RU2771079C1 - Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli - Google Patents
Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- RU2771079C1 RU2771079C1 RU2021109268A RU2021109268A RU2771079C1 RU 2771079 C1 RU2771079 C1 RU 2771079C1 RU 2021109268 A RU2021109268 A RU 2021109268A RU 2021109268 A RU2021109268 A RU 2021109268A RU 2771079 C1 RU2771079 C1 RU 2771079C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phytase
- ogataea
- yeast
- haglerorum
- escherichia coli
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims abstract description 51
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000081017 Ogataea haglerorum Species 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 46
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 241001112159 Ogataea Species 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical class OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100031004 Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 5
- 101000843187 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, cytoplasmic Proteins 0.000 description 5
- 241001099341 Ogataea polymorpha Species 0.000 description 5
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 5
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- -1 YNI1 Proteins 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001221837 Ogataea thermomethanolica Species 0.000 description 2
- 101150023810 PHO1 gene Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101100271429 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ATP6 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150078244 AMO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101100208128 Arabidopsis thaliana TSA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 241001465318 Aspergillus terreus Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000893906 Fowl adenovirus A serotype 1 (strain CELO / Phelps) Protein GAM-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029015 Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 101000838688 Homo sapiens D-aminoacyl-tRNA deacylase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000696493 Homo sapiens Histidine-tRNA ligase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101000600178 Homo sapiens Peroxisomal membrane protein PEX14 Proteins 0.000 description 1
- 101000795074 Homo sapiens Tryptase alpha/beta-1 Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101100502336 Komagataella pastoris FLD1 gene Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101000891165 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase alpha subunit Proteins 0.000 description 1
- 101000891164 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase beta subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001126578 Nitrosomonas europaea (strain ATCC 19718 / CIP 103999 / KCTC 2705 / NBRC 14298) Ammonia monooxygenase gamma subunit Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 101150015692 PEX11A gene Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000123255 Peniophora Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100040056 Peroxisomal membrane protein 11A Human genes 0.000 description 1
- 102100037476 Peroxisomal membrane protein PEX14 Human genes 0.000 description 1
- 101000662819 Physarum polycephalum Terpene synthase 1 Proteins 0.000 description 1
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100008882 Pichia angusta DAS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100240548 Pichia angusta YNR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 101100298818 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPT3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100421128 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SEI1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001123650 Schwanniomyces occidentalis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003629 TRPC3 Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 101150037542 Trpc3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029639 Tryptase alpha/beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000607481 Yersinia intermedia Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050411 appA gene Proteins 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 239000012532 cell-free culture fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021321 essential mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002075 main ingredient Substances 0.000 description 1
- 101150002012 met6 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 1
- 235000011837 pasties Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 101150107962 pex11 gene Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 102220082204 rs753215899 Human genes 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 101150026818 trp3 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий фитазу и несущий в составе хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген PhyEc-mod, кодирующий фитазу Escherichia coli, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1. Изобретение обеспечивает расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазу Е. coli. 1 ил., 2 табл., 1 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и касается получения штаммов дрожжей Ogataea haglerorum, способных продуцировать фермент фитазу.
Фосфор является важным минералом, необходимым для роста и развития животных. Источником фосфора являются фитаты (мио-инозитол гексакисфосфаты), которые содержатся в зерновых и бобовых культурах - основных ингредиентах кормов в животноводстве [Adv. Food Res. 1982, 28, 1-92]. Некоторые животные, такие как домашняя птица, свиньи и рыбы не способны утилизировать фитатный фосфор из-за отсутствия ферментов для гидролиза фитатов в их пищеварительной системе, что снижает пищевую ценность корма [Can. J. Anim. Sci. 2013, 93, 9-21]. Фитаты препятствуют эффективному усвоению кальция, натрия, магния и других минеральных веществ из кормов, а также могут связываться с белками в широком диапазоне рН, образуя нерастворимые белково-фитатные или белок-минерал-фитатные комплексы, недоступные для переваривания [J. Sci. Food Agric. 2015, 95, 878-896].
