CN110713996B

CN110713996B - 一种海藻糖酶及其载体与应用

Info

Publication number: CN110713996B
Application number: CN201910989344.2A
Authority: CN
Inventors: 黄江; 李阳源; 周银华; 江民华; 陈丽芝; 何小梅; 刘金山
Original assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Current assignee: Guangdong Vtr Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110713996A

Abstract

本发明首次公开了一种嗜热真菌Thermothelomyces中的海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述海藻糖酶在pH4.0～5.5的区间都具有较好的酶活，在发酵制酒精过程的酶活维持较高水平，所述海藻糖酶经密码子优化后的海藻糖酶基因，选用毕赤酵母作为表达菌株，重组优化的海藻糖酶毕赤酵母菌株能明显地提高海藻糖酶的表达水平。重组后的TreT酶的温度适用性更广，应用的范围更我广泛。尤其在高温条件反应的酶促反应中具有显著优势。在发酵制酒精过程中添加一定量的所述海藻糖酶，能将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，提高酒精产量，增加了转化率。

Description

一种海藻糖酶及其载体与应用

技术领域

本发明属于生物酶领域，更具体地，涉及一种海藻糖酶及其载体与应用。

背景技术

海藻糖是一种非还原的二糖，由两分子的葡萄糖残基以α-1,1-糖苷键连接而成，分子式是：C₁₂H₂₂O₁₁，分子结构对称。海藻糖在自然环境的的微生物、植物和动物中广泛存在，包括细菌、真菌、昆虫、低等植物、脊椎动物。海藻糖酶是一种海藻糖水解酶，能够特异性的将海藻糖分解为两分子的葡萄糖，最早是Bourquelot于1893年在黑曲霉中发现的，后1895年Fischer在酿酒酵母里也发现了海藻糖酶。自此以后，科研人员在不同的生物里不断地发现和鉴定了不同的海藻糖酶，这些生物包括细菌、酵母、真菌、昆虫、线虫、植物和脊椎动物(Elbein et al 1974)。

海藻糖酶在食品、农药设计和农业生产中有着潜在的价值。将海藻糖酶应用到生产中，要求海藻糖酶有较高的催化活性、良好的稳定性等性质。为了海藻糖酶的效益生产，筛选出适应各种反应条件的海藻糖酶，并且选择合适的蛋白表达系统是非常重要的，将具有巨大的市场应用价值和研究前景。

发明内容

本发明第一方面的目的在于提供一种海藻糖酶。

本发明第二方面的目的在于提供一种编码上述海藻糖酶的核苷酸序列。

本发明第三方面的目的在于提供一种载体。

本发明第四方面的目的在于提供一种细胞。

本发明第五方面的目的在于提供上述海藻糖酶、上述载体或上述细胞在发酵生产酒精中的应用。

本发明第六方面的目的在于提供一种发酵产生酒精的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个方面，提供一种编码本发明第一个方面所述海藻糖酶的核苷酸序列。

根据本发明第二个方面所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示。

本发明的第三个方面，提供一种载体，所述载体可表达本发明第一个方面所述的海藻糖酶或含有本发明第二个方面所述的核苷酸序列。

本发明的第四个方面，提供一种细胞，所述细胞包含本发明第三个方面所述的载体。

根据本发明第四个方面所述的细胞，所述细胞为毕赤酵母。

本发明的第五个方面，提供本发明第一个方面所述的海藻糖酶、本发明第三个方面所述的载体或本发明第四个方面所述的细胞在发酵生产酒精中的应用。

本发明的第六个方面，提供一种发酵产生酒精的方法，在发酵原料中加入本发明第一个方面所述的海藻糖酶。

根据本发明的第六个方面所述的方法，所述海藻糖酶与发酵原料的比例为1：(800～1200)。

根据本发明的第六个方面所述的方法，优选地，所述海藻糖酶与发酵原料的比例为1：1000。

根据本发明的第六个方面所述的方法，所述发酵原料玉米、高粱、小麦、大麦或甜菜中的至少一种。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供一种新的、从嗜热真菌Thermothelomyces得到的海藻糖酶及其经密码子优化后的海藻糖酶基因。选用毕赤酵母作为表达菌株，重组优化的海藻糖酶毕赤酵母菌株能明显地提高海藻糖酶的表达水平。

2.本发明提供的海藻糖酶在pH4.0～5.5的区间都具有较好的酶活，在发酵制酒精过程的酶活维持较高水平。

3.与常规商品的海藻糖酶相比较，TreT重组酶的温度适用性更广，应用的范围更我广泛。尤其在高温条件反应的酶促反应中具有显著优势。

4.发酵制酒精过程中添加一定量的本发明海藻糖酶，能将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，提高酒精产量，增加了转化率。

附图说明

图1不同温度下海藻糖酶的酶活变化。

图2不同pH下海藻糖酶的酶活变化。

图3发酵过程中原始海藻糖酶于优化海藻糖酶的酶活。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂盒生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

