JP4839231B2

JP4839231B2 - セサミノール配糖体のグルコシド結合分解酵素および前記酵素を産生する微生物

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Publication number: JP4839231B2
Application number: JP2007005427A
Authority: JP
Inventors: ナイールアルーン; 邦夫清本; 亨中山
Original assignee: Kiyomoto Iron and Machinery Works Co Ltd
Current assignee: Kiyomoto Iron and Machinery Works Co Ltd
Priority date: 2007-01-15
Filing date: 2007-01-15
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2027-01-15
Also published as: JP2008167712A

Description

本発明は、セサミノールの配糖体を基質としてセサミノールを生成させる新規な酵素、特に配列番号２のアミノ酸配列を持つ酵素、前記酵素を産生する微生物であるPaenibacillus sp. KB0549，および前記酵素をコードする配列番号１のデオキシリボ核酸に関する。

ゴマ油は他の植物油よりも酸化に対して安定である。これはゴマ油中に数種のゴマ特有の抗酸化成分（セサモール、セサミノールなどのリグナン類）が存在するためである。ゴマ種子中で最も豊富なリグナンはセサミン、セサモリン、ピノレシノール、セサミノールなどであり、それらのいくつかは配糖体として存在する。これらのゴマリグナンの中で、セサミノールはゴマリグナン類の中でもとりわけ高い抗酸化活性をもつ、セサミノールはゴマ種子中においてトリグルコシド［２，６−Ｏ−ジ（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルコピラノシルセサミノール］、ジグルコシド、およびモノグルコシドなどの配糖体として存在し、ゴマ油の精製工程でセサモリンから酸触媒反応によっても生成する。セサミノールは、その強い抗酸化活性と関連して、ヒトの健康に好ましいいくつかの生理活性を示す。例えばセサミノールは、循環器系疾患の原因となる低密度リポタンパクの酸化に対する強力な阻害剤となるほか、ヒトリンパ球白血病細胞（lymphoid leukemia cells）にアポトーシスを誘起させることにより抗腫瘍活性を示すことも報告されている。こうしたセサミノールの有益な生理活性はもっぱら糖部分が除去された型（アグリコン）で発揮される。セサミノールアグリコンは、近年明らかにされてきたゴマの数々の有益な生理機能の一翼を担っていると考えられ、セサミノール配糖体を加水分解してセサミノールを大量に生産することにより、健康サプリメントなど多方面の展開が可能となる。
セサミノールはゴマ油製造の際に排出されるゴマ搾りかす（sesame oil cake；ＳＯＣ）に多量に含まれる。ＳＯＣは多くの場合廃棄処分されているため、セサミノールはこのＳＯＣを安価な原料として生産することが可能である。原理的には、ＳＯＣからエタノールによりセサミノール配糖体を含むリグナン配糖体を抽出し、β−グルコシダーゼ処理によりそれらのアグリコン型を製造する方法が有効であると考えられる。しかしながら、セサミノール配糖体はその構造中に難分解性のβ−１，２−結合を含む分岐オリゴ糖構造をもち、また、セサミノールの芳香環がβ−グルコシダーゼの作用に対する立体障害となるため、既往のβ−グルコシダーゼでは分解が非常に困難であった。したがって、セサミノールの産業的製造を実現させるためには、配糖体の糖部分を効率よく除去する方法を見いだすことが重要な課題となっていた。

セサミノール配糖体からセサミノールを取得するβ−グルコシダーゼの給源として、例えば真菌Aspergillus属微生物を用いる方法や、バチルス属およびエンテロコッカス属細菌の混合培養物を用いた醗酵法が開示されている（特許文献１、２）。しかしながら、これらの方法はセサミノール配糖体を完全に分解するために長時間を要するなど、依然として効率が低く、実用化には至っていない。現時点ではセサミノールを効率よく生産する技術は見出されていない。

特開２００５−２３１２５号公報特開２００６−６１１１５号公報

発明者は，セサミノール配糖体を効率よく加水分解しうる、これまでにない新しいβ−グルコシダーゼ生産微生物を自然界に幅広く探索することが、セサミノールの効率よい製造方法を確立するために不可欠であると考え、この点について鋭意検討した。その結果、そのような微生物KB0549株をＳＯＣ中に発見した。そしてその微生物の産生するβ−グルコシダーゼを取得し、同酵素の部分アミノ酸配列の決定し、同酵素をコードする遺伝子も取得した結果、前記の課題を解決することができ、本発明を完成するに至った。KB0549株はPaenibacillus 属に属する細菌（Paenibacillus sp.）であることを明らかにし、該菌株を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-21057として寄託した。

