KR100601333B1 - 아가레이즈 및 그의 유전자 - Google Patents

Abstract

아가로-올리고사카라이드를 효율적으로 제조하는 제조법; 예를 들면, 아가로오스 겔로부터 물질, 예를 들면, 핵산을 효율적 추출할 때 유용할 수 있는 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드; 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열; 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자; 폴리펩티드의 제조 방법; 아가로-올리고사카라이드의 제조 방법; 및 아가로오스 겔로부터 물질, 예를 들면, 핵산을 효율적 추출하는 방법.

Description

아가레이즈 및 그의 유전자{Agarase and gene thereof}

본 발명은 고온에서 아가레이즈 활성을 갖는 신규한 아가레이즈 및 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 고온에서 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 고온에서 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 상기 유전자를 사용하여 유전 공학에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 다양한 생리 활성을 갖는 저중합도의 아가로올리고사카라이드을 아가로오스로부터 제조하는데 유용한 고온에서 아가레이즈 활성을 갖는α-아가레이즈, 및 이를 제조하는 방법 및 효소의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아가로오스 겔 전기영동후 아가로오스 겔로부터 핵산 등의 추출에 유용한 고온에서 아가레이즈 활성을 갖는 β-아가레이즈, 및 그의 제조 방법, 상기 효소의 용도 및 상기 효소를 사용하여 아가로오스 겔로부터 핵산 등을 추출하는 방법에 관한 것이다.

아가로오스는 아가의 주성분이다. 아가로오스는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 교대로 α-1,3 결합 및 β-1,4 결합를 통해 함께 교대로 연결 된 구조를 갖는 폴리사카라이드이다. 아가로부터 올리고사카라이드를 제조하기 위하여 아가로오스를 저분자로 분해하여야 한다. 이 목적을 위해, 아가로오스를 화학적으로 분해하는 방법 및 아가로오스를 효소적으로 분해하는 방법이 통상적으로 공지되어 있다. 화학적 분해 방법으로, 산을 사용하여 아가로오스를 가수분해할 수 있다. 이러한 경우, α-1,3 결합이 주로 절단된다. 2가지 유형의 효소, 아가로오스에서 β-1,4 결합을 절단하는 β-아가레이즈 및 아가로오스에서 α-1,3 결합을 절단하는 α-아가레이즈가 아가로오스를 분해하는 것으로 공지되어 있다.

β-1,4 결합에서 아가로오스를 절단하여 수득한 올리고사카라이드를 네오아가로올리고사카라이드로 명명한다. 네오아가로올리고사카라이드는 그의 환원성 말단에 D-갈락토오스를 갖고 그의 중합도는 짝수로 표시한다. 반면, α-1,3 결합에서 아가로오스를 절단하여 수득한 올리고사카라이드를 아가로올리고사카라이드로 명명한다. 아가로올리고사카라이드는 그의 환원성 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖고 그의 중합도는 짝수로 표시한다. 최근 그의 환원성 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 아가로올리고사카라이드가 생리 활성 예를 들면, 세포고사-유도 활성, 항암(carcinostatic) 활성, 다양한 항산화 활성, 면역조절 활성, 항알레르기성 활성, 항염증성 활성 및 α-글리코시다아제를 저해하는 활성을 갖는 것으로 나타났다(WO 99/24447, Japanese Patent Application No. 11-11646). 상기 생리 활성에 기초하여, 활성 성분으로서 아가로올리고사카라이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 기능성 식품을 제공할 수 있다.

아가로오스가 화학적으로 분해되는 방법에서 제조된 올리고사카랄이드의 크 기를 조절하는 것은 어렵다. 특히, 저중합도를 갖는 소분자 올리고사카라이드를 선택적으로 제조하는 것은 매우 어렵다(예: T. Tokunaga et al., Bioscience & Industry, 49:734 (1991)). β-아가레이즈를 사용하는 경우, 이 효소는 β-1,4 결합만을 절단하기 때문에 상기-언급한 생리 활성을 갖지 않는 네오아가로올리고사카라이드만이 수득될 수 있다.

생리 활성을 갖는 아가로올리고사카라이드는 α-1,3 결합을 절단하는 활성을 갖는α-아가레이즈를 사용하여 제조된다고 예상된다. 공지된 α-아가레이즈는 해양 그램-음성 세균 균주 GJ1B (Carbohydrate Research, 66:207-212 (1978); 이 균주는 European Journal of Biochemistry, 214:599-607 (1993)에서 알테로모나스 아가리티쿠스(Alteromonas Agarlyticus)로 표시된다) 및 비브리오 속 세균(JP-A 7-322878; 균주 JT0107-L)에 의해 제조되는 효소를 포함한다. 그러나, 이 효소는 헥사사카라이드 또는 더 짧은 올리고사카라이드를 분해할 수 없기 때문에 알테로모나스 아가리티쿠스(Alteromonas Agarlyticus)로부터 유래된 α-아가레이즈를 사용하여 주목할 만한 생리 활성을 갖는 아가로비오스를 제조할 수 없다. 또한, 비브리오 속 세균로부터 유래된 α-아가레이즈는 이 효소가 헥사사카라이드 및 더 짧은 올리고사카라이드에만 활성을 보이고 아가로오스에는 작용하지 않기 때문에 원료로서 아가로오스를 사용하여 아가로올리고사카라이드를 제조하기 위하여 사용할 수 없다.

본 발명자들은 아가로오스에서 α-1,3 결합을 절단하고 주목할 만한 생리 활성을 갖는 아가로올리고사카라이드 생성하는 효소를 얻기 위하여 집중적으로 연구 하고 이 목적에 적절한 성질을 갖는 효소를 제조하는 두개의 미생물을 발견하였다. 이들 미생물에 의해 제조되는 효소를 분리하고 그의 물리화학적 및 효소적 성질을 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 두개의 효소에 대한 유전자를 분리하고 이들 유전자를 사용하여 유전 공학적 방법에 의해 α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 용이하게 제조하는 방법을 발견하였다(WO 00/50578). 두개의 α-아가레이즈중 하나로 용해된 아가로오스로 처리하여 아가로올리고사카라이드를 수득하고자 하는 경우 효소의 최적 반응 온도는 약 40℃이기 때문에 반응 온도를 약 40℃으로 낮추어야 한다. 이러한 경우, 아가로오스의 농도가 높다면, 아가로오스는 고형화되고 효소 반응은 저해될 수 있다. 따라서, 상기 효소를 사용하고자 하는 경우, 처리는 저농도의 아가로오스를 사용하여 수행되어야 한다. 따라서, 고농도의 아가로오스는 처리될 수 없고 아가로올리고사카라이드의 제조성은 낮다. 따라서, 아가로오스가 고농도로 용해된 경우라도 아가로오스가 고형화되지 않는 높은 온도에서 활성을 갖는 열안정성 α-아가레이즈가 바람직하다.

한편, 아가로오스 겔 전기영동 후 제한 효소 처리 또는 증폭 반응된 핵산 증을 아가로오스 겔로부터 추출하는 것이 유전공학 분야에서 널리 수행되고 있다. 약 37℃의 최적 온도를 갖는 β-아가레이즈이 상기 공정을 위해 용이하게 사용되고 있다. 또한 이러한 경우, 반응 온도를 효소의 최적 온도에 따라 저하되어야 하고 아가로오스의 농도를 아가로오스가 고형화되는 것을 막기 위해 처리하고자 하는 핵산 등을 포함하는 아가로오스 겔을 대량의 물에 용해시켜 저하시켜야 한다. 이러한 경우, 회수하고자 하는 핵산 등의 농도 또한 필연적으로 저하된다. 회수율 저하 및 아가로오스 분해율 저하 및 공정 시간의 지연으로 농도를 저하하는 것은 문제를 일으킨다. 통상의 것보다 높은 온도에서의 반응을 위해 사용될 수 있는 아가레이즈가 상기 문제를 해결하기 위하여 필요하다. 그의 최적 온도는 그렇게 높지 않고 열안정성은 불충분하지만 미국 특허 제 5,869,310 호에 기술된 바와 같은 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 균주 NR19으로부터 유래된 β-아가레이즈가 아가레이즈로서 공지될 수 있다. 따라서, 고농도의 아가로오스가 고형화되지 않는 고온에서 활성을 갖는 열안정성 β-아가레이즈가 바람직하다.

상기 기술된 바와 같이, 선행 기술은 아가로올리고사카라이드의 제조 및 아가로오스 겔로부터 핵산 등과 같은 물질의 추출과 관련되는 문제를 갖는다.

상기 기술된 문제와 관련하여 본 발명자들은 고온에서 아가로오스중 α-1,3 결합을 절단하고 주목할 만한 생리 활성을 갖는 아가로올리고사카라이드 제조에 유용한 효소 및 고온에서 아가로오스중 β-1,4 결합을 절단하고 핵산과 같은 물질을 아가로스 겔로부터 유효하게 추출하는데 유용한 효소를 수득하기 위하여 집중적으로 연구하고 연구를 수행하였다. 결과, 본 발명자들은 각 목적에 적절한 성질을 갖는 두개의 효소를 제조하는 미생물을 성공적으로 발견하였다. 효소를 미생물로부터 분리하고 그의 물리화학적 및 효소적 성질을 나타내었다.

또한, 본 발명자들은 두개의 효소에 대한 유전자를 분리하고 이들 유전자를 사용하여 유전 공학적 방법에 의해 α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드 및 β-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 용이하게 제조하는 방법을 발견하였다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.

본 발명의 주목적은 아가로올리고사카라이드를 유효하게 제조하고 핵산과 같은 물질을 아가로스 겔로부터 유효하게 추출하기 위하여 사용할 수 있는 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 폴리펩티드를 제조하는 방법, 아가로올리고사카라이드을 제조하는 방법 및 핵산과 같은 물질을 아가로스 겔로부터 추출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기와 같이 요약된다. 본 발명의 제 1면은 하기로부터 선택되는 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 신규한 아가레이즈에 관한 것이다:

(1) 서열번호: 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 437의 417개의 잔기로 구성된 아미노산 서열; 또는

(2) 서열번호: 23의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 318 내지 아미노산 번호 1089의 772개의 잔기로 구성된 아미노산 서열.

아가레이즈는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 효소 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 D-갈락토오스 사이의 α-1,3 결합을 가수분해하는 활성을 갖는 효소에 의해 예시된다.

본 발명의 제 2면은 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 이 유전자가 제 1면의 아가레이즈를 코딩한다. 상기 유전자는 서 열번호:20의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 번호 61 내지 뉴클레오티드 번호 1311의 1251개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열; 서열번호:21의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 번호 952 내지 뉴클레오티드 번호 3267의 2316개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열, 또는 2316개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 뉴클레오티드 서열에 의해 예시된다.

본 발명의 제 3면은 엄격한 조건하에서 제 2면의 유전자로 하이브리드화할 수 있고 제 1면의 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명의 제 4면은 제 2면 또는 제 3면의 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.

본 발명의 제 5면은 제 4면의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다.

본 발명의 제 6면은 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법, 아가레이즈를 제조할 수 있는 미생물(예: 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)이 속하는 종에 속하는 미생물)을 배양하고; 제 1면의 아가레이즈를 상기 배양액으로부터 채취하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 7면은 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 방법, 제 1면의 형질전환체를 배양하고, 제 1면의 아가레이즈를 상기 배양액으로부터 채취하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 8면은 아가로오스를 제 1면의 아가레이즈로 분해하고; 분해물로부터 아가로올리고사카라이드로부터 채취하는 것을 포함하는, 아가로올리고사카라이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 9면은 아가로오스 겔을 제 1면의 아가레이즈로 분해하는 것을 포함하는, 아가로오스 겔로부터 물질을 추출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 제 10면은 제 1면의 아가레이즈를 포함하는, 제 9면의 아가로오스 겔로부터 물질을 추출하는 방법에 서 유용한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 제 11면은 아가레이즈의 30% 이하를 구성하는 폴리펩티드를 N 말단으로부터 결실시키는 것을 포함하는 제 1면의 아가레이즈의 열안정성을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바, 올리고사카라이드는 2개 이상 내지 10개 미만의 모노사카라이드로 구성된 사카라이드를 언급한다. 아가로올리고사카라이드는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 교대로 α-1,3 결합 및 β-1,4 결합를 통해 함께 교대로 연결된 구조를 갖고 그의 환원성 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 올리고사카라이드를 언급한다. 네오아가로올리고사카라이드는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 교대로 α-1,3 결합 및 β-1,4 결합를 통해 함께 교대로 연결된 구조를 갖고 그의 비환원성 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 올리고사카라이드를 언급한다.

폴리사카라이드는 모노사카라이드 및 올리고사카라이드외의 사카라이드를 언급한다.

본 발명의 아가레이즈는 서열번호: 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 437의 417개의 잔기로 구성된 아미노산 서열; 또는 서열번호: 23의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 318 내지 아미노산 번호 1089의 772개의 잔기로 구성된 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 일면으로, 상기-언급된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 아미노산에 적어도 70% 이상, 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상의 상동성을 갖는 영역을 갖는 것을 포함한다. DNASIS (Takara Shuzo)과 같은 계산용 컴퓨터 프로그램을 사용하여 공지된 방법에 따라 상동성을 계산한다.

본 발명의 아가레이즈는 폴리사카라이드 (예: 아가로오스) 및 올리고사카라이드 (예: 아가로올리고사카라이드 및 네오아가로올리고사카라이드) 모두에 대하여 작용할 수 있다. 예를 들면, 최적 반응 온도는 45℃ 이상이다. 본 발명의 효소와 관련하여 그러한 특성을 갖는 한 특별히 제한하지 않는다. 그의 예는 해양 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)에 의해 제조되는 아가레이즈를 포함한다.

본 발명의 아가레이즈의 절단 모드와 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 아가레이즈는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 α-1,3 결합을 가수분해 하는 α-아가레이즈 및 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4 결합을 가수분해 하는 β-아가레이즈일 수 있다.

본 발명의 α-아가레이즈는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 α-1,3 결합을 가수분해하고 폴리사카라이드 (예: 아가로오스) 및 올리고사 카라이드 (예: 아가로헥사오스)에 작용할 수 있는 효소이다. 상기 성질을 갖는 한 본 발명의 효소와 관련하여 제한하지 않는다. 그의 예는 해양 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)에 의해 제조되는 α-아가레이즈인 아가레이즈 II를 포함한다.