海藻糖酶酶活的测定方法：

海藻糖酶在一定条件下催化水解普海藻糖生成葡萄糖等还原糖，3，5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原为显棕红色的氨基络合物，在一定范围内其颜色深浅与还原糖的量成正比，故可以在550nm的波长下进行比色，计算酶活力。

酶反应体系：

1ml稀释后的发酵液，1ml溶于pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液中的2％海藻糖溶液，50℃反应30分钟，生成还原糖采用3，5-二硝基水杨酸法测定。

海藻糖酶活定义：

在上述条件下，每分钟产生相当于1umol葡萄糖还原力的酶活力为一个酶活单位。

试剂和溶液：

乙酸-乙酸钠缓冲液：准确称取无水乙酸钠4.92g溶于水中，加冰乙酸，用蒸馏水溶解并定容至1000ml，配好后用pH计校正至5.5。

DNS试剂：准确称取3，5-二硝基水杨酸6.3g放于盛有500ml蒸馏水的烧杯中，加氢氧化钠21g加热至50℃全溶，称取酒石酸钾钠182g放于300ml水中，加热溶解倒入前溶液中，加重蒸苯酚5g，加无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，过滤，贮于棕色瓶中放置7天后使用。

2％的海藻糖溶液：准确称取海藻糖2g，用pH5.5的乙酸乙酸钠缓冲液充分溶解定容至100ml(低温保存可用3天)。

葡萄糖标准曲线的绘制：

分别吸取0.1％标准葡萄糖液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4ml，依次加入到刻度试管中，用蒸馏水补加至2.0ml，配制成每毫升分别含有葡萄糖100，200，300，400，500，600，700ug的标准液。各加入DNS试剂3ml，于沸水中沸腾7分钟(样品放入重新沸腾时算起)，取出后立即加入蒸馏水10ml，混匀，冷却后，在分光光度计550nm比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以光密度为纵坐标，以对应的标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

空白的制作：以0.5ml蒸馏水代替0.5ml标准葡萄糖液。

测定步骤：

1ml适当稀释的酶液加入3mlDNS充分混匀，50℃保温30min，加入1ml 2％海藻糖，在沸水中煮沸7分钟，冷却后加蒸馏水10ml混匀，按标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD₅₅₀)。

1ml适当稀释后的酶液50℃水浴锅预热8min，加1ml已经预热至50℃2％的海藻糖溶液于试管中，精确50℃保温30分钟，立即加入DNS试剂3ml，在沸水中煮沸7分钟，冷却后加蒸馏水10ml混匀，按标准曲线时同样的操作测定光密度值(OD₅₅₀)。

酶活力的计算：酶活(u/ml)＝OD×K值÷30÷180×n

式中：

OD----样品与空白光密度值之差；

180---葡萄糖的分子量；

K-----标准曲线的斜率；

30-----酶反应时间；

n------发酵液稀释倍数。

实施例1海藻糖酶基因的获取及表达载体构建

海藻糖酶基因的获取及密码子优化：

从天然土壤中筛选、分离得到的一株嗜热真菌Thermothelomyces。通过提取mRNA，扩增该嗜热真菌的海藻糖酶基因，该海藻糖酶基因TreT全长2025bp，编码674个氨基酸，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。将海藻糖酶TreT进行密码子优化(不改变所编码的氨基酸序列)、提高稳定性后克隆至pUC57质粒上，得到优化后的海藻糖酶基因重组质粒pUC57-TreT，其中，将上述海藻糖酶按毕赤酵母密子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1：

LYINGSVTAPCDSPIYCHGELLKGVELAHPFVDSKTFVDMPTLKPVDEVLAAFSKLRQPLSNNSELNNFLAEYFAPAGHELEEVPKGELQIDPKFLNKLEDRTIKEFVSKVIDIWPDLTRRYAGPGDCSGCANSFIPVNRTFVVAGGRFREPYYWDSYWILEGLLRTGGAFTQISKNIIENFLDFIDTIGFIPNGARIYYLNRSQPPLLTRMVKSYVDYTNDTSILERALPLLIKEHDFFTNNRSVSVTASNGKTYTLHRYHVENNQPRPESYREDYITANNGSYYAASGIIYPVKTPLNETEKAVLYSNLASGAESGWDYTARWLRVPDDAARDVYFPLRSLNVREMVPVDLNSILYENEVIIAEYLEKAGNSSEAKRFASAAKQRSEAMYNLMWNATHWSYFDYNLTSNAQNIFVPADEDTASFDRYAAPPGQQVLFHVAQLYPFWTGAAPAHLKSNPLAVQKAYARVSRRLDTKKGAIAATNYRTGQQWDQPNVWPPLQHVLMQGLLNTPATFGESDPAYQGVQKLALRLAQRYLDSTFCTWYATGGSTSDFPQLQGVSPDATGIMFEKYADSATNVAGGGGEYEVVEGFGWTNGVLIWAADVFGNKLKRPDCGNITAAHTHSEAKRSLGDGGLARRAVELDPWDAAWTKMFGRSKLRRREAEDVRKRWLPL。