本発明の第１は、（１）セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−グルコシド結合を切断する活性を有する、Paenibacillus(パエニバチルス)属の微生物から産生される酵素であって、（２）配列番号２のアミノ酸配列を持つ酵素、又は、（３）前記（２）に記載の配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を持つ酵素である。
本発明の第２は、（４）FERM P-21057として寄託したPaenibacillus sp. KB0549と称する前記（１）又は（２）に記載の酵素を産生する微生物である。
本発明の第３は、（５）配列番号１に記載の前記（２）又は（３）に記載の酵素をコードするデオキシリボ核酸である。
本発明の第４は、（６）前記（５）に記載のデオキシリボ核酸を含むベクターであり、本発明の第５は、（７）前記（６）に記載のベクターを導入した形質転換体、好ましくは、（８）形質転換体が大腸菌であることを特徴とする前記（７）記載の形質転換体である。
本発明の第６は、（９）前記（７）に記載の形質転換体によって産生されるセサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−１グルコシド結合を切断する前記（２）に又は（３）記載の組換え型酵素である。
本発明の第７は、（１０）受託番号FERM P-21057として寄託した微生物を５〜７０質量％のゴマ油滓またはリグナン配糖体０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）を基質として培養することを特徴とする、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−１グルコシド結合を切断する前記（２）酵素を製造する方法である。また、本発明の８は、（１１）前記（７）又は（８）に記載の形質転換体用いることを特徴とする、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間のβ−グルコシド結合を切断する前記（２）又は（３）に記載の酵素を製造する方法であり、本発明の９は、（１２）又はセサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料に前記（１０）または（１１）に記載の酵素を製造する方法を用いて生成した酵素を用いたセサミノールの製造方法である。

本発明によりもたらされる効果は主として次の２点である。本出願に係る発明の配列番号２のアミノ酸配列を有する酵素は、セサミノール配糖体のβ−１，２−およびβ−１，６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−グルコシド結合を効率よく切断するので、セサミノール配糖体からのセサミノールの高効率な酵素的生産が可能となる。また、前記酵素を産生する微生物を用いれば、発酵工学技術によりセサミノール配糖体からセサミノールを製造することができる。

Paenibacillus sp. KB0549株は，前述のように試行錯誤により数多くの微生物の特性を検討するなかから見いだしたものである。本菌株の生産するβ‐グルコシダーゼは，セサミノール配糖体のβ−１，２−およびβ−１，６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β‐グルコシド結合を効率よく切断する。KB0549株あるいは本菌株の生産するβ‐グルコシダーゼを用いることにより、セサミノールを効率的に生産できる工業的なセサミノール製造方法が確立できる。前記酵素は、例えば図４、図５、図６、図７に示すセサミノールグルコシドからセサミノールを製造する工程で利用される。

Paenibacillus sp. KB0549の分類学的位置づけは，以下のとおりである。
Domain:Bacteria
Phylum:Firmicutes
Class: Bacilli
Order: Bacillales
Family:Paenibacillaceae
Genus: Paenibacillus
また16S rDNA配列に基づく系統解析（CLUSTAL W ver 1.83）により，本菌株のPaenibacillus 属における位置づけを推定した結果は図１のとおりである。

市販のAPI Carbohydrate assayやAPIZYM assayキットを用いてKB0549株の生理生化学的な特性を明らかにした。結果をそれぞれ図２と図３に示す。

