CN107475140B

CN107475140B - 一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体

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Publication number: CN107475140B
Application number: CN201710825655.6A
Authority: CN
Inventors: 德青美朵; 朱新文; 解修兵; 毛岸; 沈微; 陈献忠; 樊游
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2020-02-14
Anticipated expiration: 2037-09-14
Also published as: CN107475140A

Abstract

一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，属于微生物、酶工程技术领域。本发明获得了一种密码子优化的普鲁兰酶编码基因，并构建了一株高表达上述基因的重组菌巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK‑BdP5 W133。通过对上述重组菌的诱变筛选到一株在pH4.0条件下发酵水平提高的突变株WB138。该突变株在pH4.0条件下，在5 L发酵罐上发酵时间缩短24h，发酵酶活一般可以达到1100 U/mL以上。该菌株在普鲁兰酶发酵生产中有减少发酵过程染菌损失的可能。

Description

一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体

技术领域

本发明涉及采用基因工程手段并结合诱变筛选获得的一株高产普鲁兰酶的重组菌突变体及其应用，属于微生物、酶工程技术领域。

背景技术

来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶具有很高的耐酸性，在淀粉糖生产的糖化工艺中有广泛的应用。本课题组在前期工作中根据Svendsen A等公开的来源于Bacillus deramificans的一株普鲁兰酶突变体的氨基酸序列（世界专利 WO 0151620，2001年, 美国国家生物技术信息中心www.ncbi.nlm.nih.gov登陆号：AX203845）按照巴斯德毕赤酵母的密码子偏好性合成了一种上述普鲁兰酶的编码基因BdP4，并构建了一株高表达上述基因的重组巴斯德毕赤酵母WB54，实现了BdP4的高效表达，重组酶表现出优良的应用性能（王兵波, 沈微, 钱灵紫等. 一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达. 食品与发酵工业, 2016, 42(7): 9-15）。在微生物发酵过程中，发酵液污染杂菌是导致发酵失败的重要原因。一般来讲，具有耐酸性的菌种进行发酵时较少发生染菌的问题，如果发生染菌也可以通过降低pH值的方法抑制杂菌的生长使发酵过程得以维持，这可以在一定程度上减少杂菌污染导致的损失。例如目前工业上常用的生产糖化酶的黑曲霉，其发酵液一般控制在pH4.5左右，所以很少发生染菌的问题，一旦发生杂菌污染则可以将pH降低到4.0左右，很多情况下这可以使发酵继续维持到发酵终点。重组菌WB54的最适pH在5.0-5.5，在pH4.0条件下发酵速度较慢。根据本课题组的经验，由于毕赤酵母发酵时间较长，发生染菌的概率较高，如果能获得一种能适应pH4.0的酸性环境的重组菌，则酶的发酵过程中发生染菌的概率将会极大的降低。本发明对BdP4的密码子进行进一步优化，获得了另一种利于高表达的普鲁兰酶编码基因BdP5，构建了高表达基因BdP5的重组巴斯德毕赤酵母，进一步通过诱变获得一株在pH4.0条件下发酵时间缩短的突变株WB138。本发明公开上述密码子优化的BdP5基因的全序列以及获得突变株WB138的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，该突变体在酸性条件下有较高的发酵水平和较快的发酵速度，有利于减少普鲁兰酶发酵过程发生染菌的可能性。

本发明的技术方案：一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，其分类命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138（Pichi pastoris GS115/pPICK-BdP5 WB138），已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M 2015693。

所述巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138，表达一种氨基酸序列为SEQ IDNO:2的重组普鲁兰酶。

所述巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138，表达一种普鲁兰酶，普鲁兰酶基因BdP5的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。

所述巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138的应用，其在pH4.0的条件下具有较高的发酵速度，在普鲁兰酶生产中有降低发酵过程染菌损失的可能性。

上述在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体GS115/pPICK-BdP5 WB138主要通过以下途径获得。

