CN114874925A - 一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法，属于饲料加工技术领域。本发明从葡萄中筛选到一株克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri 16，本发明将此菌株应用于利用水稻秸秆糖化液发酵生产菌体蛋白。本发明利用克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri16通过半固态发酵的方法，以水稻秸秆为发酵原料，发酵得到的饲料中粗蛋白、真蛋白及氨基酸含量得到显著提升，消化率也更高。在饲料加工方面具备良好的应用前景。

Description

一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法

技术领域

本发明涉及一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法，具体涉及一种利用水稻秸秆半固态发酵生产菌体蛋白饲料的方法，属于饲料加工技术领域。

背景技术

菌体蛋白(microbial protein)，也叫微生物蛋白或单细胞蛋白，是指利用各种基质物料大规模培养细菌、真菌、藻类等微生物而获得的含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸以及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。生产菌体蛋白的微生物多样，可以在短时间内快速繁殖产生大量微生物菌体，得到更多的菌体蛋白，缓解人畜挣粮的现象。菌体蛋白所含的营养物质极其丰富，其中，蛋白质含量高达40％～80％，氨基酸组成较为齐全，含有人体必须的8种氨基酸，对改善动物的营养吸收，提高其生长有较好的促进作用，是解决蛋白质短缺的有效途径之一。

水稻秸秆含有丰富的木质纤维素，非常适用于微生物转化得可发酵性糖和生产菌体蛋白。我国每年水稻秸秆产量达2亿多吨，其中用于饲料的水稻秸秆仅占总产量的23.8％。水稻秸秆利用微生物技术生产菌体蛋白饲料，是反刍动物重要的粗饲料来源。为了高效开发水稻秸秆资源，需要预处理技术打破植物细胞壁中木质素与碳水化合物的链接，提高微生物水解酶对其纤维素和半纤维素的酶解糖化效率，再通过微生物发酵技术生产高附加值蛋白质，提高稻秸饲料的消化率，满足农业需求，避免秸秆对环境造成污染。

生物质酶法糖化的工艺成本问题是阻碍水稻秸秆商业化的关键，菌酶协同发酵可以充分降解底物，而一般情况下，产酶条件和酶解条件存在一定差异，通过微生物半固态发酵(原位酶解糖化)水稻秸秆可以得到更多的还原糖，抑制某些有毒有害物质产生，提高饲料安全性。相比液态发酵，半固态发酵更适合真菌产酶，具有容积产菌体蛋白率高的特点。

利用半固态发酵工艺发酵水稻秸秆生产菌体蛋白饲料运用于畜牧业，能够替代部分日常口粮，降低成本增加水稻的经济价值，同时还能缓解稻秸资源过剩的问题，缓解其带来的环境污染。

发明内容

本发明从葡萄糖中筛选到一株适于以秸秆糖化液为原料发酵生产菌体蛋白的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16，与常用于产单细胞蛋白的酿酒酵母和产阮假丝酵母相比，Pichia kluyveri 16能够更充分利用秸秆糖化液所得的还原糖等，产生更多的菌体蛋白，既使秸秆资源得到了充分的利用，也对保护环境作出了巨大贡献，具有较高的社会效益和经济效益。同时本发明提供了利用Pichia kluyveri 16发酵水稻秸秆半固态生产菌体蛋白的方法，该方法既能在短时间内获得更多还原糖，同时霉菌菌丝在中温酶解条件下并不会完全死亡，当恢复至酵母发酵温度时仍可以继续发酵产酶降解秸秆，使秸秆降解最大化。

本发明的第一个目的是提供一株能够发酵秸秆糖化液生产菌体蛋白的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16已与2022年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022488，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明的第二个目的是提供含有所述的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16微生物菌剂。

在一种实施方式中，所述微生物菌剂中含有不少于10⁶cfu/mL或10⁶cfu/g的菌体。

本发明的第三个目的是提供一种生产蛋白饲料的方法，所述方法是将克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16或含有在半固态条件下发酵水稻秸秆生产菌体蛋白，具体方法为：

(1)向含有水稻秸秆、麸皮和/或丢糟的固态培养体系中添加黑曲霉，28℃恒温培养，发酵产酶60～72h；

(2)发酵产酶结束后，向培养基中加入pH4.5～5.0的柠檬酸缓冲液，放置于45～50℃，原位酶解糖化20～30h；

(3)原位酶解后冷却至室温，添加克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16，在25～32℃下发酵3～4d；