SEQ ID NO.2：

TTGTACATCAATGGTTCGGTCACGGCGCCCTGCGACTCGCCAATCTACTGCCATGGCGAACTGCTCAAAGGCGTCGAATTGGCGCATCCCTTCGTCGACAGCAAGACATTTGTGGACATGCCCACGCTCAAGCCGGTAGACGAAGTGCTTGCAGCGTTCAGCAAGTTGCGCCAGCCGCTGTCTAACAACTCGGAGCTCAACAACTTCCTGGCCGAATACTTTGCCCCGGCTGGACACGAGCTCGAAGAGGTGCCCAAGGGCGAGTTGCAGATCGACCCCAAGTTCCTCAACAAGCTCGAGGATCGCACCATCAAAGAATTCGTCAGCAAGGTGATCGACATCTGGCCCGACCTTACCAGGCGCTATGCCGGCCCGGGCGACTGCTCCGGATGCGCCAACAGCTTCATCCCCGTGAACCGCACGTTCGTCGTGGCTGGCGGCCGCTTCCGGGAGCCCTACTACTGGGACTCGTACTGGATTCTCGAGGGCCTCTTGCGCACCGGCGGTGCCTTCACCCAGATCTCCAAGAACATCATCGAGAACTTCCTCGACTTTATCGACACGATCGGCTTCATCCCCAACGGCGCCAGGATCTACTACTTGAACAGGTCTCAGCCCCCTCTCCTGACGCGGATGGTGAAGAGCTACGTCGACTACACCAACGACACGAGCATCCTGGAGAGGGCCCTACCGCTGTTGATCAAGGAGCACGACTTCTTCACCAACAACCGGAGCGTGTCCGTCACGGCGTCGAACGGCAAGACGTATACTCTGCACAGGTACCACGTTGAAAACAACCAGCCGCGCCCGGAGTCGTACCGGGAGGACTACATTACCGCTAATAACGGGTCCTACTACGCGGCCTCGGGCATAATATACCCGGTCAAGACACCCCTTAACGAGACGGAAAAGGCCGTGTTGTACTCCAACCTAGCCAGCGGCGCCGAGTCCGGCTGGGATTACACCGCGCGATGGCTTCGGGTTCCCGACGACGCTGCGAGGGACGTCTACTTCCCGCTCCGCTCGCTGAATGTTCGCGAGATGGTCCCCGTTGACCTCAACTCCATCCTCTACGAGAACGAGGTTATCATCGCCGAGTACCTCGAAAAGGCCGGCAACTCCTCGGAAGCCAAGCGGTTCGCCTCGGCTGCCAAGCAGCGCAGCGAAGCCATGTACAATCTCATGTGGAACGCCACGCACTGGTCCTACTTTGACTACAATCTGACCTCCAACGCGCAAAACATTTTCGTTCCGGCCGACGAGGACACCGCCTCCTTCGACCGATATGCGGCTCCGCCAGGTCAGCAGGTCTTGTTCCACGTCGCCCAGCTCTACCCCTTCTGGACCGGCGCGGCCCCCGCCCACCTCAAGTCTAACCCCCTCGCGGTGCAAAAAGCCTATGCCCGCGTGTCGCGCAGGCTCGACACCAAGAAGGGCGCTATCGCCGCGACCAACTACCGCACCGGCCAGCAGTGGGACCAGCCCAACGTCTGGCCTCCGCTGCAGCACGTCCTGATGCAGGGCCTGCTTAACACCCCGGCCACCTTTGGCGAGTCTGACCCGGCTTACCAGGGCGTGCAGAAGCTGGCCTTGCGCCTCGCCCAGCGCTACTTGGACTCCACCTTTTGCACTTGGTATGCCACGGGCGGCTCGACCAGCGACTTCCCACAGCTACAGGGCGTCAGCCCGGACGCTACGGGCATCATGTTTGAGAAGTACGCCGACAGCGCTACCAACGTGGCCGGCGGCGGCGGCGAGTATGAGGTCGTCGAGGGTTTCGGGTGGACCAACGGCGTGCTGATCTGGGCCGCTGATGTCTTCGGTAACAAGCTCAAGCGCCCAGACTGCGGCAACATCACGGCCGCGCACACTCACTCTGAGGCTAAGAGGAGCCTGGGAGATGGCGGGCTGGCGAGAAGGGCGGTGGAGCTTGATCCGTGGGATGCCGCGTGGACCAAGATGTTTGGGCGGAGCAAGCTCCGGAGGAGAGAGGCGGAGGACGTGCGGAAGCGGTGGTCGAGTTGA。

