CN113913407A - β-甘露聚糖酶突变体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐酸耐热的β‑甘露聚糖酶突变体及基因和突变体的制备方法。本发明对来源于黑曲霉的β‑甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位点的氨基酸V、W、G和K分别突变为I、R、A和R，获得耐酸、耐热的β‑甘露聚糖酶突变体及其突变基因，同时将含有突变基因的重组表达载体，转入酵母菌株中，通过甲醇诱导表达，最高酶活水平达到51000U/mL，能进一步降低β‑甘露聚糖酶的生产成本，促进β‑甘露聚糖酶在饲料食品行业的广泛应用，且能积极应对因新冠疫情带来的原材料价格上涨的困局。

Description

β-甘露聚糖酶突变体及应用
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及耐酸耐热的β-甘露聚糖酶突变体及编码基因和突变体的制备方法。
背景技术：
甘露聚糖是植物半纤维素的主要成分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分，作为植物性饲料原料被视为一种抗营养因子。β-甘露聚糖酶在饲料工业中作为一种饲料添加剂，能有效地降解饲料中的甘露聚糖，提高动物对饲料的消化能力。
目前，β-甘露聚糖酶是我国己经批准使用的12种饲料级酶制剂中的一种，并且作为一种高效的饲料添加剂广泛应用于饲料工业中。从上个世纪90年代以来，欧美国家90％的家禽饲料中添加酶制剂，60％的猪用口粮中添加酶制剂。我国起步较晚，但其一直是饲料生产和应用研究的重点，β-甘露聚糖酶作为一种重要的饲料用酶，近年来受到了越来越多的重视。
自然界β-甘露聚糖酶主要来源于微生物，包括曲霉属、青霉属、木霉属等丝状真菌以及芽孢杆菌属和放线菌属等细菌。真菌β-甘露聚糖酶作用pH值范围一般为酸性至中性，细菌甘露聚糖酶多为中性至碱性。
目前饲料添加剂用酶都需要经过高温制粒，制备能够耐高温、耐酸、具有对消化酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶，对于β-甘露聚糖酶在饲用酶和工业化应用具有重要价值。
野生型的β-甘露聚糖酶基因经过异源表达和理性设计后能够获得较好的酶学性质，对于提高现有的β-甘露聚糖酶的耐高温性能发挥着至关重要的作用。毕赤酵母表达系统已经发展成为一个成熟的外源蛋白表达系统，工业上常用来大规模表达外源蛋白。
发明内容：
本发明的主要目的是提供一种β-甘露聚糖酶突变体及其基因、及含有该基因的重组表达载体和重组菌株、及该重组菌制备β-甘露聚糖酶的方法，旨在解决现有技术中β-甘露聚糖酶耐酸、耐高温性差的问题。
为实现上述目的，本发明通过将来源于黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCCNo.10788的甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位点的氨基酸V、W、G和K分别突变为I、R、A和R，获得耐酸、耐热的β-甘露聚糖酶突变体，所述突变体具有序列表SEQ IDNO.3所示的氨基酸序列。
本发明还提供上述突变体的编码基因；
进一步地，所述编码基因具有序列表SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。
本申请还提供一种重组表达载体，包含上述的β-甘露聚糖酶突变编码基因；
优选地，所述重组表达载体的表达载体为pPIC9。
本申请还提供一种重组菌株，包含上述的β-甘露聚糖酶突变编码基因或重组表达载体；
优选的，所述菌株的宿主细胞为毕赤酵母；
本申请还提供上述重组表达载体或重组菌株的应用，特别是在制备β-甘露聚糖酶中的应用；
进一步地，采用上述重组菌株制备β-甘露聚糖酶的方法如下：
在60m3发酵罐中的培养：按照发酵罐培养基体积的6-11％进行接种，培养温度30-32℃，罐压0.04-0.08MPa，初始转速100rpm，初始风量300m3/h，通过增加转速和通风量控制溶氧大于50％，最高转速600rpm，最高通风量4000m3/h；发酵至8h左右，开始流加50％的甘油，流加速率为700g/h，当菌体湿重达到70-90g/L时，停止流加甘油后维持0.8-1.2h进行饥饿处理，之后，开始补甲醇，使培养基中甲醇的浓度维持在0.05％-0.1％，补氨控制pH在5-5.6，菌体自溶严重时结束发酵，培养周期180-200h。
进一步地，在3m3种子罐中培养条件为：温度30-32℃，罐压0.04-0.08Mpa，初始转速100rpm，初始风量20m3/h，通过加转速和风量控制溶氧大于30％，补氨控制pH在5-5.6，培养至菌体湿重在50g/L；
进一步地，种子培养基组成为：酵母膏2-2.5％，蛋白胨2.5-3.5％，葡萄糖3-4％，其余为水，pH5-5.6；
进一步地，发酵培养基组成为：磷酸2.67-3.5％，二水硫酸钙0.093-0.15％，硫酸钾1.82-2.1％，二水硫酸镁1.49-2.3％，氢氧化钾0.413-1.2％，甘油4-6％，PMT1(微量元素)4-8mL/L，其余为水，用氨水调pH至5.0；
PMT1(1L)配方：CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，ZnCl2 20.0g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L(水溶解，过膜除菌后加入)，浓H2SO4 5.0ml，其余为水。
有益效果：
