CN103045494A - 一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用，分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO:M2012342；本发明用毕赤氏酵母菌株进行甲醇蛋白生产，整个发酵周期在70～84小时间，缩短了发酵时间，提高发酵单罐产量到140公斤菌体蛋白干重/吨发酵液。

Description

一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用。 

背景技术

当前，世界各国都十分重视开辟蛋白质资源和研究其应用技术，并已取得了很大进展，其中工业化最快的是单细胞蛋白生产，被认为是解决人类蛋白质资源匮乏最有效途径之一。 

单细胞蛋白（Single cell protein，SCP）又称微生物蛋白，指的是从纯培养的微生物细胞中提取得到的总蛋白，可作为人及动物蛋白的补充。单细胞蛋白可用制糖、造纸、淀粉、木材加工等产生的废液来发酵生产，但受原料限制而产量太少。在单细胞蛋白中，能够进行工业化大量生产的是甲醇蛋白，它是以工业甲醇为原料进行微生物发酵而得到的第二代单细胞蛋白。与天然植物蛋白相比，它含有更丰富的氨基酸、矿物质和维生素，可以部分代替鱼粉、大豆、肉类及脱脂奶粉等喂养家禽。 

从上世纪60年代起，世界就有不少国家开始进行甲醇蛋白的研究与开发生产，至70年代后期，从事该项研究工作的单位达到近千家。1980年，英国帝国化学公司（I. C. I）建立了年产10万吨甲醇蛋白的生产装置。美国的菲利浦石油公司（Phillips）改进了发酵罐结构，在1983年开发出了生产甲醇蛋白的新工艺，获得了更高浓度的甲醇蛋白，并在中间试验基础上建成了年产2000吨的工业示范装置。随后，法国的石油研究院与泰克尼伯公司（IFP-Technip），瑞典的奥普劳特（Norprotein）公司，德国的赫斯特-伍德（Hoechest-Uhde）公司等也相继建立了实验装置。国内从上世纪70年代开始，有包括山西生物研究所、北京营养源研究所等10余家单位从事甲醇蛋白的研究工作，其中山西生物研究所于90年代完成了中试工作。但从世界范围来看，由于甲醇蛋白生产过程中水、电、气消耗较大，不能实现高密度发酵，生产成本较高而使得众多厂家未投入实际生产。 

近年来，全球气候与地质灾害频发，发展中国家的工业化进程加快致使大量耕地被占用，全球性的粮食危机已开始显现，全球粮食储备水平不足年消费量的15%，以大豆与玉米为主要原料的饲料行业受到严重冲击，人与动物争夺口粮的严峻现实迫使人们寻求新的蛋白质资源来代替谷物蛋白。 

单细胞蛋白具有丰富的氨基酸、矿物质及维生素，可制作食品添加剂供人类直接食用。酵母浓缩蛋白具有明显的香味，可用于食品增鲜剂，它还可以用作饲料蛋白，大规模替代谷物蛋白而减少粮食的用量。 

甲醇蛋白生产菌种有细菌，也有酵母菌，但利用酵母菌能实现高密度发酵而有利于提高产量，但是使用什么样的酵母菌和使用什么样的方法才能利用酵母菌实现高密度发酵已达到提高产量，至今均没有报道。 

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母及其应用，有效解决甲醇蛋白发酵生产过程中甲醇转化效率低、发酵时间长、单罐收率低的问题。 

本发明解决的技术方案是， 

一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，是分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342，保藏日期为：2012年9月12日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学；

一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，具体步骤如下：

（1）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得斜面种子，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，28-32℃摇床中200-300rpm振荡培养25-35小时，得一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量计的1%酵母提取物（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨（oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%葡萄糖、2%琼脂（北京奥博星化学试剂有限公司产品，公知技术，以下同）和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量计的1%酵母浸膏（Oxiod公司产品，公知技术，以下同）、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入YPD液体培养基（配制比例同上）30L和二甲基硅油20mL，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将培养好的500-600mL一级种子全部接入罐内YPD液体培养基中进行培养，培养条件为：培养温度30-32℃，通气量1.5～2vv/m，转速200-300rpm，培养24～30小时后，菌体OD₆₀₀值达到40~45，得二级种子；