Фитаза является одним из наиболее востребованных кормовых ферментов. Фитазы (мио-инозитол гексакисфосфат 3- или 6-фосфогидролазы, ЕС 3.1.3.8 или ЕС 3.1.3.26) гидролизуют фитат до мио-инозитол производных и неорганического фосфата и с успехом используются в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвоение фосфора [J. Sci. Food Agric, 2015, 95, 878-896. doi: 10.1002/jsfa.6998]. Они обеспечивают высвобождение не только фитат-связанного фосфора, но также белков, макро- и микроэлементов, повышая питательные свойства кормов и устраняя дефицит фосфатов [British Poultry Science, 2004, 45(1), 101-108].
В настоящее время фитазы получают микробиологическим путем с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов, потребность промышленности в которых постоянно растет [Afr. J. Biotechnol., 2009, 8(17), 4229-4232.]. Наиболее часто для высокоэффективной продукции гетерологичных белков используются метилотрофные дрожжи Pichia pastoris [Journal of Biotechnology. 2015, 202, 118-134. doi.org/10.1016/j.jbiotec.2015.01.027; J. Cell Physiol. 2020, 1-15. DOI: 10.1002/jcp.29583], которые обладают мощными системами экспрессии и секреции рекомбинантных белков (в том числе, фитаз) и для которых разработаны питательные среды и отработан процесс ферментации с использованием культуры высокой плотности. Процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24, 45-66. doi: 10.1111/j.1574-6976.2000.tb00532.x].
Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenula). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи Pichia pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Pichia pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а также при культивировании в биореакторе позволяют получать биомассу с высокой плотностью клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052].
В отличие от Pichia pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре не ниже 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.
Известны примеры создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов фитазы на основе дрожжей Ogataea (Hansenula) polymorpha, в которых ген фитазы из грибов рода Aspergillus находится под контролем промотора гена FMD, кодирующего формат дегидрогеназу, и имеет природную сигнальную последовательность. Так штаммы О. polymorpha за 160 ч культивирования в 15 л ферментере на минеральной среде с глюкозой продуцируют фитазы из грибов Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus (вариант Q27L) и Aspergillus fumigatus (вариант консенсус) в количестве 4,46 г/л, 6,11 г/л и 13,5 г/л, соответственно, [Biotechnology and Bioengineering. 1999, 63 (3), 373-381], что иллюстрирует высокий потенциал системы экспрессии дрожжей рода Ogataea для производства рекомбинантного белка.
Штамм О. thermomethanolica, содержащий ген фитазы Aspergillus niger ВСС18081 под контролем конститутивного промотора гена GAP, кодирующего глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу, и с сигнальной последовательностью MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирует фитазу с активностью 134 ед./мл КЖ за 41 ч культивировании в 15 л ферментере на минеральной среде при температуре 34°С и использовании в качестве источника углерода столового сахара [Appl Biochem Biotechnol. 2016. DOI 10.1007/s12010-016-2191-8].
Вид Ogataea haglerorum выделен из дрожжей рода Ogataea в 2017 г. в результате проведения анализа последовательностей D1/D1 гена LSU rRNA, ITS1-5.8S-ITS2, фактора элонгации трансляции EF-1α и комплексного генетического анализа Наумовым Г.И. с соавторами [Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012].
Для дрожжей Ogataea haglerorum разработаны генетические технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионный вектор и метод введения ДНК в клетки реципиента [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56]. Описано использование штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 для экспрессии генов фитазы из бактерий Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, показано, что при культивировании в пробирках активность фитазы в КЖ составляет 56,2 ед./мл и 135,2 ед./мл, соответственно [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56].