SEQ ID NO.3：

CTTTATATCAACGGTTCTGTCACTGCTCCATGCGATTCCCCTATCTACTGTCACGGAGAGTTGTTGAAAGGTGTCGAGTTGGCCCACCCTTTTGTTGACTCCAAGACCTTCGTTGACATGCCAACCTTGAAACCTGTCGACGAGGTTTTGGCCGCCTTTTCCAAATTGCGTCAGCCTTTGTCCAACAACTCCGAGCTTAACAACTTCTTGGCCGAGTACTTTGCCCCTGCTGGTCACGAATTGGAAGAGGTCCCAAAGGGTGAGTTGCAGATCGATCCAAAGTTTTTGAACAAGTTGGAAGACAGAACCATCAAGGAGTTCGTCTCTAAGGTCATTGACATCTGGCCTGACTTGACCAGAAGATACGCTGGACCTGGTGATTGTTCCGGATGCGCCAACTCTTTCATCCCAGTCAATCGTACTTTCGTCGTTGCCGGTGGTCGTTTTAGAGAGCCATACTACTGGGACTCCTACTGGATCTTGGAGGGATTGTTGCGTACTGGTGGTGCTTTCACCCAGATCTCTAAGAACATTATTGAAAATTTCTTGGATTTTATTGACACTATTGGATTCATTCCTAATGGTGCTCGTATCTACTACCTTAACCGTTCCCAGCCTCCATTGTTGACTAGAATGGTTAAGTCTTACGTTGATTACACCAACGATACCTCCATCTTGGAGCGTGCTTTGCCATTGTTGATCAAGGAGCACGACTTTTTCACTAACAACCGTTCCGTTTCTGTCACCGCTTCCAACGGAAAGACCTACACCTTGCACAGATACCACGTTGAGAATAATCAACCAAGACCAGAATCCTACAGAGAAGATTATATTACTGCCAACAACGGATCCTACTACGCCGCCTCTGGTATCATCTACCCAGTTAAGACTCCATTGAACGAGACTGAGAAGGCCGTCTTGTACTCCAATTTGGCTTCCGGTGCCGAGTCCGGTTGGGATTACACCGCTAGATGGCTTAGAGTTCCAGACGACGCCGCTAGAGATGTTTACTTTCCATTGAGATCCTTGAATGTCAGAGAGATGGTTCCTGTTGATTTGAACTCTATTTTGTACGAAAATGAGGTCATTATTGCCGAATACTTGGAGAAGGCCGGTAACTCTTCCGAGGCTAAACGTTTCGCCTCTGCTGCTAAACAGCGTTCCGAGGCCATGTACAACTTGATGTGGAACGCTACCCACTGGTCTTACTTCGATTACAATTTGACCTCTAACGCTCAGAACATCTTTGTCCCTGCCGACGAAGACACCGCCTCCTTCGACAGATATGCTGCCCCTCCTGGTCAGCAAGTCTTGTTCCACGTCGCTCAGCTTTACCCATTCTGGACCGGAGCTGCTCCTGCTCATTTGAAGTCCAACCCTTTGGCCGTTCAGAAAGCCTATGCCCGTGTCTCTAGACGTTTGGACACCAAGAAGGGAGCTATTGCTGCCACCAACTATCGTACTGGTCAGCAGTGGGACCAACCAAACGTTTGGCCTCCATTGCAGCACGTCTTGATGCAGGGATTGTTGAACACCCCAGCTACCTTCGGTGAGTCCGACCCAGCTTACCAGGGAGTCCAGAAATTGGCTTTGAGACTTGCCCAGCGTTACTTGGATTCCACCTTCTGTACTTGGTACGCTACCGGTGGTTCTACCTCCGATTTCCCACAGTTGCAAGGTGTTTCTCCTGACGCTACCGGTATCATGTTCGAGAAGTACGCCGACTCCGCTACTAACGTTGCTGGTGGTGGTGGTGAGTACGAGGTCGTCGAGGGATTCGGTTGGACCAATGGTGTCTTGATCTGGGCCGCTGACGTCTTCGGTAACAAGTTGAAGCGTCCTGACTGTGGAAACATCACTGCTGCCCACACTCACTCTGAGGCTAAGCGTTCTTTGGGTGACGGTGGTTTGGCTAGACGTGCTGTCGAACTTGATCCATGGGACGCCGCTTGGACCAAAATGTTCGGTAGATCCAAGTTGCGTCGTAGAGAAGCCGAGGATGTCCGTAAAAGATGGCTCCCCCTAA。

海藻糖酶基因TreT在毕赤酵母中的表达：

利用EcoRI和NotI酶切pUC57-TreT重组质粒和毕赤酵母表达载体pPICZαA，利用NEB公司的T4连接酶连接二者，构建pPICZαA-TreT，连接产物转化大肠杆菌感受肽细胞Top10，在LBZ琼脂糖平板培养筛选阳性克隆。提取阳性克隆的质粒。送样到华大基因测序，测序结果表明，得到的重组表达载体命名为pPICZαA-TreT。

