CN110004130B - 一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。本发明通过筛选获得了如SEQ ID NO.1所示的能够提高热凝胶水解效率的基因，并将其在毕赤酵母中表达，使β‑1,3‑内切葡聚糖酶的酶活由277.8U/mL提高至333.3U/mL，热凝胶的水解效率提高了20％。

Description

一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用

技术领域

本发明涉及一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

热凝胶是一种由β-1,3-糖苷键连接而成的无分支线性葡聚糖，热凝胶低聚糖(热凝胶水解产物β-1,3-葡寡糖)具有益生元活性，目前热凝胶的水解方法主要为酸解法，但水解效率和寡糖得率均较低，且发酵过程难以控制、污染严重。内切β-1,3-葡聚糖酶在裂褶菌、黄蓝状菌、哈茨木霉、毕赤酵母等菌株中均有表达，具体包括，利用哈茨木霉、重组毕赤酵母KM71(启动子为AOX且导入了内切β-1,3-葡聚糖酶)以及重组毕赤酵母GS115(启动子替换成GAP且导入了内切β-1,3-葡聚糖酶)生产内切β-1,3-葡聚糖酶。目前市售β葡聚糖酶中内切β葡聚糖酶含量低，纯度较高的内切β葡聚糖酶制剂价格比较昂贵，增大了寡糖制备成本，内切β-1,3-葡聚糖酶可高效水解热凝胶制备β-1,3-葡寡糖。

毕赤酵母具有细胞生长快、易于培养，蛋白表达完整、重组质粒整合在染色体上，遗传性能稳定、外源基因不易丢失，外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的分离纯化等特点。启动子为AOX的重组毕赤酵母KM71产酶时需要额外加入甲醇诱导，这增加了发酵产酶的不稳定性，且甲醇有毒，对人体有害，而启动子替换成GAP的重组毕赤酵母GS115却不存在以上的问题，但是水解热凝聚的效率有待于进一步提高。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种编码β-1,3-葡聚糖酶的基因，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明的第二个目的是提供所述基因编码的β-1,3-葡聚糖酶。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或含有所述基因的细胞系。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，表达SEQ ID NO,1所示的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

本发明的第五个目的是提供所述基因工程菌在水解热凝胶方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是所述基因工程菌的发酵液加入至含10～20g/L的底物的体系中，在pH5～7，温度30℃～60℃下反应1～3h。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以0.1～0.3U/g底物的添加量向反应体系中加入发酵液。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是以0.15U/g底物的添加量向反应体系中加入发酵液。

本发明还要求保护所述基因或所述基因工程菌在制备含β-1,3-葡寡糖的产品方面的应用。

有益效果：本发明通过在毕赤酵母中表达SEQ ID NO.1所示的基因，使β-1,3-内切葡聚糖酶的酶活由277.8U/mL提高至333.3U/mL，热凝胶的水解效率提高了20％。

具体实施方式

水解效率(总酶活力)的计算方法：每分钟水解热凝胶生成1微克葡寡糖所需的酶量为1酶活单位(U)。

实施例1基因工程菌的构建

步骤1：将携带β-1,3-内切葡聚糖酶基因的JM109大肠杆菌菌株(公开于论文《土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》中)划线接种在LB培养基上37℃过夜培养14h-16h；

步骤2：挑取步骤1中的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜培养14h-16h，提取质粒，送去测序，确保β-1,3-内切葡聚糖酶基因序列的准确性；

步骤3：在TAKARA的Diversify PCR Random Mutagenesis Kit User Manual随机突变试剂盒的作用下，对步骤2中经过测序的β-1,3-内切葡聚糖酶基因进行随机突变；

步骤4：将步骤3中经过随机突变的β-1,3-内切葡聚糖酶基因进行TA克隆，随机选择JM109菌株送去测序，确定达到目的突变率，建立突变库。

步骤5：从步骤4建立的突变库中，随机选择突变的β-1,3-内切葡聚糖酶基因进行37℃过夜培养14h-16h，提取质粒；

步骤6：将实验室保存的含有PPIC9K质粒的JM109菌株过夜培养，提取质粒；

步骤7：将步骤5和步骤6中提取的酶切位点为Not I和EcoR I的T-突变的BGN13.1质粒和PGAP9K-BGN13.1质粒进行双酶切、胶回收、将胶回收的突变BGN13.1和PGAP9K连接、并转化至感受态的大肠杆菌中，然后涂布在含有相应抗性的LB平板上过夜培养，每个平板上长出60-100个单菌落，进行菌落PCR，随机选择5个阳性克隆37℃200rpm培养14h-16h，送去测序，得到符合要求的阳性克隆(BGN13.1是指β-1,3-内切葡聚糖酶基因)；