미생물 NAB2-1-1에 의해 제조되는 아가레이즈 II는 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드중 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 α-1,3 결합을 가수분해하는 효소이다. 효소는 아가로오스, 아가로헥사오스 및 아가로헥사오스보다 긴 아가로올리고사카라이드(예: 아가로옥타오스) 및 네오아가로헥사오스 및 네오아가로헥사오스보다 긴 네오아가로올리고사카라이드에 작용한다.

본 발명의 β-아가레이즈는 및 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4 결합을 가수분해 하고 폴리사카라이드 (예: 아가로오스) 및 올리고사카라이드 (예: 아가로헥사오스)에 작용할 수 있는 효소이다. 상기 성질을 갖는 한 본 발명의 효소와 관련하여 제한하지 않는다. 그의 예는 해양 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)에 의해 제조되는 β-아가레이즈인 아가레이즈 I를 포함한다.

미생물 NAB2-1-1에 의해 제조되는 아가레이즈 I은 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드중 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4 결합을 가수분해하는 효소이다. 효소는 아가로오스, 네오아가로헥사오스 및 네오아가로헥사오스보다 긴 네오아가로올리고사카라이드(예: 네오아가로옥타오스) 및 아가로헥사오스 및 아가로헥사오스보다 긴 아가로올리고사카라이드에 작용한다.

상기 언급한 효소의 활성, 및 상기 효소의 물리화학적 및 효소적 성질을 측정하는 방법을 하기에 기술한다.

(1) 효소학적 측정 방법

본 발명의 아가레이즈의 활성을 기질로서 아가로오스 LO3 (Takara Shuzo)을 사용하여 효소 반응을 수행한 후 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성된 아가로테트라오스 또는 네오아가로테트라오스를 측량하여 측정한다. 구체적으로, 정제된 효소 시료 또는 정제 과정에서의 효소의 활성을 측정하기 위하여 본 명세서에 사용된 효소 활성 측정법은 하기와 같다.

10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 I인 경우) 또는 10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 II인 경우)중 아가로오스를 0.2%(w/v) 또는 0.5%(w/v) 농도로 포함하는 용액을 제조하였다. 기질로서 180㎕의 용액을 20㎕의 효소 용액을 혼합하였다. 혼합물을 50℃에서 5 내지 30분, 바람직하게 10 분동안 반응시킨 후, 비등점 또는 75℃에서 가열하여 반응을 종결시킨다. 30㎕의 반응 혼합물을 TSK겔 α-2500 칼럼에 사용하였다(내부 지름: 7.8 mm; 길이: 300 mm; Tosoh). 약 25 분의 보유시간에서 용출되는 아가로테트라오스 또는 약 24 분의 보유시간에서 용출되는 네오아가로테트라오스를 0.8 ml/분의 유속으로 용리제로서 70% 아세토니트릴 용액을 사용하여 측량한다. 1 유니트(1 U)는 10분 후 1 ㎕mol의 아가로테트라오스를 제조하는 효소의 양으로 정의한다.

(2) 최적 pH

효소가 아세테이트 완충액 (pH 4.5), 말레이트 완충액 (pH 5.5), 아세테이트 완충액 (pH 6.0, 6.5) 또는 Tris-HCl 완충액 (pH 7.0, 7.5, 8.8)을 사용하여 제조 된 반응 혼합물중 기질로서 아가로오스에 작용하도록 하였다. 결과, 아가레이즈 I 및 아가레이즈 II는 약산 내지 약염기 조건하에서 아가로오스를 분해하는 활성을 나타낸다고 입증되었다.

(3) 최적 온도

본 발명의 아가레이즈 II는 45 내지 55℃ 범위의 온도에서 높은 효소 활성을 나타내고, 약 50℃에서 최대 활성을 나타낸다. 본 발명의 아가레이즈 I은 45 내지 70℃ 범위의 온도에서 높은 효소 활성을 나타내고, 약 55 내지 65℃에서 최대 활성을 나타낸다.

(4) 열안정성

지정된 시간동안 48℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 처리한 후 효소 시료의 잔존 활성을 측정하였다. 결과, 아가레이즈 II는 10 분동안 55℃에서 처리한 후 40%의 활성을 보였다. 아가레이즈 I은 10 분동안 60℃에서 처리한 후 100%의 활성; 20 분동안 60℃에서 처리한 후 100%의 활성; 30 분동안 60℃에서 처리한 후 98%의 활성; 10 분동안 65℃에서 처리한 후 100%의 활성; 20 분동안 65℃에서 처리한 후 95%의 활성; 30 분동안 65℃에서 처리한 후 90%의 활성; 및 60 분동안 65℃에서 처리한 후 90%의 활성을 보였다.

(5) Ca 이온 요구성

공지된 아가레이즈는 그의 활성을 나타내기 위하여 칼슘을 요한다. 본 발명의 각 아가레이즈의 칼슘 이온 요구성을 조사하였다. 결과, 칼슘 이온의 부재하에 아가레이즈 II는 칼슘 이온 존재하에 나타내는 활성의 60%를 갖는다. 칼슘 이온의 부재하에 아가레이즈 I은 칼슘 이온 존재하에 나타내는 활성의 100%를 갖는다. 따라서, 아가레이즈 II 및 아가레이즈 I 모두 칼슘 이온을 부가하지 않고 그의 활성을 나타낸다.

본 발명의 아가레이즈 II는 CaCl₂의 존재하에 안정화되지만, 마그네슘 또는 망간 이온에 의해 영향을 받지 않는다.

(6) 분자량

아가레이즈 II 및 아가레이즈 I의 분자량은 10-20% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 측정된 바 각각 약 117,000 및 약 48,000으로 추정되었다.

(7) Edman 분해 방법에 따른 아미노산 서열화

Edman 분해 방법에 따라 측정된 아가레이즈 II 및 아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열은 각각 Glu-Thr-Ile-Val-Leu-gln-Ala-glu-Ser-Phe 및 Ala-Asp-Xaa-Asp-Gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-gly였다. 아가레이즈 II 및 아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열을 서열번호:2 및 1에 각각 나타낸다.

하기 기술한 바와 같이, 아가레이즈 II를 코딩하는 유전자 및 아가레이즈 I을 코딩하는 유전자를 분리하였다. 또한, 이들 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 측정하였다. 아가레이즈 II 및 아가레이즈 I에 의해 코딩된 아미노산 서열을 서열번호:23 및 22에 각각 나타낸다. 서열번호: 23의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 318 내지 아미노산 번호 1089의 772개의 잔기로 구성된 폴리펩티드는 본 발명의 α-아가레이즈 활성을 나타내고 서열번호: 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 437의 417개의 잔기로 구성된 폴리펩티드는 본 발명의 β-아가레이즈 활성을 나타낸다.

본 발명의 아가레이즈는 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)을 배양하여 수득한 배양물로부터 정제될 수 있다. NAB2-1-1를 아가를 동화시키는 세균으로서 해수로부터 분리하였다. 하기 미생물학적 성질을 갖는다.

[미생물학적 성질]

(1) 형태

인공 해수(제품명: Jamarin S; Jamarin Laboratory)를 제조하였다. 0.3%(w/v) 농도의 펩톤 (Difco) 및 0.02%(w/v)의 효모 추출물 (Difco)을 가하였다.이어서 pH를 3M 탄산나트륨을 사용하여 7.8로 조절하였다. 0.1%(w/v) 농도의 아가로오스 LO3 (Takara Shuzo)를 가하였다. 오토클레이브에서 멸균한 후 상기-언급한 미생물을 혼합물에 접종하고 37℃에서 120 rpm으로 밤새도록 배양하였다. 상기 배양액에서 생육된 미생물은 운동성의 극성 편모를 갖고, 호기성이며 염류 요구성을 갖는 그람-음성 바실러스였다.

(2) 생육

인공해수 (제품명: Jamarin S; Jamarin Laboratory)를 제조하였다. 0.3%(w/v) 농도의 펩톤 (Difco) 및 0.02%(w/v)의 효모 추출물 (Difco)을 가하였다.이어서 pH를 3M 탄산나트륨을 사용하여 7.8로 조절하였다. 1.5%(w/v) 농도의 아가(Nacalai Tesque)를 가하였다. 혼합물을 오토클레이브하여 플레이트를 제조하였다. 상기 언급된 미생물을 플레이트에 접종하여 하기를 입증하였다:

(i) 30 내지 40℃에서의 생육이 양호하였다:

(ii) 세포가 생육함에 따라 아가 겔은 액화되었다;

(iii) pH 6.0 내지 8.0에서의 생육이 양호하였다.

NAB2-1-1을 2001년 1월 10일(원기탁일)에 기탁번호 FERM BP-7855에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.

상기-언급한 미생물의 분류학적 위치에 대한 정보는 16S 리보솜 RNA (16S rRNA)를 코딩하는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 수득할 수 있다. 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열은 각 미생물 균주에 대하여 특이적인 것으로 공지되어 있다. 구체적으로, 염색체 DNA는 미생물 NAB2-1-1로부터 추출된다. 유전자 영역 또는 그의 일부를 증폭시키기 위하여 사용될 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다. 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 결정된 서열에 대하여 GenBank 데이타베이스를 사용하는 상동성 연구를 수행한다. 이어서, 영역재 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖는 미생물, 즉, 분류학적으로 가까운 미생물이 공지될 수 있다.

미생물 NAB2-1-1중 16S 리보솜 RNA 유전자로부터 유래된 DNA 단편을 [Bulletin의 Japanese Society의 Microbial Ecology, 10:31-42 (1995)]에 기술된 방법에 따라 증폭시켰다. 문헌에 기술된 프라이머 27f 및 1492r을 PCR에 대하여 사 용하였다(프라이머 27f 및 1492r의 뉴클레오티드 서열을 각각 서열번호:32 및 33에 나타낸다). 생성된 증폭된 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 분석하였다. 결과, 본 발명의 아가레이즈를 제조하는 미생물과 상기-언급한 영역중에서 각각 약 90%의 최고의 상동성을 갖는 하기 미생물을 발견하였다:

슈도올테로모나스(Pseudoalteromonas) 종 KT0812A

에어로모나스 슈베르티(Aeromonas schubertii)

본 발명의 아가레이즈를 NAB2-1-1 및 NAB2-1-1의 자발 또는 인공 돌연변이, 또는 NAB2-1-1이 속하는 속에 속하고 본 발명의 아가레이즈를 제조할 수 있는 미생물로부터 수득할 수 있다.

인공 돌연변이는 공지된 방법, 예로서 방사선, 자외선 조사 또는 돌연변이원 처리에 따라 수득할 수 있다.

동일한 속에 속하는 미생물의 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성은 일반적으로 약 99% 이상인 것으로 공지되어 있다. 따라서, 16S rRNA 유전자의 뉴클레오티드 서열이 미생물 NAB2-1-1의 것과 99% 이상의 상동성을 갖는 미생물을 본 발명의 미생물 NAB2-1-1과 같이 사용할 수 있다.

미생물에 의해 사용될 수 있는 질소원, 무기 물질 등 및 탄소원으로서 아가, 아가로오스 등을 포함하는 배지를 미생물 배양을 위한 배지로서 사용할 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 아가 또는 아가로오스를 사용할 수 있다. 질소원의 예 는 육즙, 효모추출물, 카세인가수분해물, 트립톤 및 펩톤을 포함한다. 효모추출물 및 펩톤을 바람직하게 사용한다. 상기 질소원은 또한 아가 또는 아가로오스외에도 탄소원으로서 사용될 수 있다. 또한, 염화나트륨, 시트레이트 이온, 염화마그네슘,황산나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 브롬화칼륨, 염화스트론튬, 붕산나트륨, 규산나트륨, 플루오르화나트륨, 질산암모늄, 수소인산이나트륨 등을 염으로서 배합하여 사용할 수 있다.

특히, 펩톤, 효모 추출물 및 아가 또는 아가로오스를 인공해수 Jamarin S로 구성된 배지에 가하여 제조된 배지를 바람직하게 사용할 수 있다. 0.1 내지 2.0%의 농도로 아가 또는 아가로오스를 가하는 것이 바람직할 수 있다. 아가 또는 아가로오스의 농도를 적절하게 변화시켜 고체 또는 액체 배지를 제조할 수 있다. 효소를 제조하기 위한 목적을 위해 0.1 내지 0.3%의 농도를 사용하는 액체 배양액이 바람직할 수 있는 반면, 세포를 보존하기 위한 목적을 위해 0.1 내지 0.2%의 농도를 사용하는 고체 배양액이 바람직할 수 있다. 액체 배양액을 위해 저융점 아가로오스를 사용하는 경우, 0.1 내지 1.0%의 농도로 사용할 수 있다.

예를 들면, 배양 조건은 배지의 조성에 따라 다소 달라질 수 있지만 배양 온도는 30 내지 40℃이고, 배지의 pH는 6.0 내지 8.0이며, 배양 시간은 12 내지 48 시간이다.

상기 기술된 바와 같이 배양중 제조되는 본 발명의 α-아가레이즈 및/또는 β-아가레이즈는 세포에서 분비된다. 이어서, 배양 상층액을 수득하기 위하여 원심분리, 여과 등에 의해 배양 종료후 세포를 제거한다.

진공농축법 또는 한외여과를 사용하여 생성된 배양 상층액을 농축시켜 액체 효소를 제조할 수 있다. 다르게는, 동결건조법, 분무건조법 등에 의해 배양 상층액 을 분말효소로 전환시켜 조 효소 시료를 제조할 수 있다. 본 발명의 α-아가레이즈 및/또는 β-아가레이즈는 황산암모늄을 사용하는 염처리법 또는 용매 침전법과 같은 통상의 정제 방법에 의해 부분적으로 정제할 수 있다. 조합시킨 칼럼 크로카토그래피(예: 음이온 교환 칼럼 및 겔 여과 칼럼)과 같은 공지된 정제 방법을 사용하여 전기영동시 단일 밴드인 정제된 효소 시료를 수득할 수 있다.

기질로서 홍조류중 포함된 폴리사카라이드(예: 아가 또는 아가로오스)와 다양한 정제 정도가 다양한 상기와 같이 수득된 배양액 또는 본 발명의 α-아가레이즈를 반응시켜 아가로올리고사카라이드 예로서 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스를 제조할 수 있다.

