CN111004791B

CN111004791B - 一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用

Info

Publication number: CN111004791B
Application number: CN201911356898.5A
Authority: CN
Inventors: 常耀光; 陈广宁; 薛长湖; 申晶晶; 张玉莹; 石菲菲; 薛勇; 张恬恬
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN111004791A

Abstract

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种β‑琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用。该酶具有新颖的氨基酸序列及良好的酶学性质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。本发明开发了一种以β‑琼脂糖酶Aga16_WA检测琼脂含量的试剂盒：包括试剂A、试剂B、试剂C及校准品，其中试剂A包含β‑琼脂糖酶Aga16_WA与稳定剂。该试剂盒线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。

Description

一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用。

背景技术

琼脂是一类从红藻类植物中提取的亲水性胶体，主要由β-d-半乳糖和3,6-内醚-l-半乳糖通过β-1,4糖苷键与α-1,3糖苷键交联而成，是目前世界上用途最广泛的海藻胶之一，因其具有良好的凝胶性与食用安全性，被广泛的应用于食品工业、医药工业、日用化工、生物工程等许多方面。在食品工业中，琼脂作为一种重要的食品添加剂，可应用于果冻、乳制品、冰淇淋、罐头及肉制品等食品中，在医学领域，琼脂可作为慢性便秘、高胆固醇等病症的直接药用剂。琼脂作为一种膳食纤维，适当摄入会对人体有很大益处，但摄入过多或过少都不利于人体的健康，摄入量过多会造成人体的热量摄入太少，并且琼脂的网状结构对矿物质离子具有很强的吸附作用，会阻止人体对矿物质的吸收，摄入量过少可能会导致高血糖、高血脂及便秘等健康问题。因此，准确检测琼脂的含量对于人们生活水平的提高以及自身健康的保持具有重要意义。目前，常用的琼脂定量检测方法是苯酚-硫酸法和高效液相色谱法等。苯酚- 硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受试验条件影响较大，且费时费事、样品和试剂消耗较多。高效液相色谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。

琼脂糖酶是一类可特异性降解琼脂糖的水解酶，根据酶解位置的差异，可分为α-琼脂糖酶与β-琼脂糖酶，分别降解琼脂糖的α-1,3糖苷键与β-1,4糖苷键。对羟基苯甲酰肼(pHBH) 是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。所以找到一种具有高度特异性的β-琼脂糖酶，对于琼脂的定量检测具有重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是常用的琼脂定量检测方法是苯酚-硫酸法和高效液相色谱法，这两种方法分别具有准确性差和操作繁琐、费时费力的问题。

为解决上述问题，本发明提供一种新型β-琼脂糖酶Aga16_Wa，该酶与其他已知酶的序列相似度最高为69％(最相近序列为Catenovulum agarivorans YM01所产的beta-agarase)。该酶具有良好的贮存稳定性，在4℃下可至少稳定贮存6个月，在25℃的温度范围内放置10天后仍能保持80％的活力。而且具有良好的反应特异性，对于琼脂具有高活力，但对于其他海洋多糖，如褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。综上，β-琼脂糖酶Aga16_Wa具有良好的应用潜力，特别是应用于检测琼脂含量，具有操作简便、准确度高、稳定性好的特点。

为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种β-琼脂糖酶，为β-琼脂糖酶Aga16_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

MRRVNFWKKTSVLLFSVFIAVGSCASDSADFIPPPAEEPKEEEPKVEVKVIDVTKADVN YPTFVSFDDNTPEGMVWEKVEALSDEFETWNSDKWTKTNWNYGGTPVNMLNKNSGVTD GNLWIKATLDSTSEDQWFETSRVRSKTSIKFPMYTECSIKTAHISAFNTFWLNNGNSNDRDE IDIIENNSNPSAEATNSFDLDAYPWQMNSQYFIVKDGVTERAKGNSSNKDLSEGNTLRGVK WNEAYHVVGAWWKDAYTVQFYLDGEPSGKVTTKQPFTLEQFLIWDLWTQDSAWVGGLP KKEELLDDTVNTMRVDWVRTWKLVSK