（2）、无机盐培养基的制备：

无机盐培养基的配制：先在发酵罐中加入1m³水，然后称取以下各物质并依次加入到发酵罐中搅拌溶解（称取的量根据要配制培养液的体积来计算）：质量浓度为85%磷酸25kg/m³，磷酸氢二钾0.5kg/m³，氯化铵0.3kg/m³，二水硫酸钙0.2kg/m³，氯化钠0.5kg/m³，硫酸钾3kg/m³，七水硫酸镁2kg/m³，甘油25kg/m³，微量元素溶液4L/m³；所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜1.5g/L，碘化钾0.02g/L，一水硫酸锰0.5g/L，二水钼酸钠（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同）0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴（北京奥博星化学试剂公司产品，公知技术，以下同）0.3g/L，氯化锌20g/L，七水合硫酸亚铁19g/L，质量浓度为98%的硫酸4mL/L，生物素（又称维生素H）0.2g/L，对氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸钙0.05g/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜1.5g，碘化钾0.02g，一水硫酸锰0.5g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.3g，氯化锌20g，七水合硫酸亚铁19g，质量浓度为98%的硫酸4mL，生物素0.2g，对氨基苯甲酸0.05g和泛酸钙0.05g加水至1 L；；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用上述无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐内pH为4.5～5.0的2.5m³无机盐培养基中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同步骤（2）：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内无机盐培养基中溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度为12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉。

本发明用毕赤氏酵母菌株进行甲醇蛋白生产，整个发酵周期在70～84小时间，缩短了发酵时间，提高发酵单罐产量到140公斤菌体蛋白干重/吨发酵液。 

具体实施方式

以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明。 

一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，具体步骤如下： 

（1）、一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，是分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；

（2）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基（试管规格180mm×20mm）上，30℃培养48小时，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床中振荡培养约25小时，菌体OD₆₀₀达到3～4，显微镜观察发现菌体较大，圆形，每个菌体有2~3个芽，即为一级种子；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入30L的YPD液体培养基，20mL二甲基硅油作消泡剂，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将2瓶共500mL的一级种子接种至发酵罐中的YPD液体培养基中，培养条件为：培养温度32℃，通气量1.5～2vv/m，转速300rpm，培养24~30小时后，菌体湿重达到30~35g/L，OD₆₀₀值达到40~45，镜检观察菌体个大，出芽好，无杂菌，得二级种子；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的高温蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，发酵液中甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同上：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内培养液溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度增加到12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉，称重，25公斤/袋，包装。

经统计，本发明甘油总用量低于50～60公斤/吨，甲醇用量为100～120公斤/吨，发酵时间为72～84小时，本发明所述方法每生产1吨蛋白消耗甲醇约2.0~2.2吨，单批发酵结束后每升发酵液可获得120~140g菌体蛋白干基，甲醇转化率高达50%，发酵周期短、单罐收率低，而且经本方法生产获得甲醇蛋白干粉中不含甲醇，粗蛋白含量达55%以上，氨基酸总量可达50%，游离氨基酸含量约为40%，B族维生素含量约400mg/kg，是替代畜禽饲料蛋白的理想原料，并可按一定量替代鱼粉蛋白添加于动物饲料中，经毒理学试验结果，是一种安全、无副作用的的饲料添加剂，并经30吨发酵罐进行工业化中试表明，本发明实现了工业化生产，并取得了良好的效果，本发明甲醇转化率达高，发酵周期短、遗传稳定性和安全性好。 

Claims (3)

1.一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，其特征在于，分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342。

2.权利要求1所述的一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，得斜面种子，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，28-32℃摇床中200-300rpm振荡培养25-35小时，得一级种子；所述的YPD试管斜面培养基是由重量计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；所述的YPD液体培养基是由重量计的1%酵母浸膏、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入YPD液体培养基30L和二甲基硅油20mL，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将培养好的500-600mL一级种子全部接入罐内YPD液体培养基中进行培养，培养条件为：培养温度30-32℃，通气量1.5～2vv/m，转速200-300rpm，培养24～30小时后，菌体OD₆₀₀值达到40~45，得二级种子；

（2）、无机盐培养基的制备：

无机盐培养基的配制：先在发酵罐中加入1m³水，然后称取以下各物质并依次加入到发酵罐中搅拌溶解：质量浓度为85%磷酸25kg/m³，磷酸氢二钾0.5kg/m³，氯化铵0.3kg/m³，二水硫酸钙0.2kg/m³，氯化钠0.5kg/m³，硫酸钾3kg/m³，七水硫酸镁2kg/m³，甘油25kg/m³，微量元素溶液4L/m³；所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜1.5g/L，碘化钾0.02g/L，一水硫酸锰0.5g/L，二水钼酸钠0.2g/L，硼酸0.02g/L，六水合氯化钴0.3g/L，氯化锌20g/L，七水合硫酸亚铁19g/L，质量浓度为98%的硫酸4mL/L，生物素0.2g/L，对氨基苯甲酸0.05g/L和泛酸钙0.05g/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜1.5g，碘化钾0.02g，一水硫酸锰0.5g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.3g，氯化锌20g，七水合硫酸亚铁19g，质量浓度为98%的硫酸4mL，生物素0.2g，对氨基苯甲酸0.05g和泛酸钙0.05g加水至1 L；；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用上述无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐内pH为4.5～5.0的2.5m³无机盐培养基中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同步骤（2）：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内无机盐培养基中溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度为12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉。

