸序列，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质。上述序列同一性的数值，一般而言越大越好。

在此，“芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键”是指糖键合于芝麻素酚而成的糖苷即芝麻素酚糖苷中，为糖苷配基的芝麻素酚与侧链之间的糖苷键及侧链内的糖苷键。并且，“将具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性”是指糖键合于芝麻素酚而成的糖苷即芝麻素酚糖苷中，将为糖苷配基的芝麻素酚与侧链之间的糖苷键以及侧链内的糖苷键中的至少1个切断(水解)的活性。作为侧链内的糖苷键的例子，可列举键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,2-糖苷键及/或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键。在某实施方式中，是将全部糖苷键水解，而由芝麻素酚糖苷生成芝麻素酚。在其他实施方式中，是将键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键优先水解。以此种方式，生成只将一部分糖切断的生成芝麻素酚糖苷或将全部糖切断的芝麻素酚。

将具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷的糖苷键水解的活性，可使本发明的蛋白质与选自例如STG、SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG中的至少1个底物芝麻素酚糖苷反应，将所得到的反应生成物(芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷)精制，再将精制物通过液相层析(LiquidChromatography:LC)等公知的手法分析而确定。

在一个实施方式中，本发明提供一种芝麻素酚的制造方法，其包括将芝麻素酚糖苷的全部糖苷键切断的步骤。在其他实施方式中，本发明提供一种芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法，包括以下步骤，即，将芝麻素酚糖苷的特定键，例如键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键及/或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-葡萄糖苷键或β-1,2键切断的步骤。此外，在本发明中，将键合于芝麻素酚2′位的分支三糖水解的情况下，β-1,2-键比β-1,6-键优先水解。

“在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或附加”是指在同一序列中的任意1～83个氨基酸序列中的位置，有1～83个氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或附加，在缺失、取代、插入及附加中，也可同时发生2种以上。

以下，展示可相互取代的氨基酸残基的例示。包含于同一群组的氨基酸残基可相互取代。

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、甲硫氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基苯乙酸；

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸、酪氨酸。

本发明的蛋白质可通过使编码该蛋白质的多核苷酸(参照后述的“本发明的多核苷酸”)在适当的宿主细胞内表达等而得到，也可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。此外，也可利用AAPPTec LLC制、Perkin Elmer Inc.制、Protein Technologies Inc.制、PerSeptive Biosystems制、Applied Biosystems制、SHIMADZU CORPORATION制等的肽合成机进行化学合成。

在本发明中，“芝麻素酚糖苷”是指糖键合于芝麻素酚而成的糖苷。

芝麻素酚及芝麻素酚糖苷的例子以下述通式(I)表示。此外，将芝麻素酚2′位示于式中。在本发明中，“分支三糖”是指被附加于下述通式(I)中的R₁部分中的构成三糖的物质。

作为芝麻素酚糖苷的例示，可列举SMG、SDG(1,2)、SDG(1,6)及STG等，但不限于此。

在本发明的一个实施方式中，本发明的酶使用由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质及/或其变异体所构成的蛋白质。在其他实施例中，可利用芝麻素酚糖苷作为底物。在此，芝麻素酚糖苷的例子如前所述。在本发明的一个实施方式中，通过使用本发明的酶，并通过调节添加于反应的酶量、添加有机溶剂于反应液中或调节反应温度而调节反应条件，而以芝麻油榨粕中含量最多的芝麻素酚糖苷即STG作为底物，也可生成所谓SDG(1,2)或SDG(1,6)的稀有的芝麻素酚糖苷。

在本发明中，以芝麻素酚糖苷作为底物的反应的酶量、底物/酶比、温度、pH、有无溶剂、反应时间等，本领域技术人员可适当调整，通过调整这些可决定在何处将键合于芝麻素酚糖苷的糖切断且控制分解程度。

通过根据本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法，可将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解。

在使用本发明的酶的情况下，生成芝麻素酚糖苷及/或芝麻素酚。

此外，本发明的酶可优先切断芝麻素酚糖苷分子中的特定的键，由此，可得到例如SDG(1,2)。在本案中，“优先切断芝麻素酚糖苷分子中的特定键”，是指选择性偏好地将芝麻素酚糖苷的特定糖苷键水解。例如以STG为底物时，生成优先将STG的键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6键水解的SDG(1,2)。作为“芝麻素酚糖苷分子中的特定键”，可列举键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6键等。

本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法中，为起始物的芝麻素酚糖苷可由芝麻种子或芝麻油榨粕通过适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)萃取，或通过乙酸乙酯或其他有机溶剂：水的梯度、高效液相层析(High Performance LiquidChromatography：HPLC)、超高效液相层析(Ultra(High)Performance LiquidChromatography：UPLC)等公知的方法萃取、精制而取得。或者，为起始物的芝麻素酚糖苷也可为市售。作为本发明的起始物的芝麻素酚糖苷，可列举STG、SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG等，通过β-1,2-糖苷键或β-1,6-糖苷键及/或为糖苷配基的芝麻素酚间的糖苷键的切断，生成SDG(1,2)、SDG(1,6)、SMG、芝麻素酚等。

根据本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法，包括使本发明的蛋白质与芝麻素酚糖苷反应，将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的步骤。本发明的方法也可进一步包括将在上述步骤中生成的本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷精制的步骤。本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷可通过适当的溶剂(水等水性溶剂或醇、醚及丙酮等有机溶剂)萃取，或通过乙酸乙酯或其他有机溶剂：水的梯度、高效液相层析(High PerformanceLiquid Chromatography：HPLC)、超高效液相层析(Ultra(High)Performance LiquidChromatography：UPLC)等公知方法精制。

根据本发明的芝麻素酚糖苷及/或芝麻素酚的制造方法，可在含有底物的反应液中添加有机溶剂的条件下进行。相对于反应液总量，有机溶剂可为1％～20％的范围，优选为5％～15％、6～12％，更优选为8％。有机溶剂可为一般能取得的溶剂，优选为与水以任意比例混合的溶剂，可使用乙腈等。有机溶剂可预先添加于反应液中，也可在反应的中途阶段添加。

本说明书中“多核苷酸”，是指DNA或RNA。

作为编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸，例如可列举由序列号1的碱基序列所构成的多核苷酸。

作为“由在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质”，可列举前述蛋白质。

作为“含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上序列同一性的氨基酸序列，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质”，可列举前述蛋白质。

在本说明书中，“在高严谨条件下杂交的多核苷酸”，是指通过将例如与序列号1的碱基序列互补的碱基序列所构成的多核苷酸或与编码序列号2的氨基酸序列的碱基序列互补的碱基序列所构成的多核苷酸的全部或部分作为探针，采用菌落杂交法、斑块杂交法或Southern杂交法等而得到的多核苷酸。作为杂交的方法，可利用例如“Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manua l Vol.4,Cold Spring Harbor,LaboratoryPress 2012”、“Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons1987-1997”等中所记载的方法。

本说明书中，“高严谨条件”，是指例如5×SSC、5×登哈特溶液、0.5％SDS、50％甲酰胺、50℃，或0.2×SSC、0.1％SDS、60℃，或0.2×SSC、0.1％SDS、62℃，或0.2×SSC、0.1％SDS、65℃的条件，但不限于此。在这些条件中，将温度升得越高，越可期待能有效地获得具有高序列同一性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨性的要素，考虑温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种要素，只要是本领域技术人员，则可通过适当选择这些要素实现同样的严谨性。

