CN111094542A - 用于从乳清或糖蜜获得蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及获得蛋白质浓缩物的方法，包括采用马克斯克鲁维酵母使乳清的乳糖成分或任何可发酵的甜味液体发酵。
Description
发明目的
根据本文件公开的本发明的目的是保护用于发酵乳糖和糖蜜以获得单细胞生物质的方法，所公开的方法允许获得用于在食品工业中的应用的50％至90％的范围内的高蛋白值的产品。
背景
生物技术是跨学科的应用科学分支，其将化学、生物学、生物化学、工程学和微生物学结合在一起以克服实际问题，包括优化成本和产量。生物技术的主要目标之一是改善对大量农业来源有机废物的处理和使用，试图寻找将这些污染源转化为从经济和工业角度来看有用的衍生材料的替代方法。致力于解决此问题的生物技术的最重要切入点之一是使用微生物作为工业过程的一部分，其中将廉价的或工业废弃底物用作选定微生物的能源，以合成新的商业价值化合物。许多是通过废弃底物的生物技术利用获得的衍生有机化合物。一些以微生物代谢活动的终产物或中间产物的形式获得，其被分泌在培养基中或在细胞之后工业提取(甲醇、甲烷、乙醇、B族复合维生素、乳酸和谷氨酸、类胡萝卜素、木糖醇等)。还可行的是产品本身就是微生物生物质，并构成高蛋白质含量的食物来源。
在十九世纪末期，首先在纯作物中分离出用于食品生产(面包店、制备酒精饮品、乳制品工业等)的微生物。
这种发展迅速导致人们对某些微生物、其活动及其产物(例如氨基酸、维生素、醇等)之间的关系有了更好的了解。当前，随着生物技术的巨大进步，微生物正越来越多地取代传统的方法，例如生产酶和维生素。这个领域引起了极大的兴趣，因为在不久的将来，随着人口迅速增长，但土壤和牲畜却没有增加，我们将发现缺少用于人类和动物饲料的蛋白质的问题。
解决这一问题的可能性之一是可以满足全球某些饲养需求的微生物。可能地，微生物最重要的潜在用途不是作为整体饮食，而是作为维生素蛋白质补充剂。
寻找获得用于人类和动物使用的富含维生素、氨基酸和微量元素的蛋白质产品的可能性是当前的关注点。可以为此目的实现的选择是微生物的作物，例如使用富含乳清或富碳水化合物的液体作为作物培养基。以这种方式，使用富含发酵所必需的基本元素的乳清组合物，进而有助于解决由于其高生物需氧量或生化需氧量(BOD)而产生其成分的生态问题。
为了获得这种产品，需要选择使用存在的碳水化合物例如乳糖(乳清的主要成分)作为其生长的碳源的微生物。在这些情况下，由于其组成和特征，最常见的选择是酵母。
世界人口的增长以及源自世界、尤其是中国和印度的繁荣的最佳饮食抑制了地球：估计到2050年，现今生产的作物和食物将翻一番。
从1900年到2050年，仅150年墨西哥的人口就从0.113亿增加至1.75亿；世界人口从20亿增加到90亿，从目前的70亿再增加20亿。
农业和畜牧业是造成地球污染的主要原因，而不是工厂和汽车。直到现在，我们相信人类在其生产粮食方面面临的巨大成本：全球变暖、温室气体排放、水储备的高消耗、生物多样性的损失以及由于泄漏而对河流和湖泊的污染。
当前的生产模式应受到限制，以防止会导致生态灭绝的无序增长。
使食物翻倍以养活人类的需要要求改变食物范式并且尊重环境。
在全球70亿人口中，有34％(24亿)是贫困的，并且大部分食物匮乏。
在墨西哥，食物的费用为每人每天45美元。这样，一个四口之家每月仅在食物上花费5,400.00美元。国家统计和地理研究所(INEGI/ENIEH)2012年的研究确定每个家庭的月收入：
·Decil I：2,332美元
·Decil II：3,931美元
·Decil III：5,244美元
这表明Decyl I和II省略了1或2次食物，而Decyl III的所有收入均用于食物。换句话说，3500万墨西哥人每天都在与饥饿作斗争。
改变生产方式(利用生物技术)并生产出大量质量优良、价格低廉的高营养食品似乎是一个很好的选择。
传统的生产方式无助于养活人类的目的，并将继续成为世界污染的主要问题，是食品工业的重要组成部分，产生含有高碳水化合物水平的残留物，将有机废物倒入下水道并对环境造成严重污染。这种废物产生难闻的气味，导致严重的疾病并损害土壤的肥力和水的质量。
根据尼尔森(Nielsen)2015年的报告，对高蛋白产品的需求将继续增长，迄今为止，市场报道，购买者的第三方正在积极寻找高蛋白产品。
饮食中较难获得的宏量营养素之一是蛋白质(蛋白质是进食中最昂贵的元素，因为其由动物来源的食物和某些蔬菜提供的)。工业过程倾向于用具有较低成本的碳水化合物和脂肪代替这种宏量成分，从而达到拟仿产品价格。
结果是热量的摄入，不利于均衡饮食。
表1.蛋白质缺乏对婴儿发育的影响
FAO建议每千克体重摄入0.8到1.2克蛋白质。
蛋白质是所有生物的细胞中发挥多种功能的物质。它们构成了组织基本结构的一部分，维持了细胞中所有必要的化学反应的连续且均匀地进行：
·它们构成组织(肌肉、肌腱、皮肤、毛发、指甲、神经系统、生殖系统)的基本结构的一部分。
·它们具有调节和代谢功能(营养素吸收，血液中氧和脂肪的运输，有毒或有害物质的失活)。
·限定每个生物身份的元素，因为它们是遗传密码(DNA)结构的基础。
·它们是免疫系统和识别外来生物体的系统的重要组成部分。
·它们有助于将酶和营养素质转运至细胞。
·它们是现代不同疾病的治疗的运载体。
蛋白质是由碳、氢、氧和氮原子组成的有机大分子，也可以包含硫、磷原子，并在较小程度上包含铁、铜、镁和碘，从而将它们分组以形成被称为氨基酸的化学结构。
蛋白质的变性对应于蛋白质三级结构的丧失，变性的蛋白质具有相同的非常开放的构象，并且与溶剂的相互作用最大，从而使水溶性蛋白质在变性后时不易溶于水而沉淀。变性可以通过温度变化、pH值变化而产生，并且在某些情况下可以恢复，这一过程称为复性。
蛋白质的“生物学价值”是仅存在于动物来源的蛋白质中的一组必需氨基酸。其通过向人类提供所有必需氨基酸的能力来定义。蛋白质的组成与人体蛋白质的相似性越高，蛋白质的生物质量就越大。实际上，母乳是可与饮食中其它蛋白质的生物学价值相比较的模式。
并非所有摄入的蛋白质都会被消化或吸收。某种蛋白质的净利用率或蛋白质净供应量是含氮量与生物体保留量之间的关系。
通常，建议健康成年人每天摄入40至60克蛋白质。FAO建议每千克体重每日0.8到1.2的值。在生长、怀孕或哺乳期间增加。
·在成长中，需求是成年人的两倍或三倍。
·这取决于肠道、肾脏的健康状况，因为通过粪便和尿液对氮的吸收或损失程度不同。
·包括消耗的蛋白质的生物学价值。
表2.蛋白质功能。
| 类型 | 实例 | 功能定位 |
| 酶 | 脂肪酸合成酶 | 催化脂肪酸的合成 |
| 保留 | 卵清蛋白 | 蛋白 |
| 转运 | 血红蛋白 | 携带氧进入血液 |
| 血液中的保护 | 抗体 | 阻止外来物质 |
| 激素 | 胰岛素 | 调节葡萄糖代谢 |
| 结构 | 胶原蛋白 | 肌腱、软骨、毛发 |
| 收缩性 | 肌球蛋白 | 肌纤维成分 |
氨基酸是构成称为蛋白质分子的基本单元，它们是几乎总是具有甜味的结晶物质，它们的特征是具有氨基(-NH2)和羧基(-COOH)。
氨基酸分为必需氨基酸和非必需氨基酸，有20种氨基酸，对于成人8种是必需的，对于婴儿有9种是必需的。
当蛋白质包含必需氨基酸时，就被称为具有高生物学价值。
表3.必需氨基酸和非必需氨基酸。
| 必需 | 非必需 |
| 异亮氨酸 | 丙氨酸 |
| 亮氨酸 | 酪氨酸 |
| 赖氨酸 | 天冬氨酸 |
| 蛋氨酸 | 半胱氨酸 |
| 苯丙氨酸 | 谷氨酸 |
| 苏氨酸 | 谷氨酰胺 |
| 色氨酸 | 甘氨酸 |
| 缬氨酸 | 脯氨酸 |
| 组氨酸 | 丝氨酸 |
| 精氨酸 | 天冬酰胺 |
| 牛磺酸(猫) |
在过去的200年甚至今天，酵母在酒精发酵和面包工业中的应用是周知的。这些微生物是具有优异功能和营养特性的新营养成分和添加剂的不竭来源。实际上，现在已经通过使用主要由生物技术提供的创新制造和分级技术提高了其相关性。
单细胞蛋白质是由在优化使用不同富集或非富集底物的受控发酵条件下生长的细菌、酵母或丝状真菌产生的微生物生物质。
单细胞蛋白质是由微生物生物质产生的，在我们的案例中，选择酵母具有以下优势：