海藻糖酶基因TreT在黑曲霉中的表达：

用BglII限制性内切酶和PmeI限制性内切酶将的海藻糖酶基因TreT构建到黑曲霉表达载体PBC-gla3-TER，连接产物转化大肠杆菌感受肽细胞Top10，得到的重组表达载体命名为PBC-gla3--TreT-TER。将载体通过NotI线性化后，转化黑曲霉319菌株原生质体。涂布于TZ+潮霉素平板中，32℃倒置培养5-6天，挑取单菌落至20mL液体麦芽糊精培养基中，32℃，200rpm进行培养，筛选得到表达海藻糖酶的在重组黑曲霉。

实施例2海藻糖酶重组菌株的高效表达

将上述重组表达载体转化入对应的表达细胞中，筛选出表达效率最高一种。以pPICzαA-TreT为例。

将上述重组表达载体pPICzαA-TreT用PmeI进行线性化，将线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母感受态细胞X33，得到毕赤酵母重组菌株X33/pPICZαA-TreT。下一步进行酶学性质测定和发酵试验测定。

实施例3海藻糖酶的最适反应温度

在pH5.5的条件下，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,用DNS法测定重组海藻糖酶的酶活力，制作优化的海藻糖酶最适作用温度曲线，以pH5.5、50℃条件下测得的相对酶活为100％，结果下表1和附图1所示。

表1海藻糖酶在不同温度下酶活变化

结果表明，在60℃时测定的酶活力最高，重组优化的海藻糖酶的最佳温度60℃。

在相同条件下，在pH5.5的条件下，分别测定TreT重组酶和购买的商品海藻糖酶在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,用DNS法测定重组海藻糖酶的酶活力，制作优化的海藻糖酶最适作用温度曲线，以pH5.5、50℃条件下测得的相对酶活为100％。结果见下表2.

表2不同海藻糖酶在不同温度下酶活变化

与常规商品的海藻糖酶相比较，TreT重组酶的温度适用性更广，应用的范围更我广泛。尤其在高温条件反应的酶促反应中具有显著优势。

实施例4海藻糖酶的最适反应pH

在50℃条件下，分别在pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5时，用DNS法测定重组海藻糖酶的酶活力。以55℃、pH5.0时酶的催化活力为100％，制作海藻糖酶的最适作用pH曲线，如下表3和附图2所示。

表3海藻糖酶在不同pH下酶活变化

结果表明，重组优化的海藻糖酶的最佳反应pH为4.5，在pH4.0～5.5的区间都具有较好的酶活。

实施例5海藻糖酶重组菌株的发酵实验

从YPD-zeo平板上选取工程菌TreT的单菌落，接种于20mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20hr。以1：50的比例接种到300mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD600＝5，用以接种发酵罐。

发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵过程分为三个阶段：1)菌株培养阶段：国产的7L发酵罐，加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至4.6，加入PTMl(4.35mL/L)，接入种子菌(1：10)，通气搅拌培养约18-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；2)之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTMl，1 2mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；3)最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTMl，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15hr线性升至4mL/L·h，持续120h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD600以及菌体湿重，取上清液进行海藻糖酶活性检测。随着发酵时长的增加，蛋白浓度与酶活的变化见下表4所示。可以看出，优化后菌株的发酵酶活接近优化前菌株发酵酶活的2倍。

将上述重组毕赤酵母X33/pPICZαA-TreT单菌落进行高密度发酵培养。配置20L基本盐培养基，在50L自动控制发酵罐中灭菌后，冷却至常温备用。用氨水和磷酸调节发酵液的pH值至5.0，通过调节转速和空气流量控制溶氧大于30％，发酵温度为30℃。

整个发酵过程分3个阶段：第一阶段为菌体培养阶段，将重组菌X33/pPICZαA-TreT按照10％的接种量接种至发酵罐中，流加已灭菌的4L 50％的葡萄糖，培养24-30h，以补充完葡萄糖为标志。

第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖不完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，约需30-60min。

第三阶段为诱导表达阶段，在此阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在180-200h之间。发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜处理后获得酶液。在发酵过程中的不同时间点取样测定酶活，发酵过程中优化的海藻糖酶的表达情况如附图3所示，诱导培养185h的发酵液的酶活性为2537U/ml。同样发酵条件下，将原始的海藻糖酶毕赤酵母菌株进行高密度发酵培养，发酵过程中原始海藻糖酶的表达情况如附图3所示，诱导培养185h后其发酵液的酶活性为1438U/ml。说明重组优化的海藻糖酶毕赤酵母菌株能明显地提高海藻糖酶的表达水平。

表4发酵过程中蛋白浓度以及酶活的变化

实施例5海藻糖酶在发酵制乙醇的实践

将玉米粉与拌料水混合，料水比为1:2.25，用3M的磷酸溶液调pH至5.5，按20U/g玉米粉的用量加入耐高温α-淀粉酶，搅拌均匀后加热至95℃并维持90min；降温至室温，用3M的磷酸溶液调pH至4.3，按100U/g玉米粉的用量加入糖化酶，100U/g玉米粉的用量加入酸性蛋白酶，10U/g的用量玉米粉加入海藻糖酶TreT，玉米粉的0.1％的量加入酵母活化液，摇匀后放入已升温至32℃的电热恒温培养箱中恒温发酵。发酵结束后，利用高效液相色谱结合有机酸分析柱检测发酵液中酒精含量，以不添加海藻糖酶TreT作为空白对照。