该酶与其他已知酶的序列相似度最高为69％(最相近序列为Catenovulumagarivorans YM01所产的beta-agarase)。利用MEGA6将Aga16_Wa与GH16家族已研究过的β-琼脂糖酶序列构建系统发育树，结果如图3所示：可以看出β-琼脂糖酶Aga16_Wa处于GH16家族β-琼脂糖酶的系统发育树中。因此，Aga16_Wa是β-琼脂糖酶GH16家族的一个新成员。将β-琼脂糖酶Aga16_Wa氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Aga16_Wa与GH16家族已知的具有晶体结构的4条β-琼脂糖酶序列进行多序列比对，结果如图4所示：这4个β-琼脂糖酶分别是来源于Zobellia galactanivorans DsijT的AgaA_Zg(Genbank CAZ98338.1)，来源于Microbulbifer thermotolerans JAMB-A94的AgaA_Mt(Genbank BAD29947.1)，来源于Zobellia galactanivorans DsijT的AgaB_Zg(Genbank CAZ97711.1)与来源于Zobelliagalactanivorans DsijT的AgaD_Zg(Genbank CAZ98378.1)。由图4可知，Aga16_Wa除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，且Blast证实Aga16_Wa与Catenovulum agarivorans YM01所产的beta-agarase序列相比，仅具有69％的最高相似度，表明Aga16_Wa是GH16家族中一种新颖的β-琼脂糖酶。

上述β-琼脂糖酶Aga16_Wa的最适反应温度为40℃，最适反应pH值为7.0，在4℃下可至少稳定贮存6个月，在25℃的温度范围内放置10天后仍能保持80％的活力，且在pH5.5-9.5 的pH值范围内保持稳定，酶动力学常数Km为0.08mM，Kcat为1541.67s^-1，Kcat/Km为20.56M^-1s^-1。可得知，相较于其他琼脂糖酶，本发明的β-琼脂糖酶Aga16_Wa酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，底物结合特异性强、酶解速率快，是用于定量检测琼脂含量的理想的酶。

本发明中编码上述β-琼脂糖酶Aga16_Wa的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。

SEQ ID NO.2：

ATGAGGAGAGTTAATTTTTGGAAAAAAACATCAGTATTGTTGTTTTCTGTATTTAT AGCAGTAGGAAGTTGTGCAAGTGATTCTGCAGATTTTATACCGCCACCTGCAGAAGAA CCAAAAGAAGAAGAGCCTAAAGTAGAGGTTAAAGTAATAGATGTAACTAAGGCAGAT GTAAATTATCCAACATTTGTGTCTTTTGATGATAACACACCTGAAGGAATGGTTTGGGA AAAGGTAGAGGCTTTGTCTGATGAGTTTGAAACTTGGAATAGTGATAAATGGACAAAA ACAAATTGGAATTACGGAGGTACTCCTGTAAATATGCTAAATAAAAATTCAGGAGTAA CAGATGGAAATTTGTGGATAAAAGCCACTTTAGATTCTACAAGCGAAGATCAATGGTT TGAAACCTCAAGAGTACGATCTAAAACTTCTATTAAATTTCCAATGTATACAGAATGT AGTATTAAAACAGCTCATATATCTGCTTTTAATACGTTTTGGTTAAATAATGGAAATAG TAATGATAGAGATGAAATTGATATTATAGAAAACAATTCAAATCCATCAGCAGAAGCA ACTAATAGTTTTGATTTAGATGCATATCCATGGCAAATGAATTCTCAGTACTTTATAGT GAAAGATGGAGTTACCGAAAGAGCTAAAGGAAATTCAAGCAATAAAGATTTGTCAGA AGGAAATACCTTAAGAGGAGTTAAGTGGAACGAAGCTTATCACGTAGTAGGTGCTTGG TGGAAAGATGCATATACGGTTCAGTTTTATTTAGACGGAGAACCTTCTGGAAAAGTAA CAACAAAACAACCATTTACGTTAGAGCAATTTTTAATTTGGGATTTATGGACACAAGA TTCTGCTTGGGTAGGAGGTTTGCCTAAAAAAGAAGAATTGTTGGATGATACGGTGAAT ACAATGCGAGTAGATTGGGTACGAACTTGGAAATTAGTTTCAAAATAA

本发明还提供了一种β-琼脂糖酶的制备与纯化方法，其中，表达载体为但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中的任意一种。

本发明还提供了一种酶法检测琼脂含量的试剂盒，包括分别存放的试剂A、试剂B、试剂C和校准品，其中试剂A包含β-琼脂糖酶Aga16_Wa与稳定剂，降解琼脂为还原糖；试剂 B为显色剂，试剂C为NaOH溶液，助于显色；校准品为琼脂糖标准溶液。

