CN113122461A - 单细胞蛋白生产菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了单细胞蛋白生产菌以及包含所述菌株的细胞培养物。本申请还提供了获得所述单细胞蛋白生产菌的方法、所述单细胞蛋白生产菌在生产单细胞蛋白中的用途以及由所述单细胞蛋白生产菌生产单细胞蛋白的方法。
Description
技术领域
本发明通常涉及生物工程领域。具体而言，本申请涉及单细胞蛋白生产菌及其应用。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对畜禽肉产品的需求逐年提高，但我国农业的产能无法满足畜禽饲养对蛋白质的需求。以生猪产业为例，2017年我国猪肉产量高达5340万吨，产值接近1.3万亿元人民币，占畜禽总产值比重的约56.6％。如此庞大的产业对饲料蛋白有巨量的需求。目前我国饲料蛋白主要来自豆粕，但国内耕地不足导致国产大豆产量每年不超过1500万吨，而2017年我国大豆总需求量达到11079万吨，因此我国饲料行业过度依赖于大豆进口。海关数据显示，过去3年，我国进口大豆分别达8391万吨、9553万吨和8803.1万吨。随着贸易战的持续进行，豆粕的供需矛盾日益严峻，亟需新的饲料蛋白来源。
1969年，Kiochi Ogata等人首次发现了某些酵母可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长，这种嗜甲醇酵母引起人们极大的兴趣。此后通过这种酵母在甲醇为主要基质培养基上发酵生成单细胞菌体，作为一种单细胞蛋白推向市场作为高蛋白的动物饲料。最早且最成功的甲醇蛋白生产菌株为毕赤酵母。Phillips Petroleum Company早在上世纪70年代就开发出针对毕赤酵母的高密度发酵方法，干重超过130g/L，其菌株后来又被开发成外源蛋白重组表达用高效宿主GS115(Cereghino J L,Cregg J M.Heterologous proteinexpression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS MicrobiologyReviews,2000,24(1):45-66.)。这种细胞内含有甲醇代谢途径所必需的酶，如乙醇氧化酶、二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，在以甲醇为唯一碳源时，相关酶能占全部可溶性蛋白质的30％。相比甘油等碳源，甲醇蛋白的产率高得多。而且甲醇蛋白的主要成分包含粗蛋白、脂肪、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、矿物质和维生素，其中，粗蛋白质量分数平均在70％以上，因此，甲醇蛋白的营养价值极高，甚至比鱼粉和大豆高得多，可以代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉等用作动物饲料，实际使用价值较大。
发明内容
第一方面，本申请提供了单细胞蛋白生产菌，其为转入了甘油单-二酰酯脂肪酶基因的毕赤酵母，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述单细胞蛋白是以醇类为碳源生产的蛋白。
在一些优选的实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在一些实施方案中，所述甘油单-二酰酯脂肪酶基因是通过载体转入的。在一些优选实施方案中，所述载体为质粒载体。
在一些具体的实施方案中，所述单细胞蛋白生产菌已于2019年10月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，分类命名为Pichia pastoris FY1，其保藏编号为CGMCC 18763。
第二方面，本申请提供了获得本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌的方法，其包括：将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母，并经筛选获得，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母前对酵母进行诱变。
在一些优选的实施方案中，所述诱变选自物理诱变、化学诱变、生物诱变、环境异常诱变或以上的组合。
第三方面，本申请提供了本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌在生产单细胞蛋白中的用途。
第四方面，本申请提供了生产单细胞蛋白的方法，其包括：将本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌在适合培养所述菌以产生单细胞蛋白的条件下进行发酵。
在一些实施方案中，所述条件包括以醇类作为碳源的培养基。
在一些实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在一些优选实施方案中，所述醇类为甲醇。
第五方面，本申请提供了细胞培养物，其包含本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌和任选的培养基。
在一些实施方案中，所述培养基是以醇类作为碳源的培养基。
在一些实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在一些优选的实施方案中，所述醇类为甲醇。
附图说明
图1为40℃培养条件下通过常压室温等离子体(ARTP)诱变获得的菌落。
图2为突变株在甲醇培养基中进行培养初筛的结果，其中1#代表突变株。
图3为FY1H菌株分别在BMMY培养基(图3A)和BMGY培养基(图3B)中的生长曲线。
图4为FY1和其它转化物在微型生物反应器中的生长状况。
图5为GS115、m316H和FY1在发酵终点时的菌液浓度。
图6为GS115、m316H和FY1转化甲醇的百分比。
序列简要说明
SEQ ID NO:1：甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)的核苷酸序列；
SEQ ID NO:2：毕赤酵母proteaseA基因序列，包含启动子区域及终止子区域；