Одним из востребованных на сегодняшний день ферментов является фитаза Escherichia coli. Ген аррА, кодирующий фитазу Е. coli, был клонирован в 1985 г, затем секвенирован, а фитаза охарактеризована [Mol. Gen. Genet. 1985, 200:68-73; J. Bacteriol. 1990, 172:5497-5500; Arch. Biochem. Biophys. 1993, 303, 107-113]. Рекомбинантная фитаза Ε. coli, наработанная клетками дрожжей P. pastoris, обладает промышленно-ценными свойствами и в настоящее время коммерчески доступна в форме препаратов Quantum® и OptiPhos® [J. Sci. Food Agric. 2015, 95:878-896. doi:10.1002/jsfa.6998]. Введение в корма фитазы Ε. coli более эффективно влияет на зоотехнические показатели, чем добавление фитаз из грибов Aspergillus и Peniophora, так как фитаза Е. coli более устойчива к действию пепсина, работает в более кислой области рН, что соответствует физиологическим условиям желудочно-кишечного тракта животных, а также характеризуется высокой удельной активностью по сравнению с фитазами из других организмов [J. Anim. Sci. 2003, 81(2):474-483; Octa Journal of Biosciences, 2013, 1(2):158-169].
На основе дрожжей Ρ pastoris получены штаммы, секретирующие фитазу Е. coli, при культивировании которых в колбах активность фермента составляет 112,5 ед./мл за 72 ч [J Agric Food Chem. 2013, 61(25), 6007-6015. doi: 10.1021/jf401853b], 114 ед./мл за 72 ч [Biochem Biophys Res Commun. 1999, 257, 117-123.], 117 ед./мл за 48 ч [Biotechnol Lett. 2003, 25(10), 827-831. doi: 10.1023/a:1023568826461], 204 ед./мл за 96 ч [Enzym Microb Technol. 2004; 35(4):315-320], 237,2 ед./мл за 72 ч [Jundishapur J Microbiol. 2015, 8(12), e27553. doi: 10.5812/jjm.27553], 814 ед./мл за 96 ч [RU 2737621], 978 ед./мл за 216 ч [CN101935617].
Для увеличения продуктивности рекомбинантных штаммов Р, pastoris и улучшения промышленно-важных свойств фермента используют оптимизированные по кодоновому составу синтетические производные гена аррА Е. coli, кодирующего фитазу [J.Agric. Food Chem., 2013, 61(25), 6007-6015; Biotechnol. Lett. 2013, 35(10), 1669-1676. doi: 10.1007/sl0529-013-1255-x; Jundishapur J Microbiol. 2015, 8(12), e27553. doi: 10.5812/jjm.27553; CN 102586294; CN 102943083].
В источниках информации не обнаружено сведений об экспрессии гена фитазы из Е. coli в дрожжах рода Ogataea.
Создание высокоэффективных штаммов с повышенной продукцией фитазы Е. coli остается актуальной задачей.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фитазу Е. coli.
Техническим результатом заявляемого изобретения является рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий фитазу из Escherichia coli, содержащий в составе хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген phyEc-mod, кодирующий указанную фитазу и имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, которая адаптирована для экспрессии в метилотрофных дрожжах на основании данных о частоте встречаемости кодонов. Ранее использование оптимизированного синтетического гена phyEc-mod описано для получения трансформантов дрожжей Р. pastoris [RU 2737623].
В заявляемом изобретении термотолерантные метилотрофные дрожжи рода Ogataea впервые использованы для гетерологичной экспрессии гена фитазы из Е. coli.
Получение заявляемого трансформанта включает:
- трансформацию в клетки дрожжей Ogataea haglerorum экспрессионной кассеты, содержащей синтетический ген phyEc-mod, кодирующий фитазу Е. coli, нуклеотидная последовательность которого приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, промотор, работающий в дрожжах Ogataea (Hansenula), сигнальный пептид для осуществления секреции фермента в культуральную жидкость, терминатор, маркерный ген с регуляторными элементами, HARS и, предпочтительно, сайт для гомологичной интеграции в хромосомную ДНК; процесс трансформации экспрессионной кассеты в клетки дрожжей Ogataea (Hansenula) осуществляют, в частности, методом электоропорации [Yeast Metabolic Engineering: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. 2014, 1152, 43-62. DOI 10.1007/978-1-4939-0563-8_3] или методом с использованием ацетата лития [Curr. Genet. 1990, 18, 169-170. https://doi.org/10.1007/BF003126061], а интеграцию экспрессионной кассеты осуществляют путем или гомологичной, или негомологичной рекомбинации;
- увеличение числа копий экспрессионной кассеты в хромосомной ДНК трансформанта О. haglerorum осуществляют путем повторной трансформации кассетой;
- анализ полученных трансформантов на способность секретировать активную фитазу в культуральную жидкость в процессе ферментации.
Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Ε. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Ogataea (Hansenula). В качестве промоторов могут быть использованы МОХ, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, РМА1, АОХ, MAL, АМО, TEF1, РЕХ14, РЕХ11 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, 1-6; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278].
В качестве сигнальных пептидов используют лидерную последовательность PHO1, пре-про-лидерную последовательность MFα из Saccharomyces cerevisiae или Ogataea thermomethanolica, GAM1 из Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178, 710-724].
В качестве терминаторов транскрипции используют МОХ, AMO1, ΡНО5, АОХ1 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184].
В качестве селективных маркеров используют гены резистентности к антибиотикам или зеоцину, или генетицину (G418), или гигромицину В, или норзеотрицину, или бластицидину, а также гены, комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме дрожжей рода Ogataea, такие как LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, МЕТ6, ADE11 [FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; Yeast, 1995, 11, 343-353].
В качестве последовательностей, обеспечивающих эффективную трансформацию и автономную репликацию, используют HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gen Genet. 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178 (15), 4420-4428].
В качестве сайтов для гомологичной интеграции используют последовательности генов МОХ, TRP, URA3, LEU2, GAP, кластер генов для рибосомальной ДНК, HARS, АМО, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Ogataea.
Изобретение проиллюстрировано следующей фигурой графического изображения.
Фиг. 1. Экспрессионная кассета
Пример 1. Конструирование трансформанта дрожжей О. haslerorum, продуцирующего фитазу Е. coli
Ген phyEc-mod, кодирующий фитазу E.coli, синтезируют известным методом [J. Microbiol. Methods, 2010, 81(2), 147-152]. Полученную последовательность ДНК, приведенную в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, по сайтам EcoRI и NotI встраивают в состав экспрессионного вектора pMOX-Km-HARS [Биотехнология. 2019, 35(6), 51-56], созданного на основе коммерческого вектора pBluescript II KS+(Х52327, Stratagene).
Получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету (фиг.1), в состав которой входят следующие генетические элементы.
1. Синтетический ген phyEc-mod, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, транскрипция которого находится под контролем промотора рМОХ, наработанного с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 (линия CBS4732).
2. Терминатор транскрипции tMOX, наработанный с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Υ-1546.
3. Дрожжевой селективный маркер KтМХ, фланкированный сайтами lox66 и lox71, транскрипция которого находится под контролем промотора pGAPD гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, наработанного с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 и терминатора транскрипции tTEF. Устойчивость дрожжей Ogataea haglerorum к антибиотику генетицину (G418) обеспечивает маркер KтМХ.
4. Последовательность HARS, наработанную с использованием хромосомной ДНК штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-916 (линия DL1), обеспечивающую сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма и являющуюся возможным местом интеграции.
5. Область интеграции - нуклеотидная последовательность 3'-области региона МОХ.
Экспрессионную кассету трансформируют в штамм О. haglerorum ВКПМ Y-2584, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD600) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола в 1 л воды SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин. и собирают центрифугированием в течение 10 мин. при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCl2 в 1 л воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×109 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 500 нг ДНК экспрессионной кассеты и инкубируют на льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. при качании.
Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (G418) в количестве 300 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.