実施例１
Paenibacillus sp. KB0549から以下のようにして細胞内β‐グルコシダーゼを精製し、酵素の部分アミノ酸配列を決定した。
Paenibacillus sp．KB0549菌体を、０．５％（ｗ／ｖ）バクトペプトン（bactopeptone）、０．２５％酵母エキス、及び０．０２５％のセサミノールトリグルコシド粉末を含むｐＨ６．５の培養液にて３７℃で一昼夜培養した。以下の酵素精製操作は４℃で行った。
（Ａ）粗酵素液の調製
培養物（８リットル）を遠心分離（12000×ｇ、２０分間；Beckman社製 JLA8,1000 ローターを使用）に供し、KB0549株の細胞を沈殿として回収した。回収した細胞を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、緩衝液Ａ；３０ｍｌ）中に懸濁し、細胞破砕器（Branson Sonifer）を用いて一定の周波数の超音波を１分間あたり１０サイクル照射することにより破砕した。破砕液を遠心分離（10,000×g，30分（Beckman社製 JLA 12ローターを使用）に供し、上清（可溶性画分）を回収し、緩衝液Ａに対して透析した。
（Ｂ）イオン交換クロマトグラフィー（１）
あらかじめ緩衝液Ａで平衡化したANX-セファロースカラム（Amersham社製；直径1.６ cm，高さ１０ｃｍ）に透析内液を負荷した。カラムに吸着したβ‐グルコシダーゼ活性を、塩化ナトリウムの直線濃度勾配（０〜１Ｍ；カラム容積の８倍量）により溶出した。活性画分を集め、アミコン遠心濃縮装置により適当な容積にまで濃縮し、緩衝液Ａに対して透析した。
（Ｃ）イオン交換クロマトグラフィー（２）
あらかじめ緩衝液Ａにて平衡化したＱ−セファロースカラム（Amersham社製；直径1.６ cm，高さ10 cm）に透析内液を負荷した。カラムに吸着した酵素活性は前記Ｂに記載と同様な方法で溶出させた。活性画分を集め、アミコン遠心濃縮装置により適当な容積にまで濃縮し、緩衝液Ａに対して透析した。
（Ｄ）ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー
あらかじめ緩衝液Aにて平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（Bio-Rad社製；直径1.0 cm，高さ6.4 cm）に負荷した．カラムに吸着した酵素活性を，リン酸カリウム（ｐＨ６．５）の直線濃度勾配（１０ｍＭ〜５００ｍＭ；カラム容積の１２倍量）により溶出した。活性画分を集め、アミコン遠心濃縮装置により適当な容積にまで濃縮し、緩衝液Ａに対して透析した。
（Ｅ）イオン交換クロマトグラフィー（３）
透析試料を、緩衝液Aにて平衡化したMono Q カラム（Amersham社製；直径１．０ｃｍ、高さ１０ｃｍ）に負荷した．カラムに吸着した酵素活性を，リン酸カリウム（ｐＨ６．５）の直線濃度勾配（１０ｍＭ〜２５０ｍＭ；カラム容積の１０倍量）により溶出した。活性画分を集め、アミコン遠心濃縮装置により適当な容積にまで濃縮した。
（Ｆ）疎水性相互作用クロマトグラフィー
２０％（ｖ／ｖ）エチレングリコールを含む緩衝液Aにてあらかじめ平衡化したPhenyl Sepharose High Performance カラム（Amersham社製；直径１．６ｃｍ、高さ２．５ｃｍ、５ｍｌカラム）に濃縮試料を負荷した．カラムに吸着した酵素活性を，エチレングリコールの直線濃度勾配（２０％〜５０％；カラム容積の１０倍量）により溶出した。活性画分を最終精製標品として集めた。純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（銀染色）により検定した．以上の操作により，酵素活性の本体である分子質量８５ｋＤａのタンパク質が均一状態に精製された。精製酵素タンパク質のＮ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸部分配列を常法により決定した。

上述のようにして得られた精製酵素標品について部分アミノ酸配列（Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸配列）を以下のように決定した（アミノ酸の１文字表記で示す）。
Ｎ末端アミノ酸配列：SERRDLKALISQMTLEEKAS
内部アミノ酸配列２−１：VNGEYAAENERL（配列番号２のアミノ酸２０４番〜２１５番の相当）
内部アミノ酸配列２−２：PTRLDDIVFE（配列番号２のアミノ酸３５７番〜３６６番の相当）
内部アミノ酸配列２−３：LAETFPVQLSDN（配列番号２のアミノ酸４９７番〜５０８番の相当）
内部アミノ酸配列２−４：LRGMIPFGET（配列番号２のアミノ酸７０１番〜７１０番の相当）