아가로오스는 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 교대로 α-1,3 결합 및 β-1,4 결합를 통해 함께 교대로 연결된 구조를 갖는 폴리사카라이드이다. β-아가레이즈는 아가로오스중 β-1,4 결합을 가수분해하는 효소이다. 효소의 작용에 의해 형성된 그의 환원 말단에 D-갈락토오스를 갖는 올리고사카라이드는 네오아가로올리고사카라이드로 명명되고, 아가로올리고사카라이드에 대하여 관찰되는 것과 같은 생리활성을 보이지 않는다. 아가로오스중 α-1,3 결합을 절단한느 α-아가레이즈를 사용하는 경우, 그의 환원 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 아가로올리고사카라이드가 제조될 수 있다. 알테로모나스 아가리티쿠스(Alteromonas Agarlyticus) GJ1B 및 비브리오(Vibrio) (균주 JT0107-L) 속 세균으로부터 유래된 두개의 효소가 α-아가레이즈로 공지되어 있다. 그러나, 알테로모나스 아가리티쿠스(Alteromonas Agarlyticus) GJ1B에 의해 생상된 α-아가레이즈는 아가로헥사오스 또는 단쇄 올리고사카라이드에 작용할 수 없는 반면, 비브리오(Vibrio) (균주 JT0107-L) 속 세균으로부터 유래된 α-아가레이즈는 아가로오스를 분해할 수 없다. 따라서, 원료 아가로오스로부터 아가로비오스 또는 아가로테트라오스를 예를 들면 α-아가레이즈를 사용하여 효율적으로 제조하는 것을 불가능하였다.

WO 00/50578에 기술된 바 본 발명자에 의해 앞서 발견된 α-아가레이즈는 아가로오스, 아가로헥사오스 및 아가로헥사오스보다 긴 아가로올리고사카라이드에 작용하는 효소이다. 따라서, 아가로오스에 작용하여 아가로올리고사카라이드를 제조한다. 또한, 결과 작용으로 형성된 아가로헥사오스중 단일 α-1,3 결합을 절단할 수 있다. 이 효소를 사용하여, 아가로비오스 및 아가로테트라오스, 통상의 방법에 따라 좀처럼 제조되지 않는 디사카라이드 및 테트라사카라이드를 제조할 수 있다. 이들 효소의 최적 반응 온도는 약 40℃이다. 아가로오스는 주로 1%(w/v)의 농도로 사용된다. 이 농도에서는 50℃에서도 고형화되지 않지만, 40℃에서는 고형화된다. 즉, 통상의 효소를 사용하는 경우, 고농도의 아가로오스는 효소에 대한 최적 반응 온도에서 고형화되고 효소 반응은 진행되지 않을 수 있다. 따라서, 아가로비오스 또는 아가로테트라오스를 효율적으로 제조하는 것은 어려웠다.

한편, 본 발명의 α-아가레이즈의 최적 반응 온도는 50℃이기 때문에, 아가로오스가 고형화되지 않는 온도에서의 반응에 사용할 수 있다. 따라서, 아가로올리고사카라이드를 효율적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 α-아가레이즈는 상기 언급한 물리화학적 성질로부터 알 수 있는 바아가로오스, 아가로헥사오스 및 아가로헥사오스보다 긴 아가로올리고사카라이드에 작용하는 효소이다. 따라서, 아가로오스에 작용하여 아가로올리고사카라이드를 제조한다. 또한, 상기 작용의 결과로서 형성되는 아가로올리고사카라이드중 α-1,3 결합을 절단하여 더욱 짧은 아가로올리고사카라이드 예로서 아가로비오스 및 아가로테트라오스를 형성할 수 있다. 추가로, 그의 최적 온도는 높고 열안정성이 우수하다. 따라서, 본 발명의 α-아가레이즈를 사용하여 아가로오스 고형화에 의해 반응이 저해되지 않고 아가로비오스 및 아가로테트라오스, 통상의 방법에 따라 제조하기 어려운 디사카라이드 및 테트라사카라이드를 다량으로 제조할 수 있다.

통상의 본 발명의 α-아가레이즈 및 β-아가레이즈의 기질 특이성을 표 1에 나타낸다. 이 표에서 + 및 - 은 각각 기질을 분해하는 효소의 분해능을 나타낸다.

표 1

본 발명의 α-아가레이즈에 의해 제조되는 아가로올리고사카라이드는 아가로비오스 및 아가로테트라오스를 포함한다. 그의 존재가 사용 목적에 지장을 주시 않 는 한 아가로올리고사카라이드는 아가로헥사오스 또는 아가로헥사오스보다 긴 아가로올리고사카라이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 아가, 아가로오스, 또는 아가 또는 아가로오스로부터 유래된 올리고사카라이드를 본 발명의 α-아가레이즈를 사용하여 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스를 제조하기 위한 원료로서 사용할 수 있다. 사용되는 조건하에서 효소가 그의 활성을 나타내는 한 α-아가레이즈의 작용을 위해 사용되는 조건은 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, 아가레이즈 II는 pH 6.0 내지 8.0, 45 내지 55℃이도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 효소의 작용에 적절하면 반응 혼합물에 조성은 특별히 제한하지 않는다.

상기 기술한 바와 같이, 본 발명의 α-아가레이즈에 의해 제조되는 올리고사카라이드는 주로 헥사사카라이드 또는 저중합도를 갖는 더욱 짧은 올리고사카라이드 이다. 그러나, 반응 조건 등을 적절하게 선별하여 상이한 중합도를 갖는 올리고사카라이드를 임의로 제조할 수 있다. 또한, 그렇게 수득한 올리고사카라이드를 독립적으로 분리하고 정제하여 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스 를 제조할 수 있다.

상기 기술한 바와 같이 수득한 배양액 또는 본 발명의 α-아가레이즈를 정제도를 다양하게 하여 홍조류에 포함된 폴리사카라이드(예: 아가 또는 아가로오스)에 작용시켜 아가 또는 아가로오스를 아가로올리고사카라이드 예로서 네오아가로비오스, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스로 분해할 수 있다.

비브리오(Vibrio) 종 JT0107-1,4 (JP-A 8-38172) 및 슈도모나스 알탄티카(Pseudomonas altantica) (Morrice, L. M. et al., Eur. J. Biochem., 135, 553- 558 (1983))로부터 유래된 효소는 α-아가레이즈로 공지되어 있다. 그의 최적 반응 온도는 약 30℃이다. 아가로오스 겔로부터 핵산 등을 추출학 위하여 상기 효소를 사용하는 경우, 아가로오스는 상기 효소가 그의 활성을 나타내는 온도에서 고형화되기 때문에 반응은 방해된다. 따라서, 실제로는 사용될 수 없다. 효소s derived from 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 균주 NR19 (United States Patent No. 5,869,310), 슈도모나스(Pseudomonas) 종 N-7 (JP-B 7-97987) 및 비브리오(Vibrio) 종 PO-303 (JP-A 8-294389)으로 유래된 효소의 최적 온도는 는 상기 언급된 효소이 것보다 높다고 공지되어 있다. 그러나, 그의 최적 온도 (55℃ 이하)는 저융점 아가로오스 겔 (65℃)의 융점보다 낮기 때문에 실용성과 관련하여 문제로 남아있다.

한편, 본 발명의 β-아가레이즈는 광범위한 온도 범위(50℃ 내지 70℃)에서 높은 활성을 나타내고, 55℃ 내지 65℃에서 최대 활성을 나타낸다. 따라서, 아가로오스 겔이 완전하게 녹는 반응을 할 수 있다. 추가로, 30분동안 65℃에서의 처리후 본 발명의 β-아가레이즈의 활성은 98% 남아있고, 이는 그의 열안정성이 우수함을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 α-아가레이즈를 사용하여 아가로오스 고형화에 기인되는 방해없이 아가로스 겔로부터 핵산 등을 효율적으로 추출할 수 있다. 상기 추출은 통상의 방법에 따르는 경우는 어렵다.

본 발명의 α-아가레이즈 유전자는 상기-언급한 α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 따라서, α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 언급한다. 본 발명의 α-아가레이즈 유전자의 예는 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)에 의 해 제조되는 α-아가레이즈인 아가레이즈 II를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 아가레이즈 II를 코딩하는 유전자는 서열번호: 23에서 아미노산 번호 318 내지 아미노산 번호 1089의 772개의 잔기로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자에 의해 예시된다.

본 발명의 α-아가레이즈 유전자는 상기-언급된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 도입된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 α-아가레이즈 활성을 갖는 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명의 유전자는 서열번호: 21에서 뉴클레오티드 번호 952 내지 뉴클레오티드 번호 3267의 2316개의 잔기로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 포함한다. 본 발명의 유전자는 또한 상기-언급된 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 부가 또는 도입된 뉴클레오티드 서열을 갖고 α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명의 유전자는 엄격한 조건하에 상기-언급한 유전자에 하이브리드화되고 α-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 혼성화는 예를 들면, [T. Maniatis et al. (eds.), Molecular 클로닝: A Laboratory Manual 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술된 바에 따라 수행할 수 있다. 엄격한 조건은 6 x SSC (1 x SSC: 0.15 M 염화나트륨, 0.015 M 시트르산나트륨, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 x Denhardt's 및 100 mg/ml의 청어 정자 DNA를 포함하는 용액중에서 밤새도록 65℃에서 프로브와 함께 인큐베이션시키는 것으로 예시된다.

본 발명의 β-아가레이즈 유전자는 상기-언급한 β-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다. 따라서, β-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드에 대한 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 언급한다. 본 발명의 β-아가레이즈의 예는 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)로부터 유래된 아가레이즈 I를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 포함한다. 아가레이즈 I를 코딩하는 유전자는 서열번호: 22에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 437의 417개의 아미노산 잔기로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자에 의해 예시된다.

본 발명의 β-아가레이즈 유전자는 또한 상기-언급된 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 도입된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 β-아가레이즈 활성을 갖는 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명의 유전자는 서열번호: 20에서 뉴클레오티드 번호 61 내지 뉴클레오티드 번호 1311의 1251개의 잔기로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 유전자를 포함한다. 본 발명의 유전자는 또한 상기-언급된 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환, 결실, 부가 또는 도입된 뉴클레오티드 서열을 갖고 β-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.

또한, 본 발명의 유전자는 엄격한 조건하에 상기-언급한 유전자에 하이브리드화되고 β-아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 엄격한 조건은 상기 기술된 바의 것으로 예시된다.

예를 들면, 본 발명의 아가레이즈 유전자는 하기와 같이 클로닝될 수 있다.

게놈 DNA는 아가레이즈를 제조하는 미생물로부터 제조된다. 게놈 DNA는 적절한 공지 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 공지된 방법, 예를 들면, 리소자임 처리, 프로테아제 처리, RNase 처리, 페놀 처리 및 에탄올 침전을 조합하여 사용하여 제조될 수 있다. 이렇게 수득한 게놈 DNA는 적절한 공지 방법 예를 들면 초음파 분해 또는 제한 효소를 사용하는 분해에 의해 분해된다. 생성된 DNA 단편을 통상의 방법에 따라 벡터(예: 플라스미드 벡터)로 도입하여 재조합 DNA 분자를 작제한다. 이어서 재조합 DNA 분자를 적절한 숙주(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로 도입하여 형질전환체를 수득한다. 벡터 및 숙주에 적절한 재조합 DNA 분자의 작제 방법, 형질변환 방법등은 통상의 방법, 예를 들면 [Molecular 클로닝: A Laboratory Manual 2nd ed.]에 기술된 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 아가레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체를 포함하는 게놈 라이브러리를 수득한다.

이어서, 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 아가레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체를 선별한다. 아가레이즈 유전자를 형질전환체로부터 분리할 수 있다. 선별 방법의 예는 하기와 같다.

(1) 인덱스로서 아가레이즈 활성을 발현하는 스크리닝

게놈 라이브러리를 아가 플레이트상에서 증식시킨다. 아가레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체가 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 발현시킨다. 폴리펩티드는 그의 아가레이즈 활성 작용에 의해 아가 겔을 분해한다. 따라서, 아가 플레이트에서 아가 겔을 분해하는 콜로니 또는 플라크를 선별한다.

(2) 항체를 사용하는 스크리닝

상기 기술된 바와 같이 아가레이즈의 조, 부분 정제 또는 정제된 효소 시료를 제조한다. 통상의 방법에 따라 항원으로서 시료를 사용하여 항-아가레이즈 항체를 제조한다.

게놈 라이브러리를 플레이트상에서 증식시킨다. 증식된 콜로니 또는 플라크 나일론 또는 니크로셀룰로오스 필터에 이동시킨다. 발현된 재조합 단백질을 콜로니 또는 플라크와 함께 상기 필터에 이동시킨다. 상기 필터상의 재조합 단백질을 항-아가레이즈 항체와 반응시켜 항체와 반응성이 클론을 동정한다.

항체와 반응성이 클론을 공지된 방법, 예를 들면, 퍼옥시다아제-컨쥬게이트 2차 항체를 항-아가레이즈 항체와 반응한 필터와 반응시키고, 필터를 발색 물질과 함께 인큐베이션시킨 후 발색 을 검출하여 동정할 수 있다.

벡터에 도입된 DNA중 유전자가 높게 발현되는 발현 벡터를 상기 기술된 방법 (1) 또는 (2)에서 사용하는 게놈 라이브러리의 구축에 사용하는 경우, 관심의 대상이 되는 유전자를 포함하는 형질전환체는 용이하게 선별될 수 있다.

(3) DNA 프로브를 사용하는 혼성화에 의한 선별

게놈 라이브러리를 플레이트를 증식시킨다. 생육 콜로니 또는 플라크나일론 또는 니트로셀룰로오스 필터상으로 옮긴다. DNAs를 변성시켜 필터상에 고정화시킨다. 필터상의 DNAs를 통상의 방법에 따라 표지된 프로브와 혼성화시켜 프로브에 혼성화하는 클론을 동정한다.

상기 선별에 사용되는 프로브는 아가레이즈의 상기-언급한 아미노산 서열 정보에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드, 또다른 아미노산 서열 정보에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오티드, 및 상기 아미노산 서열정보에 기초하여 제조된 프라이머를 사용하여 증폭된 PCR 단편을 포함한다. 프로브로 사용되는 라벨의 예는 제한하는 것은 아니지만 방사선동위원소 라벨, 형광물질 라벨, 디곡식게닌 라벨 및 바이오틴 라벨을 포함한다.