野生型的β-甘露聚糖酶，在不同pH环境放置48h后仍能有98％以上的活性的pH范围为pH3.5-5.0，在92℃维持90min后，有9％的活性，最适pH为4.5、最适温度为75℃。
本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体，在不同pH环境放置48h后仍能有98％以上的活性的pH范围为pH2.5-6.5，在92℃维持90min仍有95％以上的活性，最适pH为3.5、最适温度为45℃。其酶学特性特别适合用于饲料的深加工领域，例如低pH耐受性及较低的最适反应pH有利于该酶在动物低pH的肠道环境内发挥最大的催化作用，耐高温的特性利于酶制剂的高温造粒过程，在45℃(接近于动物体内的消化环境温度)具有最高的酶解反应速率，能最大限度的提高酶的利用率。
本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体最大发酵酶活力为51000U/mL，能进一步降低β-甘露聚糖酶的生产成本，促进β-甘露聚糖酶在饲料食品行业的广泛应用，且能积极应对因新冠疫情带来的原材料价格上涨的困局。
此外，本发明确认了β-甘露聚糖酶ManA中的关键耐酸、耐热性位点V129、W258、G345和K424，并证明了这些位点对于该酶耐酸耐热的重要性，对于研究β-甘露聚糖酶ManA的耐酸耐热机制提供了重要的线索，同时对于其他β-甘露聚糖酶的耐酸耐热提供了可靠的参考依据。
附图说明：
图1β-甘露聚糖酶的最适反应pH曲线突变前后对比；
图2β-甘露聚糖酶的pH稳定范围曲线突变前后对比；
图3β-甘露聚糖酶的最适反应温度曲线突变前后对比；
图4β-甘露聚糖酶的温度稳定范围曲线突变前后对比。
具体实施方式：
以下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。
根据本发明的技术方案，来源于黑曲霉菌种保藏编号CGMCC No.10788的甘露聚糖酶ManA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
本发明的耐酸、耐热的β-甘露聚糖酶ManA突变体，是通过将β-甘露聚糖酶ManA进行V129I、W258R、G345A和K424R点突变而获得，突变体V129I/W258R/G345A/K424R的β-甘露聚糖酶氨基酸序列中，第258位色氨酸(W)和第424位赖氨酸(K)均突变为精氨酸(R)，第129位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)、第345位甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明所采用的β-甘露聚糖酶突变体的标识：
采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如V129I，表示位置129的氨基酸由野生型的Val替换成Ile，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型β-甘露聚糖酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.2中野生型β-甘露聚糖酶的核苷酸序列编号。信息如下表。
Figure BDA0003366514920000041
以下将结合具体实施方式对本发明做进一步地解释说明。
实施例1耐酸耐热β-甘露聚糖酶突变基因、表达载体及重组菌株的获得
本发明通过对来源于黑曲霉菌种保藏编号CGMCC No.10788的β-甘露聚糖酶ManA氨基酸序列中第129、258、345和424位点的氨基酸V、W、G和K分别突变为I、R、A和R，获得耐酸、耐热的β-甘露聚糖酶突变体。
取黑曲霉CGMCC No.10788对数期种子液300mL于6个50mL离心管中，8000rpm离心5min，弃上清，用600mL生理盐水清洗沉淀菌体2遍后，送上海生工进行基因组测序，得到基因序列及上下游序列信息，根据得到的基因组，利用定点突变试剂盒进行PCR扩增，然后PCR产物经过DMT酶进行去甲基化并转化DMT感受态细胞，涂布抗生素平板，挑选单克隆验证，挑选的阳性转化子经扩培及DNA提取测序验证，经测序正确的转化子用于大量制备重组质粒。
表1上述进行点突变所用引物如下
Figure BDA0003366514920000051
将与表达载体pPIC9连接测序正确的突变体基因重组载体用内切酶DraI线性化并转化毕赤酵母GS115感受态细胞，30℃培养3天，挑选在筛选平板上生长的转化子，通过扩培及基因组提取，测序验证，获得成功导入突变体基因(SEQ ID NO.4所示)的重组菌株。
筛选平板培养基：葡萄糖2％，琼脂糖1.5％，YNB1.34％，Biotin0.00004％，其余为水。
实施例2耐酸耐热β-甘露聚糖酶的制备
采用实施例1构建的重组菌株发酵制备β-甘露聚糖酶，方法如下：
3m3种子罐中的种子培养：温度32℃，罐压0.04Mpa，初始转速100rpm，初始风量20m3/h，通过加转速和风量控制溶氧大于30％，补氨控制pH在5.0，培养至菌体湿重在50g/L。
种子培养基：酵母膏2％，蛋白胨2.5％，葡萄糖3％，其余为水，pH5。
60m3发酵罐中的发酵培养：按照发酵罐培养基体积的11％进行接种，培养温度32℃，罐压0.08MPa，初始转速100rpm，初始风量300m3/h，通过增加转速和通风量控制溶氧大于50％，最高转速600rpm，最高通风量4000m3/h。发酵至8h左右，开始流加50％的甘油，流加速率为700g/h，当菌体湿重达到80g/L时，停止流加甘油后维持1.0h进行饥饿处理，之后，开始补甲醇，使培养基中甲醇的浓度维持在0.05％，补氨控制pH在5.0，菌体自溶严重时结束发酵，培养周期200h左右。