1.快速生长。
2.简单廉价的培养基。
3.简单的处理系统。
4.无致病性。
5.低核酸水平。
6.高营养价值。
7.蛋白质浓度为40％至55％。
8.易于分离。
必需氨基酸谱是评估用于人类消耗的蛋白质的基本因素。就酵母而言，必需氨基酸例如赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸的浓度是令人满意的，但是，它们的硫化氨基酸含量例如甲硫氨酸和半胱氨酸含量低，这在浓缩过程中得以解决。
表3.多种产品的氨基酸含量的比较例
传统上，单细胞蛋白质已用在加工用于动物消耗的产品中，取得了巨大的成功。甚至是用于牛的生长和肥育的替代乳的配制。FDA允许将其应用于食品，例如调味剂、增强剂和增肉剂。但是，考虑到用于蛋白质纯化所应用的技术，由于核酸含量非常低，现在的发展允许应用于各种食品系统中。
酵母是最广为人知的微生物，最深入研究并通常为消费者较好接受。酵母几乎没有毒性或致病性，可用于人类食物。尽管蛋白质含量不超过60％，但是其必需氨基酸例如赖氨酸、色氨酸和苏氨酸的浓度是令人满意的，尽管其甲硫氨酸和半胱氨酸含量较低。酵母非常富含维生素(B族)，并且其核酸含量较低，为4％至10％。
酵母已被定义为微小的单细胞真菌，大多数通过出芽繁殖，有些通过切除繁殖。这组微生物包含约60个属和约500个物种。从历史上看，对酿酒微生物学的研究一直集中在属于酵母菌属(Saccharomyces)的酵母，其负责酒精发酵。以前认为只有它们参与酒精生产过程，但是，不同的非酵母菌属酵母，尤其是在发酵的初始阶段，也会影响酒精饮品的感官特性。直到1856年，路易斯·巴斯德(Luis Pasteur)才认识到酵母作为发酵剂的作用。酵母是发酵剂，存在着在外观、性质、繁殖形式以及转化糖的方式方面不同的许多物种。酒酵母属于数个属，每个属又分物种。分布最广的物种是葡萄酒酵母(Saccharomycesellipsoideus)、柠檬克勒克酵母(Kloeckera apiculata)和葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)，它们单独占酒发酵所用酵母的90％。像所有生物一样，它们在营养和生活环境方面也有精确的需求。它们对温度非常敏感，需要富含糖、矿物元素和含氮物质的适当饮食，繁殖周期短，这使得发酵开始如此之快，但随着繁殖的增加，它们会因上述变量的缺乏或过量而死亡。
文献Taron-Dunoyer A,Pérez-Mendoza J,Martínez-Zambrano J.“Obtención deproteína unicelular a partir de lactosuero”,Vitae第19卷,第1期,2012年1-4月，描述了从乳清中获得单细胞蛋白质的方法，其中将250ml乳清加7ml 10％的三氯乙酸用作培养基，通过加热使酪蛋白沉淀，将乳清澄清化并且灭菌，将生物质离心，弃去滤液，并将生物质蛋白质在30℃下干燥24小时，消耗了培养基中68％的乳糖。在该文献中不使用酶，因为起始原料(乳清)优选通过酵母乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)产生单细胞蛋白质。关于该文献中所述的内容，有必要使所使用的菌株不同于本申请中描述的本发明中使用的菌株(我们的马克斯克鲁维酵母(Kuyveromyces marxianus)菌株)对比于该文献中描述的方法中使用的乳酸克鲁维酵母，同时指出了在要求保护的方法中，可以使用或不使用脱蛋白的乳清，培养基不进行灭菌，营养混合物不同，在我们的方法中没有絮凝，并且在我们这种情况下，我们获得的最终产品是细胞内蛋白质，而不是酵母。
文献Marta Elena Cori de Mendoza等人“Obtención y caracterización dedos concentrados proteicos a partir de biomasa de Kluyveromyces marxianusvar.Marxianus cultivada en suero lácteo desproteinizado”.Revista Científica第16卷，2006年第3期描述了一种方法，其中使用脱蛋白和补充的乳酪乳清，通过补充硫酸铵将乳糖调节至1.5％，所使用的酵母为马克斯克鲁维酵母，使用基于有机硅的消泡剂进行发酵。该文献指出已经研究了用于生产单细胞生物质的多种底物，其中乳清由于低廉的价格和可获得性而被认为是最重要的底物之一，除外其通常是废水中的重要污染物的事实，这会导致净化设备运行中的严重问题。
因此，提出将其用作能够吸收乳糖的微生物例如马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus var.Marxianus)的发酵底物，目的是获得也被称为“单细胞蛋白质”微生物生物质。其蛋白质含量基于干重为40％至80％，并且与植物蛋白相比，其质量更类似于动物蛋白。然而，将单细胞蛋白质用于人类消耗有重要的局限性：细胞壁的存在，因为它们降低了蛋白质的生物利用度，还包含抗原性和变应原性因子；高核酸含量(基本上是RNA)，其可导致肾脏疾病和痛风，并且最后导致脱水的细胞生物质所表现出的功能性质降低。这些限制可以通过使用碱提取和等电沉淀制备蛋白质浓缩物来克服，例如针对热带假丝酵母(Cándida tropicalis)和马克斯克鲁维酵母描述的；然而，这还不够，因为必须通过化学方法或酶促方法降低核酸的水平。在化学方法中，最被接受的方法之一是用三氯氧化磷或替代地三偏磷酸钠进行磷酸化，其中从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中获得了蛋白质浓缩物，然后分别通过冷冻干燥或喷雾干燥等复杂的方法脱水。该文献中描述的结果表明，可以从生长在脱蛋白乳清中的微生物生物质马克斯克鲁维酵母获得蛋白质浓缩物。对于该微生物，获得的产率和细胞浓度值是令人满意的。
尽管所描述的是与本申请的保护的对象更相似的方法，但我们可以指出以下区别：在我们的方法中，我们不使用复合B族(维生素)，此外培养基不进行灭菌，也不进行三次热处理，尽管是碱提取，但在我们的情况下，有三个涉及酶(纤维素酶和蛋白酶)的过程，所获得的蛋白质是可溶的，因此应用有所不同，因为其不具有影响其在乳制品中或其整个食品工业范围内应用的味道和颜色，另一方面，在等电沉淀后，将蛋白质渗滤并通过超滤浓缩，将蛋白质含量提高至基于干重80％，在这种情况下，其从干乳清开始，在我们的情况下使用液体甜乳清或酸乳清，酸化介质是乙酸，在我们的情况下使用磷酸或任何有机或无机酸，提取温度不同，不是仅40℃，但我们在68℃温度进行了三次处理，添加酶，酸和碱的pH调节，蛋白质不在搅拌机中研磨并且通过喷雾干燥。
Páez G.等人的文献"Perfil de aminoácido de la proteína unicelular deKluyveromuces marxianus var.Marxianus",Interciencia第33卷,第44期,2008年公开了“克鲁维酵母属、念珠菌属(Cándida)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotorula)和酵母菌属(Saccaromycosis)的酵母对于生产单细胞蛋白质(PUC)是理想的。它们的特点是发酵代谢较弱，没有葡萄糖作用，并且在不同的底物上生长：糖蜜、乳酪乳清(克鲁维酵母)、甲醇(毕赤酵母)、甘蔗渣的酸性水解物(酿酒酵母和白色假丝酵母(Cándida utilis))、淀粉废水(许旺酵母属)、造纸工业的硫酸盐溶液或正构烷烃(念珠菌(Cándida))。该文献公开了当底物是乳清和糖蜜时，所选择的酵母是马克斯克鲁维酵母，其通过确定以下来检查：与国际(FAO)参考标准和卵蛋白质以及其它常规蛋白质来源相比，所述文献中获得的氨基酸谱显示马克斯克鲁维酵母的单细胞蛋白质中氨基酸含量的平衡分布，表明这种单细胞蛋白质(PUC)作为蛋白质来源的潜在用途。尽管该文献具有氨基酸谱，但是生产酵母的方法是标准的，并且在以下方面与我们的方法完全不同；在我们的情况下，可用于使用或不使用脱蛋白乳清，工作温度不同，我们的为38℃和pH 4.2，培养基未稀释，不对培养基进行灭菌，我们使用培养基，我们使用甜乳清或酸乳清，并且在第二次处理中获得了细胞内蛋白质而不是酵母，最后可以清楚，在该方法中，异氰酸苯酯用于提取氨基酸，然后进入柱子，使其对人类消耗不可见。