SEQ ID NO:3：正向扩增引物pepF；
SEQ ID NO:4：反向扩增引物pepF；
SEQ ID NO:5：正向扩增引物MDGL_F；
SEQ ID NO:6：反向扩增引物MDGL_R。
发明详述
定义
提供以下定义用以更好地说明本申请的内容以及在实践本申请的各项发明中指导本领域普通技术人员。除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。
本文中所用的术语“包括”和“包含”表示开放式，也可以是封闭式。例如，所述包括”或“包含”可以表示还可以包括或包含没有列出的其他组分或步骤或其他要素，也可以仅包括或包含列出的组分或步骤或其他要素。
本文中使用的术语“豆粕”是大豆提取豆油后得到的一种副产品，又称“大豆粕”。
本文中使用的术语“毕赤酵母”也称为“巴斯德毕赤酵母”，是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。
本文中使用的术语“常压室温等离子体”简称ARTP。是近几年提出的一种新的大气压辉光放电冷等离子体源。能够在大气压下产生温度在25-40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流。为了从生物技术应用的角度突出这种等离子体源的特点，采用常压室温等离子体即ARTP来代表。
本文使用的术语“单细胞蛋白”(Single cell protein，SCP)又称微生物蛋白，是指从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。
本文中使用的术语“出发菌株”是指用于诱变育种的起始菌株。
本文中使用的术语“甲醇蛋白”是指以甲醇为基质生产的单细胞蛋白。
本文中使用的术语“转化子”是指掺入或导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。
本文中使用的术语“突变株”是指发生突变的菌株。
本文中使用的术语“发酵”是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。
本文中使用的术语“连续发酵”是指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵过程。
本文中使用的术语“分批发酵”是指又称为分批培养，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物生长繁殖，在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。
本文中使用的术语“补料分批发酵”又称“半连续发酵”或者“流加发酵”)是指在微生物分批发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
本文中使用的术语“一级种子”是指将菌种接种到体积较小的种子罐中，经培养后获得的大量繁殖活力强的菌体。
本文中使用的术语“凯氏定氮法”是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法，其理论基础是蛋白质中的含氮量通常占其总质量的16％左右(12％-19％)，因此，通过测定物质中的含氮量便可估算出物质中的总蛋白质含量(假设测定物质中的氮全来自蛋白质)，即：蛋白质含量＝含氮量/16％。
具体实施方式
应该理解，在本申请的特定方面、实施方案或实施例中描述的特征、特性、组分或步骤，可适用于本文所描述的任何其他的方面、实施方案或实施例，除非与之矛盾。
第一方面，本申请提供了单细胞蛋白生产菌，其为转入了甘油单-二酰酯脂肪酶基因的毕赤酵母，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本申请SEQ ID NO:1的核苷酸序列如下所示：GATGTCTCCACTTCCGAACTGGACCAGTTCGAGTTCTGGGTTCAATACGCAGCCGCCTCTTACTACGAGGCTGATTACACCGCACAGGTTGGTGATAAGCTGTCCTGCTCTAAGGGTAACTGCCCAGAAGTTGAAGCAACCGGTGCAACTGTGTCTTACGACTTCTCCGATTCCACGATCACTGACACCGCAGGTTACATCGCAGTTGATCACACCAACTCCGCAGTGGTACTGGCATTCCGTGGTTCTTACTCCGTACGTAACTGGGTTGCTGATGCTACTTTCGTCCATACCAACCCAGGTCTGTGTGATGGTTGTCTGGCTGAGCTGGGTTTCTGGTCTTCCTGGAAGCTGGTTCGTGATGATATTATCAAAGAACTGAAAGAAGTGGTGGCACAGAACCCAAACTATGAACTGGTGGTCGTGGGCCACTCCCTGGGTGCTGCTGTGGCTACTCTGGCTGCTACCGACCTGCGTGGTAAAGGTTATCCATCTGCTAAACTGTACGCTTACGCTTCCCCTCGTGTTGGCAACGCAGCCCTGGCCAAATATATCACCGCCCAGGGCAACAACTTCCGTTTCACCCACACCAATGACCCAGTACCTAAACTGCCACTGCTGTCTATGGGCTATGTACATGTTTCTCCTGAATATTGGATCACCTCTCCTAACAACGCCACTGTTTCTACCTCTGACATCAAAGTCATTGACGGCGACGTATCTTTTGACGGCAATACCGGCACGGGCCTGCCTCTGCTGACGGACTTTGAAGCCCACATTTGGTACTTTGTACAGGTTGACGCCGGCAAAGGTCCTGGCCTGCCATTCAAACGTGTTTAA。
甘油单-二酰酯脂肪酶(MDGL)是脂肪酶的一种，MDGL具有底物特异性，仅作用于甘油单酰酯(MAG)和甘油二酰酯(DAG)，对甘油三酰酯不起催化作用，可以利用酯化或转酯化反应来生产具有较高工业价值的甘油单酰酯。
在一些实施方案中，通过载体将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入单细胞蛋白生产菌。