发酵培养基组成为：磷酸3.0％，二水硫酸钙0.1％，硫酸钾2.0％，二水硫酸镁2.0％，氢氧化钾0.8％，甘油5％，PMT1(微量元素)5mL/L；用氨水调pH至5.0。
发酵培养基中，按照体积比加入0.5％的PTM1(微量元素)；
PMT1(1L)配方：CuSO4·5H2O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，ZnCl2 20.0g/L，FeSO4·7H2O 65.0g/L，Biotin 0.2g/L(水溶解，过膜除菌后加入)，浓H2SO4 5.0ml，其余为水。
进行3批发酵的情况如下，平均发酵酶活力为：50533U/mL。
批次 发酵周期(h) 发酵酶活力(U/mL)
1 200 51000
2 200 50000
3 198 50600
实施例3β-甘露聚糖酶酶活的测定方法(参见GB/T36861-2018)
标准曲线的制备
吸取乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1mol/L，pH5.5)4.0mL，加入DNS试剂5mL，沸水浴加热5min。用水冷却至室温，用水定容至25mL，制成试剂空白溶液。
分别吸取D-甘露糖标准系列溶液(浓度分别为0.10mg/mL，0.20mg/mL，0.30mg/mL，0.40mg/mL，0.50mg/mL，0.60mg/mL，0.70mg/mL)各2mL,加入至25mL刻度试管中(每个浓度做2个平行)，再分别加入2mL乙酸-乙酸钠缓冲液和5mLDNS试剂，用手微振，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至室温，再用水定容至25mL。以试剂空白溶液调零，在540nm处测定吸光度(A值)。以D-甘露糖浓度为Y轴，吸光值A值为X轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
酶活单位与定义：在一定条件下(如未特别说明，所述条件为：37℃、pH值为5.5)，每分钟从浓度为3mg/mL的甘露聚糖溶液中降解释放1μmoL还原糖所需要的酶量为一个β-甘露聚糖酶活力单位(U)。
移取10mL经过适当稀释的酶液(用乙酸-乙酸钠缓冲液稀释至酶活范围在0.04U/mL-0.08U/mL)，置于具塞刻度试管中，37℃±0.2℃水浴10min。
称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(6mg/mL)，至25mL刻度试管中，37℃±0.2℃水浴10min，加入5mL DNS试剂(配置方法见下文)，振摇3s，加入2mL经过37℃±0.2℃平衡的待测酶液，振摇3s，37℃±0.2℃保温30min，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至于室温，加水定容至25mL混匀。以试剂空白溶液(将酶液换成水)调零，用10mm比色皿，在540nm处测定样品空白溶液吸光值(A0)。
称取2g(精确至0.01g)甘露聚糖溶液(6mg/mL)，至25mL刻度试管中，37℃±0.2℃水浴10min，加入2mL经过37℃±0.2℃平衡的待测酶液，振摇3S，37℃±0.2℃精确保温30min，加入5mL DNS试剂(配置方法见下文)，振荡摇匀，沸水浴加热5min，取出，迅速用水冷却至于室温，加水定容至25mL混匀。以试剂空白溶液为空白对照，在波长540nm下，测定样品管中样液的吸光度(A)，通过线性回归方程计算β-甘露聚糖酶的活力。
试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力以X表示，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)按如下式计算：
Figure BDA0003366514920000071
式中A-样品管的吸光度；A0-样品空白管的吸光度；K-标准曲线的斜率；b-标准曲线的截距；M-D-甘露聚糖的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol)(M＝180.2g/moL)；30-酶解反应时间，单位为分(min)；1000-单位换算系数。X值应在0.04U/mL-0.08U/mL之间。如果不在这个范围内，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。
试样β-甘露聚糖酶的活力以X1表示，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)，按如下式计算：
X1＝X×N
式中X-试样稀释液中β-甘露聚糖酶活力，单位为酶活力单位每毫升(U/mL)；N-试样的总稀释倍数。
3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂：DNS试剂配制方法：称取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加水500mL，搅拌后水浴至45℃，缓慢加入100mL 0.2g/mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌直到溶液清澈透明(注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。同时补加水300mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。冷却至室温后，用去离子水定容至1000ml。此时溶液应清澈透明(如浑浊应重新配制)，储存在棕色瓶中并混合均匀，避光保存。室温下存放7天后标定标准曲线，有效期为6个月，每2个月重新标定曲线。
