JPWO2015119219A1 - 新規β−グルコシダーゼおよび同酵素を用いる易分解性セサミノール配糖体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年2月6日に出願された、日本国特許出願第2014−021669号明細書(その開示全体が参照により本明細書中に援用される)に基づく優先権を主張する。
項1.配列番号2に示すアミノ酸配列を有するか;又は
配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、セサミノール配糖体のβ−1,2−グルコシド結合を切断する酵素活性を有し、かつ6−セサミノールジグルコシドのβ−1,6−グルコシド結合及びセサミノール−グルコース間のβ−グルコシド結合を切断してセサミノールを生成する酵素活性が抑制されている、
ペプチド。
上記工程で得られた6−セサミノールジグルコシドに、β−1,6−グルコシド結合を切断する酵素を作用させる工程、
を含むセサミノールモノグルコシドの製造方法。
本発明は、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。配列番号2に示すアミノ酸配列を図3に示す。ここで、配列番号2に示すアミノ酸配列は、本願実施例において製造した酵素PSTG2のアミノ酸配列である。
本発明は、上記本発明のペプチドをコードする核酸分子を提供する。かかる核酸分子としては、例えば、配列番号1に示す塩基配列を有する核酸分子、配列番号1に示す塩基配列において、1又は数個の塩基が変異してなるもの等が挙げられる。例えば、配列番号1に示す塩基配列に対し、非コード部位の変異、もしくはエキソンにおける最終的なアミノ酸配列には関与しない範囲での変異であるサイレント変異を生じさせたもの等が挙げられる。
本発明は、上記本発明のペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。本発明においては、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等いずれのベクターであっても利用できる。
本発明は、上記ベクターを導入した形質転換体を提供する。宿主となる微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌などの細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞等を使用することができ、大腸菌等が好ましい。
本発明はまた、セサミノール配糖体のβ−1,2−グルコシド結合を切断する酵素の製造方法を提供する。本発明の方法においては、前述の本発明の核酸分子が用いられる。
本発明は、セサミノールトリグルコシドを含む基質材料に、前述した本発明のペプチドを作用させる工程を含む、セサミノールモノグルコシド及び/又は6−セサミノールジグルコシドの製造方法を提供する。
1.1 KB0549株のゲノム抽出
KB0549株(受託番号FERM P-21057として寄託されたPaenibacillus sp.)のゲノムを次のようにして抽出した。KB0549株をグリセロールストックからKB通常培地(1% Tripton, 0.5% Yeast Extract) 100 mlに植菌し、37℃で二日間振盪培養した。培養液10 ml分を遠心して集菌し、TEバッファー(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA)で洗浄した。567μlのTEバッファーに再懸濁し、10% SDSを30 μl、10 mg/ml Proteinase Kを6 μl添加し、37℃で1時間インキュベートすることで溶菌および内在タンパク質の分解を行った。その後5 M NaClを100 μl添加して十分に懸濁し、10% CTAB-0.7 M NaClを100 μl添加した。65℃で10分間インキュベートしてタンパク質および多糖類等とCTAB間に不溶性の複合体を形成させ、等量のCIA溶液(chloroform : isoamyl alocohol = 24 : 1) を添加して5分間遠心し上層を回収した。さらに回収した上層に対してフェノール・クロロホルム抽出を行い、回収した上層に0.6倍量のイソプロパノールを添加してゆっくりと転倒混和した。析出したゲノムを回収して70%エタノールで3回洗浄し、遠心エバポレーターを用いて溶媒を揮発させた後400 μlのTEバッファーに溶解させた。ここに10 mg/ml RNaseAを0.4 μl添加し37℃で30分間インキュベートすることで、抽出したゲノム中に含まれるRNAを分解した。さらに10 mg/ml ProteinaseKを4 μl添加して37℃で1時間インキュベートした後、フェノール・クロロホルム抽出を行った。回収した上層に1/10倍量の3 M 酢酸ナトリウム、2.2倍量のイソプロパノールを添加してゆっくりと転倒混和し、析出したゲノムを回収した。これを70%エタノールで3回洗浄した後遠心エバポレーターを用いて溶媒を揮発させ、適量のTEバッファーに溶解させた。このDNA溶液をKB0549株のゲノム溶液とした。
PSTG遺伝子の周辺に存在する遺伝子を探索するため、inverse PCR法を用いて既知配列の伸長を試みた。
各ORFのアミノ酸配列をBLAST検索したところ、PSTG遺伝子の上流領域にGlycoside Hydrolase family 3 (GH3) 、下流領域にエステラーゼ、Glycoside Hydrolase family 20 (GH20) に属すると考えられる遺伝子が順次存在していた。そこでKB0549株のゲノムからこれらの遺伝子のクローニングを試みた。
取得したKB0549株のゲノムを鋳型として制限酵素サイトを付加したプライマーを用いてPCRを行い、上述の3つの遺伝子を増幅した。DNAポリメラーゼはKOD-plus neo-を用い、反応液組成は製造業者の推奨する条件に従った。用いプライマーセットとサイクル条件を以下に示す。