此外，在杂交中使用市售的试剂盒的情况下，可使用例如Alkphos直接标记及检测系统(Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare))。该情况下，依照试剂盒所附的说明书，与标识的探针进行一夜培育后，将膜在55～60℃的条件下用含0.1％(w/v)SDS的最初的洗涤缓冲液洗涤，然后可检出经杂交的DNA。或者，基于以与序列号1的碱基序列互补的碱基序列或与编码序列号2的氨基酸序列互补的碱基序列的全部或部分制作探针时，在使用市售的试剂(例如PCR Labeling Mix(Roche Diagnostics公司)等)将该探针进行地高辛(DIG)标识的情况下，可使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)检测杂交。

作为除上述外可杂交的多核苷酸，可列举通过BLAST的同源性检测软件，使用默认的参数计算时，与序列号1的碱基序列的DNA或编码序列号2的氨基酸序列的DNA具有60％以上、61％以上、62％以上、63％以上、64％以上、65％以上、66％以上、67％以上、68％以上、69％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上或99.9％以上的序列同一性的DNA。

此外，氨基酸序列或碱基序列的序列同一性，可使用依照Karlin及Artur的计算法BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268,1990；Proc Natl Acad Sci USA 90:5873,1993)而决定。在使用BLAST的情况下，使用各程序的默认参数。

上述的本发明的多核苷酸可通过公知的基因工程学手法或公知的合成手法而取得。

本发明的多核苷酸可进一步包含由编码分泌信号肽的碱基序列所构成的多核苷酸。优选由编码分泌信号肽的碱基序列所构成的多核苷酸为被包含于本发明的多核苷酸的5’末端。分泌信号肽及来自编码该分泌信号肽的碱基序列的多核苷酸与前述相同。

本发明的多核苷酸优选以插入适当的表达载体的状态导入宿主中。

适当的表达载体通常以包括以下(i)～(iii)的形式而构成：

(i)可在宿主细胞内转录的启动子；

(ii)键合于该启动子的本发明的多核苷酸；及

(iii)表达盒，将在宿主细胞内可发挥功能的信号作为构成要素而含有，其中该功能涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷酸化。

作为表达载体的制作方法，可列举使用质粒、噬菌体或粘粒等的方法，但没有特别限定。

载体的具体种类没有特别限定，可适当选择能在宿主细胞中表达的载体。即只要依据宿主细胞的种类，选择确实用于使本发明的多核苷酸表达的适当的启动子序列，并以将其与本发明的多核苷酸插入各种质粒等而成的载体作为表达载体即可。

本发明的表达载体依存于所要导入的宿主的种类，含有表达控制区(例如启动子、终止子及/或复制起点等)。作为细菌用表达载体的启动子可使用惯用的启动子(例如trc启动子、tac启动子、lac启动子等)；作为酵母用启动子，可列举甘油醛3磷酸脱氢酶启动子、PH05启动子等；作为丝状菌用启动子，例如可列举淀粉酶、trpC等。此外，作为用于使目标基因在植物细胞内表达的启动子的例子，可列举花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子、rd29A基因启动子、rbcS启动子、将前述花椰菜花叶病毒的35S RNA 启动子的增强子序列附加于来自农杆菌的甘露氨酸合成酶启动子序列的5’侧的mac-1启动子等。作为动物细胞宿主用启动子，可列举病毒性启动子(例如SV40早期启动子、SV40晚期启动子等)。作为通过外在刺激使诱导性活性化的启动子，可列举小鼠乳腺癌病毒(mouse mammary tumor virus(MMTV))启动子、四环素应答性启动子、金属硫蛋白启动子及热休克蛋白启动子等。

表达载体优选含有至少1个选择标记。作为此种标记，可利用营养缺陷型标记(ura5、niaD)、抗药性标记(潮霉素、博莱霉素)、遗传霉素抗性基因(G418r)、抗铜性基因(CUP1)(Marin et al.,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA,vol.81,p.337,1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m，PDR4)(猪腰淳嗣等,生化学,vol.64,p.660,1992；Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)等。

本发明的转化体的制作方法(生产方法)没有特别限定，例如可列举将含本发明的多核苷酸的表达载体导入宿主进行转化的方法。作为成为转化对象的细胞或生物，可适当使用以往公知的各种细胞或生物。作为成为转化对象的细胞，例如可列举大肠杆菌(Escherichia coli)等细菌、酵母(出芽酵母Saccharomyces cerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe)、丝状菌(曲菌Aspergillus oryzae、Aspergillus sojae)、植物细胞、人类除外的动物细胞等。用于上述宿主细胞的适当的培养基及条件为本技术领域所公知。此外，成为转化对象的生物没有特别限定，可列举在上述宿主细胞所例示的各种微生物或植物或人类除外的动物。转化体优选丝状菌、酵母或植物。作为转化中所用的宿主，也可用能生成任一种芝麻素酚糖苷的宿主。作为宿主，不仅可使用如芝麻的原本可生成至少1个芝麻素酚糖苷的植物，也可将在原本不会生成芝麻素酚糖苷的细胞或生物中导入至少1个芝麻素酚糖苷的生成所必需的基因物质作为宿主而使用。“芝麻素酚糖苷的生成所必需的基因”例如可列举日本特开2006-129728等所记载的具有芝麻素酚糖苷合成活性的基因。

作为宿主细胞的转化方法，可利用通常使用的公知方法。例如，可通过电穿孔法(Mackenxie,D.A.et al.,Appl.Environ.Microbiol.,vol.66,p.4655-4661,2000)、粒子轰击法(日本特开2005-287403“脂质生产菌的育种方法”中记载的方法)、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.75,p.1929,1978)、乙酸锂法(J.Bacteriology,vol.153,p.163,1983)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold Spring HarborLaboratory Course Manual等记载的方法)而实施，但并不限于此。此外，对植物或源自植物的组织或细胞进行基因导入时，可适当选择使用例如农杆菌法(Plant MolecularBiology Mannual,Gelvin,S.B.et al.,Academic Press Publishers)、粒子枪法、PEG法、电穿孔法等。

使用源自非人类转化细胞的酶试剂的本发明的芝麻素酚糖苷及/或芝麻素酚的制造方法

通过使本发明的蛋白质在宿主细胞内表达，并将细胞破碎，可得到本发明的蛋白质。通过使本发明的蛋白质与底物芝麻素酚糖苷作用，可生成本发明的芝麻素酚糖苷及/或芝麻素酚。

具体而言，通过使源自本发明的转化细胞的酶试剂与具有至少一个糖苷键的芝麻素酚糖苷接触，可生成芝麻素酚。本发明的蛋白质即使在酵母中表达时，也可呈现与在曲菌中表达时相同的活性，此可在实施例中确认。

“源自转化细胞的酶试剂”，只要是使用转化细胞而调制的含有本发明的蛋白质的酶试剂，则没有特别限定，例如为转化细胞本身、转化细胞的粉碎物本身、转化细胞的培养上清液本身以及它们的精制物。因此，本发明提供一种芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的制造方法，包括以下步骤，即，在宿主细胞中使源自非人类转化细胞的酶试剂与具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷接触，而将至少1个糖苷键水解的步骤，其中该人类转化细胞导入了选自以下(a)～(e)中的多核苷酸：

(a)由序列号1的碱基序列所构成的多核苷酸；

(b)编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸；

(c)编码下述蛋白质的多核苷酸：在序列号2的氨基酸序列中，1～83个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列构成，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质；

(d)编码下述蛋白质的多核苷酸：含有相对于序列号2的氨基酸序列有90％以上的序列同一性的氨基酸序列，且具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质；