(4)发酵后的培养基中即含有粗蛋白，将培养基烘干、粉碎，即得到菌体蛋白。

在一种实施方式中，水稻秸秆与麸皮或丢糟的质量比为3～4:1。

在一种实施方式中，所述固态培养体系包含固态培养基1和固态培养基2；

所述固态培养基1中含有水稻秸秆和麸皮，以无机营养液为水分，初始含水量为50～70％，无机盐营养液每升中含有(NH₄)₂SO₄ 3.5％(w/v)、MgSO₄·7H₂O 0.5％(w/v)、KH₂PO₄2％(w/v)、微量元素液10mL、吐温-80 1mL，原位酶解糖化后得到半固态反应体系1；

所述固态培养基2中含有水稻秸秆、麸皮、丢糟，质量分数为1％的膨润土和质量分数为2.5％的尿素，初始含水量为60％～70％，原位酶解糖化后得到半固态反应体系2。

在一种实施方式中，固态培养基1和2的初始pH为4.0～5.0。

优选地，固态培养基1的初始pH为4.0；固态培养基2的初始pH为5.0。

在一种实施方式中，步骤(1)所述黑曲霉为黑曲霉CICC 40273。

在一种实施方式中，按照7％～9％的量添加菌浓为1.05×10⁷～1.05×10⁹cfu/mL的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16，所述7％～9％的量为每单位质量g或每单位体积mL分别添加0.07～0.09mL的菌液。

优选地，按照9％的量将克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16添加到半固态反应体系1中。

优选地，按照7％的量将克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16添加到半固态反应体系2中。

在一种实施方式中，将水稻秸秆烘干粉碎，利用体积分数为1.0％～1.5％的NaOH溶液在50～60℃下处理水稻秸秆粉末25～35h，结束后用水清洗并烘干。

本发明的第四个目的是提供了所述的克鲁维毕赤酵母菌或所述微生物菌剂在生产菌体蛋白中的应用。

本发明的有益效果：

本发明从葡萄中筛选到一株克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri 16，本发明将此菌株应用于利用水稻秸秆糖化液发酵生产菌体蛋白。

本发明将所述克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri 16添加至半固态培养基中，发酵生产菌体蛋白的方法，与传统固态发酵相比，半固态发酵前期完成培菌产酶和酶解糖化，能够产生更多酶充分降解水稻秸秆，后期接种克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri 16发酵产菌体蛋白，粗蛋白饲料产量较未发酵前整体得到显著提高。发酵后饲料中真蛋白含量也较未发酵前有显著提升，比原水稻秸秆提升了1.7倍，比预处理水稻秸秆提升了2.2倍，且发酵后的饲料更易消化、各种氨基酸含量也更高。

采用水稻秸秆半固态发酵生产菌体蛋白，不仅提高了秸秆资源的利用率，同时本发明使用克鲁维毕赤酵母菌Pichia kluyveri 16生产菌体蛋白的生产方式降低了饲料蛋白成本，有着良好的经济效益和社会应用前景。

生物材料保藏

本发明所提供的克鲁维毕赤酵母，分类命名为Pichia kluyveri 16，已于2022年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022488，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为产菌体蛋白初筛和复筛图：A和B分别为初筛和复筛。

图2为yeast 16菌落形态图。

图3为yeast 16基于16S rDNA序列的系统发育树。

图4为克鲁维毕赤酵母菌生理耐受性试验图。

具体实施方式

1、麦芽汁培养基：麦芽汁，0.2％氨苄青霉素钠，1％丙酸钠，琼脂2％，自然pH值，115℃灭菌15min。

2、酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose，YEPD)液体培养基：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母浸出粉1％，琼脂2％，蒸馏水l L，自然pH值，121℃灭菌20min。

3、CMC-Na种子培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g、蛋白胨3g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、葡萄糖0.5g、H₂O 1000mL、pH自然。

4、水稻秸秆产糖培养基：(NH₄)₂SO₄ 2g、KH₂PO₄ 3g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、微量元素液10mL、吐温-80 0.5mL、H₂O 1000mL、pH 5，另外添加水稻秸秆30～35g。

5、碳源同化培养基(质量体积比)：(NH₄)₂SO₄ 0.5％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄0.1％，酵母膏0.02％、碳源2％，蒸馏水1L；12l℃灭菌20min。