进一步的，所述β-琼脂糖酶浓度为25-150KU/L。

进一步的，试剂A中所述的稳定剂为糖类与醇类物质，具体为蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇中的一种或几种，且浓度范围为10-100g/L。

进一步的，试剂B中所述显色剂为150-250g/L的对羟基苯甲酰肼(pHBH)溶液。

进一步的，NaOH溶液的浓度为1.8-3.0mol/L。

利用上述试剂盒检测待测样品中琼脂含量的方法，包括如下及同等作用步骤：

(1)按照国标GB5009.88—2014方法，将样品进行脱糖处理，除去还原糖。在90-120℃下溶解于缓冲溶液得到样品液，放置于50℃中恒温待用。本方法原理是酶降解琼脂为还原糖，pHBH与还原糖反应生成黄色物质。脱糖处理是避免样品中原本存在的还原糖与pHBH显色；50℃是琼脂溶解温度，50℃下琼脂会形成凝胶，难被酶降解。

(2)取50μL样品液与校准品溶液于离心管中，分别向其中加入1-10μL试剂A(可以保证琼脂完全降解且不过于浪费试剂)，将混合溶液放置于20-60℃下孵育5-60min，然后于90-120℃下孵育5-10min，得到样品孵育液与校准品孵育液。这一步作用是用试剂A里的酶降解样品里的琼脂。

20-60℃下Aga16_Wa活力较高，能保证琼脂充分降解。5-60min同样是为了保证充分降解。时间过短会导致酶解不充分，过长则浪费时间且会导致线性关系降低。

90-120℃下是为了灭酶，避免影响后面的反应。5-10min能够保证酶完全失活。时间太短灭酶不充分，高于10min则没有必要。

(3)分别向样品孵育液、校准品孵育液中加入10-50μL试剂B与100-500μL试剂C(此用量下准确度高，线性关系好)，将上述三种混合溶液于100-120℃下孵育3-10min；完成孵育后迅速冷却至室温，以蒸馏水调零，分别测定吸光值，记为A1、A2。这一步作用是显色， B是显色剂pHBH，C是氢氧化钠(为显色创造碱性条件)，pHBH在高温和碱性条件下会和还原糖(上一步降解出来的)反应生成黄色物质。

(4)根据公式计算得知待测样品中琼脂含量(g/L)：

琼脂含量(g/L)＝A1/A2×C标

上式A1为样品孵育液的吸光值，A2为校准品孵育液的吸光值，C标为校准品浓度(g/L)。

进一步的，所述校准品指的是已知浓度的琼脂糖溶液，琼脂糖可商购获得，可将其配置为合适的浓度，例如0.1-1g/L。

进一步的，步骤(1)的缓冲溶液需自行配制，pH可在6.0-8.0之间。实验得知，酶Aga16_Wa 在pH 6.0-8.0的范围内具有较高的酶解活力及稳定性，故调整缓冲液的pH为6.0-8.0，保证酶Aga16_Wa能够保持较强的酶解活力进行酶解反应。

进一步的，步骤(1)测定吸光值所用的波长范围可在400nm-420nm之间。pHBH与还原糖的反应产物在这个波长范围内线性关系好，精准度高。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种新颖的β-琼脂糖酶，该酶与其他已知酶的序列相似度最高为69％。其具有酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，底物结合特异性强、酶解速率快，是用于定量检测琼脂含量的理想的酶。

(2)本发明的β-琼脂糖酶对于琼脂具有高活力，但对于其他海洋多糖，如褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。

(3)本发明的琼脂定量检测试剂盒利用β-琼胶酶降解样品中的琼脂形成还原糖，还原糖可与pHBH发生显色反应，且溶液颜色与还原糖浓度成正比，通过检测反应液反应前后的吸光值增量，即可得知检测样品中的琼脂含量。该试剂盒线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。

附图说明

图1：本发明的β-琼脂糖酶Aga16_Wa目的基因琼脂糖凝胶电泳图谱；

图2：本发明的β-琼脂糖酶Aga16_Wa纯化后的电泳图；

图3：Aga16_Wa与所有已知GH16家族β-琼脂糖酶构建的系统发育树；其中，星号标识为β-琼脂糖酶Aga16_Wa；

图4：Aga16_Wa多序列比对结果；其中，黑框白字为β-琼脂糖酶的保守残基。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：β-琼脂糖酶Aga16_Wa在大肠杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组 DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC；5’- GACACCTCGAGCTATTGATATACTCTTACATAATCTATTTC)，以全基因组为模板进行PCR， PCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 20s，42℃ 22s，72℃ 60s，22个循环，最后72℃持续 5min，得到了β-琼脂糖酶Aga16_Wa基因片段，连接至pET-28a(+)载体，构成重组质粒。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。筛选阳性克隆并在含氨苄青霉素的LB 培养基中利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，诱导温度为17℃，诱导时间为12h。离心收集上清，此即为β-琼脂糖酶Aga16_Wa酶液。