(e)编码具有将芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解的活性的蛋白质的多核苷酸，该多核苷酸可与由互补的碱基序列构成的多核苷酸在高严谨条件下杂交，其中该互补的碱基序列与由序列号1的碱基序列构成的多核苷酸互补。

选自上述(a)～(e)的多核苷酸，即为本发明的多核苷酸，且与前述相同。

“接触”是指使本发明的源自转化细胞的酶试剂与具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷存在于同一反应系统或培养系统中，例如包括，在含本发明的源自转化细胞的酶试剂的容器中，添加具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷；将本发明的源自转化细胞的酶试剂与具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷混合；将本发明的源自转化细胞的酶试剂添加于含具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷的容器中。

在转化体为酵母或曲菌的情况下，以本发明的多核苷酸转化的酵母或曲菌与野生型相比，表达较多本发明的蛋白质。因此，表达的本发明的蛋白质与酵母或曲菌所生成的芝麻素酚糖苷反应，在酵母或曲菌的细胞内或培养液中生成芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷，优选在培养液中生成。

在转化体为植物的情况下，成为本发明中的转化对象的植物，是指整株植物体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、柔软组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或植物培养细胞或各种形态的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶的切片、愈伤组织等的任一种。作为用于转化的植物，也可为属于单子叶植物纲或双子叶植物纲的植物的任一种。确认本发明的多核苷酸是否导入了植物中，可通过PCR法、Southern杂交法、Northern杂交法等进行。一旦取得将本发明的多核苷酸插入基因组内的转化植物体，即可通过由该植物体的有性生殖或无性生殖得到其子孙。此外，从该植物体或其子孙或这些的克隆得到例如种子、果实、切穂、块茎、块根、株体、愈伤组织、原生质体等，即可基于它们而量产该植物体。以本发明的多核苷酸转化的植物(以下称“本发明的植物”)与其野生型相比，含较多的本发明的蛋白质。因此，本发明的蛋白质与本发明的植物所生成的芝麻素酚糖苷反应，而于植物中生成芝麻素酚。此外，当植物体中的环境并非最适合水解反应时，芝麻素酚糖苷的糖苷键的水解反应受到抑制，生成未切断糖苷键而维持原样的芝麻素酚糖苷或只切断糖苷键的一部分的芝麻素酚糖苷。

本发明的几种形式的转化体或培养液与其野生型相比，本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的含量高，在其萃取物或培养液中，含有高浓度的本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷。本发明的转化体的萃取物，可通过使用玻璃珠、均质机或超声仪(sonicator)等将转化体破碎，并将该破碎物离心处理，再将其上清液回收而取得。在本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷蓄积于培养液中的情况下，通过在培养结束后，依照通常的方法(例如离心分离、过滤等)将转化体与培养上清液分离，可获得含有本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的培养上清液。

此种方式得到的萃取液或培养上清液，也可进一步供于精制步骤。本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的精制，可依照通常的分离及精制方法而进行。具体的方法与前述相同。

“芝麻素酚糖苷”、“具有至少1个糖苷键的芝麻素酚糖苷”及“将至少1个糖苷键水解的活性”，与前述相同。

其他关于通常的分子生物学的方法，可参照“Sambrook&Russell,MolecularCloning:A Laboratory Manual Vol.4,Cold Spring Harbor Lab oratory Press 2012”、“Methods in Yeast Genetics、A laboratory manua l(Cold Spring Harbor LaboratoryPress、Cold Spring Harbor,NY)”等。

此种方式所得到的本发明的芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷可按照常规方法，用于例如食品、甜味料、香料、医药品、工业原料(化妆料、肥皂等的原料)的制造等用途。

作为食品的例子，可列举：特定保健用食品、营养机能食品、机能性表示食品、营养辅助食品、健康食品、机能性食品、幼儿用食品、老人用食品等。本说明书中，食品为固体、流体、液体以及它们的混合物，为可摄食的物质的总称。

此外，在本说明书中所引用的全部文献及公开公报、专利公报或其他专利文献，均编入本说明书中作为参考。

实施例

以下用实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例限定。

[实施例1]

曲菌的β-葡萄糖苷酶基因的探究

由曲菌基因组数据(PRJNA28175)探究β-葡萄糖苷酶同源物，发现了为菌体内β-葡萄糖苷酶的同源物的AO090701000244(CDS序列：序列号1，推测氨基酸序列：序列号2，ORF序列：序列号3，基因组DNA序列：序列号4)。以其作为AOBGL11进行克隆化。AOBGL11的cDNA序列和氨基酸序列示于图1。

AOBGL11的基因组DNA的克隆

设计以下引物以克隆AOBGL11。

AOBGL11-F：

5′-ATGCCTCGTCTAGACGTCGAGAA-3′(序列号4)

AOBGL11-R：

5′-TCACAGACCCAACCAGTAGCGA-3′(序列号5)

将曲菌Aspergillus oryzae var.Brunneus(IFO 30102)的分生孢子接种至10ml的液体培养基(每1L中含20g葡萄糖、1g胰化蛋白胨、5g酵母萃取物、1g NaNO₃、0.5g K₂HPO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O)中，于30℃培养1天。通过过滤收集菌体，在液氮中磨碎后，使用DNeasy植物迷你试剂盒(Plant Mini Kit(QIAGEN))制作基因组DNA。

以基因组DNA为模板，使用引物AOBGL11-F和AOBGL11-R,用KOD-plus(东洋纺)进行PCR。将所得到的约2.57kbp的DNA片段用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)进行克隆化，从而得到质粒pCR-AOBGL11g。

[实施例2]

通过曲菌的AOBGL11p生产

曲菌表达用载体的构建

将曲菌用载体pUNA(酒类综合研究所)以限制酶SmaI消化所得的DNA片段，与将质粒pCR-AOBGL11g以限制酶EcoRI消化，末端通过Blunting Kit(Takara Bio)平滑化所得到的约2.57kbp的DNA片段连接，从而得到质粒pUNA-AOBGL11g。

曲菌的转化

曲菌的转化实施如下。

用Aspergillus oryzae niaD300株(酒类综合研究所)作为宿主。将宿主株接种至PDA培养板，于30℃培养约1周。加入0.1％tween80、0.8％NaCl，将分生孢子悬浮以得到分生孢子悬浮液。以Miracloth过滤后，通过离心回收分生孢子，进一步用0.1％tween80，0.8％NaCl洗涤，并悬浮于无菌水。将BR>B分生孢子涂布于CD培养板(每1L中含6g NaNO₃、0.52gKCl、1.52g KH₂PO₄、10g葡萄糖、2ml 1M MgSO₄、1ml微量元素溶液(Trace elementsolution，每1L中含1g FeSO₄·7H₂O、8.8g ZnSO₄·7H₂O、0.4g CuSO₄·5H₂O、0.1g NaB₄O₇·10H₂O、0.05g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O))、20g琼脂(pH6.5))，通过粒子轰击法，进行DNA导入。使用PDS-1000/He(Bio-Rad),粒子：钨M-10，碎裂盘：1100psi，距离：3cm。选取在CD培养板中生成的转化株。将通过质粒pUNA-AOBGL11g转化所得的转化株当做BGL11-1株，将通过对照载体pUNA转化所得的转化株当做C-1株。