在一些实施方案中，所述载体为质粒载体。
可利用本领域常规的用于在毕赤酵母中表达异源基因的骨架质粒载体构建适用于本发明的质粒载体。这类骨架质粒载体包括但不限于pPIC3、pPIC9、pPIC9k、pHIL-D1、pAO804、pAO815和pPSC3K等。典型的毕赤酵母表达载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和AOXTT)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。这类载体还可包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当将这类载体转化毕赤酵母时，载体的5'AOX1、AOXTT、3'AOX1以及HIS4能单独或一起与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同待表达的外源基因插入到受体菌染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。本领域技术人员熟知，AOX1启动子可被替代，包括但不限于诱导型、组成型启动子。
质粒载体的构建方法为本领域所熟知。例如，PCR扩增获得目的基因后，对PCR产物以及骨架质粒载体进行相应的限制性内切酶酶切，利用DNA连接酶将PCR产物的酶切片段与载体的酶切片段连接，将连接物转入大肠杆菌中，在合适的培养基中培养后，利用市售的质粒提取试剂盒提取获得用于转化本文所述的毕赤酵母FY1H的质粒。
在一些具体的实施方案中，FY1H菌株已于2019年10月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为Pichiapastoris FY1H，其保藏编号为CGMCC 18764。
毕赤酵母的转化方法也为本领域所熟知。例如，用限制性内切酶酶切构建得到的表达载体，获得线性化的载体。然后，可按照标准的转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey JLetchworth，2004)，电击转化毕赤酵母的感受态细胞，然后涂布到合适的平板(如MDS筛选平板)上培养数日。之后再挑取转化子至合适的平板上，根据其所表达的外源蛋白的生物学活性来挑选所需的重组菌株。
在一些实施方案中，所述单细胞蛋白是以醇类为碳源生产的蛋白。
在一些优选的实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
本申请提供了能够高效转化甲醇从而生产单细胞蛋白的毕赤酵母。例如，在一些实施方案中，与商品菌株GS115相比，本申请的毕赤酵母FY1的生长提高30％，总蛋白产量增加了12.5％，甲醇转化率提高了10.6％。
第二方面，本申请提供了获得本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌的方法，其包括：将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母，并经筛选获得。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母前对酵母进行诱变。
在一些优选的实施方案中，所述诱变选自物理诱变、化学诱变、生物诱变、环境异常诱变或以上的组合。
在一些实施方案中，所述物理诱变选自常压室温等离子体诱变、紫外线辐射、粒子照射法、离子注入诱变、超声波波阵、微波处理法、空间诱变、激光处理、或以上的组合。
在一些优选的实施方案中，所述物理诱变为常压室温等离子体诱变(ARTP)。
在一些实施方案中，所述化学诱变是通过用烷化剂、羟胺、碱基类似物、吖啶色素或以上的组合处理实现的。
在一些实施方案中，所述生物诱变选自原生质体融合，离子束介导、噬菌体介导或基因枪注入外源DNA、或以上的组合。
在一些实施方案中，通过含有醇类的平板对诱变后的酵母进行筛选。在一些实施方案中，所使用的醇类的含量为4％-6％。在具体的实施方案中，所使用的醇类的含量为4％、5％或6％或上述两数值之间的任意数值。
在一些实施方案中，所述醇类为甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在优选的实施方案中，所述醇类为甲醇。例如，在一些实施方案中，将菌株诱变后进行高浓度的甲醇平板筛选，得到耐甲醇的菌株。
在一个具体的实施方案中，将初始菌株m314H(保藏编号CGMCC16670，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)经过一系列改造后得到了m316H菌株，其蛋白生产性能有了显著的提高。本申请发明人以m316H菌株为出发菌株，通过ARTP(常压室温等离子体)诱变，并经高浓度的甲醇平板筛选，得到了一株耐甲醇的毕赤酵母FY1H，向其转入外源基因MDGL后获得了耐高浓度甲醇、生长较快、甲醇转化率高的突变菌株，例如FY1菌株。
m316H菌株已于2019年12月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为Pichia pastoris m316H，其保藏编号为CGMCC 19221。
第三方面，本申请提供了本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌在生产单细胞蛋白中的用途。
在一些优选实施方案中，所述单细胞蛋白为甲醇蛋白。
第四方面，本申请提供了生产单细胞蛋白的方法，其包括：将本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌在适合培养所述菌以产生单细胞蛋白的条件下进行发酵。
在一些实施方案中，所述条件包括以醇类作为碳源的培养基。
在一些实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在一些优选实施方案中，所述醇类为甲醇。
在一些优选的实施方案中，所述培养基为BMMY培养基。
在一些实施方案中，所述BMMY培养基包含1.34％YNB(含硫酸铵)，2％蛋白胨，1％酵母粉，0.1M pH 6.5柠檬酸钠缓冲体系，2％甲醇。
在一些实施方案中，所述条件包括28℃-34℃的培养温度。
在一些优选实施方案中，所述条件包括28℃的培养温度。