하기와 같이 제조되는 아가레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체에 대하여 풍부한 게놈 라이브러리를 선별에 사용하고자 하는 게놈 라이브러리로서 사용할 수 있다.

게놈 DNA를 아가레이즈를 제조하는 미생물로부터 제조하고고, 적절한 제한 효소로 분해하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리한 후 통상의 방법에 따라 나릴론 또는 니트로셀룰로오스 필터상에 블랏팅된다. 필터상의 DNAs는 통상의 방법에 따라 상기-언급한 표지된 프로브에 혼성화하여 프로브에 혼성화하는 DNA 단편을 검출한다. 시그날에 상응하는 DNA 단편을 추출하고 아가로오스 겔로부터 정제한다.

그렇게 수득한 DNA 단편을 통상의 방법에 따라 벡터 (예: 플라스미드 벡터) 내로 도입하여 재조합 DNA 분자를 작제한다. 이어서 재조합 DNA 분자를 적절한 숙주(예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))내로 도입하여 형질전환체를 수득 한다. 사용하고자 하는 벡터에 적절한 형질전환 방법은 통상의 방법, 예를 들면, [Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.]에 기술된 것으로부터 선택될 수 있다. 따라서, 아가레이즈 유전자를 포함하는 형질전환체에 대하여 풍부한 게놈 라이브러리를 수득한다.

게놈 라이브러리를 사용하여 선별을 더욱 효율적으로 수행할 수 있다.

관심의 대상이 되는 유전자를 상기 기술한 방법 (1) 내지 (3)으로 형질전환체를 선별하여 클로닝한다. PCR을 사용하여, 형질전환체를 사용하지 않고 시험관내에서 클로닝을 수행할 수 있다.

게놈 DNA를 아가레이즈를 제조하는 미생물로부터 제조한다. PCR은 주형으로서 게놈 DNA 및, 아가레이즈의 아미노산 서열에 대한 정보에 기초하여 제조된 한 쌍의 프라이머를 사용하여 수행된다. 따라서, 아가레이즈 유전자를 포함하는 DNA 단편을 수득할 수 있다. 또한, 전장 아가레이즈 유전자는 예를 들면, 프로브로서 상기 단편을 사용하여 혼성화, 또는 단편의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 제조된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 상기 기술한 바와 같이 수득된 유전자의 뉴클레오티드 서열을 공지된 방법에 따라 결정할 수 있다. 클론이 전체 아가레이즈 폴리펩티드를 코딩하지 않는 경우, 아가레이즈에 대한 전체 오픈 리딩 프레임(ORF)을 결정된 뉴클레오티드 서열에 기초한 신규한 프로브의 제조를 포함하는 방법을 반복하고 상기 프로브를 사용하여 게놈 라이브러리를 선별하여 새로운 클론을 수득하여 알아낸다. 아가레이즈를 코딩하는 전제 ORF를 포함하는 클론은 예를 들면, 수득한 정보에 기초하여 제조될 수 있다.

아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드는 상기 기술한 바와 같이 수득한 아가레이즈를 코딩하는 유전자를 적절한 발현 벡터와 연결시켜 유전 공학에 의해 다량으로 제조될 수 있다.

본 발명의 유전자를 수득하는 방법을 하기에 상세히 기술한다.

미생물 NAB2-1-1을 배양하여 수득한 세포를 리소자임을 용균시킨 후 단백질을 제거하고, 에탄올 침전 등을 하여 염색체 DNA을 수득한다. NAB2-1-1 염색체 DNA를 제한효소를 사용하여 완전하게 분해한다. 제한 효소에 상응하는 아댑터를 분해된 DNA에 결찰시킨다. 주형으로서 생성된 염색체 DNA, 본 발명의 아가레이즈 I 또는 II의 N-말단 또는 내부 아미노산 서열에 기초하여 제조된 프라이머 및 아댑터의 뉴클레오티드 서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.

상기와 같인 수득한 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열을 분석하여 본 발명의 아가레이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다. 전체 서열이 결정할 수 없는 경우 상기-언급한 방법을 반복할 수 있다. 다르게는, 주형으로서 염색체 DNA를 사용하여 프라이머 웨이킹(primer waking)을 수행할 수 있다.

아가레이즈의 아미노산 서열에 기초하여 작제된 프라이머는 믹스 프라이머일 수 있다. 다르게는, 주형으로서 NAB2-1-1 염색체 DNA 및 N-말단 또는 내부 아미노산 서열에 기초하여 제조된 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득된 증폭 산물의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 제조되는 새로운 프라이머를 사용할 수 있다.

그렇게 수득한 아가레이즈 II를 코딩하는 유전자는 1089개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 ORF를 갖는다. ORF의 뉴클레오티드 서열을 서열번 호:21에 나타낸다. ORF의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 서열번호:23에 나타낸다. P2에 상응하는 뉴클레오티드 서열 (아가레이즈 II의 N-말단 아미노산 서열), 시그날 펩티드성 서열을 갖는 26개의 아미노산을 코딩하는 상류 뉴클레오티드 서열, 및 추가의 상류 영역중 SD-성 서열이 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 발견된다.

따라서, 서열번호:23의 아미노산 서열은 본 발명의 α-아가레이즈의 일례이다. 앞서 결정된 아가레이즈 II의 N-말단 아미노산 서열과 이 아미노산 서열의 비교로 아가레이즈 II는 서열번호: 23의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 27 내지 아미노산 번호 1089의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드이고, 서열번호:21의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 번호 79 내지 뉴클레오티드 번호 3270(종결 코돈 포함)의 뉴클레오티드 서열에 의해 상기 아미노산이 코딩됨을 알아낸다.

3개의 추정되는 Ca-결합 영역(171-184, 271-283 및 987-999)이 ORF에서 발견된다.

아가레이즈 I을 코딩하는 유전자는 438개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드를 코딩하는 ORF를 갖는다. ORF의 뉴클레오티드 서열을 서열번호:20에 나타낸다. ORF의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 서열번호:22에 나타낸다. P1에 상응하는 뉴클레오티드 서열 (아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열), 20개의 아미노산을 코딩하는 상류 뉴클레오티드 서열, 및 추가의 상류 영역중 SD-성 서열이 유전자의 뉴클레오티드 서열에서 발견된다.

따라서, 서열번호:22의 아미노산 서열은 본 발명의 아가레이즈의 일례이다. 앞서 결정된 아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열과 이 아미노산 서열의 비교로 아가레이즈 I은 서열번호: 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 438의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드이고, 서열번호:20의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 번호 61 내지 뉴클레오티드 번호 1314(종결 코돈 포함)의 뉴클레오티드 서열에 의해 상기 아미노산이 코딩됨을 알아낸다.

상기와 같이 수득한 아가레이즈 I의 아미노산 서열은 플라보박테리움(Flavobacterium) 종 균주 NR19으로부터의 공지된 β-아가레이즈의 아미노산 서열과 단지 33%의 상동성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 아가레이즈 I이 절대적으로 신규한 서열을 갖는다는 것으로 판단된다.

본 발명의 아가레이즈를 코딩하는 유전자(예: 아가레이즈 I 또는 아가레이즈 II를 코딩하는 유전자)를 적절한 벡터에 연결하여 재조합 DNA 분자를 작제할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 분자를 적절한 숙주내로 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있다. 형질전환체를 배양하여 수득한 배양액에서 본 발명의 아가레이즈가 제조된다. 따라서, 형질전환체를 사용하여 다량으로 본 발명의 아가레이즈 (예: 아가레이즈 I 또는아가레이즈 II)를 제조할 수 있다.

공지된 방법에 따라 아가레이즈를 코딩하는 유전자내로 돌연변이를 도입하여 돌연변이 아가레이즈를 제조할 수 있다. 사용할 수 있는 돌연변이를 도입하는 방법의 예는 제한하는 것은 아니지만 올리고뉴클레오티드 더블 앰버 방법(oligonucleitide double amber method)(Hashimoto-gotoh, T. et al., gene, 152:271-275 (1995)), 더 갭 듀플렉스 방법(the gapped duplex method)(Kramer, W. et al., Nucl. Acids Res., 12:9441 (1984); Kramer, W. et al., Methods in Enzymology, 154:350 (1987)) 및 Kunkel 방법 (Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488 (1985); Kunkel, T.A., Methods in Enzymology, 154:367 (1987))을 포함한다.

관심의 대상이 되는 아가레이즈를 발현시키고자 하는 아가레이즈의 N-말단에 시그날 서열 부가되는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시켜 형질전환체외에서 분비시킬 수 있다. 시그날 서열을 특정의 것으로 제한하지 않고, 서열번호: 22에서 아미노산 번호 1 내지 아미노산 번호 20의 아미노산 서열에 의해 표시되는 아가레이즈 I에 대한 시그날 서열로 예시된다. 이 시그날 서열은 서열번호: 20에서 뉴클레오티드 번호 1 내지 뉴클레오티드 번호 60의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 다르게는, 시그날 서열은 서열번호: 23에서 아미노산 번호 1 내지 아미노산 번호 26의 아미노산 서열에 의해 표시되는 아가레이즈 II에 대한 시그날 서열로 예시된다. 이 시그날 서열은 서열번호: 21에서 뉴클레오티드 번호 1 내지 뉴클레오티드 번호 78의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다.

재조합 DNA 분자를 작제하기 위하여 사용될 수 있는 벡터의 예는 제한하는 것은 아니지만, 플라스미드 벡터, 파지 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.적절한 벡터는 재조합 DNA를 사용하는 목적에 따라 선택될 수 있다. 재조합 DNA 분자를 사용하여 아가레이즈를 제조하고자 하는 경우, 프로모터 및/또는 발현 조절을 위한 다른 영역을 포함하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그러한 플라스미드 벡터의 예는 제한하고자 하는 것은 아니지만 pKF19k, pT7BlueT 및 pET16b이다. 형질전환체를 제 조하기 위하여 사용될 수 있는 숙주는, 제한하고자 하는 것은 아니지만, 미생물 예로서 세균, 효모 및 곰팡이, 및 포유류, 어류, 곤충 등의 배양된 세포를 포함한다. 숙주에 적절한 벡터를 사용하여 작제된 재조합 DNA 분자를 사용하여 형질전환체를 제조한다.

아가레이즈 I을 유전 공학에 의해 제조하는 방법을 하기에 상세히 기술한다.

예를 들면, 서열번호:22중 아미노산 번호 21로부터 출발하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 적절한 플라스미드 벡터 (예: pKF19k (Takara Shuzo), pT7BlueT (Takara Shuzo) 또는 pET16b (Takara Shuzo))내로 도입하여 플라스미드를 작제한다. 상기 플라스미드로 형질변환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) (예: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109 또는 BL21(DE3)pLysS)를 적절한 액체 배지에서 배양한다. 필요한 경우 IPTG 등을 사용하여 유도시킨다. 플라스미드에 도입된 DNA 단편에 의해 코딩된 폴리펩티드가 발현된다.

단위 배양액중 형질전환체에 의해 발현되는 β-아가레이즈 활성이 NAB2-1-1의 배양액에 대하여 관찰되는 것보다 통상 높다.

아가레이즈 II에 대하여, 아가레이즈 II을 발현하는 형질전환체는 예를 들면, 서열번호:23중 아미노산 번호 27, 181 또는 318로부터 출발하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 사용하여 아가레이즈 I에 대하여 상기 기술된 유전 공학법에 의해 제조될 수 있다.

상기 기술한 바와 같이 유전 공학법에 의해 제조된 본 발명의 아가레이즈는 통상의 정제 방법, 예로서 황산암모늄으로의 염처리 또는 용매 침전에 의해 부분적으로 정제될 수 있다. 또한, 전기영동시 단일 밴드인 정제된 효소 시료는 통상의 정제 방법, 예로서 조합 칼럼 크로마토그래피(예: 음이온-교환 칼럼 및 겔 여과)를 사요하여 수득할 수 있다.

유전 공학법에 의해 제조된 본 발명의 아가레이즈가 불용성인 경우, 공지된 방법에 따라 용해시킬 수 있고 회수할 수 있다.

다양한 정제도의 본 발명의 수득한 재조합 α-아가레이즈를 기질로서 홍조류에 포함된 폴리사카라이드(예: 아가 또는 아가로오스)와 반응시켜 아가로올리고사카라이드 예로서 아가로비오스, 아가로테트라오스, 아가로헥사오스 및 아가로옥타오스를 제조할 수 있다.

예를 들면, 기질로서 1%(w/v) 아가로오스를 사용하여 50℃에서 16 시간동안 반응시켜 아가로올리고사카라이드를 제조할 수 있다.

유사하게, 다양한 정제도의 본 발명의 수득한 재조합 β-아가레이즈를 핵산 증의 전기영동에 사용되는 아가로스 겔에 작용시켜 아가로오스 겔중 물질(예: 핵사)을 효율적으로 추출할 수 있다.

예를 들면, 1%(w/v) 또는 3%(w/v) 아가로오스 겔상에서 전기영동하는 경우, 겔중 물질은 본 발명의 수득한 재조합 β-아가레이즈를 67℃에서 10 분동안 관심의 대상이 되는 물질을 포함하는 아가로스 겔상에 작용시켜 효율적으로 추출될 수 있다.

N-말단으로부터 ORF의 30% 이하를 결실시켜 본 발명의 아가레이즈의 열안정 성을 향상시킬 수 있다. 결실시키극 영역은 ORF의 30% 이하(예: 10%, 20%, 등)인 한 특별히 제한하지 않는다. 예를 들면, N-말단으로부터 아가레이즈 II의 29.1%를 결실시켜 아가레이즈 II의 열안정성을 향상시킬 수 있다. 칼슘 존재하에서 열안정선은 특히 현저하게 향상된다.

열안정성을 향상시키기 위해 N-말단 부위를 결실시키는 방법과 관련하여 특별히 제한하지 않는다. 유전 공학 기술을 사용하거나 프로테아제로 처리하여 수행할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되는 것은 아니다.

실시예 1

활성 측정 방법

본 발명의 아가레이즈 정제시, 정제되거나 부분적으로 정제된 효소 시료의 활성을 기질로서 아가로오스 LO3 (Takara Shuzo)을 사용하여 효소 반응을 수행한 후 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 생성된 아가로테트라오스 또는 네오아가로테트라오스를 측량하여 측정한다. 방법은 하기 상세히 설명한다.