1．构建高表达普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母

对一株耐酸性的普鲁兰酶编码基因BdP4（王兵波, 沈微, 钱灵紫等. 一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达. 食品与发酵工业, 2016, 42(7): 9-15）进行密码子优化，优化后的基因命名为BdP5。基因BdP5核苷酸的序列为SEQ IDNO: 1，其编码的蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO: 2，该氨基酸序列与基因BdP4编码的氨基酸序列完全一致。BdP5基因设计完成后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成该基因。所合成的基因与巴斯德毕赤酵母表达载体pPICK连接，获得重组质粒，该重组质粒中由于切除了质粒pPICK的α-因子编码区，因此将重组质粒命名为pPICK-BdP5。重组质粒pPICK-BdP5，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，获得大量转化子。筛选获得产普鲁兰酶水平较高的菌株133，该菌株命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133，简称W133。在5 L发酵罐上，重组菌W133在pH5.5的条件下发酵酶活最高达到1200 U/mL以上，发酵诱导时间为112h，在pH 4的条件下发酵水平大约为1100 U/mL，达到最高酶活所需的发酵诱导时间长达144h。可见菌株W133在pH 4的酸性条件下发酵酶活明显下降同时发酵时间延长32 h。

2．耐酸性突变株的筛选

用亚硝基胍对重组菌巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133进行诱变。诱变后的菌液转入 pH3.5的以甘油为唯一碳源的液体筛选培养基中，30℃震荡培养48h，以富集耐酸性突变体。上述培养液取5 mL转入80 mL pH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h，再取5 mL转入80 mL pH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h。上述为第一轮诱变富集。

将上述第一轮诱变富集得到的菌液再次用亚硝基胍诱变，诱变后的菌液转入pH3.5的以甘油为唯一碳源的液体筛选培养基中按上面的方法进行耐酸性突变株的富集。上述为第二轮诱变富集。共计进行6轮诱变富集。第六轮富集后，在以甘油为唯一碳源的固体上挑选在48h培养后，形成相对较大菌落的菌株。最终一共筛选得到约80个形成较大菌落的菌株。将上述80个菌株编号保藏，再分别进行5 L发酵罐发酵，发酵pH均控制在4.0。经发酵筛选发现其中一株编号为138的菌株，在120h达到的酶活最高，为1184 U/mL，该菌株被初步选定为酸性条件下发酵性能明显改善的菌株，命名为巴斯德毕赤酵母 GS115/pPICK-BdP5 WB138，简称WB138。

3 耐酸性突变株WB138发酵性能分析

将诱变前的菌株巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133和诱变后筛选得到的菌株巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138分别进行5 L发酵罐发酵，在相同条件下进行多次试验。结果显示，突变株WB138达到最高发酵酶活的时间为诱导120h，发酵平均最高酶活为1180 U/mL。出发菌W133达到最高酶活所需的诱导的时间为144h，发酵平均酶活为1100.6 U/mL，在诱导120h时酶活为960 U/mL。可见在pH 4.0条件下，突变株WB138的发酵时间明显缩短而发酵酶活有所提高。

上述高产普鲁兰酶的重组菌巴斯德毕赤酵母突变体WB138，分类命名为巴斯德毕赤酵母 GS115/pPICK-BdP5 WB138，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：CCTCC M 2015693。

重组菌巴斯德毕赤酵母突变体WB138的应用

重组菌巴斯德毕赤酵母突变体WB138在pH4.0的条件下具有较高的发酵速度，在普鲁兰酶生产中有降低发酵过程染菌损失的可能性。

材料和方法

普通分子生物学方法：

除非提及，DNA操作和转化按照标准的分子生物学方法进行 (Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

除非另外提及，PCR操作使用标准方法和PCR反应数据进行，可参见 (Sambrook等1989分子克隆实验手册)。

DNA操作所使用的酶根据供应商的说明等使用。

引物均为本专利发明人设计并由上海生工生物工程有限公司合成。

DNA操作使用的酶和试剂盒

除非另外提及，所有DNA操作使用的酶，例如限制性内切酶，连接酶等均为大连宝生物工程有限公司产品。PCR反应使用的DNA 聚合酶为大连宝生物工程有限公司产品Ex Taq，产品编号为DRR006A。所有DNA操作使用的酶在反应时所使用的缓冲液均为购买酶时附赠，缓冲液浓度均为反应所需浓度的10倍。柱式DNA片段回收试剂盒以及从电泳凝胶中回收DNA片段的试剂盒均为大连宝生物工程有限公司产品，产品编号分别为DV807A和DV805A。酵母氮基（YNB）为Difco公司无氨基酸酵母氮基（货号291920），该产品不含碳源和氨基酸，但含有硫酸铵。