01/05/1994发布的西班牙专利文献ES 2 050 066公开了由以下三个不同阶段组成的方法：
1)本发明涉及乳清的处理。基本上由在先的脱蛋白，然后添加发酵所必需的多种营养素(主要是氮源、磷源、矿物质元素和维生素)组成，所述营养素已经研究并且固定在其水平以获得发酵过程的最佳培养基。因此，在本发明中，使用组成和预先优化的浓度的维生素复合物代替了通过添加高成本并导致泡沫形成的酵母提取物而分解到其它系统中的生长因子和维生素的输送。
以这种方式，实现了比较经济的方法，同时减少了泡沫的形成。发酵培养基最终在发酵之前进行巴氏灭菌处理。
2)发酵。在此步骤中，从前述培养物接种正在工作的发酵罐。不断给发酵罐充气，并控制变量pH、温度和充气量、以及泡沫形成，从而使整个步骤在无菌条件下进行。
3)分离/收集产物。通过连续离心从流出物中分离出富含蛋白质的酵母。可以倾倒流出物而具有最小的污染问题。将酵母乳膏储存在罐中，直至研磨、干燥并收集为最终产品。
本专利申请相对于该文献ES 2 050 066的处理对象的差异是：在我们的情况下，可用于使用或不使用脱蛋白乳清，工作温度不同，我们的为38℃和pH 4.2，培养基未稀释，培养基未灭菌，使用甜乳清或酸乳清，并且在第二次处理中获得了细胞内蛋白质而不是酵母。
Ghaly,A,M.Kamal.和L.Correia 2005年的文献"Kinetic modelling ofcontinuous submerged fermentation of cheese whey for single cell ProteinProduction",Bioresource Technology 96(2005),1143-1152公开了使用酵母脆壁克鲁维酵母(K fragilis)作为生化反应细胞和乳糖来发酵奶酪乳清来产生单细胞蛋白质，以产生细胞作为主要产物。
我们的方法与该文献中描述的方法的区别在于，我们可以使用或不使用脱蛋白乳清，工作温度不同，我们的为38℃和pH 4.2，培养基未稀释，不对培养基进行灭菌，使用甜乳清或酸乳清以及不同菌株。
Chinappi Italia和Sánchez Crispín José A.2000年的文献"Producción debiomasa de Kluyveromices fragilis en suero de leche desproteinizado",ActaCientífica Venezolana,51:223-230描述了利用来自成熟奶酪厂的乳清进行的研究的结果，通过酸热凝法脱蛋白(pH 4,5和90/-EC)并补充硫酸铵(1g/l)，这是用于通过定向有氧发酵产生酵母脆壁克鲁维酵母(Kluyvertoworms fragilis)的生物质的良好培养基。建立最佳实验条件，以在不同设计和容量的发酵罐中获得最大的生物质生产。对于15g/l的乳糖浓度、pH 4,5、30/-EC和0.25至1VVM的通气，倍增时间小于2小时，并且98％的乳糖被消耗。在这些条件下，获得了36％至49％(g生物质/g乳糖)的干重产率。生物质(未破碎的细胞)基于干重包含46％的蛋白质，并具有65％的“体外”消化率。发酵12小时后，培养基的有机载荷降低80％。本发明涉及消除污染废物并同时生产胰岛素的方法，该胰岛素可作为用于动物的动物浓缩物中的蛋白质补充剂而具有工业价值。用于这项工作的技术使用补充有低浓度的酵母提取物的废水废物作为培养基，用于产生具有高蛋白质和维生素含量以及充分的消化率的酵母脆壁克鲁维酵母的生物质。这种生物质可以用作用于动物饲喂的饲料的营养供应。同时，发酵过程除去了多于80％的来自乳的乳清的有机载荷，避免了造成境污染增加的因素。
该文献描述了一种方法，其中将新鲜液体乳清的一部分进行脱蛋白，第一个区别在于我们的乳清可以脱蛋白或不脱蛋白，并且可以是酸乳清或甜乳清；获得生物质，然后将其干燥然后用胃蛋白酶进行酶处理，这是主要区别，因为我们的方法允许从细胞中获得蛋白质，而无需干燥，并且使用纤维素酶和蛋白酶；将蛋白质使用丙酮纯化，然后洗涤，在我们的情况下使其经受等电点，然后通过在切向过滤系统(超滤)中进行渗滤而被纯化；将乳清稀释以将其乳糖含量调节至2％，在我们的情况下，这不会发生，我们从乳清开始，并且它是脱脂的，我们不添加维生素且营养补充系统也不同。
Zumbado-Rivera Wendy,Esquivel-Rodríguez Patricia,Wong-González Eric,2006年的文献"Selección de una levadura para la producción de biomasa:crecimiento en suero de queso",Agronomía Mesoamericana,17(2):151-160描述了选择酵母以生产生物质的的研究：在奶酪乳清中的生长，该研究是使用Turrialba白色奶酪制备工艺的乳清为底物进行。通过分批发酵系统中的生长比较了马克斯克鲁维酵母、乳酒假丝酵母(Cándido kefyr)和酿酒酵母物种，发酵时间确定总生产力和生物质的蛋白质含量表明，酵母物种马克斯克鲁维酵母是用于生产单细胞蛋白质的最佳选择，因为除了易于使用外，它其与其它酵母相比具有更短的发酵时间、更高生产率、相等的生物质蛋白质含量。
在这种情况下，该文献涉及鉴定用于优化限定底物上的生物质生产的特定酵母，前述方法是用于生产生物质的一般方法，但并非特定过程，在温度和营养成分下会影响我们的方法，从生物质中提取蛋白质，这是文献中未考虑的因素，而不会破坏细胞壁。
Buitrago Glorymar等人2008年的文献"Continue production of single cellprotein of Kluyveromyces marxianus var marxianus",Rev.Téc.Ing.Univ.Zulia,31(Especial Maracaibo)描述了在先前脱蛋白的乳清中乳糖浓度对马克斯克鲁维酵母ATCC8554的生长动力学以及b-D-半乳糖苷酶的产生的影响，该文献指出在用于人和动物消耗的单细胞蛋白质的产生中，使用的微生物是：酿酒酵母、产朊假丝酵母(Candida utius)、镰刀菌(Fusarium)和马克斯克鲁维酵母，后者是快速发酵浓度为4％至5％p/v的乳糖的微生物，乳糖是构成乳清干提取的干提取物中的重要部分的糖。研究表明，在低浓度的乳糖下可以以50％的产率获得马克斯克鲁维酵母的生物质，这为建立用作蛋白浓缩物的单细胞蛋白质的连续生产系统提供了可能性。
Degrossi Claudia和Wachsman Mónica 2004的文献"Estudio de algunascaracterísticas de las cepas de levaduras y de su rendimiento celularutilizando un medio de cultivo a base de suero lácteo",Universidad deBelgrano.Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Carrera de Licenciatura enFarmacia.Tesina.在这项工作中，使用乳清作为培养基评估了不同酵母菌株的细胞产量。首次分析了酵母菌株的微观和宏观特性(脆壁克鲁维酵母Mp-8、酿酒酵母Mp-12、土生假丝酵母(Candido humicola Mp-6)，然后证明了其使用乳糖作为碳源的能力，与这些菌株使用乳糖的能力有关的文献数据得到了证实。还可以使用蛋白酶(通过明胶的流化方法)和淀粉酶(通过碘染色)的存在，其可允许代替培养基成分的来源(例如，酒精饮品工业的副产品)。使用乳清作为培养基分别和作为整体比较了各个菌株的细胞产量。观察到二元培养具有更高细胞产量的趋势。