实验结果如下表5所示，结果显示，发酵结束时含海藻糖酶TreT实验组的酒精含量为108.6g/L，空白对照的酒精含量为104.2g/L，含海藻糖酶TreT实验组的酒精含量比空白对照的酒精含量高4.22％。发酵法制酒精过程中添加一定量的海藻糖酶，将代谢过程中产生的海藻糖水解为葡萄糖，供酒精酵母利用，可以提高酒精产量，由此可见，本发明海藻糖酶在发酵制酒精等工业领域具有广泛的应用价值，对海藻糖酶进行深入研究有非常重要的意义。

表5海藻糖酶对玉米酒精发酵的影响

本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东溢多利生物科技股份有限公司

<120> 一种海藻糖酶及其载体与应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 675

<212> PRT

<213> 嗜热真菌Thermothelomyces

<400> 1

Leu Tyr Ile Asn Gly Ser Val Thr Ala Pro Cys Asp Ser Pro Ile Tyr

1 5 10 15

Cys His Gly Glu Leu Leu Lys Gly Val Glu Leu Ala His Pro Phe Val

20 25 30

Asp Ser Lys Thr Phe Val Asp Met Pro Thr Leu Lys Pro Val Asp Glu

35 40 45

Val Leu Ala Ala Phe Ser Lys Leu Arg Gln Pro Leu Ser Asn Asn Ser

50 55 60

Glu Leu Asn Asn Phe Leu Ala Glu Tyr Phe Ala Pro Ala Gly His Glu

65 70 75 80

Leu Glu Glu Val Pro Lys Gly Glu Leu Gln Ile Asp Pro Lys Phe Leu

85 90 95

Asn Lys Leu Glu Asp Arg Thr Ile Lys Glu Phe Val Ser Lys Val Ile

100 105 110

Asp Ile Trp Pro Asp Leu Thr Arg Arg Tyr Ala Gly Pro Gly Asp Cys

115 120 125

Ser Gly Cys Ala Asn Ser Phe Ile Pro Val Asn Arg Thr Phe Val Val

130 135 140

Ala Gly Gly Arg Phe Arg Glu Pro Tyr Tyr Trp Asp Ser Tyr Trp Ile

145 150 155 160

Leu Glu Gly Leu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Phe Thr Gln Ile Ser Lys

165 170 175

Asn Ile Ile Glu Asn Phe Leu Asp Phe Ile Asp Thr Ile Gly Phe Ile

180 185 190

Pro Asn Gly Ala Arg Ile Tyr Tyr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Pro Leu

195 200 205

Leu Thr Arg Met Val Lys Ser Tyr Val Asp Tyr Thr Asn Asp Thr Ser

210 215 220

Ile Leu Glu Arg Ala Leu Pro Leu Leu Ile Lys Glu His Asp Phe Phe

225 230 235 240

Thr Asn Asn Arg Ser Val Ser Val Thr Ala Ser Asn Gly Lys Thr Tyr

245 250 255

Thr Leu His Arg Tyr His Val Glu Asn Asn Gln Pro Arg Pro Glu Ser

260 265 270

Tyr Arg Glu Asp Tyr Ile Thr Ala Asn Asn Gly Ser Tyr Tyr Ala Ala

275 280 285

Ser Gly Ile Ile Tyr Pro Val Lys Thr Pro Leu Asn Glu Thr Glu Lys

290 295 300

Ala Val Leu Tyr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ala Glu Ser Gly Trp Asp

305 310 315 320

Tyr Thr Ala Arg Trp Leu Arg Val Pro Asp Asp Ala Ala Arg Asp Val

325 330 335

Tyr Phe Pro Leu Arg Ser Leu Asn Val Arg Glu Met Val Pro Val Asp

340 345 350

Leu Asn Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Glu Val Ile Ile Ala Glu Tyr Leu