通过曲菌的AOBGL11p表达

将BGL11-1株或C-1株接种于CD培养板，于30℃培养7天，使形成分生孢子。加入0.1％tween80，0.8％NaCl，将分生孢子悬浮以得到分生孢子悬浮液。用Miracloth(注册商标)过滤后，通过离心回收分生孢子，进一步用0.1％tween80，0.8％NaCl洗涤，并悬浮于无菌水，形成分生孢子悬浮液。将此分生孢子悬浮液接种于酶生产用液体培养基(每1L含有100g麦芽糖、1g胰化蛋白胨、5g酵母萃取物、1g NaNO₃、0.5g K₂HPO₄、0.5g MgSO₄·7H₂O、0.01g FeSO₄·7H₂O)，于30℃振荡培养2天。通过Miracloth(注册商标)过滤，收集菌体。将得到的湿菌体中的约0.4g以液氮冻结，再用乳钵研碎。将研碎所得的菌体悬浮于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0),充分混合后进行离心。用Amicon(注册商标)Ultra-15 50k(Merck)，通过超过滤将所得的上清液进行浓缩，再通过用含0.1％CHAPS的50mM磷酸钠缓冲液pH7.0(缓冲液A)置换，得到约1ml粗酶液。

蛋白质浓度的测定

粗酶液的蛋白质浓度使用蛋白质测定CBB溶液(5倍浓缩)(Nakarai Tesque)来定量。其结果，BGL11-1粗酶液为6.46mg/ml，C-1粗酶液为4mg/ml。

[实施例3]

pNP-β-G1c分解活性

探讨pNP-β-G1c的分解活性。10μL粗酶液、50μL 0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)、50μL20mM pNP-β-G1c水溶液、加水使总量成为200μL，于37℃反应。此外，由于BGL11-1粗酶液活性高，因此使用将粗酶液用含0.1％CHAPS的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)稀释100倍的稀释液。基于pNP-β-G1c水解而游离的对硝基酚(pNP)，每1分钟的405nm的吸光度变化(Δ405)，BGL11-1粗酶液为0.244，C-1粗酶液为0.000。由以上结果暗示AOBGL11p具有β-葡萄糖苷酶活性。

以pNP-β-G1c为底物，调查AOBGL11p的最佳温度、最佳pH及热稳定性、pH稳定性(图2(图2A-图2D))。此外BgL11-1粗酶液使用以缓冲液A稀释5000倍的稀释液(蛋白质浓度1.3μg/ml)。

最佳温度：反应液为20μL粗酶液(1.3μg/ml)、100μL 0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.5)、20mM pNP-β-G1c、加水使总量成为400μL，从反应开始后15分钟、30分钟、45分钟取样100μL，与100μL 0.2M碳酸钠溶液混合后，测定405nm的吸光度，求取Δ405。以Δ405成为最大的45℃当做1，将在各温度反应时的Δ405的比例示于图2A。由此可知45-50℃为反应最适温度。

最佳pH：反应液为20μL粗酶液(1.3μg/ml)、100μL 0.2M缓冲液、20mM pNP-β-G1c、加水使总量成为400μL。缓冲液在pH4.0-6.0时使用乙酸钠缓冲液，在pH6.0-8.0时使用磷酸钠缓冲液。以与上述相同的方式进行取样、测定，将在各pH反应时的Δ405相对于Δ405的最大值的比例示于图2B。由此可知pH6.0-7.0为反应最适pH。

热稳定性：将5000倍稀释的粗酶液(1.3μg/ml)分别于30℃、37℃、45℃、50℃保持10分钟后，进行冰冻。反应液为5μL粗酶液(1.3μg/ml)、100μL 0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.5)、20mM pNP-β-G1c、加水使总量成为100μL，于37℃反应45分钟后，添加100μL 0.2M碳酸钠溶液，并测定405nm的吸光度。求取在各温度处理时的吸光度相对于无热处理的酶液经45分钟后在405nm的吸光度的比例，并示于图2C。可知AOBGL11p在进行10分钟处理时，直至37℃仍稳定，但以45℃处理时失活至约一半，以50℃处理时活性几乎消失。

pH稳定性：将粗酶液以pH4.5、5.0、5.5、6.0(0.2M醋酸缓冲液)、pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0(0.2M磷酸钠缓冲液)的各缓冲液稀释5000倍，于37℃保持1小时后，进行冰冻。反应液为5μL粗酶液(1.3μg/ml)、100μL 0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.5)、20mM pNP-β-G1c、加水使总量成为100μL,于37℃反应45分钟后，添加100μL 0.2M碳酸钠溶液，并测定405nm的吸光度。求取保持于各pH时的吸光度相对于保持于活性最高的pH6.5时的吸光度的比例，并示于图2D。可知AOBGL11p于pH6.5附近最稳定。

[实施例4]

AOBGL11的cDNA克隆

将BGL11-1株在10ml酶生产用培养基中培养，并通过过滤收集菌体。将菌体用液氮冻结，并用乳钵将菌体研碎后，用RNeasy(QIAGEN)萃取总RNA。通过由SuperScript双股cDNA合成试剂盒(SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit(生命科技)),合成cDNA。以此作为模板，用引物AOBGL11-F及AOBGL11-R,以KOD-plus(东洋纺)进行PCR。将所得到的约2.52kbp的DNA片段，用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(Invitrogen)将AOBGL11的cDNA克隆化，从而得到质粒pCR-AOBGL11cDNA。确认碱基序列如序列号1，推测氨基酸序列如序列号2。将AOBGL11的基因组DNA序列与cDNA序列的比较示于图3。此外，与源自已确认具有STG水解活性且属于类芽孢杆菌(Paenibacillus)属的细菌KB0549株的β-葡萄糖苷酶的推测氨基酸序列的同一性为30.3％。

[实施例5]

用酵母生产AOBGL11p

酵母用表达载体的构建和酵母的转化

将质粒pCR-AOBGL11cDNA以EcoRI消化所得的约2.52kbp的DNA片段，插入酵母表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)的EcoRI位点，选出AOBGL11被插入载体pYE22m的从APDH启动子表达的方向的载体，作为pYE-AOBGL3c。作为转化的亲本，使用S.cerevisiae的EH13-15株(trp1，MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.,30,515-520,1989)。

分别使用质粒pYE22m(对照)、pYE-AOBGL11(AOBGL11表达用)依照乙酸锂法将EH13-15株转化。选取在SC-Trp琼脂培养基(2％琼脂)上生成的转化株，其中SC-Trp为：每1L中含有6.7g含或不含氨基酸的酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO))、20g葡萄糖及1.3g氨基酸粉末(由1.25g腺嘌呤硫酸盐、0.6g精氨酸、3g天冬氨酸、3g谷氨酸、0.6g组氨酸、1.8g亮氨酸、0.9g赖氨酸、0.6g甲硫氨酸、1.5g苯丙氨酸、11.25g丝氨酸、0.9g酪氨酸、4.5g缬氨酸、6g苏氨酸、0.6g尿嘧啶混合而成)。

将以质粒pYE22m转化得到的株当做C-Y株,将以质粒pYE-AOBGL11转化得到的株当做AOBGL11-Y株。将选取的C-Y株与AOBGL11-Y株在添加1/10量的1M磷酸钾缓冲液的10mlSC-Trp液体培养基中接种1白金耳，并于30℃、125rpm振荡培养2天。通过将得到的培养物离心，分为培养上清液和菌体。培养上清液使用Amicon(注册商标)Ultra-15 50k(Merck)，通过超过滤浓缩，并用含0.1％CHAPS的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)进行缓冲液置换，从而得到约1ml的培养上清液浓缩液。