实施例2：β-琼脂糖酶Aga16_Wa在枯草芽孢杆菌中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组 DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-GGATGACTGGTTCCAATTGACAAGC；5’- TAAGACACCTCGAGCTATTGATATACTCTTACATAATCTATTTC)，以全基因组为模板进行 PCR，得到β-琼脂糖酶Aga16_Wa基因片段，连接至pHT01载体，构成重组质粒。将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并利用异丙基硫代半乳糖苷在LB培养液中进行诱导表达，诱导温度为37℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙 6s，循环99次)，离心收集上清，此即为β-琼脂糖酶Aga16_Wa的粗酶液。

将粗酶液以HisTrapTM HP色谱柱对上清液中的目标蛋白进行亲和层析纯化。纯化后酶的活力为72.71U/mg，证实了重组酶在实际生产中的潜力。

实施例3：β-琼脂糖酶Aga16_Wa在毕赤酵母中克隆表达及获取

在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-AGGTGACTGGTTCCAATTGACAAGC；5’- CCGGACACCTCGAGCTATTGATATACTCTTACATAATCTATTTC)，以全基因组为模板进行 PCR，得到β-琼脂糖酶Aga16_Wa基因片段，连接至pPIC9k载体，构成重组质粒，加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中构成重组细胞；筛选阳性克隆并接种于YPD培养基中，30℃培养20h，然后接种于BMGY培养基，30℃、200rpm下摇床培养至OD600＝2.0，离心收集菌体，弃上清，用BMMY培养基重悬沉淀，29℃下200rpm用甲醇诱导培养72h。诱导结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。检测重组酶发酵液的活力为85.86U/mg。

实施例4：对所述β-琼脂糖酶Aga16_Wa进行反应特异性检验。

步骤一，溶液配制：称取化学级的琼脂糖溶于pH7.0的PBS缓冲液，制备浓度为2.00mg/mL的琼脂糖溶液；同时制备相同浓度的卡拉胶、岩藻聚糖、褐藻胶溶液。称取一定量的pHBH溶于2mol/LNaOH溶液中，制备成200mg/mLpHBH溶液。

步骤二，酶解、灭酶：取50μL不同底物溶液于离心管中，对照组为50μLPBS缓冲液，分别加入10μL酶液，40℃下反应10min；100℃金属浴中反应5min将酶灭活，

步骤三，显色：加入250μLpHBH溶液，并用PBS缓冲溶液补至1mL，100℃金属浴中反应5min，反应过后迅速冷却至室温；以PBS缓冲溶液调零，测定415nm下各组的吸光值。

平行测定三次，测定结果如下。

	对照	琼胶糖溶液	岩藻聚糖溶液	褐藻胶溶液	卡拉胶溶液
						测定平行1	0.052	1.052	0.062	0.057	0.053
测定平行2	0.064	1.027	0.053	0.062	0.058
						测定平行3	0.048	1.049	0.045	0.048	0.049
测定平均值	0.055	1.043	0.053	0.056	0.053

从以上结果可以看出，本发明的β-琼脂糖酶Aga16_Wa具有良好的反应特异性，对琼脂具有高活力，但对于其他海洋多糖，如褐藻胶、岩藻聚糖、卡拉胶等均无降解作用。

实施例5：一种琼脂检测试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C和校准品组成，其具体组成为：

实施例6：一种琼脂检测试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C和校准品组成，其具体组成为：

实施例7：一种琼脂检测试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C和校准品组成，其具体组成为：

实施例8：一种琼脂检测试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C和校准品组成，其具体组成为：

实施例9：一种琼脂检测试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C和校准品组成，其具体组成为：

实施例10：使用本发明试剂盒检测一款休闲果冻中琼脂含量的具体操作方法：

步骤一：取1mg样品，按照国标GB5009.88—2014方法进行脱糖处理，在100℃下用10mLPBS缓冲溶液溶解得到样品液，分别取50μL样品液与50μL校准品溶液(0.1g/L)于1.5mL离心管中。