6、氮源同化培养基(质量体积比)：葡萄糖2％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，KH₂PO₄0.1％，酵母膏0.02％、氮源2％，蒸馏水1L；12l℃灭菌20min。

7、0.1％诺维信纤维素酶购自诺维信生物技术有限公司，产品型号为CellicCTec3 HS。

8、酿酒酵母CICC 32236、产阮假丝酵母CICC 32834和黑曲霉CICC 40273，均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

9、真蛋白含量测定：

真蛋白是指除去非蛋白质氮以外的蛋白氮所计算得到的蛋白。在测蛋白之前对样品进行前处理洗去非蛋白氮，然后按照测粗蛋白的方法测定蛋白质，所得到的就是真蛋白含量。

样品前处理：准确称取0.5～1g样品(精确到0.0001g)装入250mL锥形瓶，加入75mL沸水，继续电炉加热煮沸15～30min，边煮边间歇摇匀防止糊底，分别依次加入20mL的2.5％NaOH溶液和20mL的10％硫酸铜溶液，摇匀，再微沸一段时间，取下冷却2h以上或过夜，用定性滤纸过滤，热水冲洗沉淀5次以上，热水最好70～80℃有助于洗脱，可滴加几滴5％氯化钡溶液和几滴2mol/L盐酸溶液检查烧杯中的滤液至不产生白色沉淀BaSO₄为止，将剩余沉淀和滤纸一起放入60～70℃烘箱烘干，用测粗蛋白方法测蛋白，即得真蛋白，以空白定性滤纸做对照。

10、不同发酵饲料营养物质的测定：

按照国标GB/T 6432、GB/T 6432、GB/T 20805、GB/T 20806、NT/Y 1459和GB/T6438的测定方法检测了各物质的粗蛋白、粗脂肪、纤维素、半纤维素、木质素和粗灰分等指标。

实施例1：菌株的筛选

1、菌株的分离筛选与鉴定

(1)酵母菌的分离筛选

将酿酒的夏黑葡萄捏碎，取100mL葡萄汁带皮，常温下过夜自然发酵24～48h。用纱布过滤葡萄汁发酵液，取50mL滤液，先稀释3倍，得到150mL稀释液。再采用十倍稀释平板法，取1mL上述稀释溶液十倍稀释到合适倍数。将原稀释液和不同倍数的稀释液涂布在麦芽汁培养基平板上，28℃恒温培养1～2d。挑选45株单菌落酵母菌在YEPD固体培养基中培养48h，转接几代划纯，制作斜面，4℃冷藏保存，备用。

(2)秸秆糖化液制备

水稻秸秆预处理：将田间收集的水稻秸秆用铡刀铡成1～3cm的小段烘干，备用。按照固液比1:10的量加入浓度为1.3％的NaOH溶液、55℃处理水稻秸秆段30h，水洗烘干备用。

糖化液制备：

①黑曲霉粗酶液制备：用接种环取1～2环活化后的黑曲霉CICC 40273于CMC-Na种子培养基中，150r/min、28℃发酵24h得种子液，接种5％黑曲霉种子液至产糖培养基培养5d发酵产酶，发酵结束后离心提取粗酶液并测定粗酶液中的成分，粗酶液中主要含有纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶，其中FPA酶活为0.312IU/mL；β-葡萄糖苷酶活为0.542IU/mL、CMC酶活为0.316IU/mL。

②用预处理后的秸秆段配制成液态产糖培养基：按体积比5％接种黑曲霉种子液至水稻秸秆产糖培养基，250mL锥形瓶装液100mL，水稻秸秆3g，发酵产酶30～36h，用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至4.5～5.0，同时加入10mL发酵5d的粗酶液或10mL浓度为0.1％(w/v)诺维信纤维素酶，升温至50℃酶解1d，取样离心取上清液，DNS法于540nm测还原糖，还原糖含量为8～10g/L的糖化液，即为水稻秸秆糖化液培养基。

(3)产菌体蛋白菌株的筛选

将前面筛选到的45株酵母菌和常用于产单细胞蛋白的酵母菌酿酒酵母CICC32236和产阮假丝酵母CICC 32834，分别接种于水稻秸秆糖化液培养基中，发酵24h，测OD比较其利用秸秆糖化液的能力。由图1A结果可知，选择初筛的生长快且好的五株菌株：16、25、31、43、产朊假丝酵母进行复筛。