菌体悬浮于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、1ml 0.1％CHAPS溶液中，通过玻璃珠将菌体破碎并进行离心，以所得的上清液作为菌体破碎液。取得20μL培养上清液浓缩液或菌体破碎液，添加1μL 2％X-β-G1c/DMF溶液，并于室温反应5分钟时，只有源自AOBGL11-Y株的菌体破碎液呈现蓝色，暗示具有X-β-G1c活性。

pNP-β-G1c活性测定

探讨pNP-β-G1c的分解活性。10μL粗酶液、50μL 0.2M磷酸钠缓冲液(pH7.0)、50μL20mM pNP-β-G1c水溶液、加水使总量成为200μL，并于37℃反应。且由于BGL11-1粗酶液活性高，使用将粗酶液用含0.1％CHAPS的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)稀释100倍的稀释液。基于pNP-β-G1c水解而游离的对硝基酚(pNP)，每1分钟的405nm的吸光度变化(Δ405)，AOBGL11-Y粗酶液中为0.068，C-Y粗酶液中为0.000。

[实施例6]

AOBGL11p的芝麻素酚糖苷水解活性

用芝麻素酚三葡萄糖苷(STG)作为底物。将STG用50μg/ml、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、20μL上述BGL11-1粗酶液或其稀释液，调至总量为100μL，并于37℃反应1小时。使上述C-1粗酶液也进行同样的反应作为对照。将反应液于100℃处理3分钟，使反应停止，然后以Cosmospin过滤器H(Nakarai Tesque)过滤，之后供于HPLC。

HPLC的分析条件如下。

管柱：Cosmosil 5C₁₈-AR-II 4.6mmI.D.×250mm(Nacalai Tesque)

移动相：A；0.1％(v/v)三氟乙酸、2:8(v/v)乙腈:水

B；0.1％(v/v)三氟乙酸、8:2(v/v)乙腈:水

B浓度10％(0分钟-3分钟)→100％24分钟线性梯度，100％(24分钟

-35分钟)

流速：0.7ml/分钟

温度：40℃

检测：UV 290nm

结果示于图4。

与10倍稀释的BGL11-1粗酶液反应的情况下，底物STG的一部分被水解，也生成SDG(1,6)及SDG(1,2)以及为糖苷配基的芝麻素酚(图4A)。

此外，在不稀释BGL11-1粗酶液而进行反应的情况下，作为底物添加的STG几乎全部被水解，生成SDG(1,2)以及为糖苷配基的芝麻素酚(图4B)。与10倍稀释的BGL11-1粗酶液反应的情况下，SDG(1,2)比SDG(1,6)多，而在BGL11-1粗酶液未稀释而进行反应的情况下，未检测出SDG(1,6)只检测出SDG(1,2)，由此暗示AOBGL11p对STG的分支糖链中的β-1,6键作用强于对β-1,2键的作用。

由以上的结果显示，AOBGL11p相比于β-1,2键，更优先将β-1,6键水解,最后水解至成为糖苷配基的芝麻素酚的形式。而且，显示通过调整酶液的浓度，可控制芝麻素酚糖苷的水解进程。此外，C-1粗酶液与STG的反应结果示于图4C，由此结果显示，C-1粗酶液未进行STG的水解。

产业上的可利用性

本发明提供一种使用源自曲菌的为葡萄糖苷水解酶的AOBGL11p，将芝麻素酚三葡萄糖苷水解而生产芝麻素酚及/或芝麻素酚糖苷的方法。

序列表

<110> 三得利控股株式会社

<120> 使用AOBGL11的芝麻素酚或芝麻素酚糖苷的生产方法

<130> G1644WO

<150> JP 2016-186066

<151> 2016-09-23

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2520

<212> DNA

<213> 米曲菌（Aspergillus oryzae）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2517)

<400> 1

atg cct cgt cta gac gtc gag aag acc atc gaa gaa ctc tcc cta ggg 48

Met Pro Arg Leu Asp Val Glu Lys Thr Ile Glu Glu Leu Ser Leu Gly

1 5 10 15

gag aag gtc gcc ttg acg gcc gga atc gac ttc tgg cac aca gct tcc 96

Glu Lys Val Ala Leu Thr Ala Gly Ile Asp Phe Trp His Thr Ala Ser

20 25 30

gtg ccc cgc ctc aac atc cca act ctc cgc atg tcc gat ggc ccc aac 144

Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Thr Leu Arg Met Ser Asp Gly Pro Asn

35 40 45

ggc gtg cgc gga act cgc ttc ttc aac ggc gtc cca gcc gca tgt ttc 192

Gly Val Arg Gly Thr Arg Phe Phe Asn Gly Val Pro Ala Ala Cys Phe

50 55 60

cct tgt gcc acg gca ctg ggc gca acc tgg gac acc gag ctg ctc cat 240

Pro Cys Ala Thr Ala Leu Gly Ala Thr Trp Asp Thr Glu Leu Leu His

65 70 75 80

gag att ggt caa ttg atg gga gag gaa tcc att gcc aag ggc tcg cac 288

Glu Ile Gly Gln Leu Met Gly Glu Glu Ser Ile Ala Lys Gly Ser His

85 90 95

att att cta ggc ccc acg atc aac acc cag cgg tct ccg ctc gga ggt 336

Ile Ile Leu Gly Pro Thr Ile Asn Thr Gln Arg Ser Pro Leu Gly Gly

100 105 110

cgt gga ttc gag tcc ttt gct gag gac ggt gtg ctc tct gga ctc ttg 384

Arg Gly Phe Glu Ser Phe Ala Glu Asp Gly Val Leu Ser Gly Leu Leu

115 120 125

gcc ggt tat atc tcc aag ggt att cag gag aag ggc gtt gcg gcc act 432

Ala Gly Tyr Ile Ser Lys Gly Ile Gln Glu Lys Gly Val Ala Ala Thr

130 135 140

ctg aag cac ttt gtg tgc aat gac cag gag cat cag cgt atg gct gtt 480

Leu Lys His Phe Val Cys Asn Asp Gln Glu His Gln Arg Met Ala Val

145 150 155 160

gat agc att gtt acg cag cgg gct ctg cgc gag atc tat ttg ttg ccg 528

Asp Ser Ile Val Thr Gln Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Leu Pro

165 170 175

ttt caa ttg gcc atg agg att tgc agg acg gct tgt gtt atg aca gct 576

Phe Gln Leu Ala Met Arg Ile Cys Arg Thr Ala Cys Val Met Thr Ala

180 185 190

tat aac aag gtg aat gga acg cac gtt agt cag aat aag gaa atc atc 624

Tyr Asn Lys Val Asn Gly Thr His Val Ser Gln Asn Lys Glu Ile Ile

195 200 205

acg gat atc ttg cgg aag gag tgg gga tgg gat ggg ttg gtt atg agt 672

Thr Asp Ile Leu Arg Lys Glu Trp Gly Trp Asp Gly Leu Val Met Ser

210 215 220

gat tgg ttc ggt acc tac agt acc agt gat gca atc aat gct ggt ttg 720

Asp Trp Phe Gly Thr Tyr Ser Thr Ser Asp Ala Ile Asn Ala Gly Leu

225 230 235 240

gac ctg gag atg ccg ggc aag aca cgc tgg cgt gga act gct ctg gcg 768

Asp Leu Glu Met Pro Gly Lys Thr Arg Trp Arg Gly Thr Ala Leu Ala

245 250 255

cat gcc gtt tct tcg aac gag gtc gct gag ttt gtc atg gat gag cgt 816

His Ala Val Ser Ser Asn Glu Val Ala Glu Phe Val Met Asp Glu Arg

260 265 270

gtc cgc aat gtg ttg aac ctg gtt aac ttt gtg gat ggc ctg aac atc 864

Val Arg Asn Val Leu Asn Leu Val Asn Phe Val Asp Gly Leu Asn Ile

275 280 285

ccg gag aac gcc ccg gag aag gct ctc aac cgg cca cag gac caa gct 912

Pro Glu Asn Ala Pro Glu Lys Ala Leu Asn Arg Pro Gln Asp Gln Ala

290 295 300

ctt ctc cgc cgt gct gcg gcg gag tct gtc gtt ctc atg aag aac gag 960

Leu Leu Arg Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val Val Leu Met Lys Asn Glu