实施例4所产β-甘露聚糖酶的基本性质
本发明提供的β-甘露聚糖酶突变体具有在pH2.5-6.5维持48h仍有98％以上的活性，在92℃维持90min仍有95％以上的活性，最适pH为3.5、最适温度为45℃，其酶学特性特别适合用于饲料的深加工领域，例如低pH耐受性及较低的最适反应pH有利于该酶在动物低pH的肠道环境内发挥最大的催化作用，耐高温的特性利于酶制剂的高温造粒过程，在45℃(接近于动物体内的消化环境温度)具有最高的酶解反应速率，能最大限度的提高酶的利用率。具体如下：
最适反应pH：在75℃条件下，分别用pH为2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的缓冲液稀释本发明实施例2制备的发酵液的上清液，测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图1所示，本发明所述β-甘露聚糖酶的最适反应pH为3.5。
pH稳定范围：在37℃条件下，分别将本发明实施例2制备的发酵液的上清液，用缓冲液调pH至不同的梯度，分别为2、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，静置48h后，用pH3.5的缓冲液稀释，在75℃条件下测定酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算相对酶活。结果如图2所示，pH2.5-6.5范围内，能保持98％以上的酶活。
最适反应温度：在pH3.5条件下，分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃条件下测定本发明所述发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活。结果如图3所示，本发明所述β-甘露聚糖酶的最适作用温度为45℃。
温度稳定范围：将待测酶液的pH调至5.0，分别在74℃、76℃、78℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃处理90min后，测定残余酶活，以未处理样品的酶活为100％，计算相对酶活，结果如图4所示，在92℃维持90min仍有95％以上的活性。
以上述同样的条件测定野生型β-甘露聚糖酶的酶学性质，结果见图1-4。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东隆科特酶制剂有限公司
<120> β-甘露聚糖酶突变体及应用
<130> 1
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 511
<212> PRT
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.10788
<400> 1
Met Val Ser Asn Arg Leu Gln Thr Ala Thr Cys Ala Leu Ser Pro Arg
1 5 10 15
Gly Leu Ala Arg Pro Val Pro His Ala Thr Ser Gly Ala Gly Ser Gly
20 25 30
Pro Arg Arg Asp Glu Arg Asp Gly Gly Val Glu Ala Glu Pro Gly Arg
35 40 45
Arg Ala Val Pro Arg Arg Arg Gly Gly Gly Pro Arg Arg Ala Gly Gly
50 55 60
Val Arg Pro Val Pro Arg Gln Leu Gln Phe Lys Gln Phe Gly Asp Val
65 70 75 80
Asp Val Leu Gly Pro Val Ala Pro Leu Glu Ala Gly Gly Arg Gly Arg
85 90 95
Pro Gly Val Arg Ala Ala Arg Arg Arg Asp Ala Ala Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Gly Ser Pro Gly Trp Arg Arg Arg Ser Ala Arg Thr Ala Ala Arg Val
115 120 125
Val Pro Val Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gln Pro Phe Gly Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Val Gly Ala His Gly Val Gly Val Gly Arg Ser Thr Arg Arg Ala
145 150 155 160
Ser Thr Ser Arg Ala Ala Lys Arg Ser Ala Val Arg Thr Gly Ser Arg
165 170 175
Lys Pro Ser Ala Arg Ala Arg Ser Gly Cys Thr Trp Ala Arg Thr Ser
180 185 190
Ala Trp Gly Ser Pro Val Thr Gly Gly Pro Ala Arg Arg Arg Gly Gly
195 200 205
Val Gly Ala Thr Pro Ala Arg Arg Ser Pro Arg Ser Thr Gly Arg Arg
210 215 220