在一些实施方案中，所述条件包括6.0-6.5的pH值。
在一些优选实施方案中，所述条件包括6.0的pH值。
在一些实施方案中，通过添加碱来对培养基的pH进行调节。
在一些优选实施方案中，所述碱为NaOH。
在一些实施方案中，通过向培养基中添加醇类来诱导蛋白质的表达。
在一些优选的实施方案中，通过向培养基中添加甲醇来诱导蛋白质的表达。
在一些实施方案中，所述发酵选自分批发酵、连续发酵或补料分批发酵。
在具体的实施方案中，跟现有商品菌株相比，FY1菌株生长、总蛋白以及甲醇转化率都明显提高。例如，在以甲醇作为唯一碳源的培养基中，FY1菌株发酵终点的菌液浓度较m316H菌株提高了40％。FY1菌株最终得到的总蛋白较m316H提高了36.4％，甲醇转化率提高了37％。这说明FY1菌株能更好地利用甲醇，能够将甲醇更高效地转化为蛋白。
第五方面，本申请提供了细胞培养物，其包含本申请第一方面所述的单细胞蛋白生产菌和任选的培养基。
在一些实施方案中，所述培养基是以醇类作为碳源的培养基。
在一些实施方案中，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
在一些优选的实施方案中，所述醇类为甲醇。
在一些优选的实施方案中，所述培养基为BMMY培养基。
在一些实施方案中，所述BMMY培养基包含1.34％YNB(含硫酸铵)，2％蛋白胨，1％酵母粉，0.1M pH 6.5柠檬酸钠缓冲体系，2％甲醇。
实施例
实施例1：m314H突变株m316H的获得
菌株m314H(CGMCC 16670，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)天然地失活了proteaseA基因(SEQ ID NO:2)，首先补偿该基因缺陷。委托上海生工合成SEQ ID NO:2所示的以下核苷酸序列:
CGAGTTTCTCCGTATCTAATCTTTCTCGCTCCCCGTACGTTAAGAATGAAATTTCTACTTCCATTATAGAAAATAGTGTATCACTGCCAGCATCTTTTACTCACAAGCAATTAAACAAAGTAACAATGGTCTCTAAGCAATTGGAATCACCACAGGGGACCTTTATCACGTTGAATCTAGTTGAAAATTCAGTGTCCAAGTTCGGTGCAGTACACATACCACAAGGAAAAACCCCATTTGTTGTTGGTAGAGATTCATCTTGTGACTGGTTGATCAAAGAAGAAAGAATTTCCAAAATACACTGCATGATTGCCAAAAAAAGGCATCCTACTGCTAATCCTTCCATATTTGAGTCACCTGCTTTAGGGCTGGAAGATATTTGGTTACTAGATTTTAGTACAAACTCTTGCTTTGTCAATGACATTAAAATAGGCAAGAATCGCAAAACTCAAATATTTCATGGAGATGAGATATGCTTGTTCAAAGATGCCCAGAAAAAAGAGCAACTCGTTTATAGGGTTCATATTGATGATGGAACAGGCCTTTTCCAGGGAGGTGAAAGAACCCAAGCCAATTCTGATGACATTCTGGATATTGATGAGGTTGATGAAAAGTTAAGAGAACTATTGACAAGAGCCTCAAGGAAACGGCATATCACCCCTGCATTGGAAACTCCTGATAAACGTGTAAAAAGAGCTTATTTGAACAGTATTACTGATAACTCTTGATGGACCTTAAAGATGTATAATAGTAGACAGAATTCATAATGGTGAGATTAGGTAATCGTCCGGAATAGGAATAGTGGTTTGGGGCGATTAATCGCACCTGCCTTATATGGTAAGTACCTTGACCGATAAGGTGGCAACTATTTAGAACAAAGCAAGCCACCTTTCTTTATCTGTAACTCTGTCGAAGCAAGCATCTTTACTAGAGAACATCTAAACCATTTTACATTCTAGAGTTCCATTTCTCAATTACTGATAATCAATTTAAAGATGATATTTGACGGTACTACGATGTCAATTGCCATTGGTTTGCTCTCTACTCTAGGTATTGGTGCTGAAGCCAAAGTTCATTCTGCTAAGATACACAAGCATCCAGTCTCAGAAACTTTAAAAGAGGCCAATTTTGGGCAGTATGTCTCTGCTCTGGAACATAAATATGTTTCTCTGTTCAACGAACAAAATGCTTTGTCCAAGTCGAATTTTATGTCTCAGCAAGATGGTTTTGCCGTTGAAGCTTCGCATGATGCTCCACTTACAAACTATCTTAACGCTCAGTATTTTACTGAGGTATCATTAGGTACCCCTCCACAATCGTTCAAGGTGATTCTTGACACAGGATCCTCCAATTTATGGGTTCCTAGCAAAGATTGTGGATCATTAGCTTGCTTCTTGCATGCTAAGTATGACCATGATGAGTCTTCTACTTATAAGAAGAATGGTAGTAGCTTTGAAATTAGGTATGGATCCGGTTCCATGGAAGGGTATGTTTCTCAGGATGTGTTGCAAATTGGGGATTTGACCATTCCCAAAGTTGATTTTGCTGAGGCCACATCGGAGCCGGGGTTGGCCTTCGCTTTTGGCAAATTTGACGGAATTTTGGGGCTTGCTTATGATTCAATATCAGTAAATAAGATTGTTCCTCCAATTTACAAGGCTTTGGAATTAGATCTCCTTGACGAACCAAAATTTGCCTTCTACTTGGGGGATACGGACAAAGATGAATCCGATGGCGGTTTGGCCACATTTGGTGGTGTGGACAAATCTAAGTATGAAGGAAAGATCACCTGGTTGCCTGTCAGAAGAAAGGCTTACTGGGAGGTCTCTTTTGATGGTGTAGGTTTGGGATCCGAATATGCTGAATTGCAAAAAACTGGTGCAGCCATCGACACTGGAACCTCATTGATTGCTTTGCCCAGTGGCCTAGCTGAAATTCTCAATGCAGAAATTGGTGCTACCAAGGGTTGGTCTGGTCAATACGCTGTGGACTGTGACACTAGAGACTCTTTGCCAGACTTAACTTTAACCTTCGCCGGTTACAACTTTACCATTACTCCATATGACTATACTTTGGAGGTTTCTGGGTCATGTATTAGTGCTTTCACCCCCATGGCTTTCCTGAACCAATAGGTCCTTTGGCAATCATTGGTGACTCGTTCTTGAGAAAATATTACTCAGTTTATGACCTAGGCAAAGATGCAGTAGGTTTAGCCAAGTCTATTTAGGCAAGAATAAAAGTTGCTCAGCTGAACTTATTTGGTTACTTATCAGGTAGTGAAGATGTAGAGAATATATGTTTAGGTATTTTTTTTTAGTTTTTCTCCTATAACTCATCTTCAGTACGTGATTGCTTGTCAGCTACCTTGACAGGGGCGCATAAGTGATATCGTGTACTGCTCAATCAAGATTTGCCTGCTCCATTGATAAGGGTATAAGAGACCCACCTGCTCCTCTTTAAAATTCTCTCTTAACTGTTGTGAAAATCATCTTCGAAGCAAATTCGAGTTTAAATCTATGCGGTTGGTAACTAAAGGTATGTCATGGTGGTATATAGTTTTTCATTTTACCTTTTACTAATCAGTTTTACAGAAGAGGAACGTCTTTCTCAAGATCGAAATAGGACTAAATACTGGAGACGATGGGGTCCTTATTTGGGTGAAAGGCAGTGGGCTACAGTAAGGGAAGACTATTCCGATGATGGAGATGCTTGGTCTGCTTTTCCTTTTGAGCAATCTCATTTGAGAACTTATCGCTGGGGAGAGGATGGACTAGCTGGAGTCTCAGACAATCATCAACTAATTTGTTTCTCAATGGCACTGTGGAATGAGAATGATGATATTTTGAAGGAGCGATTATTTGGGGTCACTGGAGAGGCTGCAAATCATGGAGAGGATGTTAAGGAGCTTTATTATTATCTTGATAATACACCTTCTCACTCTTATATGAAATACTTTACAAATATCCACAATCGAAATTTCCTTACGAAGAATTGATTTCAGAGAACCGTAAACGTTCCAGATTAGAAAGAGAGTACGAGATTACTGACTCTGAAGTACTGAAGGATAACAGATATTTTGATGTGATCTTTGAAATGGCAAAGGACGATGAAGATGAGAATGAACTTTACTTTAGAATTACCGCTTACAACCGAGGTCCCACCCCTGCCCCTTTACATGTCGCTCCACAGGTAACCTTTAGAAATACCTGGTCCTGGGGTATAGATGAGGA。
使用引物pepF：CGAGTTTCTCCGTATCTAAT(SEQ ID NO:3)和pepR：TCCTCATCTATACCCCAGG(SEQ ID NO:4)，以上述合成物为模板进行扩增。PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS(DRR010A)DNA聚合酶进行，反应体系为：水33μL，5×PrimeSTAR缓冲液10μL，dNTP混合物(各2.5mM)4μL，引物各1μL，质粒模板0.5μL，PrimeSTAR酶0.5μL。PCR反应程序为30个循环的98℃ 10秒，68℃ 1.5min。
PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒(AP-PCR-50)纯化，然后按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth,2004)，电击转化m314H。将电转物涂布到选择培养基MDS筛选平板上，于30℃培养三天。使用引物pepF和pepR，使用KOD-FX酶，按照使用说明进行菌落PCR挑选，获得pep4补偿阳性的菌株m316H。经基因组测序，pep4回补有3个拷贝，2个位于基因组原pep4位置，另一个拷贝错误插入BQ9382_C2-3700基因后期促进复合物/Cyclosome的亚基(Subunit of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome)编码区域，导致该基因失活。
将m316H菌株接种至50mL YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，1％葡萄糖)培养基中，28℃培养过夜。离心收集菌体，无菌水洗涤后，用10％的甘油溶液重悬到OD600＝1.0。吸取10μL菌液，经ARTP-M仪器中处理20s，稀释100倍后，取100μL涂布在YPM平板上(2％蛋白胨，1％酵母粉，4％甲醇，2％琼脂)，置于40℃培养箱中培养4d，挑选菌落较大的菌株，如图1所示。
实施例2：毕赤酵母宿主菌FY1H的获得
将各毕赤酵母突变株分别接种在10mL YPD培养基中培养过夜，得到各菌种子液。向BMMY(1.34％YNB(含硫酸铵)，2％蛋白胨，1％酵母粉，0.1M pH 6.5柠檬酸钠缓冲体系，2％甲醇)中接种上述菌种至初始OD＝0.5，34℃，240rpm摇床培养并监控OD情况。
如图2所示，多个突变株表现出优于出发菌株m316H以及商品菌株GS115的生长性能。
将图2中形态较好的菌株(包括FY1H)在BMMY和BMGY(1.34％YNB(BD公司产品，含硫酸铵)，2％蛋白胨，1％酵母粉，0.1M pH6.5柠檬酸钠缓冲体系，1％甘油)中进行发酵测试，并与m316H和GS115比较，初始接种量为0.2OD，置于28℃摇床中，240rpm培养，跟踪其OD600值。如图3中所示，在BMMY条件下，FY1H菌株的生长最快，其OD增长明显快于m316H，其64小时的菌液浓度较m316H提高了173％，说明经ARTP诱变后的FY1H菌株在甲醇培养基BMMY中生长较快，能更好地利用甲醇转化为细胞的生物质。在甘油培养基BMGY中，FY1H生长增加不显著。FY1H被挑出作为候选菌株用于后续测试。