305 310 315 320

gaa gac atc ttg ccc ctg aag aag gag aag tct atc ttg gtt att ggt 1008

Glu Asp Ile Leu Pro Leu Lys Lys Glu Lys Ser Ile Leu Val Ile Gly

325 330 335

cct aac tcc aag gtt gcg gcg tac tgc ggc ggt gga tcc gcg tct ttg 1056

Pro Asn Ser Lys Val Ala Ala Tyr Cys Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu

340 345 350

gat gct tat tac act gtc acc cca ttc gag ggt gtc tcg gct cag agc 1104

Asp Ala Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Phe Glu Gly Val Ser Ala Gln Ser

355 360 365

aag ggt gag gtc aag ttc tct caa ggt gtc tat tcg cac aag gac ctt 1152

Lys Gly Glu Val Lys Phe Ser Gln Gly Val Tyr Ser His Lys Asp Leu

370 375 380

cct ctc ctt gga ccc ctg ctg aag acc gcc gac ggc aag act ggt ttc 1200

Pro Leu Leu Gly Pro Leu Leu Lys Thr Ala Asp Gly Lys Thr Gly Phe

385 390 395 400

tca ttc aag gta tac aac gag cac cct tcc gag tct aac cgc gaa ctt 1248

Ser Phe Lys Val Tyr Asn Glu His Pro Ser Glu Ser Asn Arg Glu Leu

405 410 415

atc gag cag ctg cac ctg gtc tcg tcg agc gga ttc cta atg gac tat 1296

Ile Glu Gln Leu His Leu Val Ser Ser Ser Gly Phe Leu Met Asp Tyr

420 425 430

gtc aac ccc aag atc aag tct ctc acc tac tac gtc gac atg gag ggt 1344

Val Asn Pro Lys Ile Lys Ser Leu Thr Tyr Tyr Val Asp Met Glu Gly

435 440 445

ctc ttc acc ccc gag gaa gac ggt gtc tac gac ttc ggt gtc act gtt 1392

Leu Phe Thr Pro Glu Glu Asp Gly Val Tyr Asp Phe Gly Val Thr Val

450 455 460

gtt ggc acc ggc caa ctg ttc atc gac ggc gag ctc gtc gtt gac aac 1440

Val Gly Thr Gly Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Leu Val Val Asp Asn

465 470 475 480

acc aag aac cag cgc cag ggc tcc gcc ttc ttc ggc tcc gct acc gtc 1488

Thr Lys Asn Gln Arg Gln Gly Ser Ala Phe Phe Gly Ser Ala Thr Val

485 490 495

gaa gag aag ggc tcc aaa gaa ctc aag gcc ggc caa aca tac aag gtt 1536

Glu Glu Lys Gly Ser Lys Glu Leu Lys Ala Gly Gln Thr Tyr Lys Val

500 505 510

ctc ttc cag ttc ggc aca gcc cct acc tcc gac ctc gat acc cgc ggc 1584

Leu Phe Gln Phe Gly Thr Ala Pro Thr Ser Asp Leu Asp Thr Arg Gly

515 520 525

gtg gta gtc ttc gga ccc ggt ggc ttc cgc ttc gga gcc agc cgt cgc 1632

Val Val Val Phe Gly Pro Gly Gly Phe Arg Phe Gly Ala Ser Arg Arg

530 535 540

gtc ggc cag gaa gag ctc atc tcc aac gcc gtc aag ctc gcc tcc gag 1680

Val Gly Gln Glu Glu Leu Ile Ser Asn Ala Val Lys Leu Ala Ser Glu

545 550 555 560

gcc gaa caa gta gtc gtc ttc gcc ggt ctg act agc gaa tgg gaa acc 1728

Ala Glu Gln Val Val Val Phe Ala Gly Leu Thr Ser Glu Trp Glu Thr

565 570 575

gag ggc tac gac cgc gac cac atg gac ctt ccc ccc ggc agc gac gag 1776

Glu Gly Tyr Asp Arg Asp His Met Asp Leu Pro Pro Gly Ser Asp Glu

580 585 590

atg atc tcg cgc gtg ctg gac gtc aac ccg aac gcc gtc gtg gtc att 1824

Met Ile Ser Arg Val Leu Asp Val Asn Pro Asn Ala Val Val Val Ile

595 600 605

cag agc ggc acc cca gtg acc atg cca tgg gcc aac aag acc aag gct 1872

Gln Ser Gly Thr Pro Val Thr Met Pro Trp Ala Asn Lys Thr Lys Ala

610 615 620

ctc cta cac gcc tgg ttc ggc ggt aac gag tgc ggt aac ggt atc gcg 1920

Leu Leu His Ala Trp Phe Gly Gly Asn Glu Cys Gly Asn Gly Ile Ala

625 630 635 640

gac gtg ctc tac ggc gac gtc aac ccc tcc ggc aag ctg ccc att act 1968

Asp Val Leu Tyr Gly Asp Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Ile Thr

645 650 655

ttc ccc gta cgt ctg cag gac aac ccc agc tac gtc aac ttt cgt tcc 2016

Phe Pro Val Arg Leu Gln Asp Asn Pro Ser Tyr Val Asn Phe Arg Ser

660 665 670

gag cgc ggc cgt gtc ctc tac ggt gaa gac gtc tac gtc gga tac cgc 2064

Glu Arg Gly Arg Val Leu Tyr Gly Glu Asp Val Tyr Val Gly Tyr Arg

675 680 685

tac tac gaa aag gtc gat ctg gcc cct ctc ttc ccc ttc ggc cac ggt 2112

Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Leu Ala Pro Leu Phe Pro Phe Gly His Gly

690 695 700

ctc tcc tac acc acc ttc acc cgc tcc gac ctg acc ctc acc acc act 2160

Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Thr Arg Ser Asp Leu Thr Leu Thr Thr Thr

705 710 715 720

ccc gag aag ccc cag tac gaa gaa agc ggc gag ccc atc acc gca acc 2208

Pro Glu Lys Pro Gln Tyr Glu Glu Ser Gly Glu Pro Ile Thr Ala Thr

725 730 735

gtc acg gtg acc aac acc ggc aag gtc gcc ggt gca gag atc gtc cag 2256

Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Lys Val Ala Gly Ala Glu Ile Val Gln