该现有技术与本文所述的方法的差异在于，在我们的情况下，我们可以使用或不使用脱蛋白乳清，工作温度不同，培养基未稀释，培养基未灭菌，可以使用甜乳清或酸乳清，并且在第二次处理中获得了细胞内蛋白质而不是酵母。
Araujo Karelen,Páez Gisela等人的文献"Efecto de la concentración delactosa sobre la cinética de crecimiento de Kluyveromyces marxianus varmarxianus y la producción deβ-galactosidasa"，研究了在先前脱蛋白乳清中乳糖浓度对马克斯克鲁维酵母菌ATCC 8554的生长动力学和βD-半乳糖苷酶的产生的影响。
与该现有技术文献的不同之处在于，在我们的方法中，可以使用脱蛋白乳清，工作温度不同，培养基未稀释，我们不对培养基未进行灭菌，我们在第二次处理中获得细胞内蛋白质而不是酵母，并且不使用乳糖酶。
发明详述
本专利申请中包含的发明提供了用于食物的最佳使用以及减少与排入排水系统和环境中的营养素废物相关的污染的解决方案。由于可以使用乳清、糖蜜、甘蔗渣，因此本发明基于可持续性并且可以在国家的不同地区复制。
乳清是奶酪生产过程中凝结的结果，通过使用肾素或凝结剂或酸化剂。黄绿色，不透明，并且含有6.0％至6.5％的固体。这约占乳的固体的50％。
乳清有不同的种类，基本分类可以认为是来自乳的甜乳清，其酸度为14至16°D，天然酸度为9至11°D(其中最有价值的)，pH 5.8-5.6；酸乳清，酸度大于16°D，pH 4.0至5.8，通常它来自直接酸化的奶酪或在切开凝乳前先进行成熟化的奶酪，并且最终盐化乳清含有来盐化过程的高水平盐。
对乳清有不同的处理，包括将其用作液体用于生产饮品、乳制品、乳制饮品，到生产高商业价值酶和氨基酸以及生产水。
乳清是宝贵营养素的丰富来源，可以说通过不同的工艺步骤可以将其回收以供人类食用。
自1980年代以来，由于世界人口的不断增加，一直鼓励生产单细胞蛋白质。
通常，已确定酵母中的蛋白质含量为45％至55％，加上含有低水平RNA的附加价值，从而可以将其用作食品补充剂，既可用于牲畜饲料中和也可用于人类食用。
本专利申请中包含的发明是用于发酵乳糖和糖蜜以获得单细胞生物质的方法，所述方法用于获得用于在食品工业中应用的范围在50％至90％的高蛋白值的产品。生产手段可以由奶酪乳清或糖蜜制备。在其中使用乳清的该方法的实施例的情况下，其将包含所有其余成分，特别是乳糖，这是供马克斯克鲁维酵母使用的碳源。
该方法允许从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得底物。乳清和高淀粉水浸出浓缩物代表了严重的污染源，通常生物需氧量等于60,000mg/L。
测量污染的BOD(生化需氧量)表明，每丢弃一升乳清，就会产生由0.68个人造成的等同的污染。并且尽管在某些情况下已经为乳清提供了附加值，但是从中回收蛋白质时，仍然存在如何处理渗透物和酸乳清的问题。
使用食品和发酵工厂操作中存在的允许使用高糖残渣或碳水化合物的简单系统，本发明可以增加产品的价值，在这种情况下，其并不代表强烈的进入(un ingreso fuerte)并有益于其应用的环境。
在过程中，特别是在发酵中，有一些参数需要测量以允许限定过程，主要参数是特定时间的生物质生产。由于在生物质发展中的重要性，选择能够在短时间内生长的菌株。因此，确定了待生产的蛋白质的量，从而确定了相应的经济因素。
尽管存在用于进行发酵的商业酵母，但更有效的是使用从待使用它们的区域开始的纯酵母培养物，这被称为选定的本地酵母，因为认为在微区域中发现的酵母是：区域特异性的，完全适应该区域的气候条件和原料，也就是说，必须发酵的是至少部分负责所获得的产品的独特特性。
因此，区域的固有特性可能是选择酵母时一个令人关注的方面，尽管还有许多其它因素也要考虑在内。这些参数的重要性可能是相对的，这具体取决于要使用它们的产品。
因此，为每种类型的发酵选择合适的菌株是非常重要的策略，一方面可以确保正确的发酵，而且可以改善最终产品的特性，因为酵母可以产生赋予所获得产品独特性的化合物，例如甘油、酯、高级醇等。
在评估酵母马克斯克鲁维酵母的生物技术应用时，不可能不考虑其它更受欢迎的物种，主要是酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母。第一种可能是生物技术行业中使用最广泛的生物催化剂，并且是生物学研究中的模型生物，而第二种已被选为负Crabtree模型。与酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母类似，有数个菌株已获得公认安全(GRAS)的事实表明，就监管机构的批准程序而言，与后者酵母相比，这方面对前者没有任何不利影响。科学界选择乳酸克鲁维酵母作为克鲁维酵母属的模式生物而不是马克斯克鲁维酵母的事实，不仅使人们对它的生理学有了更好的了解，并对其基因组进行了完整的测序，而且还导致了包括表达超过40种气象蛋白质在内的多种应用的发展。这在很大程度上归因于以下事实：研究人员从一开始就使用了很少量的分离的乳酸克鲁维酵母，而这并不是马克思克鲁维酵母物种的情况。
单细胞蛋白质是由微生物生物质产生的，并且在我们的情况下选自马克斯克鲁维酵母(酵母)，其具有以下优势：
1.快速生长。
2.简单廉价的培养基。
3.简单的处理系统。
4.无致病性。
5.低核酸水平。
6.高营养价值。
7.蛋白质浓度为40％至55％。
8.易于分离。
因此，酵母克鲁维酵母被选择为马克斯克鲁维酵母(K.m)，因为其具有高繁殖能力、产生生物质的能力和发酵碳水化合物的能力，在20小时的时间范围内产生相当于0.3g/l/H的生物质，并且蛋白质含量为32％。
用于酵母生长的底物及其发酵和精炼条件的变化将决定本发明涉及最终产品的组成。
所获得的蛋白质通常包含80％的氨基酸，12％的核酸和8％的铵，在本发明中，通过切向过滤将其消除。消化率和生物学价值很高，取决于纯化工艺，介于85％至97％之间。从生物学的角度来看，它具有非常高的价值。
存在多种用于培养乳微生物的培养基，实际上，任何包含乳糖、水和矿物质的培养基都有助于这些微生物的发育。
该方法开始于获得马克斯克鲁维酵母，其包含在-45℃的甘油中或在实验室中的环境中繁殖的菌株中，将该甘油引入预先灭菌且调整过的培养基中以正确繁殖菌株。根据以下配方制备发酵培养基：
| 描述 | 量，％ |
| 碳水化合物(乳糖或糖蜜) | 4.50 |
| 硫酸铵 | 0.60 |
| 硫酸镁 | 0.20 |
| 酵母提取物 | 0.60 |
| 磷酸一钾 | 0.60 |
| 尿素 | 0.40 |
| 水 | 93.10 |
| 总计 | 100.00 |
制备培养基，用浓磷酸或其它有机或无机酸的溶液将pH调节至4.0；在250℃、15psi压力下灭菌30分钟。
将其移出进行冷却，将pH恢复至3.8，冷却至38℃，并在无菌层流通风橱中转移所有甘油或制备培养物以允许其繁殖。
将其在轨道培养箱中于150rpm、38℃下孵育12小时进行扩大，遵循此程序直至达到10和30升的发酵量，在10至50升容量的发酵罐中继续扩大以达到工业水平的接种量，相当于工业水平要处理的总体积的1％。
在实验室发酵过程中，应控制泡沫的形成，添加基于有机硅的消泡剂，使用磷酸或有机酸或无机酸或NaOH或KOH(稀释至10％)来调节pH；温度不应超过40℃，也从36℃降低。每小时每升培养基添加1,22L空气，并寻求以饱和状态溶解氧；根据耗氧量和光密度的图，经过12至20小时的时间。通过大容量离心分离器收获生物质；对于该过程，分离器可以考虑通过喷嘴的分离器或应用膜。
为了达到碳水化合物的全部消耗，应使用相同的程序将含有乳糖的澄清物发酵至三次。
一旦获得了生物质，将其在饮用水溶液中稀释至10％总固体含量，并根据以下描述进行第一酶处理：
(应注意，废水将经过膜过滤处理和电渗析以回收饮用水)。
将生物质稀释至10％。
用磷酸将pH调节至6.8。加热至68℃，在120rpm下持续60分钟。
将温度调节至80℃，用氢氧化钠溶液或1％氢氧化钾将pH调节至9.0。