355 360 365

Glu Lys Ala Gly Asn Ser Ser Glu Ala Lys Arg Phe Ala Ser Ala Ala

370 375 380

Lys Gln Arg Ser Glu Ala Met Tyr Asn Leu Met Trp Asn Ala Thr His

385 390 395 400

Trp Ser Tyr Phe Asp Tyr Asn Leu Thr Ser Asn Ala Gln Asn Ile Phe

405 410 415

Val Pro Ala Asp Glu Asp Thr Ala Ser Phe Asp Arg Tyr Ala Ala Pro

420 425 430

Pro Gly Gln Gln Val Leu Phe His Val Ala Gln Leu Tyr Pro Phe Trp

435 440 445

Thr Gly Ala Ala Pro Ala His Leu Lys Ser Asn Pro Leu Ala Val Gln

450 455 460

Lys Ala Tyr Ala Arg Val Ser Arg Arg Leu Asp Thr Lys Lys Gly Ala

465 470 475 480

Ile Ala Ala Thr Asn Tyr Arg Thr Gly Gln Gln Trp Asp Gln Pro Asn

485 490 495

Val Trp Pro Pro Leu Gln His Val Leu Met Gln Gly Leu Leu Asn Thr

500 505 510

Pro Ala Thr Phe Gly Glu Ser Asp Pro Ala Tyr Gln Gly Val Gln Lys

515 520 525

Leu Ala Leu Arg Leu Ala Gln Arg Tyr Leu Asp Ser Thr Phe Cys Thr

530 535 540

Trp Tyr Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ser Asp Phe Pro Gln Leu Gln Gly

545 550 555 560

Val Ser Pro Asp Ala Thr Gly Ile Met Phe Glu Lys Tyr Ala Asp Ser

565 570 575

Ala Thr Asn Val Ala Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Glu Val Val Glu Gly