740 745 750

ctc tgg gtc gct ccc ccg gca acg gaa gtc aac cgt ccc gtc cgc gaa 2304

Leu Trp Val Ala Pro Pro Ala Thr Glu Val Asn Arg Pro Val Arg Glu

755 760 765

ctc aag gga ttc act aag gtc ttc ctg cag cct ggt gag cag aag aag 2352

Leu Lys Gly Phe Thr Lys Val Phe Leu Gln Pro Gly Glu Gln Lys Lys

770 775 780

gtc gag atc gtc gtg gag aag aag ctg gcg acg agt tgg ttc gac gag 2400

Val Glu Ile Val Val Glu Lys Lys Leu Ala Thr Ser Trp Phe Asp Glu

785 790 795 800

atg cgc gag aag tgg gcg tcc gag aaa ggc gag tat gag gtt ctt gta 2448

Met Arg Glu Lys Trp Ala Ser Glu Lys Gly Glu Tyr Glu Val Leu Val

805 810 815

act ggt act ggc gag ggt gtt ctt aag tcg tcc ttc aag gtc gag aag 2496

Thr Gly Thr Gly Glu Gly Val Leu Lys Ser Ser Phe Lys Val Glu Lys

820 825 830

act cgc tac tgg ttg ggt ctg tga 2520

Thr Arg Tyr Trp Leu Gly Leu

835

<210> 2

<211> 839

<212> PRT

<213> 米曲菌（Aspergillus oryzae）

<400> 2

Met Pro Arg Leu Asp Val Glu Lys Thr Ile Glu Glu Leu Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Ala Leu Thr Ala Gly Ile Asp Phe Trp His Thr Ala Ser