每千克生物质添加1g碱性纤维素酶，保持在该条件下15分钟。在一时间段之后，通过离心或通过膜分离生物质。储存澄清液，并对碎屑(生物质)进行第二酶处理；第一步，用磷酸将pH调节至6.8，并加热至68℃，保持60分钟。
用氢氧化钠或氢氧化钾将pH调节至9.0，并且分别向每千克获得的生物质中再次添加碱性纤维素酶和颗粒纤维素酶，并在80℃下保持15分钟。
再次通过离心分离或膜分离碎屑，并保留澄清液。
根据以下程序对碎屑进行第三酶处理：用磷酸将pH值调节至6.8，并且加热至68℃，保持60分钟的时间。
用氢氧化钠或氢氧化钠将pH调节至9.0，并以每千克获得的生物质1g的比例添加蛋白酶，并在80℃下保持15分钟。
再次通过离心分离或膜分离碎屑，并保留澄清的液体。
保留碎屑以备后用。
将澄清的提取物合并在一起，用碱性溶液将pH值调节至7.0，然后通过膜浓缩和蒸发进行浓缩，以除去大部分的盐分、糖分并将其浓度分别提高至30％和60％，然后干燥。
对产品进行干燥，干燥器的入口温度为140℃，干燥器的出口温度为71℃。
产量为每克碳水化合物0.83克蛋白质。
所使用的发酵培养基为：硫酸铵(0.15％)+硫酸镁(0.05％)+酵母(0.15％)+磷酸一钾(0.15％)+尿素(0.1％)+水+碳水化合物(乳糖和糖蜜)(4.5％)。用磷酸调节至pH＝4。将其在85℃下巴氏灭菌，pH＝3.8在38℃下以150rpm孵育12至20小时。添加有机硅进行泡沫控制，并用磷酸或1％NaOH调节pH，温度为36℃至40℃+1.22L空气/L培养基。
对生物质进行离心，并用水和1g/l六偏磷酸钠洗涤(以除去多余的糖)，然后用水将生物质稀释至10％总固体含量。对其进行第一酶处理，用稀酸将pH调节至6.8，在120rpm下加热至68℃/60分钟。将温度调节至80℃并且用1％NaOH溶液调节至pH 9.0，添加纤维素酶1g/kg生物质，保持在该条件下15分钟，将澄清液离心或用膜分离，储存澄清液并且对生物质进行第二酶处理：用酸将pH调节至6.8，并加热至68℃/60分钟。用颗粒纤维素酶NaOH和碱性纤维素酶1g/kg生物质将pH调节至9，80℃/15分钟；离心或通过膜处理，保留澄清液，并将获得的生物质进行第三酶处理：用稀酸将pH调节至6.8，以120rpm加热至68℃/60分钟。将温度调节至80℃并且用1％NaOH溶液调节质pH 9.0。添加1g/kg生物质的蛋白酶，80℃/15分钟，进行离心分离，保留液体并丢弃生物质。
合并蛋白质，并用碱性溶液将pH调节至7，通过膜和蒸发将其浓缩，其中除去盐分和糖分，在干燥前将其浓缩至30％和60％。在干燥器中140℃入口和71℃出口下干燥。
产量为0.12％蛋白质/g碳水化合物。
更具体地说，该方法包括以下步骤：
1.接收乳清：
一旦释放产物，将其通过连接到脱气排放泵的Tygon软管连接到排放管线。
2.送至冷却压机，在那里温度降低至4℃。
3.将产物保存在具有恒定搅拌的4℃的料仓中。
4.将其通过相应的阀组和泵排出，以送至巴氏灭菌器平衡罐，在那里蒸煮并达到85℃/15秒。
5.送至超滤膜平衡罐。
6.将渗透物送至储罐，并通过进料管线向储罐添加50％w/v营养素溶液。
待添加的营养素的比例如下表所示：
每克乳糖待添加的营养素
| 名称 | 量 |
| 乳糖 | 1.00 |
| 硫酸铵 | 0.15 |
| 硫酸镁 | 0.05 |
| 酵母提取物 | 0.15 |
| 磷酸一钾 | 0.15 |
| 尿素 | 0.1 |
| 水 | 98.4 |
| 总计 | 100.00 |
7.将其从储罐通过相应泵送至罐，并且从阀组送至板式交换器的平衡罐，以使产物处于85℃/1分钟，并将温度降至40℃，然后送至发酵罐。
8.在接下来分批发酵过程的情况下，发酵罐已经洗涤并且用卫生蒸汽灭菌，在连续工艺的情况下将根据需要根据工艺的需要继续进行。
在此阶段，应控制注入的空气量以保持在每升糖稀释液1.5升空气的比例，pH为5.6至4.6，搅拌保持在200rpm，温度在39℃至41℃的范围内，应通过二氧化硅计量来自动控制泡沫产生，将培养基用磷酸溶液酸化，以及用50％的氢氧化钠溶液碱化。
在分批工艺的情况下，其将发酵20小时，如果连续发酵，更换率为20％。
作为控制的一部分，应该计算以下的图形表示：氧气消耗、pH变化和温度以及生长曲线。
9.将产物泵送到倾析器或通过喷嘴的离心机中，在那里产物将分离为生物质和澄清物。
10.将澄清物送至储罐，在那里将等同于5％生产体积泵送至平衡桶，其余部分储存用于最后的纳滤和反渗透处理，以回收水用于服务和稀释酶处理。储存处理物以备后用(渗透物)，残留物将被丢弃(截留物)。
11.将所得的纯化的生物质泵送到肺罐中，用六偏磷酸钠(1g/升)缓冲的水溶液稀释，以除去碳水化合物。最终固体浓度应达到10％。
11A.将溶液泵送至通过倾析或通过离心喷嘴分离，其中将生物质泵送至第一酶处理，并且通过纳滤和反渗透处理进行澄清化。
11B.在酶处理罐中，将生物质稀释至10％总固体含量，通过板式交换器以将温度升至68℃。
12.一旦达到稀释，将pH升高至6.8，并保持一小时。完成之后，通过板式热交换器和相应泵以将温度升高至80℃，并通过添加氢氧化钠将pH值调节至8.0。每千克溶解在10％水中的基于干重的生物质还添加1.5g PG-02(颗粒中性纤维素酶)，从而保持15分钟。
13.将溶液通过泵泵送至通过倾析或通过离心喷嘴分离，其中将生物质泵送至第二酶处理，并且将澄清物送至蛋白质化肉汤罐储存，其中具有3％的总固体含量。
14.在第二酶处理罐中，将生物质稀释至10％总固体含量。通过板式交换器将温度升至60℃。
15.一旦达到稀释，将pH升高至6.8，保持一小时，完成后，通过泵送通过板式交换器以将温度升高至80℃，并通过添加氢氧化钠将pH调节至8.0。对于每千克溶解在10％水中的基于干重的生物质，还添加1.5g PG02和PG04(碱性蛋白酶浓缩物)，如此保持15分钟。
16.将溶液泵送至通过倾析或通过离心喷嘴分离，其中将生物质通过泵送至第二酶处理，并且将澄清物送至蛋白化肉汤罐储存，其含有2.8％的总固体。
17.在酶处理罐中，将生物质稀释至10％总固体含量，通过板式交换器使温度升至60℃。
18.一旦达到稀释，用磷酸将pH降至4.5，如此保持1小时。完成后，将其泵送通过板式交换器以将温度升高至80℃，通过添加氢氧化钠将pH值调节至8.0。对于每千克基于干重的生物质添加相同的1.5g Luco(纤维素酶浓缩物，AL2X)，如此保持15分钟。
19.将溶液泵送至通过倾析或通过离心喷嘴分离，其中将生物质泵送至收集容器，并且将澄清物送至蛋白化肉汤罐储存，其包含2.58％的总固体。
20.在储罐中，监测固体含量和蛋白质含量。根据具体情况，用氢氧化钠或磷酸将pH调节至6.8至7.0(达到2.8％的总固体和52％的蛋白质)。储罐必须装有搅拌器。从这里将其送至膜过滤系统以除去盐分并增加蛋白质含量。
21.通过泵送至超滤系统。
22.将截留物送至肺罐，在那里监测蛋白质、碳水化合物、盐的含量和pH值(在此阶段，达到蛋白质浓度为68％至70％，并且固体含量为9％)。其立即进入纳滤，其中达到蛋白质含量为80％，总固体为30％。下一步是电渗析，其中通过维持30％的固体并且同时除去核酸来达到92％的蛋白质含量，并且在此步骤中进行巴氏灭菌。一旦完成，将其送至蒸发处理，达到40％的固体含量。
23.然后，将浓缩产物在160℃至180℃的入口温度和60℃至80℃的出口温度下进行喷雾干燥。
24.最后，将其装袋(ensaca)并储存。
25.在超滤和纳滤系统中，将截留物泵入肺罐，在那里将其保持蒸发，在此阶段，通过板式交换器在60℃加热，将渗透物送至肺罐，以能够与其余的生物质澄清液和生物质洗涤水一起积累，以便随后送至超滤和反渗透。所有产物在进入过滤系统之前都要经过巴氏消毒，渗透物通过离子树脂和电渗析系统，以再利用系统中的水。截留物的水被丢弃。
最终产品可以用作白面包、甜面包、乳制品配方、水果饮品、玉米饼等的食品补充剂。
附图说明
在该方法的一个实施例中(图1)，其开始于接收乳清的步骤：
所述方法具有以下步骤；
1.接收甜乳清或酸乳清：
通过管件(pipa)或者通过管道(tubería)直接接收乳清，在通过管件的情况下，在到达时应称重并移至接收区域，一旦到达接收区域，对其进行间隔10分钟的搅拌，并且取样。