Thr Ala Ser Gly Arg Arg Gly Val Arg Ala Cys Gly Ala Gly Pro Cys
225 230 235 240
Arg Cys Gly Gly Ala Arg Arg Gly Gly Ser Ala Gly Ala Arg Arg Pro
245 250 255
Arg Trp Cys Arg Gly Arg Arg Arg Gly Arg Gly Ala Glu Leu Ala Cys
260 265 270
Ala Glu Gln Ala Gly Glu Pro Ala Val Arg Arg Arg Ser Pro Gly Gly
275 280 285
Ala Ile Thr Ser Val Ser Leu Ser Arg Asn Gly Ser Arg Gly Pro Lys
290 295 300
Gly Pro Arg Gly Arg Arg Gly Gly Arg Pro Ser Arg Gly Arg Gly Leu
305 310 315 320
Arg Gly Tyr Arg Arg Glu Arg Gly Gly Pro Arg Glu Arg Phe Leu Thr
325 330 335
Cys Thr Asp Gly Ser Trp Arg Phe Gly Arg Ser Pro Pro Arg Arg Pro
340 345 350
Pro Ala Arg Cys Gly Arg Arg Thr Ala Ala Arg Ser Ala Val Arg Thr
355 360 365
Ala Val Arg Thr Ser Arg Ser Ala Ser Ala Arg Pro Pro Ala Gly Ala
370 375 380
Arg Pro Pro Gly Pro Pro Arg Arg Arg Ser Arg Pro Gly Arg Ala Gly
385 390 395 400
Arg Arg Arg Arg Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ser Arg Ser Thr Tyr Gly
405 410 415
Leu Ala Leu Ser Glu Ala Arg Lys Thr Ala Ala Lys Ser Val Pro Arg
420 425 430
Cys Arg Arg Cys Thr Ala Gly Ser Ala Glu Arg Trp Phe Arg Ser Val
435 440 445
Ser Thr Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Pro Ala Val Ile Ser Thr
450 455 460
Pro Asn Pro Arg Arg Glu Arg Arg Asn Ser Trp Arg Gly Ser Gly Arg
465 470 475 480
Pro Gly Cys Pro Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Pro
485 490 495
Ala Pro Gly Ala Gly Arg Ala Arg Ala Ala Gly Arg Pro Gly Arg
500 505 510
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)CGMCC No.10788
<400> 2
atggtctcga accgccttca gacggcgacc tgtgcactct ccccgcgcgg actcgcccgt 60
ccagttccac acgctacgag tggcgcgggg tccggccccc gccgggacga acgggacggt 120
ggggtcgaag cggagccagg taggcgtgcg gtaccccggc gtcgaggtgg agggcctcgc 180
cgggctggag gcgtacggcc tgtaccgcgc cagctccagt tcaagcagtt cggggacgtc 240
gacgtgcttg ggcccgtcgc ccccctggag gcgggcggaa gagggcgtcc aggcgtacgg 300
gcggcgcgtc ggcgcgacgc ggcggcgagg acgcccgggt cgccggggtg gcgacgaagg 360
tcagcccgca ccgcagcacg agtcgtcccg gtacgggccc tcctcgccgg ccagccgttc 420
ggcggcgccc caggcgtagg ggcgcacggt gttggcgtag gccggtcgac gcggagggcg 480
tcgacgtcca gggccgcgaa gaggtccgcc gtccgcaccg ggtcgcggaa gccgtccgcg 540
cgggcgcggt cggggtgcac ctgggcgcgg acttcggcct ggggctctcc ggtgaccggg 600
ggtccggcgc ggcgtagggg cggagtcggc gcgacgcctg cgcgacggtc tccgcgatcc 660
acaggccgtc gaacggcgtc agggcgcaga ggagttcggg cttgtggtgc gggtccttgt 720
aggtgcggtg gggcgcgtcg agggggatcg gccggggccc gtcgcccgcg gtggtgtcgg 780
ggtcggcggc gaggccgggg cgccgagctc gcgtgtgccg agcaggccgg ggagccagca 840