20 25 30

Val Pro Arg Leu Asn Ile Pro Thr Leu Arg Met Ser Asp Gly Pro Asn

35 40 45

Gly Val Arg Gly Thr Arg Phe Phe Asn Gly Val Pro Ala Ala Cys Phe

50 55 60

Pro Cys Ala Thr Ala Leu Gly Ala Thr Trp Asp Thr Glu Leu Leu His

65 70 75 80

Glu Ile Gly Gln Leu Met Gly Glu Glu Ser Ile Ala Lys Gly Ser His

85 90 95

Ile Ile Leu Gly Pro Thr Ile Asn Thr Gln Arg Ser Pro Leu Gly Gly

100 105 110

Arg Gly Phe Glu Ser Phe Ala Glu Asp Gly Val Leu Ser Gly Leu Leu

115 120 125

Ala Gly Tyr Ile Ser Lys Gly Ile Gln Glu Lys Gly Val Ala Ala Thr

130 135 140

Leu Lys His Phe Val Cys Asn Asp Gln Glu His Gln Arg Met Ala Val

145 150 155 160

Asp Ser Ile Val Thr Gln Arg Ala Leu Arg Glu Ile Tyr Leu Leu Pro

165 170 175

Phe Gln Leu Ala Met Arg Ile Cys Arg Thr Ala Cys Val Met Thr Ala

180 185 190

Tyr Asn Lys Val Asn Gly Thr His Val Ser Gln Asn Lys Glu Ile Ile

195 200 205

Thr Asp Ile Leu Arg Lys Glu Trp Gly Trp Asp Gly Leu Val Met Ser

210 215 220

Asp Trp Phe Gly Thr Tyr Ser Thr Ser Asp Ala Ile Asn Ala Gly Leu

225 230 235 240

Asp Leu Glu Met Pro Gly Lys Thr Arg Trp Arg Gly Thr Ala Leu Ala

245 250 255

His Ala Val Ser Ser Asn Glu Val Ala Glu Phe Val Met Asp Glu Arg

260 265 270

Val Arg Asn Val Leu Asn Leu Val Asn Phe Val Asp Gly Leu Asn Ile

275 280 285

Pro Glu Asn Ala Pro Glu Lys Ala Leu Asn Arg Pro Gln Asp Gln Ala

290 295 300

Leu Leu Arg Arg Ala Ala Ala Glu Ser Val Val Leu Met Lys Asn Glu

305 310 315 320

Glu Asp Ile Leu Pro Leu Lys Lys Glu Lys Ser Ile Leu Val Ile Gly

325 330 335

Pro Asn Ser Lys Val Ala Ala Tyr Cys Gly Gly Gly Ser Ala Ser Leu

340 345 350

Asp Ala Tyr Tyr Thr Val Thr Pro Phe Glu Gly Val Ser Ala Gln Ser

355 360 365

Lys Gly Glu Val Lys Phe Ser Gln Gly Val Tyr Ser His Lys Asp Leu

370 375 380

Pro Leu Leu Gly Pro Leu Leu Lys Thr Ala Asp Gly Lys Thr Gly Phe

385 390 395 400

Ser Phe Lys Val Tyr Asn Glu His Pro Ser Glu Ser Asn Arg Glu Leu

405 410 415

Ile Glu Gln Leu His Leu Val Ser Ser Ser Gly Phe Leu Met Asp Tyr

420 425 430

Val Asn Pro Lys Ile Lys Ser Leu Thr Tyr Tyr Val Asp Met Glu Gly

435 440 445

Leu Phe Thr Pro Glu Glu Asp Gly Val Tyr Asp Phe Gly Val Thr Val

450 455 460

Val Gly Thr Gly Gln Leu Phe Ile Asp Gly Glu Leu Val Val Asp Asn

465 470 475 480

Thr Lys Asn Gln Arg Gln Gly Ser Ala Phe Phe Gly Ser Ala Thr Val

485 490 495

Glu Glu Lys Gly Ser Lys Glu Leu Lys Ala Gly Gln Thr Tyr Lys Val

500 505 510

Leu Phe Gln Phe Gly Thr Ala Pro Thr Ser Asp Leu Asp Thr Arg Gly

515 520 525

Val Val Val Phe Gly Pro Gly Gly Phe Arg Phe Gly Ala Ser Arg Arg

530 535 540

Val Gly Gln Glu Glu Leu Ile Ser Asn Ala Val Lys Leu Ala Ser Glu

545 550 555 560

Ala Glu Gln Val Val Val Phe Ala Gly Leu Thr Ser Glu Trp Glu Thr

565 570 575

Glu Gly Tyr Asp Arg Asp His Met Asp Leu Pro Pro Gly Ser Asp Glu

580 585 590

Met Ile Ser Arg Val Leu Asp Val Asn Pro Asn Ala Val Val Val Ile

595 600 605

Gln Ser Gly Thr Pro Val Thr Met Pro Trp Ala Asn Lys Thr Lys Ala

610 615 620

Leu Leu His Ala Trp Phe Gly Gly Asn Glu Cys Gly Asn Gly Ile Ala

625 630 635 640

Asp Val Leu Tyr Gly Asp Val Asn Pro Ser Gly Lys Leu Pro Ile Thr

645 650 655

Phe Pro Val Arg Leu Gln Asp Asn Pro Ser Tyr Val Asn Phe Arg Ser

660 665 670

Glu Arg Gly Arg Val Leu Tyr Gly Glu Asp Val Tyr Val Gly Tyr Arg

675 680 685

Tyr Tyr Glu Lys Val Asp Leu Ala Pro Leu Phe Pro Phe Gly His Gly

690 695 700

Leu Ser Tyr Thr Thr Phe Thr Arg Ser Asp Leu Thr Leu Thr Thr Thr

705 710 715 720

Pro Glu Lys Pro Gln Tyr Glu Glu Ser Gly Glu Pro Ile Thr Ala Thr

725 730 735

Val Thr Val Thr Asn Thr Gly Lys Val Ala Gly Ala Glu Ile Val Gln

740 745 750

Leu Trp Val Ala Pro Pro Ala Thr Glu Val Asn Arg Pro Val Arg Glu

755 760 765

Leu Lys Gly Phe Thr Lys Val Phe Leu Gln Pro Gly Glu Gln Lys Lys

770 775 780

Val Glu Ile Val Val Glu Lys Lys Leu Ala Thr Ser Trp Phe Asp Glu

785 790 795 800

Met Arg Glu Lys Trp Ala Ser Glu Lys Gly Glu Tyr Glu Val Leu Val

805 810 815

Thr Gly Thr Gly Glu Gly Val Leu Lys Ser Ser Phe Lys Val Glu Lys

820 825 830

Thr Arg Tyr Trp Leu Gly Leu

835

<210> 3

<211> 2571

<212> DNA

<213> 米曲菌（Aspergillus oryzae）

<400> 3

atgcctcgtc tagacgtcga gaagaccatc gaagaactct ccctagggga gaaggtcgcc 60

ttgacggccg gtaagtcaaa aacccacgat cgcaagagaa aagaaatgct aagaatccca 120

ggaatcgact tctggcacac agcttccgtg ccccgcctca acatcccaac tctccgcatg 180

tccgatggcc ccaacggcgt gcgcggaact cgcttcttca acggcgtccc agccgcatgt 240

ttcccttgtg ccacggcact gggcgcaacc tgggacaccg agctgctcca tgagattggt 300

caattgatgg gagaggaatc cattgccaag ggctcgcaca ttattctagg ccccacgatc 360

aacacccagc ggtctccgct cggaggtcgt ggattcgagt cctttgctga ggacggtgtg 420

ctctctggac tcttggccgg ttatatctcc aagggtattc aggagaaggg cgttgcggcc 480

actctgaagc actttgtgtg caatgaccag gagcatcagc gtatggctgt tgatagcatt 540

gttacgcagc gggctctgcg cgagatctat ttgttgccgt ttcaattggc catgaggatt 600

tgcaggacgg cttgtgttat gacagcttat aacaaggtga atggaacgca cgttagtcag 660

aataaggaaa tcatcacgga tatcttgcgg aaggagtggg gatgggatgg gttggttatg 720

agtgattggt tcggtaccta cagtaccagt gatgcaatca atgctggttt ggacctggag 780

atgccgggca agacacgctg gcgtggaact gctctggcgc atgccgtttc ttcgaacgag 840

gtcgctgagt ttgtcatgga tgagcgtgtc cgcaatgtgt tgaacctggt taactttgtg 900

gatggcctga acatcccgga gaacgccccg gagaaggctc tcaaccggcc acaggaccaa 960

gctcttctcc gccgtgctgc ggcggagtct gtcgttctca tgaagaacga ggaagacatc 1020

ttgcccctga agaaggagaa gtctatcttg gttattggtc ctaactccaa ggttgcggcg 1080

tactgcggcg gtggatccgc gtctttggat gcttattaca ctgtcacccc attcgagggt 1140

gtctcggctc agagcaaggg tgaggtcaag ttctctcaag gtgtctattc gcacaaggac 1200

cttcctctcc ttggacccct gctgaagacc gccgacggca agactggttt ctcattcaag 1260

gtatacaacg agcacccttc cgagtctaac cgcgaactta tcgagcagct gcacctggtc 1320

tcgtcgagcg gattcctaat ggactatgtc aaccccaaga tcaagtctct cacctactac 1380

gtcgacatgg agggtctctt cacccccgag gaagacggtg tctacgactt cggtgtcact 1440

gttgttggca ccggccaact gttcatcgac ggcgagctcg tcgttgacaa caccaagaac 1500

cagcgccagg gctccgcctt cttcggctcc gctaccgtcg aagagaaggg ctccaaagaa 1560

ctcaaggccg gccaaacata caaggttctc ttccagttcg gcacagcccc tacctccgac 1620

ctcgataccc gcggcgtggt agtcttcgga cccggtggct tccgcttcgg agccagccgt 1680

cgcgtcggcc aggaagagct catctccaac gccgtcaagc tcgcctccga ggccgaacaa 1740

gtagtcgtct tcgccggtct gactagcgaa tgggaaaccg agggctacga ccgcgaccac 1800

atggaccttc cccccggcag cgacgagatg atctcgcgcg tgctggacgt caacccgaac 1860

gccgtcgtgg tcattcagag cggcacccca gtgaccatgc catgggccaa caagaccaag 1920

gctctcctac acgcctggtt cggcggtaac gagtgcggta acggtatcgc ggacgtgctc 1980

tacggcgacg tcaacccctc cggcaagctg cccattactt tccccgtacg tctgcaggac 2040

aaccccagct acgtcaactt tcgttccgag cgcggccgtg tcctctacgg tgaagacgtc 2100

tacgtcggat accgctacta cgaaaaggtc gatctggccc ctctcttccc cttcggccac 2160

ggtctctcct acaccacctt cacccgctcc gacctgaccc tcaccaccac tcccgagaag 2220

ccccagtacg aagaaagcgg cgagcccatc accgcaaccg tcacggtgac caacaccggc 2280

aaggtcgccg gtgcagagat cgtccagctc tgggtcgctc ccccggcaac ggaagtcaac 2340

cgtcccgtcc gcgaactcaa gggattcact aaggtcttcc tgcagcctgg tgagcagaag 2400

aaggtcgaga tcgtcgtgga gaagaagctg gcgacgagtt ggttcgacga gatgcgcgag 2460

aagtgggcgt ccgagaaagg cgagtatgag gttcttgtaa ctggtactgg cgagggtgtt 2520

cttaagtcgt ccttcaaggt cgagaagact cgctactggt tgggtctgtg a 2571

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AOBGL11-F

<400> 4

atgcctcgtc tagacgtcga gaa 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> AOBGL11-R

<400> 5

tcacagaccc aaccagtagc ga 22

Claims (26)

1.一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的制造方法，其特征在于，包括以下步骤，即，使由序列号2的氨基酸序列构成的蛋白质与具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷反应，而使底物芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷为选自芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚单葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))以及芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)中的任一种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷为STG。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

7.一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的制造方法，其特征在于，包括以下步骤，即，在宿主细胞内，使来自非人转化细胞的酶试剂与具有至少1个糖苷键的底物芝麻素酚糖苷接触，将底物芝麻素酚糖苷的至少1个糖苷键水解，其中非人转化细胞导入了编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸由序列号1的碱基序列构成。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸为插入于表达载体的多核苷酸。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述转化细胞选自转化植物、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转化细胞选自转化植物、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述转化细菌为转化大肠杆菌。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述转化细菌为转化大肠杆菌。

14.根据权利要求7～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述底物芝麻素酚糖苷选自芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚单葡萄糖苷，SMG)、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-2)二葡萄糖苷，SDG(1,2))、芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-6)-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚(1-6)二葡萄糖苷，SDG(1,6))以及芝麻素酚2′-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2)-O-(-β-D-吡喃葡萄糖基(1-2))β-D-吡喃葡萄糖苷(芝麻素酚三葡萄糖苷，STG)中的任一种。

15.根据权利要求7～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷为选自SDG(1,6)、SDG(1,2)及芝麻素酚中的任一种以上。

17.根据权利要求7～13中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

18.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述至少1个糖苷键为选自键合于芝麻素酚2′位的葡萄糖与糖苷配基之间的糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的龙胆二糖的β-1,6-糖苷键、键合于芝麻素酚2′位的槐糖的β-1,2键或键合于芝麻素酚2′位的分支三糖的β-1,6-糖苷键或β-1,2键中的任一种。

20.一种生成芝麻素酚或生成芝麻素酚糖苷的生产方法，其特征在于，包括培养非人类转化体，该非人类转化体导入了编码由序列号2的氨基酸序列所构成的蛋白质的多核苷酸。

21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸由序列号1的碱基序列构成。

22.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸为插入于表达载体的多核苷酸。

23.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述转化体选自转化植物、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

24.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述转化体选自转化植物、转化细菌、转化酵母、转化丝状菌。

25.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述转化细菌为转化大肠杆菌。

26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述转化细菌为转化大肠杆菌。

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