一旦取得500ml样品，将确定以下参数：
| 参数 | |
| 温度 | 6至8℃ |
| 酸度 | 14至16°D |
| 乳糖 | 4.5至5.0％ |
| 密度 | 1.018至1.022Kg/L |
| 总固体 | 6.0至6.05％ |
| 蛋白质 | 0.72至0.78％ |
| 抗生素 | 阴性 |
| 抑制剂 | 阴性 |
| 氯化物衍生物 | 阴性 |
| 脂肪 | 0.15至0.30％ |
| 醇稳定性 | 阴性 |
| 沸腾 | 阴性 |
| Rezasurina | 良好 |
作为乳清分批的处理过程的一部分，进行了感官分析，以确定：
| 指标 | 甜乳清 | 酸乳清 | 质量规范 |
| 气味 | 特征性 | 特征性 | 特征性 |
| 颜色 | 绿黄色 | 绿黄色 | 绿黄色 |
| 风味 | 特征性 | 特征性 | 特征性 |
此外，还确定了甜和酸两个品种的奶酪乳清的pH、密度、酸度、脂肪含量、干物质和粗蛋白以及乳糖、钙、磷的浓度。
值得一提的是，在乳清酸模式的情况下，pH和乳糖含量降低，并且酸度和盐含量增加。
一旦释放产品，将其通过连接到排气泵的Tygon软管连接到排放管线。
2.冷却
将获得的乳清送去澄清化，以除去悬浮的固体，然后送至通过平板压机冷却，在那里将与乳清发生冷冻液交换，以将温度降低至至少4℃，进一步在该步骤中，将控制例如以下的条件：温度、混悬液中固体的百分比、乳糖含量、蛋白质、酸度、稳定性、抑制剂和脂肪含量。
3.储存
将乳清送至料仓罐，该料仓设置为至少4℃的隔离，并在使用之前将乳清保持在那里，该料仓具有恒定搅拌、人员入口、CIP清洗系统、液位和通风。
在此阶段，将执行液位、温度以及输入和/或输出日期的记录。
4.脱脂和巴氏杀菌：
将乳清通过阀组排出，并通过管道和相应的泵送至巴氏灭菌器的平衡罐。
将乳清送至在80℃进行巴氏杀菌15秒，并且在此阶段，包括撇油器以最大程度地消除脂肪含量，使其至少0.25％，将其送至4℃的肺罐，所述罐具有搅拌并且应是隔离的，具有液位指示器、人员输入和CIP系统。
该步骤是关键控制点，因此要进行温度、压力、流量控制泵、转向阀、合适的平衡罐液位等的相应控制。
4之二.肺罐中的储存：
对乳清进行巴氏消毒后，其可能会或可能不会被送至确保最高温度为4℃的肺罐，肺罐应是隔离的，并具有搅拌、液位指示器、人员输入和CIP系统。
在此步骤中，存在微生物污染的风险，从而使健康(sanidad)和细菌控制过程成为关键的控制参数，此外，还应控制温度、停留时间、脂肪含量、rezasurine和酸度。
5.超滤：
为了给超滤器(UF)供料，应确保脂肪含量最大为0.02％并且rezasurine良好(4小时内未发生变化)，如果不满足这些参数，则膜将被覆盖并且保留器具有高数量。UF还浓缩细菌，因此这是细菌学和机械控制的关键点。
认为在该过程中每平方米膜的流量为每小时10升，最大压降为4巴，这是在选择超滤设备时需要考虑的。
将乳清通过阀组和相应的泵直接从肺罐排出到超滤系统，或直接送入超滤器的平衡桶。
在这种情况下，截留物是WPC 35，其将被送至相应的罐以根据现有方法进一步处理并获得WPC 80。
蛋白质的浓度为34％，固体含量为9％。
渗透物将包含乳糖，乳糖是允许酵母(马克斯克鲁维酵母)进一步生长的碳源，渗透物的蛋白质含量为3％到5％，总固体含量为5.5％，这具体取决于乳清的质量(甜乳清或酸乳清)。
6.发酵：
考虑到在出口处产物是无菌的，将渗透物送至发酵罐，该培养基将根据相应的配方进行富集(无机盐)并酸化至pH 4.6(磷酸)，应添加乳链菌肽以抑制任何细菌生长。
本发明的一个实施方案是分批过程，其中可以通过选择分批进料或连续发酵来选择，以优化过程。
发酵过程进行30小时的一段时间，接种1％。接种物的产生过程如下所述。
在这个关键控制点待控制的因素是，pH应保持在4.0至5.5的范围内，温度应保持在38℃，空气进给量应为每分钟每升培养基1.2体积的空气，其应该通过0.21微米的绝对过滤器过滤，并且不应该包含油，也就是说，其必须为经过消毒的空气，泡沫的产生通过有机硅消泡剂来控制，搅拌必须保持在150rpm的量级，优选的是海洋类型的8叶片，并且隔开1.5个距离直径。
7.生物质的收集：
在图2的情况或使用液态甜乳清的流程图中，该过程省略了乳清蛋白浓缩物(也称为WPC)的产生，实际上，在图示或图1的描述中，正如在第5点刚提到的，其被送至储罐，这是唯一的区别点，因为从这一点开始，两个过程是相同的。
在图3的情况下，工厂过程从接收糖蜜开始，然后进行稀释、澄清化并通过活性炭系统以完全遵循过程B的路径。
实际上，配方是相同的，但是只有糖改变成乳糖。
关于图示或图4，示出了接种物的繁殖，该过程由以下组成：将保存在-80℃的甘油中的纯马克斯克鲁维酵母菌株解冻，并倒入含有10ml马铃薯葡萄糖培养基的试管中，然后放入轨道培养箱中，两小时后将其倒入100ml烧瓶中，并在轨道培养箱中于38℃下再孵育4小时，然后倒入1升烧瓶中，重复操作以达到包含5升Ferbach的烧瓶，维持4小时的孵育。在此操作结束时，必须对10升接种物计数，可以将其添加到乳清或糖蜜培养基中，占总体积的1％或达到1000升，其应孵育8小时，并且可以用作10,000升反应器的接种物。
逐批重复此操作。
实例1
本发明涉及在IBT UNAM(墨西哥国立自治大学生物技术研究所)进行的蛋白质生产测试。
制备并且计算配方以确定测试开发过程中的要求，目的是为了确认文献中关于在富培养基中通过马克斯克鲁维酵母发酵乳糖的报道，以实现通过先前分析和提出的酶促方法生产蛋白质。要注意的是，根据理论研究，预期的生物质产量对应于存在的乳糖的50％。但是，添加氮源以允许更好地收获生物质。
首先，获得甘油，其在-40℃下并且含有来自其中的相应的微生物菌株。在培养基制备和灭菌时，将其留在环境中。
将接种物的生产过程修改为以下方式：
将甘油解冻，分为两部分，添加至一定体积的由100ml制备的培养基，在轨道培养箱中于37℃孵育，孵育时间为12小时。
用于此目的的配方如下：
| 乳糖 | 20克 |
| 硫酸铵 | 3克 |
| 硫酸镁 | 1克 |
| 酵母提取物 | 3克 |
| 磷酸一钾 | 3克 |
| 尿素 | 2克 |
| 水 | 1.97升 |
| 总计2升 | 固体浓度为1.66％ |
尽管发现固体含量略低，但这与以下事实更相关：人工乳清的生产中存在分裂以避免该过程中蛋白质的沉淀和分离，这涉及根据实验室环境的更复杂过程。
在接种培养物之前，灭菌的后果之一并且需要考虑的是pH升高，在这种情况下，其从4.2升至7.2，这使得有必要校正培养基的条件以达到至少4.5的酸度。
保持此pH值的目的是为了防止细菌的生长，尽管可以采取谨慎措施，但其可能在接种时改变发酵途径。
12小时后，在显微镜下检查培养物，其中观察到菌株的正确生长，应注意的是，为了验证在生长过程中产物繁殖的实际参数之一是250ml烧瓶的颈部的光环(halo)的出现。
一旦此完成，因为繁殖要重复进行，使用先前制备好并且在每个900ml Fernbach烧瓶中灭菌的剩余培养基，接种并送至保持相同工艺条件的轨道培养箱中，即150rpm搅拌，37℃孵育和12小时发酵。
当在显微镜前进行检查时，根据实验室观察，观察到丝状细菌的外观受到损害，观察测试的生存能力。同样，从产品中散发出的香气也不是酵母发酵和如果用细菌发酵的特征。
尽管建议中止该过程，但是考虑到细菌生长的生长培养基，决定继续进行30升发酵，调整pH参数，然后接种30升发酵罐，该发酵罐已包含根据以下配方制备的经灭菌的培养基：
| 乳糖 | 300克 |
| 硫酸铵 | 45克 |
| 硫酸镁 | 15克 |
| 酵母提取物 | 45克 |
| 尿素 | 30克 |
| 水 | 28升 |
(考虑到将接种2升制备好的培养物。
为确保该过程的成功，选择存在较少丝状生物体的Fernbach，并接种到30升发酵罐中，其应发酵8小时，然后在30升发酵罐中进行最终接种。这意味着30升发酵罐中的最终量为29升而不是30升。