実施例２
Paenibacillus sp. KB0549株を培養することによりセサミノールトリグルコシドからセサミノールを製造する方法を以下に記載する。
KB0549株を、０．５％（ｗ／ｖ）バクトペプトン、０．２５％酵母エキス、及び０．０２５％のセサミノールトリグルコシド粉末を含むｐＨ６．５の培養液にて３７℃で一昼夜培養した。培養菌体を４℃、７０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより除去した。上清を凍結乾燥後、クロロホルムにてセサミノールを、また、７５％エタノールでセサミノール配糖体を抽出した。抽出物を逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Hitachi Lachromシステム）に供し、セサミノール関連化合物を分析した。
ＨＰＬＣ条件は次の通りである：
カラム、Wakosil II 5C18HG（４．６φ×２５０ｍｍ、和光純薬製）；
流速、０．８ｍｌ／ｍｉｎ；
展開溶媒：A，１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸；
Ｂ：８０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸カラムを０〜１００％Ｂの直線濃度勾配（４０分間）により展開した。クロマトグラムは２８０ｎｍにて検出することにより得られ、標準試料の保持時間と比較することによりリグナン類を同定した．生成物がセサミノールであることは、ＬＣ−ＷＳスペクトル測定により、溶出位置ならびに分子量（分子量３７０）などの点から確認した。
以上のようにして、KB0549株を培養することによりセサミノールトリグルコシドからセサミノールを製造することができた。
次に未焙煎ゴマ（黒ゴマ，白ゴマ，金ゴマ），焙煎ゴマ，ゴマ脱脂粕を出発原料として、それら中に含まれるセサミノールトリグルコシドやセサミノールジグルコシドをセサミノールに微生物変換する方法についても検討した。
粉末化した各ゴマ試料３ｇを５０ｍｌ容試験管に入れ、３ｍｌの水と混合し、加圧蒸気滅菌した。これにKB0549株の培養物（２．１ｍｌ、１×１０^７ｃｆｕ／ｍｌ）を接種し、ふらん器中で３７℃で７２時間インキュベートした。一定量の反応液を２４時間ごとにサンプリングし、クロロホルムにてセサミノールを、また、７５％エタノールでセサミノール配糖体を抽出した。抽出物中のセサミノール関連物質をＨＰＬＣで分析した。

実施例３
Paenibacillus sp. KB0549株のβ‐グルコシダーゼ遺伝子のクローニング。
Paenibacillus sp．KB0549細胞からゲノムＤＮＡを以下のようにして調製した：
KB0549細胞をデンプン培地（１％可溶性デンプン、０．５％ペプトン、及び０．５％酵母エキス；１リットル）を用いて培養した。培養菌体を集め、１５ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Tris-Cl、１ｍＭ EDTA;ｐＨ８．０）中に懸濁した。これに、1 ｍｌの１０％ＳＤＳおよび１００μｌのプロテイナーゼＫを加えた。混合物を３７℃で１時間インキュベート後、５Ｍ塩化ナトリウムを３．６ｍｌ及びＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド)／NaCl混液を３．０ｍｌ加えた。混合物を６５℃で３０分間インキュベートした。次いで、等容量のクロロホルム・イソアミルアルコール混液を加えて激しくかくはん後、混合物を遠心分離器にかけた（4000×ｇ、１０分間；室温）。広口ピペットを用いて上層を新しい試験管に移し、それと等容量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加えた．混合後，混合液を遠心分離（4000×ｇ、5分間；室温）に供した．上層を新しい試験管に移し、液体中に含まれるデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を２−プロパノールの添加により沈殿させた。沈殿を７０％エタノールで洗浄し、ペレットを４ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解させ、３．６４ｍｇのKB0549株ゲノムＤＮＡを得た。
前述のようにして決定した精製酵素のＮ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列にもとづいて縮重プライマーを設計し、KB0549株ゲノムＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。まず、プライマーとしてSi80BGF1(TCACAAATGACRTTAGAAGAAAAGGC)及びSi80BGR2(ATCGCTTAAYTGNACCGGGAANGTYTC)を用いたＰＣＲにより１．５ｋｂの増幅ＤＮＡフラグメントを得た。このＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供して分離精製後、ＴＯＰＯ−ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。得られたプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α細胞を形質転換した。
カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に生育した形質転換細胞からプラスミドを単離し、Beckman CEQ 2000 DNA sequencerにより挿入断片の塩基配列を決定した。Ｎ末端アミノ酸配列及び内部アミノ酸配列に基づいて他のプライマーも設計し、それらを用いたＰＣＲにより２．１ｋｂのＤＮＡ断片が増幅され、同様にしてその塩基配列が決定された。決定された塩基配列から推定される本β‐グルコシダーゼのアミノ酸配列は，他のβ‐グルコシダーゼ（セレブロシダーゼなど）と弱い相同性を示し，本酵素はグルコシルヒドロラーゼファミリー３に属する酵素であることが確認された。