Наличие целевого гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов подтверждают методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов PhyEc-F (5'-cagagtgagcctgagttgaaac-3'), PhyEc-R (5'-gcaagctgggattctagcttcg-3') и Taq полимеразы. Режим реакции ПЦР: 96°С - 3 мин - 1 цикл; 30 циклов: 96°С - 30 с, 53°С - 30 с, 68°С - 150 с; 68°С - 5 мин. - 1 цикл. Присутствие в реакционной смеси ПЦР-фрагмента размером 1223 п. н. подтверждает наличие синтетического гена в составе хромосомной ДНК полученных трансформантов
Отбор наиболее продуктивных трансформантов осуществляют по результатам их культивирования по следующей схеме:
- Посевную культуру выращивают в пробирках (50 мл) с 5 мл жидкой питательной среды YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Посев ферментационной среды осуществляют в соотношении 1/10.
- Ферментацию проводят при 37°С на качалке (250 об/мин) в питательной среде YP с добавлением глюкозы (2 мас. %) в течение 5 дней. Через 24 ч культивирования начинают индукцию метанолом, который добавляют в количестве 3 об.%, затем такое же количество метанола добавляют на 48 ч культивирования. В качестве контроля используют штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584, содержащий экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS.
Продуктивность трансформантов О. haglerorum оценивают по активности секретированной фитазы. Для этого клетки трансформантов осаждают центрифугированием, а супернатант используют для определения фитазной активности модифицированным методом Фиске-Субарроу [J. Biol. Chem. 1925, 66, 376-400; J. Microbiol. Methods. 1999, 39(1), 17-22]. За единицу ферментативной активности фитазы (1 ед.) принимают количество фермента, способного высвободить 1 мкмоль неорганического фосфата из фитата натрия за 1 мин. в стандартных условиях (температура 37°С, значение рН 4,5, продолжительность гидролиза 30 минут).
Двенадцать независимо отобранных трансформантов культивируют в пробирках и определяют активность фитазы в бесклеточной культуральной жидкости. Результаты определения приведены в табл.1. В качестве контрольного образца используют штамм О. haglerorum ВКПМ Y-2584, содержащий экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS, активность фитазы у контрольного штамма не тестируется.
По результатам ферментации отбирают трансформант №2 с наибольшей активностью фитазы.
Повышения фитазной активности трансформанта достигают путем повторной трансформации штамма экспрессионной кассетой. Такую процедуру повторяют несколько раз.
Из хромосомной ДНК трансформанта №2 удаляют селективный маркер КтМХ методом рекомбинации по lox сайтам в присутствии Cre рекомбиназы [FEMS Yeast Res. 2014, 14, 1048-1054. DOI: 10.1111/1567-1364.12197]. Отбирают колонию, которая не растет на среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином в количестве 300 мкг/мл, но растет на полной среде без антибиотика.
Клетки из отобранной колонии трансформируют экспрессионной кассетой (фиг.1) и проводят ферментацию в пробирках 36 независимых трансформантов, из которых отбирают 10 трансформантов О. haglerorum, содержащих ген phyEc-mod и имеющих наибольшие значения активности (табл.2).
Трансформант О. haglerorum №25, продуцирует фитазу Е. coli с активностью 806 ед./мл за 120 ч ферментации в пробирках при температуре 37°С.
Представленные в таблице 2 значения активности фитазы трансформантов О. haglerorum - продуцентов фитазы Е. coli свидетельствуют об эффективной экспрессии синтетического гена phyEc-mod в дрожжах О. haglerorum.
Отобранный по результатам ферментации наиболее продуктивный трансформант №25, который синтезирует фитазу с активностью 806 ед./мл, депонируют в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1) как Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-4856.
Штамм характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:
При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.
При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях. В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.
Штамм способен синтезировать фитазу при культивировании в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) с последующей индукцией метанолом.
Активность фитазы заявляемого трансформанта Ogataea haglerorum 255 ВКПМ Y-составляет 806 ед./мл, что сравнимо с показателями известного продуцента фитазы P. pastoris. Заявляемый трансформант, в отличие от продуцента фитазы Р. pastoris, способен синтезировать и секретировать фермент при температуре культивирования 37°С. Эта особенность заявляемого трансформанта термотолерантных дрожжей О. haglerorum является перспективной для разработки более экономичной технологии культивирования и получения товарной формы ферментного препарата фитазы.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный
научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных
микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский
институт" (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика).