再次，必须将培养基调节至pH 4.2，在灭菌之后增加至pH 6.60，以便在接种之前将pH调节至4.03。所用的发酵罐是Sartorius Biostat C Plus，根据以下来固定操作条件，首先，确定没有空气注入条件，以便根据搅拌器和设备控制来处理氧饱和度。设置以下操作条件：搅拌200rpm，pH 4.2±0.7，用10％的苏打调节pH，因为发酵会使发酵酸化，此时的氧饱和度为98.2％，孵育温度设置为37℃，以及用本发明涉及基于有机硅的消泡剂控制起泡，将消泡剂预先稀释至30％以防止进料系统的堵塞。
4小时后，在显微镜下监测发酵的进行，获得了预期的结果，丝状生物体的存在已经消失，并且在培养基中观察到酵母的正确生长。因此，决定终止发酵过程。
达到8小时后，设备面板的读数表明pH为3.69，氧饱和度为60％，变化为12.1％，与设备补偿相同，孵育温度为37℃，消泡剂消耗量为21ml，碱10％NaOH 10ml。
发酵培养基的气味已经是正确的，并且是酵母发酵的特征，当在显微镜下观察样品时，确定了培养过程良好，因此准备最终发酵阶段。
确定了18至20小时的最佳发酵时间。
制备接种物以从菌斑产生新的甘油，因为培养物是干净的，因此它们可以用于第二天，并产生新的甘油。
根据以下配方制备培养基：
| 乳糖 | 2.700千克 |
| 硫酸铵 | 0.405千克 |
| 硫酸镁 | 0.135千克 |
| 酵母提取物 | 0.405千克 |
| 磷酸一钾 | 0.405千克 |
| 尿素 | 0.270千克 |
| 水 | 265.680升 |
再次，尽管将培养基的pH值调节至4.2，但是灭菌后的pH值提高至6.60，因此在接种前将pH值调节至4.03，考虑到体积，决定将体积以及pH值降低一点，以利于酵母的成长，其在文献中报道的最佳生长范围为3.8至5.0，保留了最小范围或下限3.8，而上限为4.5。
在这种情况下，发酵罐为300升，通过21微米的绝对过滤器供给压缩空气，并且具有用于使用卫生蒸汽的输入以及用于提高温度的蒸气夹套。这是承受压力的容器，从而将设备的空气的工作压力调节到1巴，然后通过使用30升发酵罐软管通过使用卫生空气加压来供给产品。
在这个阶段，除了等待20个小时发酵外，别的都不用做，这是满足的，但是，在转移产品时，经发酵培养基的气味非常令人愉悦，并且已得到纠正。根据发酵的耗氧曲线，考虑到需氧量的减少(我们认为这是生长的间接指标)，决定在发酵开始后的15个小时停止发酵。
将其在封闭式离心机中以14,000rpm的速度进行离心，该离心机以8升/分钟、480升/小时处理，所获得的产物为浓缩糊状物，深色和令人愉快的气味，在此阶段具有特征性的味道和令人愉快的味道。
通过在2.9千克生物质中添加7升水进行稀释，以便在设备中进行处理，并且固体含量对应于9.28％。
由于用与报道不同的那些条件下发挥作用的另一国家来源的酶代替了颗粒中性纤维素酶，因此改良了该工艺阶段，其以每千克生物质1g的量添加。在此之前，用50v/v的溶解的氢氧化钠调节培养基，将产物加热至60℃，在6.8的pH值下保持60分钟，最后将温度降至50℃，将pH调节至5.5，添加酶，在保持220rpm的搅拌下使其反应15分钟。
对混合物进行离心，得到总共8.5升，固体浓度为3.0％，将碎屑回收并重悬，最终得到固体浓度为9.83％，以进行第二破碎步骤。
同样，将10升发酵罐Sartorios内的液体在保持220rpm的搅拌下加热至60℃的温度，并且用20％的溶解盐酸调节pH 6.8。60分钟后，将pH调节至9.0，并将温度调节至80℃，仅添加碱性蛋白酶浓缩物，这是因为颗粒中性纤维素酶在培养基的pH下是不相容的，应记住替换该酶。
15分钟后，将其再次离心，得到澄清物，其固体浓度为2.86％，最终体积为7.5升。再次将生物质重悬以得到固体含量为9.48％的液体，并进行第三酶处理，其如下进行：将液体放入10升发酵罐中，操作参数为220rpm，pH 4.5(再次用20％的盐酸苏打)在60℃下保持60分钟，然后用50％的溶解的氢氧化钠将pH调节至9，将温度升高至80℃以添加纤维素酶浓缩物AL2X。15分钟后，将其收获，丢弃碎屑并且产生8.5升澄清物。此时的固体含量为2.7％。
在所有三种情况下，使澄清物通过Westfalia澄清池以除去所有悬浮固体。
为了利用该时间，决定在Niro商用干燥机中进行第一酶提取物的干燥，最初以130℃进料，干燥器出口为60℃。
消耗浓缩物的前半部分后，发现蛋白质产量非常低，实际上相当于22克。决定通过将入口干燥温度调节至140℃并且出口为71℃来继续进行操作，从而提高了性能，但是在打开容器时，由于整个蛋白质都结块，因此可以确定干燥不充分。决定停止。
结果：
与乳糖含量有关的初始产量为每1.7克乳糖1克湿生物质，每克乳糖0.34克生物质。发现一个影响因素是可溶性氧浓度，其不能在所使用的设备中调节，因此需要三次发酵以实现最高的生产率。
另外，观察到该方法的重要后果之一是除去了固体和污染物溶质。
β-葡聚糖酶的替代显示了良好的结果，因为蛋白质浓缩物中的最终固体含量符合文献报道的结果。但是，鉴于失活的pH值，它不能用于第二阶段，因此建议回收原始酶。
鉴于存在阻止其干燥的乳糖，干燥问题显然与相同情况有关。两次第二提取效果更好，具有显著降低的乳糖含量，建议在酶处理之前向生物质提供温水洗涤。另外，发酵被限定为三次。
干燥过程中回收剩余的蛋白质，剩下1升样品，要求将pH值调节为7.01-7.2，使其与食品更加一致。
该蛋白质是咸的，因此建议重新考虑酸，从盐酸变为柠檬酸，并用氢氧化钾或氢氧化钙而不是氢氧化钠中和，以避免高氯化钠含量。
定义生物质收获后的乳糖或固体含量也很重要。如果低，则无需额外的发酵。
通过指定180℃的入口和100℃的出口，将干燥温度向上调节。
还应考虑通过冻干过程获得蛋白质的可能性。但是，根据最终干燥结果，可以在喷雾干燥系统中操作产品而不会出现问题，因此我们必须考虑冻干物是否与干燥竞争。
喷雾产品和冻干物之间存在与粉末密度有关的重要差异，其在冻干物中的密度更大，另一方面是分散性，冻干物的冷冻干燥溶液是通过喷雾获得的粉末的15倍。
进行测试，其中获得样品以确定通过本申请的方法获得的样品的氨基酸含量，并且将其与具有以下显示的结果的模式(patrones)进行比较，所显示的结果是针对各个样品并与模式相比较。
对鉴定为以下的两个样品测定氨基酸谱：白色单细胞蛋白质(INN-L14668)和深色单细胞蛋白质(INN-L14669)，将其交付给萨尔瓦多·祖比伦医学科学研究所和营养(Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán)进行测试。
实例2.对食品170白色单细胞蛋白质样品和深色单细胞蛋白质样品进行的氨基酸谱分析
样品：白色单细胞蛋白质(INN L14668)
报告：034/16/L
接收：2016-02-16
分析：2016-02-19
测试结果仅指所分析的样品。
认可的方法认可号：A-0099-007/11，于2011-11-23生效。
样品：深色单细胞蛋白质(INN-L14669)
报告：034/16/L
接收：2016-02-16
分析：2016-02-19
测试结果仅指所分析的样品。
认可的方法认可号：A-0099-007/11，于2011-11-23生效。
表3食品170和各种模式的氨基酸含量比较
实例3
进行了270升的测试。
材料：
| 原材料 | 量 | 单位 |
| 乳糖 | 3.000 | kg |
| 硫酸铵 | 0.450 | kg |
| 硫酸镁 | 0.150 | kg |
| 尿素 | 0.300 | kg |
| 酵母提取物 | 0.450 | kg |
| 磷酸一钠 | 0.450 | kg |
| 水 | 265.200 | 升 |
| 总计 | 270.000 | 升 |
方法：
1.制备培养基。
2.验证S.T.。用10％盐酸将pH调节至4.5。
3.在85℃下巴氏杀菌60秒。
4.将温度调节至35℃。
5.接种10％的培养物。
6.调节发酵参数，100rpm，空气1.22VVM，pH 4.5(确定光密度)，并保持在40℃。
7.使用消泡剂、苏打和10％盐酸调节pH，使其发酵20小时。
8.停止搅拌和通气，静置15分钟。
9.将生物质离心并获得生物质。
10.保留生物质，并丢弃肉汤。
11.将生物量调整为相当于在10％ST水(用饮用水稀释)的重量。