步骤8：提取步骤7中符合要求的阳性克隆的质粒，保存在-20℃；

步骤9：将实验室保存的空载GS115酵母菌接种在YPD培养基，活化，制备感受态空载GS115酵母菌；

步骤10：用Sal I酶将步骤8中提取的质粒线性化，并用TAKARA购买的MiniBESTDNA Fragment Purification Kit试剂盒纯化；

步骤11：将步骤10中的线性化质粒电转入步骤9中感受态GS115中，涂布在MD平板；步骤12：随机挑取步骤11长出的菌落，点种在G418平板上,筛选髙拷贝，通过摇瓶发酵进行分析，筛选酶活教导的重组菌，获得表达SEQ ID NO.1所示序列的阳性克隆。

实施例2 β-1,3-内切葡聚糖酶的发酵

将实施例1构建的表达SEQ ID NO.1的重组毕赤酵母在含有BMGY培养基的摇瓶，30℃，200rpm发酵72h；

按照实施例1的相同策略构建表达SEQ ID NO.2所示基因的重组毕赤酵母作为对照，在上述相同条件下发酵相同时间。

将发酵液离心，取上清，配制水解体系：向浓度为2％的底物热凝胶中加入pH5.50.025mol/L的醋酸钠缓冲液，和添加量为0.15U/g热凝胶的实施例2制备的β-1,3-内切葡聚糖酶，水解体系中热凝胶、醋酸钠缓冲液及β-1,3-内切葡聚糖酶的体积比为3:5:2，在50℃温度下反应2.5h时间，用生物传感仪器和TLC薄层色谱分别测它们水解液中葡萄糖含量和总糖含量(检测方法公开于论文《薄层层析-图像分析定量热凝胶β-1,3-葡寡糖》中)，结果显示，测得总糖含量10.634g/L，葡萄糖含量为0.634g/L，则β-1,3-葡寡糖的含量为10g/L。经计算，水解效率为333.3U/ml。以按实施例1的策略表达SEQ ID NO.2所示基因的重组菌为对照，与对照的水解效率(277.8U/mL)相比，水解效率提高了20％。

表1表达不同基因的重组菌的水解效率

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种提高热凝胶水解效率的基因工程菌及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2459

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggtccgatg aattaagaac tcggtacgcg cggatcttcc agagattctg aagcttacgc 60