培养基、缓冲液以及实验中使用的微生物菌株及质粒，除非有特别说明，本专利所使用的培养基、缓冲液以及微生物菌株及质粒等均与文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号:201610306855.6]一致。

筛选培养基：酵母氮基（YNB）0.3%, 生物素0.01%，甘油2%。用HCl或NaOH调整至所需pH。制作固体培养基时使用的凝固剂为0.8%的琼脂糖。

方法1 普鲁兰酶酶活测定

同文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号: 201610306855.6]，中的方法[1]

方法2 巴斯德毕赤酵母感受态细胞的制备与转化

同文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号: 201610306855.6]中的方法[2]

方法3 重组巴斯德毕赤酵母的摇瓶诱导表达

同文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号: 201610306855.6]中的方法3

方法4 毕赤酵母细胞破碎

同文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号: 201610306855.6]中的方法4

方法5 重组巴斯德毕赤酵母发酵罐发酵

首先进行种子培养

挑取单菌落接种20 mL YPD培养基，30℃、200 r/min培养36 h后，转接1 mL 到20mL YPG培养基中继续培养12 h，转接5 mL到100 mL YPG培养基中继续培养12 h。

将上述培养得到的种子液按10%接种量接入装有2.4 L BSM培养基的5 L全自动发酵罐中，用50%氨水控制pH稳定在4.0，温度30℃，搅拌转速和通气量分别为800 r/min和2V/v.m。培养至19 h左右，菌体增长即将进入稳定期时开始流加补料生长培养基。当菌体干重达到70 g/L（实际操作时按OD600=290控制），停止补料。待甘油耗尽，继续保持基质匮乏状态约1 h，控制指标为当DO>60%时，开始流加补料诱导培养基，流加速率为6.0 mL/h以溶氧作为反馈指标，将溶氧控制在25%，间隔12 h取样。所使用发酵罐为上海百伦生物科技有限公司产品BLBIO-5GJ。

方法6 菌体干重的测定

同文献[沈微, 王冰波, 朱金寸等. 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株. 专利号: 201610306855.6]中的方法10。

生物材料样品保藏：一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体，其分类命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138（Pichi pastoris GS115/pPICK-BdP5 WB138），已保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M 2015693，保藏时间为2016年11月23日。

附图说明

图1 WB138发酵进程。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1 密码子优化的普鲁兰酶基因BdP5的获得与表达