12.用10％V/V氢氧化钠将pH调节至6.8。
13.在持续搅拌下在60分钟内将温度升至60℃。
14.用10％氢氧化钠将pH值升至9.0。
15.添加在饮用水中稀释至10％的颗粒状中性纤维素酶(1g/kg生物质)。
16.将温度升至80℃并保持15分钟。
17.离心，储存生物质和肉汤。
18.用1/1的饮用水稀释生物质，并用10％的盐酸将pH调节至6.8。
19.用10％V/V氢氧化钠将pH调节至6.8。
20.在持续搅拌下60分钟内将温度升至60℃。
21.用10％氢氧化钠将pH值升至9.0。
22.添加在饮用水中稀释至10％的颗粒中性纤维素酶和碱性蛋白酶，二者均为1g/每千克生物质。
23.将温度升至80℃并保持15分钟。
24.离心，储存生物质和肉汤。
25.用1/1饮用水稀释生物质，用10％盐酸将pH调节至4.5。
26.在持续搅拌下60分钟内将温度升至60℃。
27.用10％苏打将pH值升至9.0。
28.添加在饮用水中稀释至10％的AL2X浓缩纤维素酶(1g/每千克生物质)，将温度升至80℃并保持15分钟。
29.将温度升至80℃并保持15分钟。
30.离心，储存肉汤并且丢弃固体。
31.将其通过超滤器并用5KD膜浓缩至4:1。
32.一旦收集了所有肉汤，确定干燥的蛋白质和固体含量。
33.将其在180-200℃下干燥，获得具有4％湿度的细粉。
工业应用
发酵乳糖和糖蜜以获得单细胞生物质的方法，其允许获得高蛋白产品，并且用作生产奶酪乳清或糖蜜的手段，以供马克斯克鲁维酵母用于获得单细胞生物质和随后的单细胞蛋白质，以及从所述方法中直接获得的产品，这些概念显然可以满足工业应用的需求。
应当指出，关于这一日期，申请人已知的实现所述发明的最佳方法是通过阅读本发明的说明书可以清楚地看出的。
尽管出于清楚理解的目的已经通过图示和实例的方式对本发明进行了详细描述，但是根据本发明的教导，对于本领域的普通技术人员而明显的是，可以对其进行变化和修改并且对其进行的改变不脱离本文(包括所附权利要求)描述的精神或范围。
Claims (9)
1.在充分描述了我的发明之后，我认为它是新颖的，因此要求保护我的专有财产，其内容
包含在以下条款中。
使用马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于包括以下步骤：
1.接收乳清；
2.送至冷却压机，在那里温度降低至约4℃；
3.将产物保存在具有恒定搅拌且约4℃的料仓中；
4.将产物通过阀组和泵排出，以送至巴氏灭菌器平衡罐，在那里脱脂并在85℃的温度下保持约15秒；
5.将产物送至超滤膜平衡罐；
6.将渗透物送至储罐，并通过进料管线向所述储罐添加50％w/v营养素；
7.将来自所述储罐的产物通过泵送至罐，并且从阀组送至板式交换器平衡罐，以使产物在85℃的温度下保持1分钟，然后将温度降至约40℃；
8.将产物送至发酵罐，在那里设备准备好控制待注入的空气体积，其必须保持在每升糖稀释液约1.5升空气的比例，pH为在5.6至4.6的范围内，搅拌保持在约200rpm，温度为在39℃至41℃的范围内，并且通过添加二氧化硅来控制泡沫的产生，将培养基用磷酸溶液酸化，以及用50％的氢氧化钠溶液碱化；
9.将产物通过泵送至倾析器或通过喷嘴的离心机中，以便将产物分离为生物质和澄清物；
10.将澄清物送至储罐，从其中将等同于约5％生产体积泵送至平衡桶，其余部分储存用于其最后的纳滤和反渗透处理以回收水；
11.澄清化所产生的生物质通过泵送至肺罐，通过用六偏磷酸钠(1g/升)缓冲的水溶液稀释以除去碳水化合物；
12. I.-将溶液通过泵送至通过倾析或通过喷嘴的离心机分离，从其中将生物质通过泵送至第一酶处理，并且将澄清物送至纳滤和反渗透处理；
13..在酶处理罐中，将生物质稀释至10％总固体含量，通过板式交换器并将温度升至约68℃；
14.一旦达到稀释，将pH升高至6.8，使其保持一小时，完成此之后，将其利用泵通过板式交换器并且将温度升至约80℃，通过添加氢氧化钠将pH值调节至8.0，对于每千克溶解在10％水中的基于干重的生物质添加1.5g颗粒中性纤维素酶，保持15分钟；
15.将溶液通过泵送至通过倾析或通过喷嘴的离心机分离，并且将生物质通过泵送至第二酶处理，并且将澄清物送至蛋白化肉汤罐储存，其中具有3％的总固体含量；
16.在第二酶处理罐中，将生物质稀释至10％总固体含量，通过板式交换器以将温度升至约60℃；
17.一旦达到稀释，将pH升高至6.8，保持一小时，完成后，通过泵通过板式交换器以将温度升至80℃，通过添加氢氧化钠将pH值调节至8.0，对于每千克溶解在10％水中的基于干重的生物质，添加1.5g颗粒中性纤维素酶和浓碱性蛋白酶，从而保持15分钟；
18..-将溶液通过泵送至通过倾析或通过喷嘴的离心机分离，并且将生物质通过泵送至第二酶处理，并且将澄清物送至蛋白化肉汤罐储存，其含有2.8％的总固体；
19.在第三酶处理罐中将生物质稀释至10％的总固体含量，通过板式交换器使温度升至60℃；
20.一旦达到稀释，用磷酸将pH降至4.5持续1小时，完成后，通过泵通过板式交换器以将温度升至80℃，通过添加氢氧化钠将pH值调节至8.0，对于每千克基于干重的生物质添加1.5g浓纤维素酶AL2X，保持15分钟；
21.将溶液通过泵送至通过倾析或通过喷嘴的离心机分离，并且将生物质通过泵送至收集容器，并且将澄清物送至蛋白化肉汤罐储存；
22.在储罐中，核实固体和蛋白质的含量，适当地用氢氧化钠或磷酸将pH调节在6.8至7.0，并保持搅拌；然后将其送至膜过滤系统以去除盐并增加蛋白质含量；
-将其通过泵送至超滤系统；
23.将截留物送至肺罐，在那里核实蛋白质、碳水化合物、盐含量和pH，立即进行纳滤；
24.下一步是进行电渗析，同时除去核酸，并且在此阶段进行巴氏灭菌，一旦完成，将其送至蒸发处理；
25..-将浓缩产物在160℃至最高180℃的入口温度和60℃至80℃的出口温度下进行喷雾干燥；
26.-最终装袋并储存；
27.-在超滤和纳滤系统中，将截留物通过泵送至肺罐，在那里保持蒸发，在此阶段通过板交换在60℃加热，将渗透物送至肺罐，以能够与其余的生物质澄清液和生物质洗涤水一起积累，以便稍后送至超滤和反渗透。
2.根据权利要求1所述的使用马克斯克鲁维酵母发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于在步骤6)中营养素的添加根据以下关系完成：
。
3.根据权利要求1所述的使用马克斯克鲁维酵母发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于当所述原料为糖蜜时，所述方法从接收糖蜜开始，随后进行稀释、澄清化并通过活性炭系统，然后所述方法的其余部分继续不变。
4.根据权利要求1所述的使用马克斯克鲁维酵母发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于所述方法可以从接种物的繁殖开始，开始于保存在-80℃的甘油中的马克斯克鲁维酵母的纯菌株，将其解冻，倒入装有10ml马铃薯葡萄糖培养基的试管，并放入轨道培养箱中，2小时后，将其倒入100ml烧瓶中，并在38℃的轨道培养箱中再孵育4小时，然后将其倒入1升烧瓶中，并重复操作，直到达到5升烧瓶，并保持孵育4个小时。
5.根据权利要求1所述的使用马克斯克鲁维酵母发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于在步骤8)中如果所述方法是分批式的，则发酵进行20小时。
6.根据权利要求1所述的使用马克斯克鲁维酵母发酵乳糖和/或糖蜜以从甜乳清、酸乳清或任何可发酵的含糖液体或高淀粉水中获得单细胞生物质的方法，其特征在于在步骤8)中如果发酵过程是连续的，则更换率为20％。
7.直接从根据权利要求1至6的方法能够获得的蛋白质产品。
8.直接从权利要求1至6的方法能够获得的蛋白质产品的用途，其特征在于其用作乳制品、面粉和果汁饮品的补充剂。
9.直接从权利要求1至6的方法能够获得的蛋白质产品，其特征在于其具有以下氨基酸含量：
。
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