由图1B结果可知，25和43利用秸秆糖化液生长所得酵母菌体蛋白的粗蛋白含量在p＜0.5时显著性差异不大，菌体所含粗蛋白含量相对较低；16、31和产阮假丝酵母的粗蛋白含量在p＜0.5时差异不显著，16号菌粗蛋白含量最高。

综上可知，菌株16相比常用的产蛋白菌株——产阮假丝酵母和酿酒酵母更适用于发酵秸秆糖化液产菌体蛋白。

(4)菌株形态观察

将yeast 16在YEPD固体培养基中划线后于28℃恒温培养箱中培养2d，取出观察菌株的菌落形态。如图2所示，该菌落表面粗糙、干燥、高凸起、微皱、呈乳白色；边缘褶皱不透明。在光学显微镜10×100和扫描电镜下观察，能明显观察到酵母的细胞核、液泡及细胞壁，该菌株呈椭圆形或橄榄形，有凸起芽孢。

(5)菌株的分子生物学鉴定

将上海派森诺生物科技股份有限公司反馈回来的测序结果(序列如SEQ ID NO.1所示)上传至NCBI网站进行比对分析，用MEGA-X以邻接法对菌株26S rDNA基因序列进行系统发育分析，构建菌株的系统发育树(图3)。由结果可知，yeast 16与Pichia kluyveri序列相似度最大为99.82％。经查阅资料(国家标准品网)，克鲁维毕赤酵母菌属于毕赤酵母属，呈球形、椭圆形，菌落呈圆形的凸起的乳白色菌落，繁殖方式是通过多边芽殖的方式进行无性繁殖，产生子囊孢子，与上面形态观察时的结论一致。最终确定16号酵母菌为克鲁维毕赤酵母菌(Pichia kluyveri)。

实施例2：克鲁维毕赤酵母菌的性能

(1)糖类发酵试验

鉴定所需化合物共有7种，为葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、可溶性淀粉。按培养液的2％(2g/100mL)分别加入上述糖到糖发酵培养基中(成分与碳源同化培养基相同)，分装到试管，试管内倒置杜式小管一支。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃培养1～2周，观察菌株生长状况，是否有气泡，有气泡记为阳性(+)，无气泡记为阴性(-)，结果如表1所示：筛选得到的克鲁毕赤酵母菌除了能利用葡萄糖、果糖发酵产气之外，还能利用蔗糖和可溶性淀粉产气，但产气不多，还能利用麦芽糖产少量气，不能利用乳糖、半乳糖。

(2)碳源同化试验

碳源有13种：葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、纤维二糖、核糖、木糖、棉子糖、海藻糖、D-甘露糖、L-鼠李糖。将上述糖加入到碳源同化培养基中，糖含量为2％(2g/100mL)。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃条件下培养2～3d，观察是否浑浊并于OD_600nm下测吸光值，另以不接种任何糖源作空白对照。结果如表1所示：筛选得到的克鲁毕赤酵母菌在有氧条件下，能同化葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、棉子糖、D-甘露糖等6种碳源，半乳糖、麦芽糖、海藻糖等同化效果较差，不能同化乳糖、核糖、纤维二糖、L-鼠李糖。

(3)氮源同化试验

氮源有5种，为硝酸钠、硫酸铵、硝酸钾、亚硝酸钠、蛋白胨。将上述氮源加入到氮源同化培养基中，氮含量为2％(2g/100mL)。将活化后的酵母菌接入到上述培养基中，28℃条件下培养2～3d，观察是否浑浊并于OD_600nm下测吸光值，另以不接种任何氮源做空白对照。结果如表1所示：筛选得到的克鲁毕赤酵母菌能同化利用尿素、(NH₄)₂SO₄、KNO₃、蛋白胨，不能同化亚硝酸钠。

表1.酵母菌生理生化实验

实施例3：克鲁维毕赤酵母菌的生理耐受性试验

测定克鲁维毕赤酵母菌对温度、pH、葡萄糖、酒精、SO₂、高渗氯化钠溶液的耐受性。

将活化后培养到对数期的P.kluyveri 16以5％(V/V)的接种量分别接入含有10mLYEPD培养基的试管中，放于摇床培养，在温度28℃、转速150r/min条件下培养1d，发酵完后试管用涡旋振荡器混匀，测OD_600nm值，绘制耐受性曲线。