実施例２
以上のようにしてクローン化された遺伝子を適当なベクターに組込むことにより，他の原核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーターおよび形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞において目的遺伝子を発現させることが可能である。
原核細胞の宿主としては、例えば大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）等を挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質発現させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコン、すなわち複製起点および調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させればよい。またベクターは形質転換細胞に表現形質の選択性を付与することができる配列を持つものが望ましい。上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母、植物細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、アグロバクテリウム感染法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。
可能な宿主としては、例えば大腸菌ではE. coli K12株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にpBR322、Puc、pET系のプラスミドがよく用いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌株およびベクターがいずれも利用できる。プロモーターとしては、大腸菌においてはトリプトファン(trp)プロモーター、ラクトース（lac）プロモーター、トリプトファン・ラクトース（tac）プロモーター、リポプロテイン（lpp）プロモーター、バクテリオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポリペプチド鎖伸長因子Ｔｕ（tufB）プロモーター等を挙げることができる。枯草菌としては，例えば207-25株が好ましく，ベクターとしてはpTUB228（Ohmura, K. et al. (1984) J.Biochem. ９５、８７−９３）等が用いられるが、これに限定されるものではない。プロモーターとしては，枯草菌のα−アミラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられ、さらに必要によりα−アミラーゼのシグナルペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を連結することにより、菌体外での分泌発現も可能となる。真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、植物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えばＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. (1981) Cell 23, 175-182）やチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L.A. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 4216-4220）等がよく用いられているが、これらに限定されるわけではない。植物としてはシロイヌナズナ Arabidopsis thalianaやその培養細胞が一般によく用いられているが、タバコNicotiana tabacum、他の園芸植物、あるいはそれらの培養細胞を用いてもよい。発現のためのプロモーターとしてはカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターを、ターミネータとしてはノパリン合成酵素のＮＯＳ等を好ましく利用できるが、これに限定されない。真核微生物宿主として酵母細胞もよく用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母、例えばSaccharomyces cerevisiaeが好ましい。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Bennetzen, J.L. and Hall, B.D.(1982) J. Biol. Chem. 257, 3018-3025) や酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター(Miyanohara, A.et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80、1-5)等を好ましく利用できる。
得られた形質転換体を常法に従い培養することができ、該培養により細胞内または細胞外に本発明の酵素が産生される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択することができる。たとえば、大腸菌の場合には、ＬＢ培地、ＹＴ培地、Ｍ９培地等を使用することができる。
上記により、形質転換体の細胞内または細胞外に産生される本発明の酵素は、その物理的性質や化学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離・精製することができる。該方法としては、たとえば通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せ等を例示することができる。上記方法により、容易に高収率、高純度で所望の本発明の酵素を工業的規模で製造できる。
本発明に係るPaenibacillus KB0549株のβ−グルコシダーゼ遺伝子を
プライマーSi80F (ATGAGTGAACGACGGGATTTGAAAGCACTG) および
Si80R5 (TCAGCCGTTCAAATATTCAAGCAGCTTGC) または
Si80R6 (GGATATGACGTTGTAACATGATCAGCCG)を用いてPCRで増幅した。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって精製・抽出し、エントリーベクターpENTER/TEV/D-TOPOに連結した。連結した遺伝子が目的酵素遺伝子であることを塩基配列解析にて確認した。
これをディスティネーションベクターpDEST15, pDEST17にクローニングし、得られた組換え型プラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)細胞を形質転換した。酵素遺伝子の発現は以下のようにして行なった。１００ｐｐｍのアンピシリンを添加したＬＢ培地を用い３７℃で形質転換細胞を培養した。次いで培養液を新鮮なＬＢ培地で５０倍に希釈し、２３℃で培養を続けた。培養液の光学濁度が０．５−０．６となった時点でイソプロピルチオガラクトシドを１ｍＭの終濃度となるように加え、２０℃でさらに一晩培養を続けた。培養後、遠心分離（5000 ×ｇ、１５分間）により菌体を回収し、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｍＭ、ＰＷＳＦ、０．０５％ＣＨＡＳＰを含有する０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液を氷上で1時間静置した後、氷上で超音波処理（Branson sonicator、１０秒間一定周波数での超音波照射を５回）することにより菌体を破砕した。
菌体破砕液を遠心分離し、上清画分と沈殿画分に分離した。沈殿画分は上清画分と同容量の０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液（０．５ｍＭＰＷＳＦ、０．０５％ＣＨＡＰＳを含有する）に懸濁した。両方の画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。
上清画分または沈殿画分（それぞれ２００μｌ）に５０μｌのセサミノール３Ｇ保存溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で少なくとも６時間インキュベートした。反応液から５０μｌをサンプリングし、９８℃で３分間加熱することにより酵素反応を停止させた。反応液を遠心分離することにより不溶物を除去し、上清をＨＰＬＣ分析（上述）に供した。その結果、上清画分の反応液にセサミノールの生成が認められた。