步骤二：分别向样品液与校准品溶液中加入5μL试剂A，混匀，40℃孵育30min，100℃孵育5min。

步骤三：分别向样品孵育液与校准品孵育液中加入25μL试剂B和225μL试剂C，用PBS 缓冲溶液补足至1mL，混匀，在100℃金属浴中孵育5min。完成孵育后迅速冷却至室温，以蒸馏水调零，在415nm下分别测定吸光值，记为A1、A2。

步骤四：样品中琼脂含量(g/L)＝A1/A2×C标，测得A1为0.628，A2为0.446，代入公式得到该果冻的琼脂浓度为0.141g/L。

实施例11：对上述实施例5至9所述试剂盒进行准确性验证。

使用商购获得的化学级琼脂糖配制成浓度为0.8g/L的琼脂糖溶液，使用上述实施例四至八的试剂盒分别重复测定三次，计算相对误差。检测结果如下表所示。

从以上结果可以看出，根据本发明的试剂盒得到的测定结果的平均值相对偏差小于1％，说明本发明试剂盒具有良好的准确性。

实施例12：对上述实施例5至9所述试剂盒进行线性相关性验证。

使用商购获得的化学级琼脂糖配制成浓度分别为0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20g/L的琼脂糖标准溶液，每个浓度的溶液分别测定三次，取其平均值。分别利用实施例5至9的试剂盒进行检测。检测结果如下表所示。

从上述检测结果显示，实施例5至9检测结果相关性均大于0.990，这说明本发明试剂盒具有良好的线性相关性。

实施例13：对本发明所述试剂盒进行稳定性验证。

使用商购获得的化学级琼脂糖配制成浓度为0.8g/L的琼脂糖溶液，将试剂盒分别放置于 4℃和25℃下，在特定时间点测定标准溶液的琼脂含量，并将测定结果与0个月测定结果进行比较。检测结果如下表所示。

4℃下试剂盒检测稳定性：

月	0	4	8	12	16	20	24
								测定值(g/L)	0.808	0.801	0.795	0.788	0.814	0.813	0.831
偏差(％)	-1.00	-0.13	0.63	1.50	-1.75	-1.62	-3.87

25℃下试剂盒检测稳定性：

月	0	2	4	6	8	10	12
								测定值(g/L)	0.808	0.804	0.812	0.822	0.782	0.837	0.754
偏差(％)	-1.00	-0.50	-1.50	-2.70	2.30	-4.60	5.80

从上述实验结果可知，本发明试剂盒在4℃储存下能够稳定24个月，在25℃储存下能够稳定12个月，完全能够满足检测要求。

:最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种β-琼脂糖酶及其在琼脂定量检测中的应用

<130> 中国海洋大学

<140> 1

<141> 2019-11-13

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 324

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Arg Val Asn Phe Trp Lys Lys Thr Ser Val Leu Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Phe Ile Ala Val Gly Ser Cys Ala Ser Asp Ser Ala Asp Phe Ile