agaattcttg ctgtcgtgtt gatcattgac cggcatcatg ttgaagttga ctgctttggt 120

tgcgttgttg ttgggggcag cttctgctac tccaacacct tccccacctg cttctgatga 180

aggaatcact aaaagagcta cttcttttta ctaccctaac atggatcatg ttaatgcacc 240

aagaggattt gctcctgact tagatggtga ctttatctac ccaatctatc aaactgttaa 300

cgctggagat ggtaatgctt tgcaaaacgc tatcactact gatggaaaag gtggtagtag 360

acacccacaa tggttcgctt cacagcctag agttgtgtat atccctccag gtacctacac 420

tatttctaag actcttagat tcgatactga tactatttta atgggagatc ctactagtcc 480

accaattatc aaggcagctg ccggtctttc cggtgaccaa acactaattt ctgctcaaga 540

tcctagtact aatgaaaagg gtgaattgtc ttttgcagtt gctattaaga acgttgtttt 600

gggtactact gccattccag gtggtaactc cttcactgct ttgtggtggg gtgttgccca 660

agctgctcac cttcaaaacg ttaggattac tatgtcttcc tcttccggtg gtaacggtca 720

tacaagtatt agaatgggaa gaggttctac tctgggactg gctggtgtta gagttggagg 780

aggtcaaaac ggaatttgga tcgacggtca ccagcaagcc tcctttcaca acatctactt 840

ctttcaagac acaatcggag tgttgatctc ttctggtacc actttttcga ttttctcttc 900

aactttcgac acttgtggaa cagctttccc aactctggcc ggttctcctt ggattgcatt 960

gattgatgct aagtcaatca actctggagt tacttttacc actaaccagt ttccatcatt 1020

catgattgaa aacttgacta aggacaatgg aaccccagtc gttgttgcca gaggtagtac 1080

cttggttggt gcttcatctc acgttaacac ctactcttac ggtaacactg ttggtaggaa 1140

cccaacctac ggagacgtta cttcatctaa ctctagacca tccgctttgg ctccaggagg 1200

tagataccct tacgttgctc caccaacata tggagatttg cctatttcat ctttctcgaa 1260

cgctaaagat ccagcccaaa acggaaaccg acaagttaaa ggtgacaaca ctattaatga 1320

ggccgacact cttaacgctg tttcggaact ggccgcttct caaaacaaag tcgcttattt 1380

cccattcgga aagtatagag ttgattccac tttgttcatt cctaaaggtt cgagaattgt 1440

tggagaggca tgggctacta ttacaggtaa cggtaatttc tttaaaaatg aaaactctcc 1500

acaaccagtt gtctctgtcg gaagagctgg agatgttgga attgctcaac ttcaggattt 1560

gagggttact actaacgacg ttctaccagg tgctattctt gatcaattca acatggctgg 1620

taatcatcca ggtgacgttg ctctatggaa ctctttggtc acagttggtg gaaccagagg 1680

tgctcaagct ttggccaacg cttgtactaa caattctaat gagtgtaagg gagctttcat 1740

tggtatccat gttgctaagg ggtcatcccc ttacattcaa aatgtttggg aattgggttt 1800

gagagatcat gttgctgaaa acttttctgg tggtacttcc catagaagag aaagatggta 1860

ctttggtcct ataagaagaa acgctacttg ttcgtaccct atcggtagtg gacattggtg 1920

gttgtaccaa ttgaacctac ataacgctgc taatgttgtt gtttccttgt tgcaagctga 1980

gactaattac catcaaggag ctaatactca acaaattcca cctgcacctt gggttgctaa 2040

tgtcggtact tggggagacc ctgatttttc ttggtgtaat ggtggcgatg aacgttgtag 2100

aatgggtcct gctagcttta tcaatggtgg ttctaacttc tacacttacg catccgctgc 2160

ttgggctttc ttcagtggtc ctggacaagg ttgtgctcag tttgagtgtc aacaaactat 2220

ccattggatt gcttccactc catctaactt gcaagctttt ggtttgtgca gtaaggatct 2280

gttaacactt tgagattggg tgacggtact ttcatcaaca ctcaaaacgg ctacactggt 2340

ggttggactc ctggtggtgg agatgttgct agatatacta cttaagcggc cgcgaattaa 2400

ttcgccaatc gtcgaacggc aggcgtgcaa acttggcgta atcatgtcat gttcttcca 2459

<210> 2

<211> 2340

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccggaattct tgctgtcgtg ttgatcattg accggcatca tgttgaagtt gactgctttg 60

gttgcattgt tgttgggtgc agcttctgct actccaacac cttccccacc agcttctgat 120

gaaggaatca ctaaaagagc tacttctttt tactacccta acatggatca tgttaatgca 180

ccaagaggat ttgctcctga cttagatggt gactttaact acccaatcta tcaaactgtt 240

aacgctggag atggtaatgc tttgcaaaac gctatcacta ctgatggaaa aggtggtagt 300

agacacccac aatggttcgc ttcacagcct agagttgtgt atatccctcc aggtacctac 360

actatttcta agactcttag attcaatact gatactattt taatgggaga tcctactaat 420

ccaccaatta tcaaggcagc tgctggtttt tcaggtgacc aaacactaat ttctgctcaa 480

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catacaggta ttagaatggg aagaggttct actctgggac tggctgatgt tagagttgaa 720

agaggtcaaa acggaatttg gattgacggt caccagcaag cctcctttca caacatctac 780

ttctttcaaa acacaatcgg aatgttgatc tcttctggta atactttttc gattttctct 840

tcaactttcg acacttgtgg aactgctttc ccaactctgg ccggttctcc ttggattgca 900

ttgattgatg ctaagtcaat caactctgga gttactttta ccactaacca gtttccatca 960

ttcatgattg aaaacttgac taaggacaat ggaaccccag tcgttgttgt cagaggtagt 1020

accttggttg gtgcttcatc tcatgttaac acctactctt acggtaacac tgttggtaga 1080

aacccaacct acggagacgt tacttcatct aacactagac catccgcttt ggctccagga 1140

ggtagatacc cttacgttgc tccaccaaca tatggagatt tgcctatttc atctttcttg 1200

aacgttaaag atccagccca aaacggaaac cgacaagtta aaggtgacaa cactattaat 1260

gaggccgaca ctcttaacgc tattttggaa ctggccgctt ctcaaaacaa agtcgcttat 1320

ttcccattcg gaaagtatag agttgattcc actttgttca ttcctaaagg ttcgagaatt 1380

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tggttgtacc aattgaacct acataacgct gctaatgttg ttgtttcttt gttgcaagct 1920

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tctgttaaca ctttgagatt gggtgacggt actttcatca acactcaaaa cggttacact 2280

ggtggttgga ctcctggtgg tggagatgtt gctagatata ctacttaatt gcggccgcaa 2340

Claims (10)

1.一种编码β-1,3-葡聚糖酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的β-1,3-葡聚糖酶。

3.携带权利要求1所述基因的载体或含有权利要求1所述基因的细胞系。

4.一种基因工程菌，其特征在于，表达SEQ ID NO. 1所示的基因。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以毕赤酵母为宿主。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母是毕赤酵母GS115。

7.权利要求4～6任一所述的基因工程菌在水解热凝胶方面的应用。

8.一种水解热凝胶的方法，其特征在于，将权利要求4～6任一所述基因工程菌的发酵液加入至含10～20g/L的底物的体系中，在pH5～7，温度30℃～60℃下反应1～3h。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵液是在含有BMGY的培养基的中，于28～30℃，发酵60～72h后，离心并收集上清获得。

10.权利要求1所述的基因或权利要求4～6任一所述基因工程菌在制备含β-1,3-葡寡糖的产品方面的应用。