实施例3：利用毕赤酵母FY1菌株生产单细胞蛋白
向GS115、m316H和FY1H中转入外源基因MDGL操作方法如下。
经过优化并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成MDGL核苷酸序列SEQ IDNO:1。
使用引物MDGL_F：TACGTAGATGTCTCCACTTCCGAAC(SEQ ID NO:5)及MDGL_R：CCTAGGTTAAACACGTTTGAATGG(SEQ ID NO:6)，扩增MDGL的成熟肽部分，PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS(DRR010A)DNA聚合酶进行，反应体系为：水33μl，5×PrimeSTAR缓冲液10μl，dNTP混合物(各2.5mM)4μl，引物各1μl，质粒模板0.5μl，PrimeSTAR酶0.5μl。PCR反应程序为30个循环的98℃10秒，68℃1min。
PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化(AP-PCR-50)，使用NEB公司SnaB和AvrII限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。同时使用相同的限制性内切酶酶切pPIC9K质粒，酶切物同样进行纯化。使用Fermentas公司T4 DNA连接酶，按照产品说明，将PCR产物酶切片段和pPIC 9k载体酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工测序。
将测序正确的重组表达载体用Bgl II限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth,2004)，电击转化GS115、m316H和FY1H毕赤酵母感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养三天。挑取转化子至MDGL筛选平板(BMMY，2％甘二酯，0.04％PVA，2％琼脂糖)上，30℃培养2天，挑取水解圈最大的转化子，得到含有MDGL的重组菌株。
转化物经活性平板上挑出水解圈最大的重组菌菌落，进行发酵测试。单菌落先挑选至50mL的BMGY培养基中，28℃，240rpm培养过夜，取300OD菌体离心收集，得到一级种子。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。
使用
Pro微型生物反应器，对转化物进行补料发酵，初始体积800μL，甲醇补加流速4μL/h，流加NaOH控制pH为6.0。如图4所示，在28℃条件下发酵76h生物量达到最大，OD值由初始甲醇补加时的20增长到最高值108。对BioLector终点发酵物检测，结果发现该FY1菌胞外蛋白量很低，表明诱变作用未提高该菌的外源蛋白分泌能力，但使其生长出现了显著的提高。
再次使用摇瓶对FY1等菌进行发酵测试，单菌落先挑选至50mL的BMGY培养基中，28℃，240rpm培养过夜，取300OD菌体离心收集，得到一级种子。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加1％甲醇，28℃，240rpm诱导表达。
甲醇补加方式：初始向BMMY中添加1％甲醇，第二天早上和晚上各补加1％甲醇，发酵结束时共加入甲醇3.75mL。测定发酵终点菌液浓度，并于8000rpm，4℃离心发酵液收集菌体以进行总蛋白含量测定。从图5可以看出，经ARTP诱变的FY1菌株较m316H的发酵终点浓度提高了40％，生长速度有了较大提升。
实施例4：菌泥蛋白含量测定(凯氏定氮法)
取0.2g左右菌泥样品进行凯氏定氮。具体步骤如下：
1.硝化：将称好的样品放入试管中，加入6.0g硫酸铜-硫酸钾催化剂和12.0mL浓硫酸，置于420℃消化装置中硝化2小时，直至全部样品变为透明的澄清液体。
2.蒸馏、滴定：将样品放入Foss 8400凯氏定氮仪中，测其蛋白含量。
测得的总蛋白含量如表1所示。
表1菌株总蛋白含量及甲醇转化率
由以上表1可见，与出发菌株m316H相比，毕赤酵母FY1菌株总蛋白量提高了36.4％，甲醇转化率也提高了37％(参见图6)，说明FY1菌株可以更有效地利用甲醇，将甲醇转化为蛋白。FY1与商品菌株GS115对比表明，两种菌体的蛋白含量相当，但FY1生物量大，因此FY1的生产效率和转化效率都高于商品菌株GS115。
可以理解，尽管本申请以某种形式被说明，但本申请并不局限于本说明书中所显示和描述的内容。对本领域的技术人员显而易见的是，在不偏离本申请的范围的前提下还可做出各种变化。这些变化都在本申请要求保护的范围内。
序列表
<110> 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司
<120> 单细胞蛋白生产菌及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgtctcca cttccgaact ggaccagttc gagttctggg ttcaatacgc agccgcctct 60
tactacgagg ctgattacac cgcacaggtt ggtgataagc tgtcctgctc taagggtaac 120
tgcccagaag ttgaagcaac cggtgcaact gtgtcttacg acttctccga ttccacgatc 180
actgacaccg caggttacat cgcagttgat cacaccaact ccgcagtggt actggcattc 240
cgtggttctt actccgtacg taactgggtt gctgatgcta ctttcgtcca taccaaccca 300
ggtctgtgtg atggttgtct ggctgagctg ggtttctggt cttcctggaa gctggttcgt 360
gatgatatta tcaaagaact gaaagaagtg gtggcacaga acccaaacta tgaactggtg 420