10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 I인 경우) 또는 10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 II인 경우)중 아가로오스를 0.2%(w/v) 또는 0.5%(w/v) 농도로 포함하는 용액을 제조하였다. 기질로서 180㎕의 용액을 20㎕의 효소 용액을 혼합하였다. 혼합물을 50℃에서 5 내지 30분, 바람직하게 10 분동안 반응시킨 후, 비등점 또는 75℃에서 가열하여 반응을 종결시킨다. 30㎕의 반응 혼합물을 TSK겔 α-2500 칼럼에 사용하였다(내부 지름: 7.8 mm; 길이: 300 mm; Tosoh). 0.8 ml/분의 유속으로 용리제로서 70% 아세토니트릴 용액을 사용하여 용출을 수행하였다. 효소 반응에 의해 형성된 약 25 분의 보유시간에서 용출되는 아가로테트라오스 또는 약 24 분의 보유시간에서 용출되는 네오아가로테트라오스를 측량하였다.1 유니트(1 U)는 10분 후 1 ㎕mol의 아가로테트라오스를 제조하는 효소의 양으로 정의한다.

실시예 2

NAB2 -1-1로부터의 아가레이즈의 제조

100 ml의 인공 해수(제품명: Jamarin S; Jamarin Laboratory)를 제조하였다. 0.3%(w/v) 농도의 펩톤 (Difco) 및 0.02%(w/v)의 효모 추출물 (Difco)을 가하였다.이어서 pH를 3M 탄산나트륨을 사용하여 7.8로 조절하였다. 생성된 혼합물을 500-ml의 삼각플라스크에 옮겼다. 오토클레이브에서 멸균한 후 NAB2-1-1을 혼합물에 접종하고 37℃에서 120 rpm으로 밤새도록 배양하였다. 생성된 배양액을 전배양액(preculture)으로서 사용하였다.

본 배양을 하기와 같이 수행하였다. 3,000 ml의 인공 해수(제품명: Jamarin S; Jamarin Laboratory)를 5,000 ml의 자(jar) 발효기 베쓸에서 제조하였다. 0.3%(w/v) 농도의 펩톤 (Difco) 및 0.02%(w/v)의 효모 추출물 (Difco)을 가하였다.이어서 pH를 7.8로 조절하였다. 12 g의 NuSieve GTG 아가로오스 (Takara Shuzo)를 가하였다. 오토클레이브를 사용하여 혼합물을 멸균하였다. 30ml의 전배양액을 혼합 물내로 접종하고 37℃에서 250 rpm으로 18시간동안 배양하였다. 이어서 배양액을 8,000 x g에서 20 분동안 원심분리하여 세포가 제거된 약 3,000 ml의 상층액을 회수하였다.

하기 방법은 4℃ 이하에서 수행하였다.

상층액을 투석막(Sanko Junyaku)에 놓고 이틀 밤에 걸쳐 약 500g의 폴리에틸렌 글리콜에 적셔 약 10배로 농축시켰다. 탈염화시키기 위하여 완충액 I (10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에 대하여 투석하였다.

투석액을 완충액으로 평형화된 음이온-교환 수지 DEAE Toyopearl 650M (Tosoh)로 충진된 칼럼(Φ 2.0 cm x 12 cm)에 로딩하였다. 칼럼을 약 120 ml의 완충액 I으로 세척하였다. 비흡착성 분획 및 세정 분획 (약 400 ml)을 회수하고 아가레이즈 I 분획으로서 배합하였다. 10 mM 내지 1,000 mM 염화나트륨 (총용출량: 400 ml)의 선형 구배를 사용하여 용출을 수행하였다. 농도 300 mM 및 600 mM 사이의 염화나트륨에서 용출된 약 160 ml의 분획을 아가레이즈 II 분획을 회수하였다.

아가레이즈 I 분획 및 아가레이즈 II 분획를 탈염화시키기 위하여 완충액 II(10 mM 염화칼슘,10 mM 염화나트륨, 5% 글리세롤 및 1mM PMSF를 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에 대하여 투석하였다.

아가레이즈 II 분획을 추가로 하기와 같이 정제하였다. 투석된 아가레이즈 II 분획을 25 ml 의 QAE Toyopearl 550C (Tosoh)로 충진된 칼럼(Φ 2.0 cm x 12 cm)상에 로딩하였다. 이러한 경우, 10 mM 내지 800 mM 염화나트륨 (총용출량: 250 ml)의 선형 구배를 사용하여 용출을 수행하였다. 약 500 mM에서 용출된 약 70ml의 분획을 수득하였다. 이 분획을 완충액 II에 대하여 투석하고, 약 1 ml using 원심분리 한외여과막 CENTRIPREP-10 (Amicon)을 사용하여 약 1ml의 부피로 농축시켰다. 농축액을 완충액 II로 평형화된 Sephadex G-100 (Pharmacia)으로 충진된 칼럼(Φ0.8 cm x 50 cm)을 사용하여 겔 여과하였다. 약 20 ml의 아가레이즈 II 분획을 수득하였다. 다시 한외여과막을 사용하여 이 분획을 약 1ml의 부피로 농축시켰다.

소듐 도데셀 설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제된 단백질을 전기영동하여 거의 균일하게 정제되었음을 확인하였다. 전체 활성은 약 150 U이었다.

아가레이즈 I 분획을 추가로 하기와 같이 정제하였다.

투석된 아가레이즈 I 분획을 완충액 II으로 평형화된 CM Toyopearl 650 (Tosoh)로 충진된 칼럼(Φ 2.0 cm x 9.5 cm)상에 로딩하였다. 10 mM 내지 10,00 mM 염화나트륨 (총용출량: 300 ml)의 선형 구배를 사용하여 용출을 수행하였다. 염화나트륨 농도 약 300 mM이하에서 용출된 약 90ml의 아가레이즈 I 분획을 수득하였다. 1.0 M 황산암모늄을 포함하는 완충액 II에 대하여 이 분획을 밤새도록 투석하고, 동일한 완충액으로 평형화된 30ml의 Butyl Toyopearl 650M (Tosoh)로 충진된 칼럼(φ 2.0 cm x 9.5 cm)상에 로딩하였다. 1.0 M 내지 0 M 황산암모늄 (총용출량: 300 ml)의 선형 구배를 사용하여 용출을 수행하였다. 300mM 내지 0M 범위의 농도에서 용출된 아가레이즈 I 분획 (약 60 ml)를 회수하였다. 아가레이즈 II과 같이, 분획을 완충액 II에 대하여 투석하고 원심 한외여과막 CENTRIPREP-10 (Amicon)을 사 용하여 약 1ml의 부피로 농축시켰다.

소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔상에서 정제된 단백질을 전기영동하여 거의 균일하게 정제되었음을 확인하였다. 전체 활성은 약 310 U이었다.

실시예 3

효소의 다양한 성질 조사

[아가레이즈 I 및 아가레이즈 II와의 반응 산물의 동정]

10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 I인 경우) 또는 10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 II인 경우)중 아가로오스를 0.5%(w/v) 농도로 포함하는 20㎕의 용액을 정제된 효소 아가레이즈 I 또는 아가레이즈 II를 사용하여 분해하였다. 용리제로서 70% 아세노니트릴를 사용하여 겔 여과 칼럼(Tosoh, TSKgel α-2500)하였다. 결과, 아가레이즈 I에 대하여 주요 피크는 약 24 분 및 약 28 분에서 관찰되었다. 표준에 대해 관찰된 지연 시간에 기초하여 이들 피크는 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스에 각각 일치한다고 판단되었다. 아가레이즈 II를 사용한 분해 산물에 대하여, 주요 피크는 약 22 분, 약 25 분 및 약 29 분의 지연 시간에서 관찰되었다. 표준에 대해 관찰된 지연 시간에 기초하여 이들 피크는 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스에 각각 일치한다고 판단되었다.클로로포름 : 메탄올 : 아세트산 = 3 : 3 : 1의 조성물을 갖는 전개액을 사용하여 박층 크로마토그래피에 2회 전개시켜 반응 산물을 확인하였다. 3개의 아가로올리고사 카라이드, 즉, 아가로비오스 (Rf 값 = 0.76), 아가로테트라오스 (Rf 값 = 0.50) 및 아가로헥사오스 (Rf 값 = 0.33), 및 2개의 네오아가로올리고사카라이드, 즉, 네오아가로테트라오스 (Rf 값 = 0.59) 및 네오아가로헥사오스 (Rf 값 = 0.41)을 대조군으로서 사용하였다. 결과, 아가레이즈 I을 사용하여 수득한 반응 산물에 대하여 네오아가로올리고사카라이드에 일치하는 위치에서 오르시놀-황산을 사용하여 발색 물질을 확인하였다. 아가레이즈 II를 사용하여 수득한 반응 산물에 대하여 아가로올리고사카라이드에 일치하는 위치에서 발색 물질을 확인하였다. 이 결과는 아가레이즈 I이 아가로오스 분자에서 D-갈락토오스 및 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 β-1,4 결합을 가수분해하여 네오아가로올리고사카라이드를 제조하는 β-아가레이즈이고, 아가레이즈 II는 아가로오스 분자에서 α-1,3 결합을 가수분해하여 아가로올리고사카라이드를 제조하는 α-아가레이즈이다.

[Ca 이온 요구성]

아가레이즈 I 용액 및 아가레이즈 II 용액을 무칼슘 완충액 (10 mM 염화나트륨 및 1 mM EDTA를 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에 대하여 밤새도록 투석하였다. 10 mM 염화나트륨 및 1 mM EDTA를 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)중 0.2%(w/v) 농도로 아가로오스를 포함하는 용액을 가하였다. 혼합물을 50℃에서 10 분동안 반응시켰다. 끓는물에서 1분(아가레이즈 I의 경우) 또는 75℃에서 1분(아가레이즈 II의 경우)동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 활성을 측정하였다. 50℃에서 10 분동안의 통상의 반응에 대하여 관찰된 활성을 100%로 정의하였다. 결과, 아가레이즈 I 및 아가레이즈 II는 각각 그 활성의 약 100% 및 약 60%를 나타내었다.

[최적 온도]

효소의 불활성화가 억제되고 아가레이즈 I 및 아가레이즈 II에 대하여 반응이 신속하게 진행되는 온도는 50 내지 65℃ 및 45 내지 55℃였다.

[열안정성]

지정된 기간동안 효소 용액을 48℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 가열하였다. 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 I인 경우) 또는 10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)(아가레이즈 II인 경우)중 아가로오스를 0.2%(w/v) 농도로 용액을 가열된 용액에 가하였다. 혼합물을 50℃에서 10 분동안 반응시켰다. 끓는물에서 1분(아가레이즈 I의 경우) 또는 75℃에서 1분(아가레이즈 II의 경우)동안 가열하여 반응을 종결시켰다. 이어서, 활성을 측정하였다. 50℃에서 10 분동안의 통상의 반응에 대하여 관찰된 활성을 100%로 정의하였다. 결과, 아가레이즈 I은 65℃에서 60 분동안 처리한 후 그 활성의 약 85%를 나타내었고 아가레이즈 II는 55℃에서 10 분동안 처리한 후 그 활성의 40%를 나타내었다.

[분자량]

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동를 사용하여 분자량을 측정하였다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 통상의 방법에 따라 분자량 마커(Bio-Rad, 미오신 (MW 200,000), α-갈라토시다아제 (MW 116,250), 포스포릴라아제 b (MW 97,400), 소 혈청 알부민 (MW 66,200), 오브알부민 (MW 45,000), 탄산안히드라제(MW 31,000), 트립신 저해제 (MW 21,500), 리소자임 (MW 14,400))과 함께 SDS를 포함하는 10-20% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였다. 각각 유동성에 기초하여 아가레이즈 I 및 아가레이즈 II의 분자량은 약 48,000 및 약 117,000이었다.

[아미노-말단 아미노산 서열]

아가레이즈 I 및 아가레이즈 II의 아미노-말단 아미노산 서열을 Edman 분해 방법에 따라 결정하였다. 약 10 pmol 효소 단백질에 상응하는 아가레이즈 I 또는 아가레이즈 II을 포함하는 정제된 효소 시료 용액을 10-20% 폴리아크릴아미드 구배 겔을 사용하여 SDS-PAGE 시켰다. 전기영동후, 겔 상에서 분리된 효소를 막 ProBlot (Applied Biosystems)상에 블로팅하였다. 효소가 흡착된 막 일부를 단백질 서열기 G1000A (Hewlett Packard)를 사용하여 분석하였다. 결과, 결정된 아가레이즈 I (P1; 서열번호:1) 및 아가레이즈 II (P2; 서열번호:2)의 아미노-말단 아미노산 서열은 각각 Ala-Asp-Xaa-Asp-gly-Val-Pro-Ile-Pro-Ala-Pro-Ala-gly였 및 Glu-Thr-Ile-Val-Leu-gln-Ala-glu-Ser-Phe이었다.

[부분 아미노산 서열의 결정]

2 nmol 의 정제된 아가레이즈 I 또는 II을 사용하여 시스테인 잔기의 카복실메틸화를 수행하였다. 펩티드 단편을 분리하고 리실렌도펩티다제로 분해하여 수득한 분해 산물로부터 HPLC을 사용하여 정제하였다.μBondasphare C8 (Waters)을 칼럼을 위해 사용하고, 용액 A (0.1% TFA) 및 용액 B (80% 아세노니트릴을 포함하는 0.1% TFA)을 용출을 위해 사용하였다. 선형으로 50분에 걸쳐 0% 내지 100%로 용액 B의 비를 증가시키면서 0.5 ml/분의 유속으로 용출을 수행하였다.

분획을 수거하기 위하여 214 nm에서 검출을 수행하였다. 각각의 펩티드 분획에 대하여 아미노산 서열 분석하였다. 아가레이즈 I에 대하여, 부분 아미노산 서열 PI3 (서열번호:3) 및 PI4 (서열번호:4)을 결정하였다. 아가레이즈 II에 대하여, 부분 아미노산 서열 PII5 (서열번호:5), PII6 (서열번호:6) 및 PII7 (서열번호:7) 을 결정하였다.