以上のように，本発明に係るセサミノール配糖体のβ−１，２−およびβ−１，６−グルコシド結合およびセサミノール-グルコース間β−１−グルコシド結合を切断する酵素，および該酵素を産生する微生物は、セサミノール配糖体からセサミノールを工業規模で生産するための有用な触媒となる。また、該酵素をコードするデオキシリボ核酸は前記酵素を産生する微生物の開発に有用である。

Paenibacillus 属におけるKB0549株の分類学的位置づけ．16S rDNA配列に基づく系統解析（CLUSTAL W ver 1.83）による。 Paenibacillus sp. KB0549株の糖資化性試験．API Carbohydrate assayによる試験結果 Paenibacillus sp. KB0549の酵素活性の特性．APIZYM assayキットによる試験結果．本発明の酵素の反応の説明．セサミノールトリグルコシドを基質としてセサミノールを得る反応を触媒する．セサミノールトリグルコシドのHPLC分析クロマトグラムセサミノールトリグルコシドを本発明の酵素と1時間反応させた反応液のHPLC分析クロマトグラムセサミノールトリグルコシドを本発明の酵素と3時間反応させた反応液のHPLC分析クロマトグラム

Claims

セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−１グルコシド結合を切断する活性を有する、Paenibacillus(パエニバチルス)属の微生物から産生される配列番号２のアミノ酸配列を持つ酵素。
請求項１に記載の配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を持ち、且つセサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β−１グルコシド結合を切断する活性を有する酵素。
受託番号FERM P-21057として寄託したPaenibacillus sp. KB0549と称する請求項１に記載の酵素を産生する微生物。
配列番号１に記載の請求項１又２に記載の酵素をコードするデオキシリボ核酸。
請求項４に記載のデオキシリボ核酸を含むベクター。
請求項５に記載のベクターを導入した形質転換体。
形質転換体が大腸菌であることを特徴とする請求項６記載の形質転換体。
請求項６に記載の形質転換体によって産生される、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間β-グルコシド結合を切断する組換え型酵素。
受託番号FERM P-21057として寄託した微生物を５〜７０質量%のゴマ油滓またはリグナン配糖体０．０１％〜０．５％(ｗ／ｖ)を基質として培養することを特徴とする、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間のβ−グルコシド結合を切断する請求項１に記載の酵素を製造する方法。
請求項６又は７に記載の形質転換体を用いることを特徴とする、セサミノール配糖体のβ−１、２−およびβ−１、６−グルコシド結合およびセサミノール−グルコース間のβ−グルコシド結合を切断する請求項１又は２に記載の酵素を製造する方法。
セサミノールトリグルコシド、セサミノールジグルコシド、セサミノールモノグルコシドからなる群より選ばれる少なくとも１つのリグナンまたは前記リグナンを含む基質材料に請求項９又は１０に記載の酵素を製造する方法を用いて生成した酵素を用いたセサミノールの製造方法。