在本课题组前期工作中，王冰波等对普鲁兰酶基因BdP的核苷酸序列进行了优化，获得普鲁兰酶编码基因BdP4并在巴斯德毕赤酵母中实现了高效表达（王兵波, 沈微, 钱灵紫等. 一种密码子优化的酸性普鲁兰酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达. 食品与发酵工业, 2016, 42(7): 9-15）。以此为依据，本专利对上述BdP4基因的密码子进一步进行优化，获得基因BdP5。基因BdP5的序列列为SEQ ID NO: 1，其编码的氨基酸序列列为SEQ IDNO: 2，该氨基酸序列与基因BdP4编码的氨基酸序列完全一致，该蛋白命名为PBdP5。BdP5基因设计完成后由上海生工生物工程技术服务有限公司合成该基因。所合成的基因被克隆在重组质粒pUK-BdP5上。所合成基因的5’端增加了便于克隆和表达的序列，序列为：AGATCTCAAA CGATG。其中ATG为普鲁兰酶编码区的翻译起始密码子，AGATCT为核酸内切酶BglII的识别位点。所列SEQ ID NO: 1除基因编码区从翻译起始密码子ATG到终止子TAA的序列之外也包括ATG之前的12个碱基。由于BdP5基因的长度约2.8 kb，与载体pUK接近，为便于基因的回收，在操作时用ApaLI、BglII和AvrI三个核酸内切酶酶切载体pUK-BdP5。其中ApaLI用于将载体pUK切成三个片段。酶切后回收其中约2.8 kb的普鲁兰酶编码基因BdP5。上述片段回收纯化后与经BamHI和AvrI酶切并经纯化的载体pPICK连接，其中，BamHI和BglII是同尾酶，因此可以完成连接，连接完成后连接处的BamHI和BglII识别位点均消失。连接物转化大肠杆菌JM109，转化物涂布含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板，培养16h后任选4个转化子提取质粒，用引物Pa（5’-caaaaaacaa ctaattattc-3’）和Pt（5’-gaggaacagtcatgtctaag-3’）进行PCR鉴定。引物Pa与载体pPICK的BamHI识别位点前的25-5个碱基序列一致，Pt与质粒pPICK的AvrI识别位点后的21-40个碱基序列互补，当模版为pPICK的空质粒时，PCR产物应该是0.3 kb左右的片段（包含未切除的α-因子编码区），当模版是插入了BdP5基因的重组质粒时，PCR产物为2.8 kb左右的片段，电泳结果显示以上述4个质粒为模版进行PCR后，其中3#质粒的PCR产物是2.8 kb符合重组质粒应有特征。将上述3#质粒进行测序，测序结果也显示，该重组质粒确实是在pPICK的BamHI和AvrI之间插入了BdP5后得到的重组质粒，其中的BdP5基因的编码区序列与SEQ ID NO: 1的编码区序列完全一致。在载体pPICK中，在BamHI和AvrI位点之间有一段酵母α-因子的编码区，用于引导重组蛋白在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达。本发明在进行重组蛋白表达时将所表达的基因在BamHI和AvrI之间插入，实际上已经将α-因子的编码区切除，同时所合成的普鲁兰酶基因也只含有成熟肽编码区，因此所进行的表达是酵母细胞内表达，所表达的蛋白理论上只存在于细胞内，不能分泌到培养液中。由于上述重组质粒中，pPICK的α-因子已经被切除，为标明重组质粒中原质粒部分发生的变化，将上述重组质粒命名为pPICK-BdP5。

大量提取重组质粒pPICK-BdP5，使用BglII酶切线性化，使用柱式DNA片段纯化试剂盒纯化酶切产物。按材料方法中方法2介绍的方法转化毕赤酵母GS115感受态细胞。进行多次转化获得约2000个以上的转化子，全部挑取并点种至含3 mg/mL G418的MD-G418培养基平板，30℃培养48h，共计获得171个可以在MD-G418培养基上生长并形成菌落的转化子。这些转化子理论上是很可能含有高拷贝普鲁兰酶表达单元的转化子。将上述171个转化子划线分离后挑取单菌落接种于BMGY培养液中，按材料方法中方法3进行诱导表达。诱导120小时后分别取样，离心收集细胞，用与发酵液同样体积的pH 4.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液悬浮细胞，细胞悬液按材料方法中方法4进行细胞破碎，破碎液进行酶活检测。酶活检测结果显示，171株转化子中，有33株检测不到明显的普鲁兰酶酶活，其中一株编号为133的菌株发酵水平最高，在发酵120小时后达到最高酶活104 U/mL，该菌株被命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133，简称W133。同样条件下，用pPICK空质粒转化巴斯德毕赤酵母GS115得到的重组菌完全检测不到酶活。

实施例2：巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133发酵性能初步分析

本课题组在5 L发酵罐上对重组菌W133的发酵性能进行了初步分析，其中pH对发酵过程的影响见表1。

表1 发酵液pH对发酵产酶的影响

由表1可见，在所设定条件下，当发酵培养基pH控制在5.0-5.5范围内时酶活和发酵时间基本不变。当pH在4时发酵酶活明显下降同时发酵时间延长32 h。

实施例3：耐酸性突变株的筛选

用亚硝基胍对重组菌巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133进行诱变。诱变方法如下：W133单菌落接种液体YPD培养基，培养24h，达到对数生长期时，取10 mL菌体，离心，弃上清，用等体积的2 mmol/L的pH 6.0的磷酸缓冲液悬浮菌体，加入用磷酸缓冲液预先溶解的亚硝基胍2 mg，30℃震荡培养2h。离心，弃上清，再用磷酸缓冲液悬浮菌体，菌体转入80mL YPD液体培养基中，30℃震荡培养4h。取5 mL菌液离心收集菌体，用5 mL生理盐水悬浮菌体，转入80 mL pH3.5的以甘油为唯一碳源的液体筛选培养基中，30℃震荡培养48h，以富集耐酸性突变体。上述培养液取5 mL转入80 mL pH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h，再取5 mL转入80 mL pH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h。上述为第一轮诱变富集。