실시예 4

아가로올리고사카라이드의 제조

최종 농도 1.0%(w/v)으로 반응용 2ml의 완충액(10 mM 염화칼슘 및 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에 아가로오스 LO3을 가하였다. 약 1.0 U 정제된 아가레이즈 II 시료를 추가로 가하였다. 혼합물을 50℃에서 16 시간동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 혼합물을 0.22-μm 필터 (Millipore)를 통해 여과하였다. 여과된 반응 혼합물을 실시예 1에서 본 발명의 효소의 활성을 측정하기 위하여 사용된 것과 동일한 조건하에서 고성능 액체 크로마노토그래피를 사용하여 분석하여 생성된 아가로올리고사카라이드를 결정하였다. 결과, 아가로비오스, 아가로테트라오스 및 아가로헥사오스가 반응 혼합물에서 검출되었다. 따라서, 상기-언급한 효소 반응으로 이들 저분자 아가로올리고사카라이드가 생성되었음을 확인하였다.

실시예 5

네오아가로올리고사카라이드의 제조

최종 농도 1.0%(w/v)으로 반응용 2ml의 완충액(10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에 아가로오스 LO3을 가하였다. 약 1.0 U 정제된 아가레이즈 I 시료를 추가로 가하였다. 혼합물을 65℃에서 16 시간동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 혼합물을 0.22-μm 필터 (Millipore)를 통해 여과하였다. 여과된 반응 혼합물을 실시예 1에서 본 발명의 효소의 활성을 측정하기 위하여 사용된 것과 동일한 조건하에서 고성능 액체 크로마노토그래피를 사용하여 분석하여 생성된 네오아가로올리고사카라이드를 결정하였다. 결과, 네오아가로테트라오스 및 네오아가로헥사오스가 반응 혼합물에서 검출되었다. 따라서, 상기-언급한 효소 반응으로 이들 저분자 네오아가로올리고사카라이드가 생성되었음을 확인하였다.

실시예 6

아가레이즈 I을 사용한 아가로오스 겔로부터의 핵산 회수

1μg의 DNA 분자량 마커인 λ-HindIII (Takara Shuzo)을 1.0%(w/v) SeaPlaque GTG 아가로오스 겔상에서 전기영동시켰다. 약 4.4 kbp 및 약 6.6 kbp 크기의 분리된 DNA 단편을 갖는 겔을 절단하고 1.5-ml Eppendorf 튜브에 놓았다. 1 ml의 반응 완충액 (50 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2) )을 가하였다. 혼합물을 실온에서 10 분동안 방치시켰다. 이어서 완충액을 버리고 겔을 튜브에 남겼다 튜브를 67℃에서 5 분동안 겔을 융해시키기 위해 인큐베이션시켰다. 1.0 U의 정제된 아가레이즈 I 효소를 가하였다. 혼합물을 10분동안 상기 온도에서 인큐베이션시켰다. Eppendorf 튜브를 얼음상에 놓음으로써 아가로오스 겔이 완전하게 용해되었음을 확인하였다. 이어서 통상의 방법에 따라 에탄올 침전을 수행하여 DNA 단편을 회수하였다. 유사하게 DNA 분자량 마커, 100 bp Ladder 마커 (Takara Shuzo)을 3.0%(w/v) NuSieve GTG 아가로오스 겔로부터 DNA로부터 회수하였다. 이러한 경우 400 bp 및 500 bp의 DNA 단편을 회수하였다. 슈도모나스 알탄티카(Pseudomonas altantica)(Takara Shuzo) 로부터 유래된 상업적으로 이용가능한 β-아가레이즈의 것과 비교한 DNA 회수율을 결과를 표 2에 나타낸다.

상업적으로 이용가능한 β-아가레이즈를 사용하는 경우, 효소를 부가하기 전에 아가로스 겔을 융해시키기 위하여 사용되는 온도로부터 효소가 작용할 수 있는 온도로 온도를 저하시켜야 한다. 반응 온도가 낮기 때문에, 반응 시간은 길어야 하고 조작 소요 시간은 연장된다.

한편, 본 발명의 아가레이즈 I을 사용하는 경우, 아가로오스 겔을 융해된 후 즉시 상기 효소를 가할 수 있다. 온도를 저하시킬 필요없이 고온에서 반응을 수행시킬 수 있기 때문에, 조작 소요 시간은 짧다.

표 2

* 회수된 DNA의 양/적용된 DNA의 양 x 100.

** 에탄올 침전까지의 소요 시간.

실시예 7

NAB2 -1-1로부터의 염색체 DNA 제조

1리터의 인공 해수(제품명: Jamarin S; Jamarin Laboratory)를 제조하였다. 0.3%(w/v) 농도의 펩톤 (Difco) 및 0.02%(w/v)의 효모 추출물 (Difco)을 가하였다.이어서 pH를 3M 탄산나트륨을 사용하여 7.8로 조절하였다. 0.1%(w/v) 농도의 아가로오스 LO3 (Takara Shuzo)를 가하였다. 혼합물을 오토클레이브를 사용하여 멸균시켰다. 10㎕의 아가레이즈-제조 균주 NAB2-1-1의 글리세롤 저장액을 2ml의 배지내로 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 1ml의 배양액을 100ml의 동일한 배지에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 이어서 배양액을 8,000 x g에서 10 분동안 원심분리하여 회수하였다. 세포를 10 ml의 완충액 A (100 mM NaCl 및 10 mM EDTA(pH 8.0)를 포함하는 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0))에 현탁시켰다. 0.25 ml 의 리소자임 용액 (20 mg/ml)을 가하였다. 혼합물을 37℃에서 1 시간동안 인큐베이션시켰다. 이어서 5.0% 농도의 SDS를 포함하는 2.5 ml의 완충액 A를 가하였다. 생성된 혼합물을 진탕시키면서 60℃에서 20 분동안 인큐베이션시켰다. 1.5 ml의 프로테아제 K 용액 (20 mg/ml)를 가하였다. 혼합물을 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 이어서 거의 동량의 페놀을 혼합물에 가하고 생성된 혼합물을 약 10 분동안 실온에서 서서히 진탕시켰다. 혼합물을 2,000 x g에서 10 분동안 원심분리하였다. 상층액을 냉 에탄올에 이동시켰다. 염색체 DNA를 유리 막대를 사용하여 휘저었다(wind). 염색체 DNA를 휘저은 용액에 거의 동량의 페놀을 가하고 유사한 공정을 수행하여 다시 염색체 DNA를 휘저었다. 염색체 DNA를 10㎕ 의 완충액 A에 현탁시켰 다. 50㎕의 RNase A 용액 (10 mg/ml)을 가하고, 혼합물을 37℃에서 10 분에서 인큐베이션시켰다. 염색체 DNA를 에탄올 침전에 의해 용액으로부터 회수하고 5 ml의 완충액 B (140 mM NaCl 및 1 mM EDTA (pH 7.5)을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5))을 현탁시켰다. 현탁액을 동일한 완충액에 대하여 밤새도록 투석시켰다. 이어서, 약 5.0 mg의 염색체l DNA를 수득하였다. OD260 nm/280 nm에 기초하여 DNA의 순도를 조사하였다 각 경우 값은 약 1.8이었다. 하기 기술하는 바와 같이 아가레이즈 I 및 아가레이즈 II의 클로닝을 위해 염색체 DNA 를 사용하였다.

실시예 8

아가레이즈 I 유전자의 클로닝

실시예 3에서 기술된 바와 같이 결정된 아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열, P1 (서열번호:1)에 기초하여 믹스(mixed) 프라이머 1 및 2 (서열번호:8 및 9)를 작제하고 DNA 합성기를 사용하여 합성하고 정제하였다. 구체적으로, 각각 서열번호:8 및 9으로 표시되는 믹스 프라이머 1 및 2는 아미노산 서열 P1중 아미노산 번호 4-10 및 4-13의 아미노산 서열과 일치한다. 시험관내 클로닝 키트 (Takara Shuzo)에서 이들 프라이머 및 LA PCR을 사용하여 아가레이즈 I 유전자 클로닝을 수행하였다.

1차 PCR을 하기와 같이 수행하였다. 실시예 7에서 제조된 염색체 DNA를 제한효소 BamHI를 사용하여 완전하게 분해하였다. DNA Ligation 키트 (Takara Shuzo)를 사용하여 말단의 분해된 DNA에 BamHI 아댑터(adaptor)를 결찰시켰다. 그의 일부를 PCR용 0.5-ml 튜브에 놓았다. 5㎕의 10 x LA PCR 완충액, 8㎕의 dNTP 혼합물, 1㎕ 믹스 프라이머 1, 1㎕ 프라이머 C1 (시험관내 클로닝 키트(Takara Shuzo)에 첨부된 프라이머), 0.5㎕의 TaKaRa LA Taq 및 50㎕까지 멸균수를 가하였다. 용액을 50㎕의 광유를 오버레이(overlay)한 후, 자동 유전자 증폭기 Thermal Cycler (Takara Shuzo)를 사용하여 반응시켰다. 94℃에서 2 분동안 변성시킨 후, PCR을 30회 시행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 2 분동안 프라이머의 어닐링 및 72℃에서 2 분동안의 합성 반응으로 구성되었다.

이어서, 2차 PCR을 반응 혼합물을 주형으로서 사용하여 수행하였다. 주형으로서 1차 PCR에 의해 수득한 1㎕ 반응 혼합물, 및 믹스 프라이머 2 및 프라이머 C2 (시험관내 클로닝 키트 (Takara Shuzo)중 첨부된 LA PCR에 첨부된 프라이머)의 배합물을 사용한 것을 제외하고 1차 PCR을 위한 것과 동일한 조건하에서 PCR을 수행하였다. PCR 후, 광유 상층을 제거하고 5㎕ 반응 혼합물을 1.0% 아가로오스 겔상에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 DNA를 염색하여 증폭 산물을 확인하였다. 결과, 약 0.8 kb의 DNA 단편이 관찰되었다. 상기 DNA 단편을 βN으로 명명하였다.

아가로오스 겔로부터 절단된 증폭된 단편 βN을 벡터 pT7Blue에 결찰시키고에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질변환시키기 위해 사용하였다. 디데옥시 쇄 터미네이터 방법에 따라 형질전환체를 사용하여 증폭된 단편 βN의 뉴클레오티드 서열 말단 영역을 결정하였다. 프라이머 3 및 4 (서열번호:10 및 11) 를 N-말단 영역의 서열에 기초하여 작제하였다. 프라이머 5 및 6 (서열번호:12 및 13)을 N-말단 영역외의 말단측 영역의 서열에 기초하여 작제하였다. DNA 합성기를 사용하여 항성한 후 정제하였다. βN의 DNA 단편 상류 및 하류를 이들 프라이머 및 시험관내 클로닝 키트 (Takara Shuzo)중 LA PCR를 사용하여 유사한 방법으로 클로닝하였다. 이러한 경우, 프라이머를 55℃에서 1 분동안 어닐링하였다.

상류 영역에 대하여, 프라이머 3 및 4를 이용하여 약 0.6 kb의 DNA 단편을 수득하고 βUN으로 명명하였다. βN의 하류 영역에 대하여, 프라이머 5 및 6을 이용하여 약 1.3 kb의 DNA 단편을 수득하고 βC로 명명하였다. βUN 및 βC 모두를 벡터 pT7Blue (Novagen)에 결찰시켰다. 디데옥시 쇄 터미네이터 방법에 따라 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. DNA 단편 βN, βUN 및 βC의 뉴클레오티드 서열을 분석하고 배열하였다. 결과, 438개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 ORF가 발견되었다.

ORF의 뉴클레오티드 서열 및 ORF의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 각각 서열번호:20 및 22에 나타낸다. βUN에는 아미노산 서열 P1에 대한 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 P1로부터 상류의 20개의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 추가의 상류 영역에서 SD-성 서열이 존재한다는 것이 발견되었다.

실시예 3에서 결정된 N-말단 아미노산 서열 P1은 서열번호:22에서 21번째 내지 33번째 아미노산 서열과 일치한다. 실시예 3에서 결정된 부분 아미노산 서열 PI3 (서열번호:3) 및 PI4 (서열번호:4)는 각각 서열번호:22에서 265번째 내지 272번째 아미노산 및 367번째 내지 376번째 아미노산의 서열에 매치한다.

실시예 9

아가레이즈 II 유전자의 클로닝

실시예 3에서 기술된 바와 같이 결정된 아가레이즈 II의 N-말단 아미노산 서열, P2 (서열번호:2) 및 PII2(서열번호:6)에 기초하여 믹스 프라이머 7 및 8 (서열번호:14 및 15)를 작제하였다. 서로 상이한 스트랜드에 혼성화한다. 믹스 프라이머를 DNA 합성기를 사용하여 합성하고 정제하였다.

구체적으로, 서열번호:14로 표시되는 믹스 프라이머 7은 아미노산 서열 P2중 아미노산 번호 1-8의 아미노산 서열과 일치하고, 서열번호:15로 표시되는 믹스 프라이머 8은 아미노산 서열 PII6중 아미노산 번호 2-10을 코딩하는 DNA의 상보적인 스트랜드와 일치한다.

시험관내 클로닝 키트 (Takara Shuzo)에서 이들 프라이머 및 LA PCR을 사용하여 아가레이즈 II 유전자 클로닝을 수행하였다.

1차 PCR을 하기와 같이 수행하였다. 실시예 7에서 제조된 10 ng의 NAB2-1-1 염색체 DNA를 PCR용 0.5-ml 투브에 놓았다. 5㎕의 10 x LA PCR 완충액, 8㎕의 dNTP 혼합물, 40 pmol의 각각의 믹스 프라이머 7 및 8, 0.5㎕의 TaKaRa LA Taq 및 멸균수를 50㎕으로 가하였다. 용액을 50㎕의 광유로 오버레이(overlay)한 후, 자공 유전자 증폭기 Thermal Cycler (Takara Shuzo)를 사용하여 반응시켰다. 94℃에서 2 분동안 변성시킨 후, PCR을 30회 시행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 2 분동안 프라이머의 어닐링 및 72℃에서 2 분동안의 합성 반응으로 구성되었다. 광유 상층을 제거하고 5㎕ 반응 혼합물을 1.0% 아가로오스 겔상에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 DNA를 염색하여 증폭 산물을 확인하였다. 결과, 약 600bp의 DNA 단편이 관찰되었다. 상기 DNA 단편을 αN으로 명명하였다.