gttcggcggc ggtctccagg gggagcgatt acgtcggtga gcttgagcag gaacgggagc 900
cgggggccga agggcccgag ggggcgccgg ggtgggcgcc catccagggg ccgcgggctt 960
agggggtacc ggcgagagcg aggcggtcca cgggagcggt tcctgacgtg tacggacggt 1020
tcctggcggt tcggacgctc gccccctcgg cggcctccag ctcgctgcgg gcgccggacg 1080
gccgcgcggt cggcggtgag gacggcggtc aggacctcgc ggagcgcgtc ggcccggcct 1140
ccggccggag cacggccccc cgggcctcct cggcggcgaa gccggccagg gagagcgggg 1200
cggcggcggc gagcagggac gggggcgtgc agcaggtcga cgtacggctt ggcgttgtcg 1260
gaggccagga agacggcggc gaagtcggtg ccgaggtgcc ggcggtgcac agcaggatct 1320
gcggagcggt ggttcaggag cgtgtccacc ggcgcgtcgt acgcctcctc ctcgccggcc 1380
gtgatctcga cgccgaaccc gcgccgggag aggcggaact cgtggcgcgg ttcaggtcga 1440
ccggggtgtc ccggtgcagg gcgaggtcgg gcgcgcgggc gggcgcccgc tcccggagcg 1500
gggcgcgctc gcgcagcagg acgacccggg cgctaa 1536
<210> 3
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Val Ser Asn Arg Leu Gln Thr Ala Thr Cys Ala Leu Ser Pro Arg
1 5 10 15
Gly Leu Ala Arg Pro Val Pro His Ala Thr Ser Gly Ala Gly Ser Gly
20 25 30
Pro Arg Arg Asp Glu Arg Asp Gly Gly Val Glu Ala Glu Pro Gly Arg
35 40 45
Arg Ala Val Pro Arg Arg Arg Gly Gly Gly Pro Arg Arg Ala Gly Gly
50 55 60
Val Arg Pro Val Pro Arg Gln Leu Gln Phe Lys Gln Phe Gly Asp Val
65 70 75 80
Asp Val Leu Gly Pro Val Ala Pro Leu Glu Ala Gly Gly Arg Gly Arg
85 90 95
Pro Gly Val Arg Ala Ala Arg Arg Arg Asp Ala Ala Ala Arg Thr Pro
100 105 110
Gly Ser Pro Gly Trp Arg Arg Arg Ser Ala Arg Thr Ala Ala Arg Val
115 120 125
Ile Pro Val Arg Ala Leu Leu Ala Gly Gln Pro Phe Gly Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Val Gly Ala His Gly Val Gly Val Gly Arg Ser Thr Arg Arg Ala
145 150 155 160
Ser Thr Ser Arg Ala Ala Lys Arg Ser Ala Val Arg Thr Gly Ser Arg
165 170 175
Lys Pro Ser Ala Arg Ala Arg Ser Gly Cys Thr Trp Ala Arg Thr Ser
180 185 190
Ala Trp Gly Ser Pro Val Thr Gly Gly Pro Ala Arg Arg Arg Gly Gly
195 200 205
Val Gly Ala Thr Pro Ala Arg Arg Ser Pro Arg Ser Thr Gly Arg Arg
210 215 220
Thr Ala Ser Gly Arg Arg Gly Val Arg Ala Cys Gly Ala Gly Pro Cys
225 230 235 240
Arg Cys Gly Gly Ala Arg Arg Gly Gly Ser Ala Gly Ala Arg Arg Pro
245 250 255
Arg Arg Cys Arg Gly Arg Arg Arg Gly Arg Gly Ala Glu Leu Ala Cys
260 265 270
Ala Glu Gln Ala Gly Glu Pro Ala Val Arg Arg Arg Ser Pro Gly Gly
275 280 285
Ala Ile Thr Ser Val Ser Leu Ser Arg Asn Gly Ser Arg Gly Pro Lys
290 295 300
Gly Pro Arg Gly Arg Arg Gly Gly Arg Pro Ser Arg Gly Arg Gly Leu
305 310 315 320