将上述第一轮诱变富集得到的菌液取10 mL，离心，弃上清，用等体积的2 mmol/L的pH 6.0的磷酸缓冲液悬浮菌体，加入用磷酸缓冲液预先溶解的亚硝基胍2 mg，30℃震荡培养2h。离心，弃上清，再用磷酸缓冲液悬浮菌体，菌体转入80 mL YPD液体培养基中，30℃震荡培养4h。取5 mL菌液离心收集菌体，用5 mL生理盐水悬浮菌体，转入80 mL pH3.5的以甘油为唯一碳源的液体筛选培养基中，30℃震荡培养48h，以富集耐酸性突变体。上述培养液取5 mL转入80 mL pH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h，再取5 mL转入80 mLpH3.5的液体筛选培养基中30℃震荡培养48h。上述为第二轮诱变富集。

共计进行6轮诱变富集。第六轮富集后，取菌液适当稀释后涂布以甘油为唯一碳源的固体筛选培养基。培养48h后，取其中菌落较大的2000个菌落，用生理盐水适当稀释后再次涂布固体筛选培养基，观察第二次涂布得到的平板上的菌落，菌落普遍较大的选作进一步筛选的菌株，一共筛选得到约80个菌株。将上述80个菌株编号保藏，再分别进行5 L发酵罐发酵，发酵pH均控制在4.0。第一轮发酵筛选得到6株在120h发酵酶活明显提高的菌株，将上述6株菌分别进行三次平行发酵，进一步进行发酵性能分析。6株菌三次发酵在120h达到的酶活的平均值如表2所示。

表2 6株突变体发酵性能

由表2可见，其中编号为138的菌株，在120h达到的酶活最高，为1184 U/mL，该菌株被初步选定为酸性条件下发酵性能明显改善的菌株，命名为巴斯德毕赤酵母 GS115/pPICK-BdP5 WB138，简称WB138。

实施例4：WB138发酵性能分析

将诱变前的菌株巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 W133和诱变后筛选得到的菌株巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138分别进行5 L发酵罐发酵，发酵pH控制在4.0，在相同条件下进行多次试验。结果显示，突变株WB138达到最高发酵酶活的时间为诱导120h，发酵平均最高酶活为1180 U/mL。出发菌W133达到最高酶活所需的诱导的时间为144h，发酵平均酶活为1100.6 U/mL，在诱导120h时酶活为960 U/mL。可见在pH 4.0条件下，突变株WB138的发酵时间明显缩短而发酵酶活有所提高。图1 是在pH4.0 条件下，WB138某一次发酵的进程曲线。

由图1可见，WB138在诱导120h后，酶活达到最高为1121 U/mL，酶活最高时菌体量大约为细胞干重137 g/L。进行多次试验，结果显示发酵酶活均在1100 U/mL左右，所需发酵诱导时间不超过120 h。高产普鲁兰酶的重组菌巴斯德毕赤酵母突变体WB138，分类命名为巴斯德毕赤酵母 GS115/pPICK-BdP5 WB138已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：CCTCC M 2015693。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一株在酸性条件下发酵速度提高的高产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变体

<140> 2017108256556

<141> 2017-09-14

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 2808

<212> DNA

<213> 普鲁兰酶基因BdP5(pullulanase encoding gene BdP5)