Акционерное общество «Биоамид».
State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial
Microorganisms of National Research Center «Kurchatov Institute»
(NRC «Kurchatov Institute» – GOSNIIGENETIKA).
Joint-stock Venture Bioamide.
<120> Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы
Escherichia coli.
<130>
<141>
<160> 1
<210> 1
<211> 1233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> синтетический ген PhyEc-mod, кодирующий фитазу Escherichia coli
<400> 1
cagagtgagc ctgagttgaa actggaatcc gttgtcatcg tctctagaca tggtgttaga 60
gcaccaacca aggccaccca acttatgcaa gatgtcaccc cagacgcttg gccaacctgg 120
ccagtcaagc tgggttggtt gacacctaga ggtggtgagc tcgttgctta cttgggtcaa 180
taccaaagac agcgtcttgt tgccaacgga ttgttggccg ataagggttg tccacaacca 240
ggtcaagtag ctattattgc tgacgtcgac gaaagaaccc gtaagacagg tgaagccttc 300
gccgccggtc ttgctcctga ctgtgccatt accgttcaca cccaagctga cacttctaga 360
ccagatccat tattcaaccc tttgaagact ggtgtttgcc aattggaccc agctaacgtt 420
actgacgcta tcttgtccag agctggagga tccattgctg acttcaccca acactaccag 480
actgccttca gagagttgga aagagttctt aacttcccac aatccaaatt gtgctttaac 540
cgtgagaagc aagacgaatc ctgttccttg actcaagcat taccatctga gttgaaggtc 600
tccgccgaca acgtctcttt gaccggtgct gtcagcttgg cttccatgtt gactgaaatc 660
tttcttctgc aacaagctca aggtatgcct gagccaggtt ggggtagaat caccgactct 720
caccaatgga acaccttgtt gtccttgcac aacgctcaat tcgacttgct gcagagaact 780
ccagaggttg ctagatccag agccacccca ttgttggact tgatcatggc tgctttgact 840
cctcacccac ctcaaaagca agcctacggt gttaccttgc ccacttctgt cttgttcatt 900
gccggtcacg atactaactt ggcaaatctc ggcggtgctt tggagttgaa ctggactctt 960
cctggtcaac ctgataacac tccaccaggt ggtgagctcg ttttcgaaag atggcgtaga 1020
ctatctgata actctcaatg gattcaggtt tcgttggtct accaaacttt gcagcagatg 1080
agagacaaga ctccactgtc tttgaacacg cctccaggag aagtcaaatt gaccttgcct 1140
ggatgtgaag agagaaatgc tcagggtatg tgttccttgg ctggtttcac tcaaatcgtt 1200
aacgaagcta gaatcccagc ttgttccttg taa 1233
<---
Claims (1)
- Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий фитазу Escherichia coli, содержащий в составе хромосомной ДНК оптимизированный синтетический ген PhyEc-mod, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021109268A RU2771079C1 (ru) | 2021-04-05 | 2021-04-05 | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021109268A RU2771079C1 (ru) | 2021-04-05 | 2021-04-05 | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2771079C1 true RU2771079C1 (ru) | 2022-04-26 |
Family
ID=81306463
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021109268A RU2771079C1 (ru) | 2021-04-05 | 2021-04-05 | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2771079C1 (ru) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586294A (zh) * | 2011-01-12 | 2012-07-18 | 上海市农业科学院 | 一种适于毕赤酵母表达的高比活植酸酶基因及其制备方法和表达 |
| RU2737623C1 (ru) * | 2019-12-03 | 2020-12-01 | Акционерное Общество "Биоамид" | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris с увеличенной продукцией фитазы Escherichia coli |
-
2021
- 2021-04-05 RU RU2021109268A patent/RU2771079C1/ru active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586294A (zh) * | 2011-01-12 | 2012-07-18 | 上海市农业科学院 | 一种适于毕赤酵母表达的高比活植酸酶基因及其制备方法和表达 |