3.根据权利要求2所述的一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母的应用，其特征在于，具体步骤如下：

（1）、一株高效转化甲醇生产单细胞蛋白的毕赤酵母，是分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2012342；

（2）、利用巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株生产单细胞蛋白的方法：

一级种子的培养：将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株 0.5mL用划线法接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，取2支培养好的斜面种子，每支用10mL无菌水将斜面种子全部冲洗下来，分别接种到2个装250mL YPD液体培养基的2L三角瓶中，置于30℃，220rpm的摇床中振荡培养约25小时，菌体OD₆₀₀达到3～4，即为一级种子；

二级种子培养：在50L发酵罐中加入30L的YPD液体培养基，20mL二甲基硅油作消泡剂，通入蒸汽对罐内培养基进行灭菌，灭菌温度为121℃，时间为30min，在对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样品也进行灭菌，灭菌结束后，用冷却水进罐体夹套对培养基进行降温，待温度降至30～35℃后，将2瓶共500mL的一级种子接种至发酵罐中的YPD液体培养基中，培养条件为：培养温度32℃，通气量1.5～2vv/m，转速300rpm，培养24~30小时后，菌体湿重达到30~35g/L，OD₆₀₀值达到40~45，得二级种子；

（3）、巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中高密度发酵：

巴斯德毕赤酵母HGD-01菌株在5m³发酵罐中采用无机盐培养基进行菌体蛋白生产：其中，罐中无机盐培养基装液量为2.5m³，用160℃以上的高温蒸汽对其进行灭菌，同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，灭菌结束后用冷却循环水对无机盐培养基进行降温，当罐内无机盐培养基温度降至30～35℃时，用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5～5.0，然后将二级种子30L全部接种到5m³发酵罐中进行发酵，发酵温度为30～32℃，通气量1.5～2vv/m，搅拌转速80-200rpm，24小时后，无机盐培养基中甘油耗尽，溶氧开始上升，开始流加甲醇，用甲醇检测仪器在线监测甲醇浓度，发酵液中甲醇浓度控制在0.8%～1.2%，每6个小时取样测定菌体OD₆₀₀值和湿重，45-50小时后，菌体湿重达到250-300 g/L，OD₆₀₀值达到42～45，此时发酵结束，收集发酵液；

（4）、将5m³发酵罐中的发酵液在30m³发酵罐中高密度发酵，30m³发酵罐中用的发酵培养基与5m³发酵罐中的发酵培养基相同，均为无机盐培养基，配制方法同上：

30m³发酵罐中装无机盐培养基20m³，用同（3）步骤中的灭菌方法灭菌结束后用质量浓度为35%的氨水调节无机盐培养基pH至4.5-5.0，将5m³发酵罐中的发酵液在发酵结束前12小时移种1m³到30m³发酵罐内的无机盐培养基中进行发酵，发酵温度30～32℃，控制罐内培养液溶氧为30-50%，搅拌转速100-150rpm，当无机盐培养基中甘油消耗完后，溶氧快速上升，溶氧达到70%以上时开始流加甲醇，流加甲醇速度为5L/h/m³，当菌体湿重达到125g/L后，甲醇流加速度增加到12～15L/h/m³，发酵54～60小时后，菌体湿重达到380～450g/L，镜检观察发现菌体个大，内容物较多，出芽数量较少，发酵终止；

（5）、甲醇蛋白提取：

将上述（4）步骤在30m³发酵罐中获得的发酵液经卧式离心机，离心机转速3000转/分钟，进料量5吨/小时，连续离心浓缩获得浓缩的菌体蛋白液，浓缩的菌体蛋白液收集到5m³发酵液储罐中，向储罐中加入1m³的清水，搅拌均匀，经喷雾干燥机进行喷雾干燥，调节进风口温度至140～160℃、出口温度至65-80℃，调节进料流量为1吨/小时，收集蛋白干粉，称重，25公斤/袋，包装。