<400> 2

agatctcaaa cgatggacgg taacactacc actatcattg ttcactactt cagaccagct 60

ggtgactacc aaccttggtc tttgtggatg tggcctaagg atggtggagg tgctgaatac 120

gacttcaacc aaccagctga ctccttcggt gctgttgctt ctgctgacat tccaggtaac 180

ccttctcaag ttggtatcat tgtcagaact caagactgga ccaaggatgt ctccgctgac 240

agatacattg acttgtccaa gggtaacgag gtctggttgg ttgaaggtaa ctctcaaatc 300

ttctacaacg agaaggatgc tgaagacgct gccaaaccag ctgtcagcaa cgcctacttg 360

gacgcttcca accaagttct ggtcaagttg tctcaaccat tgaccctcgg tgagggagcc 420

tccggtttca ctgttcacga tgacactgct aacaaggaca ttccagtcac ctctgttaag 480

gatgcctcct tgggtcaaga cgttactgct gtcttggctg gtaccttcca gcacatcttt 540

ggtggatctg actgggctcc tgacaaccac tccaccttgc ttaagaaagt tactaacaat 600

ttgtaccaat tctctggtga cttgccagaa ggtaactacc agtacaaggt tgctttgaac 660

gactcctgga acaatccatc ctacccttct gacaacatca acttgactgt tccagctgga 720

ggtgcccatg tcaccttctc ctacattcca tccactcacg ctgtctacga cactatcaac 780

aatcctaacg ctgacttgca agttgagtct ggtgttaaga ctgatctggt cacagttacc 840

cttggtgaag acccagatgt ctctcacacc ttgtccattc agactgacgg ttaccaagcc 900

aagcaagtca ttccacgtaa cgtattgaac tcctctcaat actactactc tggagatgac 960

ttgggtaaca cctacactca aaaggccact acattcaagg tttgggctcc tacctccact 1020

caagtcaacg ttctgttgta cgactctgcc actggttcgg tcaccaagat tgttccaatg 1080

actgcttctg gtcacggtgt ctgggaggct acagttaacc aaaacttgga aaactggtac 1140

tacatgtacg aggttactgg tcaaggatcc accagaactg ctgttgaccc ttacgccaca 1200

gctatcgcac caaacggtac cagaggaatg attgttgact tggccaagac tgatccagct 1260

ggttggaact ccgacaagca catcactcct aagaacattg aagacgaggt tatctacgaa 1320

atggacgtca gagacttctc cattgatcca aactctggta tgaagaacaa aggtaagtac 1380

ttggccttaa ccgagaaagg taccaaggga cctgacaacg tcaagactgg tattgactcc 1440

ttgaagcaac ttggtatcac tcacgttcag ttgatgccag tcttcgccag taactctgtt 1500

gacgaaaccg atccaactca agacaactgg ggttacgatc ctcgtaacta cgacgttcca 1560

gagggtcagt acgctaccaa cgccaatggt aacgctagaa tcaaggagtt caaagagatg 1620

gtcttgtctc tccacagaga acacattggt gttaacatgg acgtcgttta caaccacacc 1680

ttcgccactc aaatctccga cttcgacaag attgttccag agtactacta cagaactgac 1740

gatgctggta actacaccaa cggatctggt actggcaacg aaatcgctgc agagagacct 1800

atggttcaga agttcatcat tgactccttg aagtactggg tcaacgaata ccacattgac 1860

ggtttcagat tcgacttgat ggctctgctt ggtaaggaca ccatgtccaa agctgcctct 1920

gagttgcacg ctatcaaccc aggtatcgcc ttgtacggtg aaccttggac tggaggtacc 1980

tctgccttgc ctgatgacca acttctgacc aagggtgctc agaaaggtat gggagttgct 2040

gtcttcaatg acaacttgcg taacgctcta gatggtaacg tcttcgacag ttctgctcaa 2100

ggtttcgcca ctggtgctac tggtttgact gatgccatca agaacggtgt tgagggatcc 2160

attaacgact tcacctccag tccaggtgaa accatcaact acgtcacgtc tcacgacaac 2220

tacaccttgt gggacaagat tgccctctcc aaccctaacg actccgaggc tgatagaatc 2280

aagatggacg aattggctca agcagttgtc atgacctctc aaggagttcc cttcatgcaa 2340

ggtggtgagg aaatgttgag aaccaagggt ggcaatgaca actcctacaa cgctggtgat 2400

gccgtcaacg agttcgactg gtccagaaag gctcagtacc cagacgtctt caactactac 2460

tctggtttga ttcaccttag actggaccat ccagccttca gaatgaccac agctaacgaa 2520

atcaactccc acttgcagtt ccttaactct ccagagaaca ctgttgctta cgaattgact 2580

gatcacgtca acaaggacaa gtggggtaac atcattgttg tctacaaccc taacaagact 2640

gttgctacca ttaacttgcc atctggtaag tgggccatca atgctacctc tggtaaggtt 2700

ggagagtcca cgttgggtca agccgaagga tccgttcaag ttcctggtat ttccatgatg 2760

atcttgcacc aagaggtctc tccagaccac ggtaagaaat aacctagg 2808

<210> 2

<211> 929

<212> PRT

<213> 普鲁兰酶PBdP5(pullulanase PBdP5)