结果分析：由图4可知，P.kluyveri 16OD随着温度的升高先上升后下降，温度超过40℃菌不生长，在低温4～15℃时P.kluyveri 16生长较差，在25℃生物量达到最高(图4A)；P.kluyveri 16OD随着pH的升高先上升后降低，在pH 4～9生长良好，pH 9时OD最大，pH超过9时，OD快速下降，P.kluyveri 16更喜酸性、中性和微碱性(图4B)；P.kluyveri 16OD随葡萄糖含量先上升后下降，当浓度为20％时OD达到最大，当浓度为70％时，基本不生长(图4C)；P.kluyveri 16耐酒精浓度9％，超过9％基本不生长(图4D)；P.kluyveri 16SO₂耐受性较好，随SO₂浓度增大一直减小，但减小趋势较平缓，当SO₂浓度在500mg/L～600mg/L时，P.kluyveri 16OD迅速下降，当SO₂浓度为600mg/L时，P.kluyveri 16基本不生长(图4E)；P.kluyveri 16对高渗氯化钠耐受性较差，其OD随着氯化钠浓度的增长而迅速下降，当NaCl浓度为120g/L时，P.kluyveri 16基本不生长(图4F)。

实施例4：克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵水稻秸秆产菌体蛋白饲料

(1)水稻秸秆与麸皮固态发酵、半固态发酵产菌体蛋白饲料

黑曲霉种子液的制备：先从斜面接一环黑曲霉到平板上，培养4天长出孢子后，用5mL0.1％(V/V)吐温-80生理盐水冲洗孢子，稀释2～3倍，进行活菌计数，菌悬液浓度为1.0×10⁷～1.5×10⁷cfu/mL，然后按照10％(v/v)接种量接种到种子培养基中，培养24h，制成黑曲霉种子液。

培养基：固态发酵培养基1：水稻秸秆粉末与麸皮的比例3:1(总固态物料为6g)，以无机盐营养液为水分，初始水分为60％，无机盐营养液初始pH 4；(无机盐营养液：(NH₄)₂SO₄3.5％、MgSO₄·7H₂O 0.5％、KH₂PO₄ 2％、微量元素液10mL、吐温-80 1mL、自来水1L)。

①固态发酵：向固态发酵培养基1中接种20％秸秆降解菌黑曲霉CICC 40273，28℃恒温培养，发酵产酶60h，(每隔6h摇瓶翻动一次)；

②半固态发酵：将固态发酵产酶60h后的培养基拿出，加入50mL pH为4.8的柠檬酸缓冲液，放回原位，将温度升高到50℃，原位酶解糖化24h，取出冷却至室温，按照9％(每单位质量g或每单位体积mL分别添加0.09mL)的量接种1.05×10⁷～1.05×10⁹cfu/mL的酵母菌16，28℃，150r/min(或0r/min)，发酵4d，倒入平板60～70℃烘干，粉碎，测粗蛋白。

(2)水稻秸秆与麸皮的全固态发酵产菌体蛋白饲料

培养基：固态发酵培养基1：水稻秸秆粉末与麸皮的比例3:1(总固态物料为6g)，以无机盐营养液为水分，初始水分为60％，无机盐营养液初始pH 4；(无机盐营养液：(NH₄)₂SO₄3.5％、MgSO₄·7H₂O 0.5％、KH₂PO₄ 2％、微量元素液10mL、吐温-80 1mL、自来水1L)。

①产酶：向固态发酵培养基1中接种20％秸秆降解菌黑曲霉CICC 40273，28℃恒温培养，发酵产酶72h，(每隔6h摇瓶翻动一次)；

②发酵：将固态发酵产酶72h后的培养基拿出，冷却至室温，按照9％(每单位质量g或每单位体积mL分别添加0.09mL)的量接种酵母菌16，混匀，28℃(0r/min)，发酵3.5d，倒入平板60～70℃烘干，粉碎，测粗蛋白。

(3)水稻秸秆与麸皮、丢糟固态发酵、半固态发酵产菌体蛋白饲料

培养基：固态发酵培养基2：水稻秸秆:麸皮:丢糟的比例为3:1:1(总固态物料8g)，膨润土1％(w/w)，尿素2.5％(w/w)，含水量70％，初始pH 5。

①固态发酵：向固态发酵培养基2中接种20％秸秆降解菌黑曲霉，28℃恒温培养，发酵产酶72h，(每隔6h摇瓶翻动一次)；

②半固态发酵：将固态发酵产酶72h后的培养基拿出，加入50mL pH为4.8的柠檬酸缓冲液，放回原位，将温度升高到50℃，原位酶解糖化24h，取出冷却至室温，按照7％(每单位质量g或每单位体积mL分别添加0.07mL)的量接种1.05×10⁷～1.05×10⁹cfu/mL的酵母菌16，28℃，150r/min(或0r/min)，发酵3.5d，倒入平板60～70℃烘干，粉碎，测粗蛋白。