| RU2737623C1 (ru) * | 2019-12-03 | 2020-12-01 | Акционерное Общество "Биоамид" | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris с увеличенной продукцией фитазы Escherichia coli |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NAUMOV G., NAUMOVA E. Ogataea haglerorum sp. Nov., a novel member of the species complex, Ogataea (Hansenula) polymorpha. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2017, 67:2465-2469. Найдено онлайн: https://www.microbiologyresearch.org/docserver/fulltext/ijsem/67/7/2465_ijsem002012.pdf?expires=1643043787&id=id&accname=guest&checksum=6C5C9B609B274DF13C9B4F8DDECC2D7C Дата обращения 26.01.2022. CHAROENRAT T. ET AL. High Cell Density Process for Constitutive Production of a Recombinant Phytase in Thermotolerant Methylotrophic Yeast Ogataea thermomethanolica Using Table Sugar as Carbon Source. Appl Biochem Biotechnol. 2016 Dec;180(8):1618-1634. doi: 10.1007/s12010-016-2191-8. Найдено онлайн: https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12010-016-2191-8 Дата обращения 26.01.2022. * |
| ТАРУТИНА М.Г. И ДР. Сравнительная характеристика фитаз из Citrobacter freundii и Yersinia intermedia, экспрессированных в метилотрофных дрожжах Ogataea polymorpha и Pichia pastoris. Биотехнология, 2019, Т. 35, N 6, с.51-56. Найдено онлайн: https://www.elibrary.ru/download/elibrary_41601469_27702767.pdf Дата обращения 26.01.2022. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111378585B (zh) | 用于表达外源基因的毕赤酵母突变株 | |
| CN107586789B (zh) | 高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用 | |
| KR101087760B1 (ko) | 신규한 재조합 효모 균주 및 이를 이용한 에탄올 및 목적단백질의 동시 생산 방법 | |
| JP7566748B2 (ja) | フルクトース利用の向上のために改変した微生物株 | |
| JP2023512309A (ja) | 高収量組換え微生物のためのシステムおよび方法ならびにその使用 | |
| RU2771079C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
| RU2701498C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент фитазы | |
| CN113736817A (zh) | 一种毕赤酵母中提高碱性脂肪酶分泌效率及酶活的方法 | |
| RU2701642C1 (ru) | Штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
| RU2355754C1 (ru) | ШТАММ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica - ПРОДУЦЕНТ ЛИПАЗЫ | |
| EP4032982A1 (en) | Novel promoter hasp1 of phaeodactylum tricornutum and signal peptide thereof, and use thereof | |
| RU2701308C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент ксиланазы | |
| JP6206408B2 (ja) | シゾサッカロミセス・ポンベ変異体の形質転換体、およびクローニングベクター | |
| US20230340077A1 (en) | Production of myoglobin from trichoderma using a feeding media | |
| RU2785901C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum - продуцент фитазы Escherichia coli | |
| RU2737623C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Pichia pastoris с увеличенной продукцией фитазы Escherichia coli | |
| CN113122461B (zh) | 单细胞蛋白生产菌及其应用 | |
| RU2764793C1 (ru) | Трансформант дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу, содержащий в составе хромосомы синтетический ген MANS | |
| RU2771582C1 (ru) | Трансформант дрожжей Komagataella phaffi - продуцент фитазы Citrobacter gillenii | |
| RU2795707C1 (ru) | Трансформант Ogataea haglerorum - продуцент термостабильной α-амилазы | |
| RU2756330C1 (ru) | Трансформант дрожжей Komagataella phaffii, продуцирующий фитазу Cronobacter turicensis | |
| RU2747782C1 (ru) | Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis | |
| RU2815882C1 (ru) | Трансформант Ogataea haglerorum - продуцент рекомбинантного химозина в активной форме | |
| KR101828580B1 (ko) | 자일로스 이소머라제의 분비발현을 통하여 자일로스를 탄소원으로 이용하는 방법 | |
| RU2828277C1 (ru) | Трансформант Komagataella phaffii, содержащий ген HAC1, продуцент рекомбинантного химозина Vicugna pacos в активной форме |