<400> 2

Met Asp Gly Asn Thr Thr Thr Ile Ile Val His Tyr Phe Arg Pro Ala

1 5 10 15

Gly Asp Tyr Gln Pro Trp Ser Leu Trp Met Trp Pro Lys Asp Gly Gly

20 25 30

Gly Ala Glu Tyr Asp Phe Asn Gln Pro Ala Asp Ser Phe Gly Ala Val

35 40 45

Ala Ser Ala Asp Ile Pro Gly Asn Pro Ser Gln Val Gly Ile Ile Val

50 55 60

Arg Thr Gln Asp Trp Thr Lys Asp Val Ser Ala Asp Arg Tyr Ile Asp

65 70 75 80

Leu Ser Lys Gly Asn Glu Val Trp Leu Val Glu Gly Asn Ser Gln Ile

85 90 95

Phe Tyr Asn Glu Lys Asp Ala Glu Asp Ala Ala Lys Pro Ala Val Ser

100 105 110

Asn Ala Tyr Leu Asp Ala Ser Asn Gln Val Leu Val Lys Leu Ser Gln

115 120 125

Pro Leu Thr Leu Gly Glu Gly Ala Ser Gly Phe Thr Val His Asp Asp

130 135 140

Thr Ala Asn Lys Asp Ile Pro Val Thr Ser Val Lys Asp Ala Ser Leu

145 150 155 160

Gly Gln Asp Val Thr Ala Val Leu Ala Gly Thr Phe Gln His Ile Phe

165 170 175

Gly Gly Ser Asp Trp Ala Pro Asp Asn His Ser Thr Leu Leu Lys Lys

180 185 190

Val Thr Asn Asn Leu Tyr Gln Phe Ser Gly Asp Leu Pro Glu Gly Asn

195 200 205

Tyr Gln Tyr Lys Val Ala Leu Asn Asp Ser Trp Asn Asn Pro Ser Tyr

210 215 220

Pro Ser Asp Asn Ile Asn Leu Thr Val Pro Ala Gly Gly Ala His Val

225 230 235 240

Thr Phe Ser Tyr Ile Pro Ser Thr His Ala Val Tyr Asp Thr Ile Asn

245 250 255

Asn Pro Asn Ala Asp Leu Gln Val Glu Ser Gly Val Lys Thr Asp Leu

260 265 270

Val Thr Val Thr Leu Gly Glu Asp Pro Asp Val Ser His Thr Leu Ser

275 280 285

Ile Gln Thr Asp Gly Tyr Gln Ala Lys Gln Val Ile Pro Arg Asn Val

290 295 300

Leu Asn Ser Ser Gln Tyr Tyr Tyr Ser Gly Asp Asp Leu Gly Asn Thr

305 310 315 320

Tyr Thr Gln Lys Ala Thr Thr Phe Lys Val Trp Ala Pro Thr Ser Thr

325 330 335

Gln Val Asn Val Leu Leu Tyr Asp Ser Ala Thr Gly Ser Val Thr Lys

340 345 350

Ile Val Pro Met Thr Ala Ser Gly His Gly Val Trp Glu Ala Thr Val

355 360 365

Asn Gln Asn Leu Glu Asn Trp Tyr Tyr Met Tyr Glu Val Thr Gly Gln

370 375 380

Gly Ser Thr Arg Thr Ala Val Asp Pro Tyr Ala Thr Ala Ile Ala Pro

385 390 395 400

Asn Gly Thr Arg Gly Met Ile Val Asp Leu Ala Lys Thr Asp Pro Ala

405 410 415

Gly Trp Asn Ser Asp Lys His Ile Thr Pro Lys Asn Ile Glu Asp Glu

420 425 430

Val Ile Tyr Glu Met Asp Val Arg Asp Phe Ser Ile Asp Pro Asn Ser

435 440 445

Gly Met Lys Asn Lys Gly Lys Tyr Leu Ala Leu Thr Glu Lys Gly Thr

450 455 460

Lys Gly Pro Asp Asn Val Lys Thr Gly Ile Asp Ser Leu Lys Gln Leu

465 470 475 480

Gly Ile Thr His Val Gln Leu Met Pro Val Phe Ala Ser Asn Ser Val