(4)水稻秸秆与麸皮、丢糟全固态发酵产菌体蛋白饲料

培养基：固态发酵培养基2：水稻秸秆:麸皮:丢糟的比例为3:1:1(总固态物料8g)，膨润土1％(w/w)，尿素2.5％(w/w)，含水量70％，初始pH 5。

①产酶：向固态发酵培养基1中接种20％秸秆降解菌黑曲霉CICC 40273，28℃恒温培养，发酵产酶72h，(每隔6h摇瓶翻动一次)；

②发酵：将固态发酵产酶72h后的培养基拿出，冷却至室温，按照7％(每单位质量g或每单位体积mL分别添加0.07mL)的量接种酵母菌16，混匀，28℃(0r/min)，发酵3.5d，倒入平板60～70℃烘干，粉碎，测粗蛋白。

表2.不同发酵工艺饲料中粗蛋白含量比较

结果分析：由表2可知，秸秆与麸皮和丢糟固态培养基发酵饲料的粗蛋白含量整体比秸秆与麸皮固态培养基发酵得到的蛋白饲料高13.87％～33.54％，半固态原位酶解发酵工艺饲料蛋白比全固态发酵工艺较优，粗蛋白含量可提高15.33％～35.26％。全固态发酵时，秸秆与麸皮和丢糟培养基发酵的饲料蛋白比秸秆与麸皮培养基高13.14％。

实施例5：不同发酵饲料营养物质的测定

(1)以未发酵水稻秸秆为对照，测定各发酵蛋白饲料的常规营养物质，比较发酵前后秸秆饲料的营养物质变化。

表3.不同发酵饲料营养物质含量

结果分析：

在发酵过程中添加麸皮和酒糟是为了补充氮源和微生物所需的微量元素，减少无机营养元素的成本，满足微生物生长需求。发明人在前期试验中，也做了秸秆与麸皮、秸秆与酒糟及不含麸皮、酒糟的秸秆为发酵样品发酵前后的粗蛋白含量的对比，发现麸皮与酒糟的添加并不是粗蛋白含量增加的原因。

由表3可知，两种发酵饲料的粗蛋白相比未发酵秸秆有很大提高，比原水稻秸杆分别高1.1倍和2.7倍，比预处理水稻秸秆分别高了1.7倍和2.9倍；且秸秆与麸皮和丢糟发酵饲料粗蛋白22.9％比秸秆与麸皮发酵饲料粗蛋白17.5％高5.4％。

两种发酵饲料的纤维素、半纤维素相比未发酵秸秆都有所降低。秸秆与麸皮发酵饲料的纤维素、半纤维素相对原水稻秸秆的降解率分别为59.3％和53.1％，相对预处理水稻秸秆的降解率分别为70.1％和44.1％；秸秆与麸皮和丢糟发酵饲料的纤维素、半纤维素相对原水稻秸秆的降解率分别为60.7％和52.3％，相对预处理水稻秸秆的降解率分别为71.1％和43.2％。

粗脂肪发酵前后变化不大；木质素发酵后相对有所提高，可能是因为木质素未被消耗，发酵后的物料基数有所减小，导致木质素比例变大。粗灰分发酵后有所下降。

(2)蛋白饲料真蛋白的测定

表4.不同发酵饲料真蛋白含量

结果分析：由表4可知，预处理水稻秸秆真蛋白含量比原水稻秸杆稍许降低，两种发酵饲料的真蛋白性比未发酵秸秆有很大提高，但两种发酵饲料真蛋白含量没有显著性差异。两种发酵饲料真蛋白含量比原水稻秸杆都提高了1.7倍，比预处理水稻秸秆都提高了2.2倍。

实施例6：发酵饲料体外消化试验

用体外消化法来模拟动物肠道消化吸收的生理作用，在体外通过测定加酶前后饲料蛋白消化率的变化，可对发酵饲料效果进行评估。直接用胃蛋白酶配制酶液，模拟动物胃环境酶解消化饲料样品，消化2.5h，测定消化前后样品粗蛋白含量，计算粗蛋白体外消化率。