아가로오스 겔로부터 절단된 증폭된 단편 αN을 벡터 pT7Blue에 결찰시키고에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질변환시키기 위해 사용하였다. 디데옥시 쇄 터미네이터 방법에 따라 형질전환체를 사용하여 증폭된 단편 αN의 뉴클레오티드 서열 말단 영역을 결정하였다. 프라이머 9 및 10 (서열번호:16 및 17) 을 N-말단 영역의 서열에 기초하여 작제하였다. 프라이머 11 및 12 (서열번호:18 및 19)을 N-말단 영역외의 말단측 영역의 서열에 기초하여 작제하였다. DNA 합성기를 사용하여 항성한 후 정제하였다. αN의 DNA 단편 상류 및 하류를 이들 프라이머 및 시험관내 클로닝 키트 (Takara Shuzo)중 LA PCR를 사용하여 유사한 방법으로 클로닝하였다.

이러한 경우, PCR을 하기와 같이 수행하였다. 실시예 7에서 제조된 NAB2-1-1 염색체 DNA를 제한효소 BamHI를 사용하여 완전하게 분해하였다. DNA Ligation 키트 (Takara Shuzo)를 사용하여 말단의 분해된 DNA에 BamHI 아댑터(adaptor)를 결찰시켰다. 그의 일부를 PCR용 0.5-ml 튜브에 놓았다. 5㎕의 10 x LA PCR 완충액, 8㎕의 dNTP 혼합물, 1㎕ 믹스 프라이머 9, 1㎕ 프라이머 C1, 0.5㎕의 TaKaRa LA Taq 및 50㎕까지 멸균수를 가하였다. 용액을 50㎕의 광유로 오버레이(overlay)한 후, 자공 유전자 증폭기 Thermal Cycler (Takara Shuzo)를 사용하여 반응시켰다. 94℃에서 2 분동안 변성시킨 후, PCR을 30회 시행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1분동안 변성, 50℃에서 2 분동안 프라이머의 어닐링 및 72℃에서 2 분동안의 합성 반응으로 구성되었다.

이어서, 2차 PCR을 반응 혼합물을 주형으로서 사용하여 수행하였다. 주형으 로서 1차 PCR에 의해 수득한 1㎕ 반응 혼합물, 및 프라이머 10 및 프라이머 C2의 배합물을 사용한 것을 제외하고 1차 PCR을 위한 것과 동일한 조건하에서 PCR을 수행하였다. PCR 후, 광유 상층을 제거하고 5㎕ 반응 혼합물을 1.0% 아가로오스 겔상에서 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 DNA를 염색하여 증폭 산물을 확인하였다. 결과, 약 500bp의 DNA 단편이 관찰되었다. 상기 DNA 단편을 αUN으로 명명하였다.

유사하게 프라이머 11 및 12를 이용하여 αN의 하류의 약 2-kb의 DNA 단편을 수득하고 αC로 명명하였다. αUN 및 αC 모두를 벡터 pT7Blue (Novagen)에 결찰시켰다. 디데옥시 쇄 터미네이터 방법에 따라 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. DNA 단편 αN, αUN 및 αC의 뉴클레오티드 서열을 분석하고 배열하였다. 결과, 1089개의 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩하는 ORF가 발견되었다.

ORF의 뉴클레오티드 서열 및 ORF의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 각각 서열번호:21 및 23에 나타낸다. αUN에는 아미노산 서열 P2에 대한 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 P2로부터 상류의 시그날 펩티드성 서열을 갖는 26개의 아미노산을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및 추가의 상류 영역에서 SD-성 서열이 존재한다는 것이 발견되었다.

아미노산 서열 P2는 서열번호:23에서 27번째 내지 36번째 아미노산 서열과 일치한다. 실시예 3에서 결정된 부분 아미노산 서열 PII5 (서열번호:5), PII6 (서열번호:6) 및 PII7 (서열번호:7)은 각각 서열번호:23에서 129번째 내지 138번째 아미노산, 640번째 내지 649번째 아미노산 및 738번째 내지 747번째 아미노산의 서열 에 매치된다.

또한, 3개의 추정의 Ca-결합 부위(서열번호:23중 171-184, 271-283 및 987-999)가 발견되었다.

실시예 10

아가레이즈 I을 발현시키기 위한 프라스미드의 구축

프라이머 13 (서열번호:24)은 뉴클레오티드 번호 12 내지 17의 제한효소 EcoRI에 대한 인식 서열 및 뉴클레오티드 번호 19 내지 38중 서열번호 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 27에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 DNA이다. 뉴클레오티드 번호 11 내지 16에 제한효소 PstI에 대한 인식 서열을 갖고 염색체상에 아가레이즈 I에 대한 리딩 프레임으로부터 약 300bp 하류의 부위에 상보적이 스트랜드에 혼성화하는 프라이머 13 및 프라이머 14 (서열번호:25)를 사용하여 하기와 같이 PCR을 수행하였다. 각 10 pmol의 프라이머 13 및 14, 주형으로서 NAB2-1-1로부터의 10 ng 염색체 DNA, 5㎕의 10 x ExTaq 완충액, 8㎕의 dNTP 혼합물, 0.5㎕의 TaKaRa ExTaq 및 50㎕까지 멸균수를 PCR용 0.5-ml 튜브에 가하였다. 튜브를 자동 유전자 증폭기 Thermal Cycler (Takara Shuzo)에 놓았다. 94℃에서 2 분동안 변성시킨 후, PCR을 25회 수행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1 분, 55℃에서 2 분 및 72℃에서 2 분으로 구성된다. PCR 산물을 농축시키고 에탄올 침전의 의해 탈염화하고, 제한 효소 EcoRI (Takara Shuzo) 및 PstI (Takara Shuzo)로 이중으로 분해한 후 1.0% 아가로오스 겔상에서 전기영동시켰다. EcoRI-PstI 분해물을 추출하고 정제하였다. 정제된 산물을 동일한 효소로 분해된 pUC18 (Takara Shuzo)와 혼합하고 DNA Ligation 키트 (Takara Shuzo)를 사용하여 결찰시켰다. 10㎕ 결찰 혼합물을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질변환시켰다. 형질전환체를 1.5%(w/v) 농도의 아가 및 50μg/ml 농도의 앰피실린을 포함하는 LB 배지상에서 생육시켰다. 플라스미드를 백색 콜로니로부터 제조하고 DNA 서열화를 수행하였다. PCR 산물이 적절하게 삽입된 플라스미드를 선별하고 pNB101으로 명명하였다. pNB101은 아가레이즈 I의 아미노산 서열(서열번호:22)에서 아미노산 번호 21 내지 437의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다. 플라스미드 pNB101로 형질변환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pNB101으로 명명하여 2001년 1월 10일(원기탁일)에 기탁번호 FERM BP-7854에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.

도입된 pNB101을 갖는 형질전환체를 50μg/ml 앰피실린을 포함하는 2.5 ml의 LB 브로쓰내 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양액 일부를 2.5 ml의 신선한 동일 배지에 접종하고 기하급수적인 성장기에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이때, IPTG를 최종 농도 1.0 mM로 가하였다. 추가의 2시간동안 20℃의 온도에서 배양을 계속하여 관심의 대상이 되는 단백질의 발현을 유도하였다. 이어서 원심분리에 의해 세포를 회수하고 150㎕의 세포 파쇄 용액(10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에서 현탁시켰다. 세포를 초음파에 의해 파 쇄하였다. 상층액으로서의 추출물 및 침전액을 원심분리에 의해 서로로부터 분리하고 기질로서 아가로오스를 사용하여 β-아가레이즈 활성을 측정하기 위한 샘플로서 사용하였다. 이어서 상층액으로서 추출물에 대하여 활성을 관찰하였다. 100ml 배양액에 포함된 활성은 야생형 균주 NAB2-1-1의 것보다 약 25배 높았다.

실시예 11

pET16b 을 사용하는 아가레이즈 I에 대한 발현 시스템

프라이머 15 (서열번호:26) 및 프라이머 16 (서열번호:27), 및 주형으로서 NAB2-1-1 염색체 DNA을 사용하여 실시예 10에 기술된 조건하에 PCR을 수행하였다. 프라이머 15는 뉴클레오티드 번호 14 내지 19의 제한효소 NdeI에 대한 인식 서열 및 뉴클레오티드 번호 20 내지 39중 아가레이즈 I의 아미노산 서열(서열번호 22)의 아미노산 번호 21 내지 27에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머이다. 프라이머 16은 뉴클레오티드 번호 12 내지 17에 제한효소 XhoI에 대한 인식 서열을 갖고 염색체상에 아가레이즈 I에 대한 리딩 프레임으로부터 약 300bp 하류의 부위에 상보적이 스트랜드에 혼성화하는 프라이머이다. 증폭된 단편을 에탄올 침전의 의해 농축시키고 NdeI (Takara Shuzo) 및 XhoI (Takara Shuzo)으로 분해하고, 추출하고 정제하였다. 동일한 효소로 분해된 pET16b (Takara Shuzo)에 산물을 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 pNB201로 명명하였다. pNB201은 아가레이즈 I의 아미노산 서열(서열번호:22)에서 아미노산 번호 21 내지 437의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다.

pNB201을 사용하여 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) BL21(DE3)pLysS 를 형질변환시키고 생성된 형질전환체를 사용하여 실시예 10에 기술된 바와 같이 β-아가레이즈의 활성을 결정하였다. 추출물에 대하여 활성을 관찰하였다. 100ml 배양액에 포함된 활성은 NAB2-1-1의 것보다 약 50배 높았다.

실시예 12

아가레이즈 II를 발현시키기 위한 프라스미드의 구축

프라이머 17 (서열번호:28)은 뉴클레오티드 번호 10 내지 15의 제한효소 EcoRI에 대한 인식 서열 및 뉴클레오티드 번호 17 내지 37에 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호 23)중 아미노산 번호 27 내지 33에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 DNA이다. 뉴클레오티드 번호 11 내지 16에 제한효소 BamHI에 대한 인식 서열을 갖고 염색체상에 아가레이즈 II에 대한 리딩 프레임으로부터 약 250bp 하류의 부위에 상보적이 스트랜드에 혼성화하는 프라이머 17 및 프라이머 18 (서열번호:29)를 사용하여 하기와 같이 PCR을 수행하였다. 각 10 pmol의 프라이머 17 및 18, 주형으로서 야생형 NAB2-1-1로부터의 10 ng 염색체 DNA를 ExTaq(Takara Shuzo)를 사용하는 반응 시스템중 PCR을 위해 사용하였다. 94℃에서 2 분동안 변성시킨 후, PCR을 30회 수행하였다. 각 사이클은 94℃에서 1 분, 55℃에서 2 분 및 72℃에서 2 분으로 구성된다. PCR 산물을 농축시키고 에탄올 침전의 의해 탈염화하고, 제한 효소 EcoRI (Takara Shuzo) 및 BamHI (Takara Shuzo)로 이중으로 분해한 후 1.0% 아가로오스 겔상에서 전기영동시켰다. EcoRI-BamHI 분해물을 추출하고 정제하였다. pUC18을 포함하는 하이브리드 플라스미드를 실시예 10에 기술된 바와 같이 작제하고, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 형질변환시켰다.하이브 리드 플라스미드를 pNA101으로 명명하였다. pNA101은 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 27 내지 1089의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다.

플라스미드 pNA101로 형질변환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)을 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109/pNA101으로 명명하여 2001년 1월 10일(원기탁일)에 기탁번호 FERM BP-7853에 International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central(6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan)에 기탁하였다.

도입된 pNA101을 갖는 형질전환체를 사용하여 세포 파쇄 용액중 10mM 염화칼슘을 함유하는 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 α-아가레이즈 활성을 측정하였다. 추출물에 대하여 활성을 관찰하였다. 100ml 배양액에 포함된 활성은 야생형 균주 NAB2-1-1의 것보다 약 15배 높았다.

실시예 13

결실을 포함하는 아가레이즈 II 단백질의 활성

변형된 단백질을 하기 기술하는 바와 같이 유전 공학법에 의해 제조하였다. 변형된 단백질의 α-아가레이즈 활성을 측정하였다.

프라이머 19(서열번호 30)는 뉴클레오티드 번호 12 내지 17의 제한효소 EcoRI에 대한 인식 서열 및 뉴클레오티드 번호 19 내지 40중 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호 23)의 아미노산 번호 181 내지 188에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머이다.

프라이머 19 및 프라이머 18 (서열번호:29) 및 주형으로서 NAB2-1-1 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다. 산물을 pUC18에 결찰시키고, 실시예 12에 기술된 바와 같이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 형질변환하였다. 연결부의 DNA 서열을 확인하여 수득한 하이브리드 플라스미드를 pNA201로 명명하였다. pNA201d로부터 발현된 단백질은 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 180 이하 부위가 결실된 것이다. 즉, pNA201d는 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 181 내지 1089의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다. IPTG를 사용하여 발현을 유도한 후, 세포 파쇄 용액중 10mM 염화칼슘을 함유하는 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 활성을 측정하였다. 추출물에 대하여 α-아가레이즈 활성을 관찰하였다. 100ml 배양액에 포함된 활성은 NAB2-1-1의 것보다 약 2배 높았다.

프라이머 20(서열번호 31)은 뉴클레오티드 번호 12 내지 17의 제한효소 EcoRI에 대한 인식 서열 및 뉴클레오티드 번호 19 내지 40중 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호 23)의 아미노산 번호 318 내지 325에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프라이머이다. 프라이머 20 및 프라이머 18 (서열번호:29) 및 주형으로서 NAB2-1-1 염색체 DNA를 사용하여 PCR을 수행하여 pUC18, pNA301d를 작제하였다. 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 317 이하의 펩티드 결실된 단백질은 도입된 pNA301d을 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109로부터 발현된다. 즉, pNA301d는 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열 번호:23)중 아미노산 번호 318 내지 1089의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다. 세포 파쇄 용액중 10mM 염화칼슘을 함유하는 것을 제외하고 실시예 10에 기술된 바와 같이 활성을 측정하였다. 추출물에 대하여 α-아가레이즈 활성을 관찰하였다. 100ml 배양액에 포함된 활성은 NAB2-1-1의 것보다 약 15배 높았다. 또한, 도입된 pNA301d를 갖는 형질전환체로부터 유래된 추출물을 칼슘을 포함하지 않는 완충액(10 mM 염화나트륨 및 1 mM EDTA (pH 7.2)를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.2))에 대하여 투석시킨 후 10 mM 염화나트륨 및 1 mM EDTA (pH 7.2)를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.2)중 0.2%의 농도로 아가로오스를 포함하는 용액과 반응시켰다. 결과, 칼슘을 포함하는 완충액을 사용하여 관찰된 것과 유사한 분해 활성이 관찰되었다.