485 490 495

Asp Glu Thr Asp Pro Thr Gln Asp Asn Trp Gly Tyr Asp Pro Arg Asn

500 505 510

Tyr Asp Val Pro Glu Gly Gln Tyr Ala Thr Asn Ala Asn Gly Asn Ala

515 520 525

Arg Ile Lys Glu Phe Lys Glu Met Val Leu Ser Leu His Arg Glu His

530 535 540

Ile Gly Val Asn Met Asp Val Val Tyr Asn His Thr Phe Ala Thr Gln

545 550 555 560

Ile Ser Asp Phe Asp Lys Ile Val Pro Glu Tyr Tyr Tyr Arg Thr Asp

565 570 575

Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Asn Gly Ser Gly Thr Gly Asn Glu Ile Ala

580 585 590

Ala Glu Arg Pro Met Val Gln Lys Phe Ile Ile Asp Ser Leu Lys Tyr

595 600 605

Trp Val Asn Glu Tyr His Ile Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Met Ala

610 615 620

Leu Leu Gly Lys Asp Thr Met Ser Lys Ala Ala Ser Glu Leu His Ala

625 630 635 640

Ile Asn Pro Gly Ile Ala Leu Tyr Gly Glu Pro Trp Thr Gly Gly Thr

645 650 655

Ser Ala Leu Pro Asp Asp Gln Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gln Lys Gly

660 665 670

Met Gly Val Ala Val Phe Asn Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly

675 680 685

Asn Val Phe Asp Ser Ser Ala Gln Gly Phe Ala Thr Gly Ala Thr Gly

690 695 700

Leu Thr Asp Ala Ile Lys Asn Gly Val Glu Gly Ser Ile Asn Asp Phe

705 710 715 720

Thr Ser Ser Pro Gly Glu Thr Ile Asn Tyr Val Thr Ser His Asp Asn

725 730 735

Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Ile Ala Leu Ser Asn Pro Asn Asp Ser Glu

740 745 750

Ala Asp Arg Ile Lys Met Asp Glu Leu Ala Gln Ala Val Val Met Thr

755 760 765

Ser Gln Gly Val Pro Phe Met Gln Gly Gly Glu Glu Met Leu Arg Thr

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Lys Gly Gly Asn Asp Asn Ser Tyr Asn Ala Gly Asp Ala Val Asn Glu

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820 825 830

Thr Ala Asn Glu Ile Asn Ser His Leu Gln Phe Leu Asn Ser Pro Glu

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Gly Asn Ile Ile Val Val Tyr Asn Pro Asn Lys Thr Val Ala Thr Ile

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Asn Leu Pro Ser Gly Lys Trp Ala Ile Asn Ala Thr Ser Gly Lys Val

885 890 895

Gly Glu Ser Thr Leu Gly Gln Ala Glu Gly Ser Val Gln Val Pro Gly

900 905 910

Ile Ser Met Met Ile Leu His Gln Glu Val Ser Pro Asp His Gly Lys

915 920 925

Lys

Claims

1.一株产普鲁兰酶的重组巴斯德毕赤酵母突变株，其分类命名为巴斯德毕赤酵母GS115/pPICK-BdP5 WB138，已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2015693，该突变株适合在pH4.0的条件下发酵生产普鲁兰酶；

上述突变株所表达的重组普鲁兰酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。