gtcgtgggcc actccctggg tgctgctgtg gctactctgg ctgctaccga cctgcgtggt 480
aaaggttatc catctgctaa actgtacgct tacgcttccc ctcgtgttgg caacgcagcc 540
ctggccaaat atatcaccgc ccagggcaac aacttccgtt tcacccacac caatgaccca 600
gtacctaaac tgccactgct gtctatgggc tatgtacatg tttctcctga atattggatc 660
acctctccta acaacgccac tgtttctacc tctgacatca aagtcattga cggcgacgta 720
tcttttgacg gcaataccgg cacgggcctg cctctgctga cggactttga agcccacatt 780
tggtactttg tacaggttga cgccggcaaa ggtcctggcc tgccattcaa acgtgtttaa 840
<210> 2
<211> 3230
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ccattataga aaatagtgta tcactgccag catcttttac tcacaagcaa ttaaacaaag 120
taacaatggt ctctaagcaa ttggaatcac cacaggggac ctttatcacg ttgaatctag 180
ttgaaaattc agtgtccaag ttcggtgcag tacacatacc acaaggaaaa accccatttg 240
ttgttggtag agattcatct tgtgactggt tgatcaaaga agaaagaatt tccaaaatac 300
actgcatgat tgccaaaaaa aggcatccta ctgctaatcc ttccatattt gagtcacctg 360
ctttagggct ggaagatatt tggttactag attttagtac aaactcttgc tttgtcaatg 420
acattaaaat aggcaagaat cgcaaaactc aaatatttca tggagatgag atatgcttgt 480
tcaaagatgc ccagaaaaaa gagcaactcg tttatagggt tcatattgat gatggaacag 540
gccttttcca gggaggtgaa agaacccaag ccaattctga tgacattctg gatattgatg 600
aggttgatga aaagttaaga gaactattga caagagcctc aaggaaacgg catatcaccc 660
ctgcattgga aactcctgat aaacgtgtaa aaagagctta tttgaacagt attactgata 720
actcttgatg gaccttaaag atgtataata gtagacagaa ttcataatgg tgagattagg 780
taatcgtccg gaataggaat agtggtttgg ggcgattaat cgcacctgcc ttatatggta 840
agtaccttga ccgataaggt ggcaactatt tagaacaaag caagccacct ttctttatct 900
gtaactctgt cgaagcaagc atctttacta gagaacatct aaaccatttt acattctaga 960
gttccatttc tcaattactg ataatcaatt taaagatgat atttgacggt actacgatgt 1020
caattgccat tggtttgctc tctactctag gtattggtgc tgaagccaaa gttcattctg 1080
ctaagataca caagcatcca gtctcagaaa ctttaaaaga ggccaatttt gggcagtatg 1140
tctctgctct ggaacataaa tatgtttctc tgttcaacga acaaaatgct ttgtccaagt 1200
cgaattttat gtctcagcaa gatggttttg ccgttgaagc ttcgcatgat gctccactta 1260
caaactatct taacgctcag tattttactg aggtatcatt aggtacccct ccacaatcgt 1320
tcaaggtgat tcttgacaca ggatcctcca atttatgggt tcctagcaaa gattgtggat 1380
cattagcttg cttcttgcat gctaagtatg accatgatga gtcttctact tataagaaga 1440
atggtagtag ctttgaaatt aggtatggat ccggttccat ggaagggtat gtttctcagg 1500
atgtgttgca aattggggat ttgaccattc ccaaagttga ttttgctgag gccacatcgg 1560
agccggggtt ggccttcgct tttggcaaat ttgacggaat tttggggctt gcttatgatt 1620
caatatcagt aaataagatt gttcctccaa tttacaaggc tttggaatta gatctccttg 1680
acgaaccaaa atttgccttc tacttggggg atacggacaa agatgaatcc gatggcggtt 1740
tggccacatt tggtggtgtg gacaaatcta agtatgaagg aaagatcacc tggttgcctg 1800
tcagaagaaa ggcttactgg gaggtctctt ttgatggtgt aggtttggga tccgaatatg 1860
ctgaattgca aaaaactggt gcagccatcg acactggaac ctcattgatt gctttgccca 1920