실시예 14

AgarACE 효소와의 비교( Promega )

[최적 온도]

본 발명의 아가레이즈 I의 효소학적 성질을 AgarACE 효소,Promega로부터 판매되는 해양 플라보박테리움(Flavobacterium)으로 유래된 β-아가레이즈의 것과 비교하였다.

10㎕의 아가레이즈 I 또는 AgarACE 효소 (Promega; 첨부된 데이타 쉬트에 따라 0.29 유니트와 일치)를 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.3) (FMC)에서 가열하여 용해하여 40㎕의 1.0%(w/v) NuSieve GTG 아가로오스에 가하였다. 혼합물을 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃에서 10 분동안 반응시켰다. 사전에 실시예 1에 기술된 바와 같은 방법에 따라 효소 모두의 활성을 측정하였다. 이어서, 효소를 가하여 동일한 효소 활성이 각 반응에 관여하도록 하였다. 반응 후, 효소 활성을 실시예 1에 기술된 바와 같이 계산하였다. 최대 효소 활성을 100%으로 정의하고, 상대값으로 결과를 표 3에 나타낸다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 아가레이즈 I의 최적 온도는 50℃ 내지 65℃이고 AgarACE 효소의 최적 온도는 45℃ 내지 50℃이었다.

표 3

[열안정성]

10㎕의 아가레이즈 I 또는 AgarACE 효소 (첨부된 데이타 쉬트에 따라 0.29 유니트와 일치)를 60℃ 또는 65℃에서 지정 기간동안 인큐베이션한 후 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.3) (FMC)에서 가열하여 용해하여 40㎕의 1.0%(w/v) NuSieve GTG 아가로오스에 가하였다. 효소를 가하여 동일한 효소 활성이 상기 기술된 바와 같은 각 반응에 관여하도록 하였다. 혼합물을 10분동안 55℃(아가레이즈 I의 경우) 또는 10분동안 45℃(AgarACE 효소의 경우)에서 반응시켰다. 반응 후, 효소 활성을 실시예 1에 기술된 바와 같이 계산하였다. 최대 효소 활성을 100%으로 정의하고, 상대값으로 결과를 표 4에 나타낸다. 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 10분동안 65℃에서 인큐베이션시킨 후 아가레이즈 I의 활성은 거의 100% 유지된 반면, AgarACE 효소는 65℃에서 10분동안 인큐베이션 한후 완전하게 불활성화되었다.

표 4

실시예 15

칼슘에 기인한 효소의 열안정성 변화

pNA101 (실시예 11) 또는 pNA301d (실시예 13)로 형질전환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) JM109을 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 2.5 ml의 LB 브로쓰에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양액 일부를 100 ml의 동일한 배지에 접종하고 기하급수적인 성장기에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이때, IPTG를 최종 농도 1.0 mM로 가하였다. 추가의 2시간동안 20℃의 온도에서 배양을 계속하여 관심의 대상이 되는 단백질의 발현을 유도하였다. 이어서 원심분리에 의해 세포를 회수하고 5 ml의 세포 파쇄 용액(10 mM 염화나트륨 및 1 mM 염화칼슘을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에서 현탁시켰다. 세포를 초음파에 의해 파쇄하였다. 상층액을 원심분리하여 회수하였다. 상층액중 α-아가레이즈 활성을 측정하였다. 상층액을 세포 파쇄 용액으로 희석하여 각 샘플에 대하여 단위 부피당 동일한 효소 활성이 포함되도록 하였다. 그렇게 수득한 각 효소에 대한 추출물을 칼슘을 포함하는 완충액 A(10 mM 염화나트륨 및 10 mM 염화칼슘을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)), 또는 칼슘을 포함하지 않는 완충액 B(10 mM 염화나트륨 및1 mM EDTA (pH 7.2)를 포함하는 20 mM Tris-HCl (pH 7.2))에 대하여 밤새도록 투석하였다. 20㎕ 효소 용액을 55℃ 또는 50℃에서 10 분동안 인큐베이션시킨 후 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)중 농도 0.2%로 아가로오스를 포함하는 180㎕의 용액과 반응시켰다. 실시예 1에 기술된 방법에 따라 잔존 α-아가레이즈 활성을 측정하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.

NAB2-1-1로부터 수득한 천연 아가로오스 II를 대조군으로 사용하였다.

표 5

* 각 효소에 대하여 완충액 A중 50℃에서 처리한 후의 잔존 활성을 100으로 정의하였다.

실시예 16

결실을 갖는 아가로오스 II의 활성

하기 기술하는 유전 공학법에 의해 변형된 단백질을 제조하였다. 변현된 단백질의 α-아가레이즈 활성을 측정하였다.

프라이머 21 (서열번호:34)은 뉴클레오티드 번호 19 내지 40의 아가로오스 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 290 내지 297에 상응하는 뉴클 레오티드 서열 및 뉴클레오티드 번호 12 내지 17의 제한효소 EcoRI에 대한 인식 서열을 갖는다.

PCR을 프라이머 21 및 프라이머 18 (서열번호:29) 및 주형으로서 NAB2-1-1 염색체 DNA를 사용하여 수행하였다. 산물을 pUC18에 결찰시키고, 실시예 12에 기술된 바와 같이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)을 형질변환시켰다. 연결부의 DNA 서열을 확인하여 수득한 하이브리드 플라스미드를 pNA401d로 명명하였다. pNA401d로부터 발현된 단백질은 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 번호 289 이하의 부분이 결실된 것이다. 즉, pNA401d는 아가레이즈 II의 아미노산 서열(서열번호:23)중 아미노산 서열의 아미노산 번호 290 내지 1089의 아미노산 서열을 코딩하는 플라스미드이다. 실시예 13에서 수득한 pNA301d 또는 상기 기술한 바와 같이 수득한 pNA401d로 형질변환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 50μg/ml의 앰피실린을 포함하는 2.5 ml의 LB 브로쓰에 접종하고 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 배양액 일부를 100 ml의 동일한 배지에 접종하고 기하급수적인 성장기에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이때, IPTG를 최종 농도 1.0 mM로 가하였다. 추가의 2시간동안 20℃의 온도에서 배양을 계속하여 관심의 대상이 되는 단백질의 발현을 유도하였다. 이어서 원심분리에 의해 세포를 회수하고 5 ml의 세포 파쇄 용액(10 mM 염화나트륨 및 1 mM 염화칼슘을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2))에서 현탁시켰다. 세포를 초음파에 의해 파쇄하였다. 상층액을 원심분리하여 회수하였다. 상층액중 α-아가레이즈 활성을 측정하였다. 상층액을 세포 파쇄 용액으로 희석하여 각 샘플에 대하여 단위 부피당 동일한 효소 활성이 포 함되도록 하였다. 20㎕ 효소 용액을 55℃ 또는 60℃에서 10 분동안 인큐베이션시킨 후 10 mM 염화나트륨을 포함하는 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.2)중 농도 0.2%로 아가로오스를 포함하는 180㎕의 용액과 반응시켰다. 실시예 1에 기술된 방법에 따라 잔존 α-아가레이즈 활성을 측정하였다. 결과를 표 6에 나타낸다. 이 결과는 pNA401d의 산물의 열안정성이 pNA301d의 것과 동일하거나 그보다 우수하다는 것을 나타낸다.

NAB2-1-1로부터 수득한 천연 아가로오스 II를 대조군으로 사용하였다.

표 6

* 각 효소에 대하여 완충액 A중 50℃에서 처리한 후의 잔존 활성을 100으로 정의하였다.

또한, 37℃에서 밤새도록 IPTG와 함께 인큐베이션한 후 상기 기술한 바와 같이 상층액을 원심분리하여 회수하고 초음파로 세포를 파쇄하였다. 상층액의 단백질 함량을 측정하였다. 상층액을 SDS-PAGE하여 동일한 양의 단백질을 로딩하였다.추가로, 상층액 회수시 수득한 침전액을 세포 파쇄 용액에서 현탁시키고 유사한 방식으로 SDS-PAGE하였다. 결과, 천연형 또는 pNA301d를 사용하여 수득한 상층액중 관심의 대상이 되는 단백질의 양보다 pNA401d를 사용하여 유도되어 수득한 상층액 중 관심의 대상이 되는 단백질의 양이 더욱 많음을 확인하였다. 따라서, pNA401d로 형질변환된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유도에 의해 발현된 돌연변이 α-아가레이즈가 용이하게 용해됨을 확인하였다.

서열 목록 프리 텍스트

서열번호:1: 아가레이즈 I의 N-말단 아미노산 서열

서열번호:2: 아가레이즈 II의 N-말단 아미노산 서열

서열번호:3: 아가레이즈 I의 부분 아미노산 서열

서열번호:4: 아가레이즈 I의 부분 아미노산 서열

서열번호:5: 아가레이즈 II의 부분 아미노산 서열

서열번호:6: 아가레이즈 II의 부분 아미노산 서열

서열번호:7: 아가레이즈 II의 부분 아미노산 서열

서열번호:8: PCR 프라이머 1

서열번호:9: PCR 프라이머 2

서열번호:10: PCR 프라이머 3

서열번호:11: PCR 프라이머 4

서열번호:12: PCR 프라이머 5

서열번호:13: PCR 프라이머 6

서열번호:14: PCR 프라이머 7

서열번호:15: PCR 프라이머 8

서열번호:16: PCR 프라이머 9

서열번호:17: PCR 프라이머 10

서열번호:18: PCR 프라이머 11

서열번호:19: PCR 프라이머 12

서열번호:20: 아가레이즈 I중 ORF의 뉴클레오티드 서열

서열번호:21: 아가레이즈 II중 ORF의 뉴클레오티드 서열

서열번호:22: 아가레이즈 I의 아미노산 서열

서열번호:23: 아가레이즈 II의 아미노산 서열

서열번호:24: PCR 프라이머 13

서열번호:25: PCR 프라이머 14

서열번호:26: PCR 프라이머 15

서열번호:27: PCR 프라이머 16

서열번호:28: PCR 프라이머 17

서열번호:29: PCR 프라이머 18

서열번호:30: PCR 프라이머 19

서열번호:31: PCR 프라이머 20

서열번호:32: 16S 리보솜으로부터 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머

서열번호:33: 16S 리보솜으로부터 DNA 단편을 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오티드 프라이머

서열번호.34: PCR 프라이머 21

본 발명은 신규한 아가레이즈을 제공한다. 본 발명의 아가레이즈의 최적 온도는 통상의 아가레이즈보다 높고 아가레이즈의 열안정성은 탁월하다. 따라서, 고온 반응에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 아가레이즈는 고형화되지 않고 고농동의 아가로오스의 존재하에서 반응할 수 있다는 점에서 특히 유효하다.

본 발명의 아가레이즈를 사용하여 아가로오스로부터 직접 환원 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 저중합도의 아가로올리고사카라이드(예: 아가로비오스 및 아가로테트라오스) 또는 비환원성 말단에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 갖는 네오아가로올리고사카라이드(예: 네오아가로비오스 및 네오아가로테트라오스)를 효과적으로 제조할 수 있다.

핵산 증은 본 발명의 아가레이즈를 사용하여 아가로오스로부터 유효하게 추출될 수 있다.

본 발명의 아가레이즈를 사용하여 제조된 아가로올리고사카라이드는 생리 활성 예를 들면, 세포고사-유도 활성, 항암(carcinostatic) 활성, 다양한 항산화 활성, 면역조절 활성, 항알레르기성 활성을 갖는다. 따라서, 약제학적 조성물, 식품 및 음료 분야에서 유용하다.

본 발명은 최초로 아가레이즈에 대한 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열 을 개시한다. 따라서, 아가레이즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 제공할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 유전자를 사용하여 유전 공학에 의해 아가레이 즈 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조하는 산업적으로 유리한 방법을 제공한다.

또한, 상기 유전자를 사용하는 유전 공학에 의한 제조 방법에서는 아가레이즈의 제조를 유도하기 위하여 배지에 아가로오스를 부가할 필요가 없다. 따라서, 배양시 노동력을 덜 들고 효소를 용이하게 정제할 수 있다.

추가로, 본 발명이 최초로 아가레이즈 유전자를 제공한다는 사실에 기초하여, 본 발명은 상기 유전자에 대한 정보에 기초하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 재조합 폴리펩티드, 폴리펩티드 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 및 아가레이즈에 특이적으로 하이브리젠이션하는 프라이머 또는 프로브를 제공한다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (9)

1. 서열번호: 22의 아미노산 서열에서 아미노산 번호 21 내지 아미노산 번호 437의 417개의 잔기로 구성된 아미노산 서열; 및

   서열번호: 22의 아미노산 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 아가레이즈.
2. 제1항에 있어서, 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)로부터 수득할 수 있는 아가레이즈.
3. (a) 제1항의 아가레이즈를 코딩하는 뉴클레오티드 서열;

   (b) 서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드 번호 61 내지 뉴클레오티드 번호 1311의 1251개의 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열; 및

   (c) 서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열로 구성된 그룹 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는, 아가레이즈를 코딩하는 유전자.
4. 제3항에 있어서, 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855)로부터 수득할 수 있는 유전자.
5. 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자.
6. 제5항의 재조합 DNA 분자를 포함하는 형질전환체.
7. 미생물 NAB2-1-1 (FERM BP-7855) 또는 제6항의 형질전환체를 배양하고; 배양액으로부터 아가레이즈를 채취하는 것을 포함하는, 제1항의 아가레이즈를 제조하는 방법.
8. 제1항의 아가레이즈로 아가로오스 겔을 분해하는 것을 포함하는, 아가로오스 겔로부터 물질을 추출하는 방법.
9. 제1항의 아가레이즈를 포함하는, 제8항의 아가로오스 겔로부터 물질을 추출하는 방법에 사용되는 키트.