Arg Gly Tyr Arg Arg Glu Arg Gly Gly Pro Arg Glu Arg Phe Leu Thr
325 330 335
Cys Thr Asp Gly Ser Trp Arg Phe Ala Arg Ser Pro Pro Arg Arg Pro
340 345 350
Pro Ala Arg Cys Gly Arg Arg Thr Ala Ala Arg Ser Ala Val Arg Thr
355 360 365
Ala Val Arg Thr Ser Arg Ser Ala Ser Ala Arg Pro Pro Ala Gly Ala
370 375 380
Arg Pro Pro Gly Pro Pro Arg Arg Arg Ser Arg Pro Gly Arg Ala Gly
385 390 395 400
Arg Arg Arg Arg Ala Gly Thr Gly Ala Cys Ser Arg Ser Thr Tyr Gly
405 410 415
Leu Ala Leu Ser Glu Ala Arg Arg Thr Ala Ala Lys Ser Val Pro Arg
420 425 430
Cys Arg Arg Cys Thr Ala Gly Ser Ala Glu Arg Trp Phe Arg Ser Val
435 440 445
Ser Thr Gly Ala Ser Tyr Ala Ser Ser Ser Pro Ala Val Ile Ser Thr
450 455 460
Pro Asn Pro Arg Arg Glu Arg Arg Asn Ser Trp Arg Gly Ser Gly Arg
465 470 475 480
Pro Gly Cys Pro Gly Ala Gly Arg Gly Arg Ala Arg Gly Arg Ala Pro
485 490 495
Ala Pro Gly Ala Gly Arg Ala Arg Ala Ala Gly Arg Pro Gly Arg
500 505 510
<210> 4
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggtctcga accgccttca gacggcgacc tgtgcactct ccccgcgcgg actcgcccgt 60
ccagttccac acgctacgag tggcgcgggg tccggccccc gccgggacga acgggacggt 120
ggggtcgaag cggagccagg taggcgtgcg gtaccccggc gtcgaggtgg agggcctcgc 180
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gacgtgcttg ggcccgtcgc ccccctggag gcgggcggaa gagggcgtcc aggcgtacgg 300
gcggcgcgtc ggcgcgacgc ggcggcgagg acgcccgggt cgccggggtg gcgacgaagg 360
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acaggccgtc gaacggcgtc agggcgcaga ggagttcggg cttgtggtgc gggtccttgt 720
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gggcgcgctc gcgcagcagg acgacccggg cgctaa 1536

Claims (10)

1.一种β-甘露聚糖酶突变体，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.权利要求1所述甘露聚糖酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.包含权利要求2所述编码基因的重组表达载体或重组菌株。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，采用pPIC9质粒作为表达载体。
6.如权利要求4所述的重组菌株，其特征在于，采用毕赤酵母GS115作为宿主。
7.权利要求4所述重组表达载体或重组菌株在生产权利要求1所述β-甘露聚糖酶中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵方法如下：按照培养基体积的6-11％进行接种，培养温度30-32℃，罐压0.04-0.08MPa，初始转速100rpm，初始风量300m3/h，通过增加转速和通风量控制溶氧大于50％，最高转速600rpm，最高通风量4000m3/h；发酵至8h左右，开始流加50％的甘油，流加速率为700g/h，当菌体湿重达到70-90g/L时，停止流加甘油后维持0.8-1.2h进行饥饿处理，之后开始补甲醇，使培养基中甲醇的浓度维持在0.05％-0.1％，补氨控制pH在5-5.6，菌体自溶严重时结束发酵，培养周期180-200h。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成为：磷酸2.67-3.5％，二水硫酸钙0.093-0.15％，硫酸钾1.82-2.1％，二水硫酸镁1.49-2.3％，氢氧化钾0.413-1.2％，甘油4-6％，PMT1 4-8mL/L，其余为水，调pH至5.0。
10.权利要求1所述β-甘露聚糖酶在水解甘露聚糖中的应用。
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