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acgctgtgga ctgtgacact agagactctt tgccagactt aactttaacc ttcgccggtt 2040
acaactttac cattactcca tatgactata ctttggaggt ttctgggtca tgtattagtg 2100
ctttcacccc catggctttc ctgaaccaat aggtcctttg gcaatcattg gtgactcgtt 2160
cttgagaaaa tattactcag tttatgacct aggcaaagat gcagtaggtt tagccaagtc 2220
tatttaggca agaataaaag ttgctcagct gaacttattt ggttacttat caggtagtga 2280
agatgtagag aatatatgtt taggtatttt tttttagttt ttctcctata actcatcttc 2340
agtacgtgat tgcttgtcag ctaccttgac aggggcgcat aagtgatatc gtgtactgct 2400
caatcaagat ttgcctgctc cattgataag ggtataagag acccacctgc tcctctttaa 2460
aattctctct taactgttgt gaaaatcatc ttcgaagcaa attcgagttt aaatctatgc 2520
ggttggtaac taaaggtatg tcatggtggt atatagtttt tcattttacc ttttactaat 2580
cagttttaca gaagaggaac gtctttctca agatcgaaat aggactaaat actggagacg 2640
atggggtcct tatttgggtg aaaggcagtg ggctacagta agggaagact attccgatga 2700
tggagatgct tggtctgctt ttccttttga gcaatctcat ttgagaactt atcgctgggg 2760
agaggatgga ctagctggag tctcagacaa tcatcaacta atttgtttct caatggcact 2820
gtggaatgag aatgatgata ttttgaagga gcgattattt ggggtcactg gagaggctgc 2880
aaatcatgga gaggatgtta aggagcttta ttattatctt gataatacac cttctcactc 2940
ttatatgaaa tactttacaa atatccacaa tcgaaatttc cttacgaaga attgatttca 3000
gagaaccgta aacgttccag attagaaaga gagtacgaga ttactgactc tgaagtactg 3060
aaggataaca gatattttga tgtgatcttt gaaatggcaa aggacgatga agatgagaat 3120
gaactttact ttagaattac cgcttacaac cgaggtccca cccctgcccc tttacatgtc 3180
gctccacagg taacctttag aaatacctgg tcctggggta tagatgagga 3230
<210> 3
<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacgtagatg tctccacttc cgaac 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctaggttaa acacgtttga atgg 24
Claims (10)
1.单细胞蛋白生产菌，其为转入了甘油单-二酰酯脂肪酶基因的毕赤酵母，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的单细胞蛋白生产菌，其中所述单细胞蛋白是以醇类为碳源生产的蛋白，优选地，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合。
3.如权利要求1所述的单细胞蛋白生产菌，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶基因是通过载体转入的，优选地，所述载体为质粒载体。
4.如权利要求1所述的单细胞蛋白生产菌，其保藏编号为CGMCC 18763。
5.获得权利要求1-4中任一项所述的单细胞蛋白生产菌的方法，其包括：将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母，并经筛选获得，其中所述甘油单-二酰酯脂肪酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.如权利要求5所述的方法，其还包括在将甘油单-二酰酯脂肪酶基因转入酵母前对酵母进行诱变，优选地，所述诱变选自物理诱变、化学诱变、生物诱变、环境异常诱变或以上的组合。
7.权利要求1-4中任一项所述的单细胞蛋白生产菌在生产单细胞蛋白中的用途。
8.生产单细胞蛋白的方法，其包括：
将权利要求1-4中任一项所述的单细胞蛋白生产菌在适合培养所述菌以产生单细胞蛋白的条件下进行发酵。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述条件包括以醇类作为碳源的培养基，优选地，所述醇类选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合，更优选地，所述醇类为甲醇。
10.细胞培养物，其包含权利要求1-4中任一项所述的单细胞蛋白生产菌和任选的培养基，优选地，所述培养基是以醇类作为碳源的培养基，其中所述醇类优选地选自甲醇、乙醇、丙二醇、丙三醇、丁醇、戊醇、己醇、山梨醇、D-泛醇、甾醇或以上的组合，更优选地，所述醇类为甲醇。
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