20 25 30

Pro Pro Pro Ala Glu Glu Pro Lys Glu Glu Glu Pro Lys Val Glu Val

35 40 45

Lys Val Ile Asp Val Thr Lys Ala Asp Val Asn Tyr Pro Thr Phe Val

50 55 60

Ser Phe Asp Asp Asn Thr Pro Glu Gly Met Val Trp Glu Lys Val Glu

65 70 75 80

Ala Leu Ser Asp Glu Phe Glu Thr Trp Asn Ser Asp Lys Trp Thr Lys

85 90 95

Thr Asn Trp Asn Tyr Gly Gly Thr Pro Val Asn Met Leu Asn Lys Asn

100 105 110

Ser Gly Val Thr Asp Gly Asn Leu Trp Ile Lys Ala Thr Leu Asp Ser

115 120 125

Thr Ser Glu Asp Gln Trp Phe Glu Thr Ser Arg Val Arg Ser Lys Thr

130 135 140

Ser Ile Lys Phe Pro Met Tyr Thr Glu Cys Ser Ile Lys Thr Ala His

145 150 155 160

Ile Ser Ala Phe Asn Thr Phe Trp Leu Asn Asn Gly Asn Ser Asn Asp

165 170 175

Arg Asp Glu Ile Asp Ile Ile Glu Asn Asn Ser Asn Pro Ser Ala Glu

180 185 190

Ala Thr Asn Ser Phe Asp Leu Asp Ala Tyr Pro Trp Gln Met Asn Ser

195 200 205

Gln Tyr Phe Ile Val Lys Asp Gly Val Thr Glu Arg Ala Lys Gly Asn

210 215 220

Ser Ser Asn Lys Asp Leu Ser Glu Gly Asn Thr Leu Arg Gly Val Lys

225 230 235 240

Trp Asn Glu Ala Tyr His Val Val Gly Ala Trp Trp Lys Asp Ala Tyr

245 250 255

Thr Val Gln Phe Tyr Leu Asp Gly Glu Pro Ser Gly Lys Val Thr Thr

260 265 270

Lys Gln Pro Phe Thr Leu Glu Gln Phe Leu Ile Trp Asp Leu Trp Thr

275 280 285

Gln Asp Ser Ala Trp Val Gly Gly Leu Pro Lys Lys Glu Glu Leu Leu

290 295 300

Asp Asp Thr Val Asn Thr Met Arg Val Asp Trp Val Arg Thr Trp Lys

305 310 315 320

Leu Val Ser Lys

<210> 2

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaggagag ttaatttttg gaaaaaaaca tcagtattgt tgttttctgt atttatagca 60

gtaggaagtt gtgcaagtga ttctgcagat tttataccgc cacctgcaga agaaccaaaa 120

gaagaagagc ctaaagtaga ggttaaagta atagatgtaa ctaaggcaga tgtaaattat 180

ccaacatttg tgtcttttga tgataacaca cctgaaggaa tggtttggga aaaggtagag 240

gctttgtctg atgagtttga aacttggaat agtgataaat ggacaaaaac aaattggaat 300

tacggaggta ctcctgtaaa tatgctaaat aaaaattcag gagtaacaga tggaaatttg 360

tggataaaag ccactttaga ttctacaagc gaagatcaat ggtttgaaac ctcaagagta 420

cgatctaaaa cttctattaa atttccaatg tatacagaat gtagtattaa aacagctcat 480

atatctgctt ttaatacgtt ttggttaaat aatggaaata gtaatgatag agatgaaatt 540

gatattatag aaaacaattc aaatccatca gcagaagcaa ctaatagttt tgatttagat 600

gcatatccat ggcaaatgaa ttctcagtac tttatagtga aagatggagt taccgaaaga 660

gctaaaggaa attcaagcaa taaagatttg tcagaaggaa ataccttaag aggagttaag 720

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tatttagacg gagaaccttc tggaaaagta acaacaaaac aaccatttac gttagagcaa 840

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gaagaattgt tggatgatac ggtgaataca atgcgagtag attgggtacg aacttggaaa 960

ttagtttcaa aataa 975

Claims

1.一种β-琼脂糖酶，其特征在于：为β-琼脂糖酶Aga16_WA，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1中所述β-琼脂糖酶的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.2及其他可翻译出SEQ ID NO. 1的所有基因。

3.权利要求1中所述的β-琼脂糖酶的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的β-琼脂糖酶在琼脂定量检测中的应用。

5.一种酶法检测琼脂含量的试剂盒，其特征在于：包括试剂A、试剂B、试剂C和校准品，其中试剂A包含权利要求1中所述的β-琼脂糖酶Aga16_WA与稳定剂，试剂B为显色剂，试剂C为NaOH溶液，校准品为琼脂糖标准溶液。

6.如权利要求5所述的酶法检测琼脂含量的试剂盒，其特征在于：所述β-琼脂糖酶浓度为25-150KU/L；稳定剂为糖类与醇类物质。

7.一种利用权利要求5中试剂盒进行琼脂定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）按照国标GB5009.88—2014方法，将样品进行脱脂、脱糖处理，在90-120℃下用缓冲溶液溶解得到样品液，放置于50℃中恒温待用；

（2）取一份样品液与等体积的校准品溶液，分别向其中加入试剂A，进行孵育，得到样品孵育液与校准品孵育液；

（3）分别向样品孵育液、校准品孵育液中加入试剂B与试剂C，孵育3-10min；完成孵育后迅速冷却至室温，以蒸馏水调零，分别测定吸光值，记为A1、A2；

（4）根据公式计算得知待测样品中琼脂含量g/L：

琼脂含量g/L= A1/A2×C标

上式A1为样品孵育液的吸光值，A2为校准品孵育液的吸光值，C标是校准品浓度g/L。

8.如权利要求7所述的进行琼脂定量检测的方法，其特征在于：步骤（2）的孵育步骤为取一份样品液与等体积的校准品溶液，分别向其中加入试剂A，放置于20-60℃下孵育5-60min，然后于90-120℃下孵育5-10min。