得られたDNA断片に対して10x A-attachment mix (TOYOBO)を用いて60℃、30 minの条件でdA付加を行った。反応液組成は製造業者の推奨する条件に従った。dA付加後のDNA断片を0.8%アガロースゲルに供して電気泳動を行って分離し、目的の断片と同じ大きさのバンドを切り出した。そのゲル中の断片をHihg pure PCR product purification kit (Roche) を用いて回収した。回収したDNA断片をpGEM-T Easy Vector Systems (Promega) を用いてpGEM-T-easy vectorへと挿入した。作成したプラスミドで大腸菌株DH5αを形質転換し、50 μg/ml アンピシリンを含むLB寒天培地上において37℃で一晩培養した。生育したコロニーの内、白色のものについてコロニーPCRを行い目的のDNA断片を持つものをさらに選抜した。選抜したコロニーをアンピシリンを含むLB液体培地 (50 μg/ml) で一晩培養し、FastGene Plasmid Mini Kit (FastGene) を用いてプラスミドを回収した。回収したプラスミドの目的DNA断片中のPCRエラーの有無を、DNAシークエンシング解析を行い確認した (コンストラクト名;pGEM T Easy esterase, GH20, or GH3)。
エステラーゼ、GH20、GH3を大腸菌で異種発現するためのコンストラクトの作成を行った。2.2で作成したプラスミドに対して、挿入した目的DNA断片を制限酵素を用いて切り出した(esterase; XhoI/PstI, GH20, GH3; SacI/XhoI)。切り出したDNA断片を0.8%アガロースゲルに供して電気泳動を行って分離し、目的DNA断片のバンドを切り出した後、ゲル中のDNA断片を前述の方法で回収した。発現ベクターpColdI (Takara)も同様の制限酵素で処理した後、pColdIと目的DNA断片をLigation high Ver.2 (TOYOBO) を用いてpColdIへと挿入した(コンストラクト名;pColdI esterase, GH20, or GH3)。
2.3.で作成したコンストラクト(pColdI esterase, GH20, or GH3)で大腸菌株BL21を形質転換し、50 μg/ml アンピシリンを含むLB培地寒天培地上において37℃で一晩培養した。生育したコロニーに対してコロニーPCRを行い、目的のDNA断片を持つコロニーを選抜した。選抜したコロニーを50 μg/ml アンピシリンを含むLB液体培地1 mlに植菌し、37℃で一晩培養した。この培養液をLB液体培地100 mlに1 ml植菌し37℃で振盪培養した。600 nmにおける光学濃度が0.4-0.5に達した際に氷水で急冷後、15℃で30分間振盪してコールドショックプロモーターを活性化させた。その後IPTGを終濃度が1 mMとなるように培養液に添加し、15℃で24時間振盪培養した。
以下の精製作業はすべて4℃で行った。3.1.5で発現誘導した菌体を4℃、7000 x gで5分間遠心して回収し、binding buffer (20 mM リン酸ナトリウム buffer(pH 7.4), 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole) で洗浄した。ペレットを破砕用バッファー (20 mM リン酸ナトリウムbuffer(pH 7.4), 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 1 mM フッ化フェニルメチルスルホニル (PFMS), 1 mg/ml lysozyme) 10 mlに懸濁し、超音波破砕機 (Branson sonifier 250)を用いて破砕した(Output Control 2 , Duty cycle 40%, 1 min on, 2 min off x 3)。破砕後4℃、15000 x gで30分間間遠心して膜画分などの残滓を除去し、上清を0.45 μm シリンジフィルター (Millipore) に通すことで残滓を完全に取り除いたものを粗酵素液とした。
PSTG1遺伝子周辺に存在する遺伝子の中で、PSTG1と同じ酵素ファミリーに属すると考えられるGH3について機能解析を行った。以下、GH3をPSTG2と示す。
PSTG2のSTGに対する反応性を評価した。反応液組成を以下に示す。
PSTG1のSTGに対する反応性を評価した。反応液組成を以下に示す。
PSTG1とPSTG2をともに反応系に添加し、STG分解のタイムコースを評価した。反応液組成を以下に示す。
精製したPSTG2および市販のセルラーゼであるエンチロン S-KTL (洛東化成工業) を用いて、STGを基質としたSMG産生を試みた。
上記4.で使用したエンチロンS-KTLのSTGの分解活性を評価した。反応液組成を以下に示す。
p-ニトロフェニルβグルコシドの加水分解活性で酵素量(10ユニット)を揃えた各セルラーゼ標品の6-SDG分解活性を比較した。すなわち、0.8mM 6-SDGを含有する0.01 Mリン酸カリウム緩衝液700μlにセルラーゼ10ユニットを添加し、37℃で5 minインキュベートした。98℃で2 min反応液を処理して反応を停止し、遠心分離して得られた上清を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)に供し、反応液中に残存する6-SDG、および生成したセサミノールモノグルコシド(SMG)とセサミノールの量を求めた。
Claims (8)
- 配列番号2に示すアミノ酸配列を有するか;又は
配列番号2に示すアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加してなるアミノ酸配列を有し、セサミノール配糖体のβ−1,2−グルコシド結合を切断する酵素活性を有し、かつ6−セサミノールジグルコシドのβ−1,6−グルコシド結合及びセサミノール−グルコース間のβ−グルコシド結合を切断してセサミノールを生成する酵素活性が抑制されている、
ペプチド。 - 請求項1に記載のペプチドをコードする核酸分子。
- 請求項2に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターを導入した形質転換体。
- 大腸菌である、請求項4に記載の形質転換体。
- 請求項4又は5に記載の形質転換体により生産される、セサミノール配糖体のβ−1,2−グルコシド結合を切断する酵素。
- 請求項4又は5に記載の形質転換体を培養する工程を含む、セサミノール配糖体のβ−1,2−グルコシド結合を切断する酵素の製造方法。
- セサミノールトリグルコシドを含む基質材料に、請求項1に記載のペプチド又は請求項6に記載の酵素を作用させる工程を含む、セサミノールモノグルコシド及び/又は6−セサミノールジグルコシドの製造方法。
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