580 585 590

Phe Gly Trp Thr Asn Gly Val Leu Ile Trp Ala Ala Asp Val Phe Gly

595 600 605

Asn Lys Leu Lys Arg Pro Asp Cys Gly Asn Ile Thr Ala Ala His Thr

610 615 620

His Ser Glu Ala Lys Arg Ser Leu Gly Asp Gly Gly Leu Ala Arg Arg

625 630 635 640

Ala Val Glu Leu Asp Pro Trp Asp Ala Ala Trp Thr Lys Met Phe Gly

645 650 655

Arg Ser Lys Leu Arg Arg Arg Glu Ala Glu Asp Val Arg Lys Arg Trp

660 665 670

Leu Pro Leu

675

<210> 2

<211> 2025

<212> DNA

<213> 嗜热真菌Thermothelomyces

<400> 2

ttgtacatca atggttcggt cacggcgccc tgcgactcgc caatctactg ccatggcgaa 60

ctgctcaaag gcgtcgaatt ggcgcatccc ttcgtcgaca gcaagacatt tgtggacatg 120

cccacgctca agccggtaga cgaagtgctt gcagcgttca gcaagttgcg ccagccgctg 180

tctaacaact cggagctcaa caacttcctg gccgaatact ttgccccggc tggacacgag 240

ctcgaagagg tgcccaaggg cgagttgcag atcgacccca agttcctcaa caagctcgag 300

gatcgcacca tcaaagaatt cgtcagcaag gtgatcgaca tctggcccga ccttaccagg 360

cgctatgccg gcccgggcga ctgctccgga tgcgccaaca gcttcatccc cgtgaaccgc 420

acgttcgtcg tggctggcgg ccgcttccgg gagccctact actgggactc gtactggatt 480

ctcgagggcc tcttgcgcac cggcggtgcc ttcacccaga tctccaagaa catcatcgag 540

aacttcctcg actttatcga cacgatcggc ttcatcccca acggcgccag gatctactac 600

ttgaacaggt ctcagccccc tctcctgacg cggatggtga agagctacgt cgactacacc 660

aacgacacga gcatcctgga gagggcccta ccgctgttga tcaaggagca cgacttcttc 720

accaacaacc ggagcgtgtc cgtcacggcg tcgaacggca agacgtatac tctgcacagg 780

taccacgttg aaaacaacca gccgcgcccg gagtcgtacc gggaggacta cattaccgct 840

aataacgggt cctactacgc ggcctcgggc ataatatacc cggtcaagac accccttaac 900

gagacggaaa aggccgtgtt gtactccaac ctagccagcg gcgccgagtc cggctgggat 960

tacaccgcgc gatggcttcg ggttcccgac gacgctgcga gggacgtcta cttcccgctc 1020

cgctcgctga atgttcgcga gatggtcccc gttgacctca actccatcct ctacgagaac 1080

gaggttatca tcgccgagta cctcgaaaag gccggcaact cctcggaagc caagcggttc 1140

gcctcggctg ccaagcagcg cagcgaagcc atgtacaatc tcatgtggaa cgccacgcac 1200

tggtcctact ttgactacaa tctgacctcc aacgcgcaaa acattttcgt tccggccgac 1260

gaggacaccg cctccttcga ccgatatgcg gctccgccag gtcagcaggt cttgttccac 1320

gtcgcccagc tctacccctt ctggaccggc gcggcccccg cccacctcaa gtctaacccc 1380

ctcgcggtgc aaaaagccta tgcccgcgtg tcgcgcaggc tcgacaccaa gaagggcgct 1440

atcgccgcga ccaactaccg caccggccag cagtgggacc agcccaacgt ctggcctccg 1500

ctgcagcacg tcctgatgca gggcctgctt aacaccccgg ccacctttgg cgagtctgac 1560

ccggcttacc agggcgtgca gaagctggcc ttgcgcctcg cccagcgcta cttggactcc 1620

accttttgca cttggtatgc cacgggcggc tcgaccagcg acttcccaca gctacagggc 1680

gtcagcccgg acgctacggg catcatgttt gagaagtacg ccgacagcgc taccaacgtg 1740

gccggcggcg gcggcgagta tgaggtcgtc gagggtttcg ggtggaccaa cggcgtgctg 1800

atctgggccg ctgatgtctt cggtaacaag ctcaagcgcc cagactgcgg caacatcacg 1860

gccgcgcaca ctcactctga ggctaagagg agcctgggag atggcgggct ggcgagaagg 1920

gcggtggagc ttgatccgtg ggatgccgcg tggaccaaga tgtttgggcg gagcaagctc 1980

cggaggagag aggcggagga cgtgcggaag cggtggtcga gttga 2025

<210> 3

<211> 2026

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctttatatca acggttctgt cactgctcca tgcgattccc ctatctactg tcacggagag 60

ttgttgaaag gtgtcgagtt ggcccaccct tttgttgact ccaagacctt cgttgacatg 120

ccaaccttga aacctgtcga cgaggttttg gccgcctttt ccaaattgcg tcagcctttg 180

tccaacaact ccgagcttaa caacttcttg gccgagtact ttgcccctgc tggtcacgaa 240

ttggaagagg tcccaaaggg tgagttgcag atcgatccaa agtttttgaa caagttggaa 300

gacagaacca tcaaggagtt cgtctctaag gtcattgaca tctggcctga cttgaccaga 360

agatacgctg gacctggtga ttgttccgga tgcgccaact ctttcatccc agtcaatcgt 420

actttcgtcg ttgccggtgg tcgttttaga gagccatact actgggactc ctactggatc 480

ttggagggat tgttgcgtac tggtggtgct ttcacccaga tctctaagaa cattattgaa 540

aatttcttgg attttattga cactattgga ttcattccta atggtgctcg tatctactac 600

cttaaccgtt cccagcctcc attgttgact agaatggtta agtcttacgt tgattacacc 660

aacgatacct ccatcttgga gcgtgctttg ccattgttga tcaaggagca cgactttttc 720

actaacaacc gttccgtttc tgtcaccgct tccaacggaa agacctacac cttgcacaga 780

taccacgttg agaataatca accaagacca gaatcctaca gagaagatta tattactgcc 840

aacaacggat cctactacgc cgcctctggt atcatctacc cagttaagac tccattgaac 900

gagactgaga aggccgtctt gtactccaat ttggcttccg gtgccgagtc cggttgggat 960

tacaccgcta gatggcttag agttccagac gacgccgcta gagatgttta ctttccattg 1020

agatccttga atgtcagaga gatggttcct gttgatttga actctatttt gtacgaaaat 1080

gaggtcatta ttgccgaata cttggagaag gccggtaact cttccgaggc taaacgtttc 1140

gcctctgctg ctaaacagcg ttccgaggcc atgtacaact tgatgtggaa cgctacccac 1200

tggtcttact tcgattacaa tttgacctct aacgctcaga acatctttgt ccctgccgac 1260

gaagacaccg cctccttcga cagatatgct gcccctcctg gtcagcaagt cttgttccac 1320

gtcgctcagc tttacccatt ctggaccgga gctgctcctg ctcatttgaa gtccaaccct 1380

ttggccgttc agaaagccta tgcccgtgtc tctagacgtt tggacaccaa gaagggagct 1440

attgctgcca ccaactatcg tactggtcag cagtgggacc aaccaaacgt ttggcctcca 1500

ttgcagcacg tcttgatgca gggattgttg aacaccccag ctaccttcgg tgagtccgac 1560

ccagcttacc agggagtcca gaaattggct ttgagacttg cccagcgtta cttggattcc 1620

accttctgta cttggtacgc taccggtggt tctacctccg atttcccaca gttgcaaggt 1680

gtttctcctg acgctaccgg tatcatgttc gagaagtacg ccgactccgc tactaacgtt 1740

gctggtggtg gtggtgagta cgaggtcgtc gagggattcg gttggaccaa tggtgtcttg 1800

atctgggccg ctgacgtctt cggtaacaag ttgaagcgtc ctgactgtgg aaacatcact 1860

gctgcccaca ctcactctga ggctaagcgt tctttgggtg acggtggttt ggctagacgt 1920

gctgtcgaac ttgatccatg ggacgccgct tggaccaaaa tgttcggtag atccaagttg 1980

cgtcgtagag aagccgagga tgtccgtaaa agatggctcc ccctaa 2026

Claims

1.一种编码海藻糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的基因。

3.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求2所述的载体；所述细胞为毕赤酵母。

4.权利要求2所述载体或权利要求3所述细胞在发酵生产酒精中的应用。

5.一种生产酒精的方法，其特征在于，在发酵原料中加入权利要求1所述的海藻糖酶；所述发酵原料为玉米。