表5.不同发酵饲料粗蛋白体外消化率

结果分析：由表5可知，预处理水稻秸秆的粗蛋白体外消化率较原水稻秸秆有所增加，两种发酵饲料的粗蛋白体外消化率达50％以上，相比未发酵秸秆有很大提高，秸秆与麸皮发酵饲料的粗蛋白体外消化率比原水稻秸秆提高了82.5％，比预处理水稻秸秆提高了70.3％；秸秆与丢糟和麸皮发酵饲料的粗蛋白体外消化率比原水稻秸秆提高了93.2％，比预处理水稻秸秆提高了80.3％。

实施例7：发酵饲料氨基酸测定

严格按照国标GB/T 18246-2000测定秸秆饲料发酵前后氨基酸成分和含量的变化。准确称取1.0g(精确到0.0001g)秸秆饲料，水解成单一氨基酸后进行离子交换色谱法分离、测定，用相应的混合氨基酸标准工作液做对照，对分离氨基酸进行分析测定。

表6.不同发酵饲料氨基酸含量

结果分析：由表6可知，水稻秸秆发酵前后都有17种氨基酸，发酵饲料的氨基酸相比未发酵水稻秸秆成倍增加，基本都是2倍以上。原水稻秸秆中胱氨酸和蛋氨酸基本没有，发酵饲料分别增长了10倍多和4倍多。

实施例8：克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16微生物菌剂的制备

取200～600μL的Pichia kluyveri 16接种于10～30mL YPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待Pichia kluyveri 16达到10⁸cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依次加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)和冷冻保护剂(15％(w/v)的蔗糖溶液)，待细胞浓度不低于10⁷cfu/mL时，真空冷冻干燥处理得到固体菌剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川轻化工大学

<120> 一种利用克鲁维毕赤酵母菌半固态发酵产蛋白饲料的方法

<130> BAA220629A

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 572

<212> DNA

<213> Pichia kluyveri

<400> 1

gctcagtagc ggcgagtgaa gcggcaagag ctcagatttg aaatctcacc tagtgtgcga 60

gttgtaaatt gcaggttgga gtctcgggtt agacgtgtgt gcaagtccct tggaacaggg 120

tgccactgag ggtgagagcc ccgtagcgtg catgtcgaca cctgtgaggc ccttctgacg 180

agtcgagttg tttgggaatg cagctctaag tgggtggtaa attccatcta aggctaaata 240

ttggcgagag accgatagcg aacaagtact gtgaaggaaa gatgaaaagc actttgaaaa 300

gagagtgaaa cagcacgtga aattgttgaa agggaagggt attgggctcg acatgggatt 360

tacgcatcgt tgcctctcgt gggcggcgct ctgggttttt cctgggccag catcggtttt 420

cgttgcagga taaggacaat tggaatgtgg ctcctcggag tgttatagcc ttttgtagat 480

gctgcgtatg gggaccgagg gctgcggcgg actcgtttcg tctcggatgc tggcacaacg 540

gcgcaatacc gcccgtcttg aaccccggac ca 572

Claims (10)

1.一株克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)，已于2022年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022488。

2.含有权利要求1所述克鲁维毕赤酵母菌的微生物菌剂。

3.一种生产蛋白饲料的方法，其特征在于，所述方法是利用权利要求1所述克鲁维毕赤酵母菌或权利要求2所述微生物菌剂在半固态条件下发酵水稻秸秆生成菌体蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法为：

(1)向含有水稻秸秆、麸皮和/或丢糟的固态培养体系中添加黑曲霉，28℃恒温培养，发酵产酶60～72h；

(2)发酵产酶结束后，向培养基中加入pH4.5～5.0的柠檬酸缓冲液，放置于45～50℃，原位酶解糖化20～30h；

(3)原位酶解后冷却至室温，添加所述克鲁维毕赤酵母或所述微生物菌剂，在25～32℃下发酵3～4d；

(4)发酵后的培养基即为含有菌体蛋白的饲料。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，水稻秸秆与麸皮或丢糟的质量比为3～4:1。

6.根据权利要求3～5任一所述的方法，其特征在于，按照7％～9％的量添加菌浓为1.05×10⁷～1.05×10⁹cfu/mL的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri 16。

7.根据权利要求3～6任一所述的方法，其特征在于，所述固态培养体系包含固态培养基1和固态培养基2；

所述固态培养基1中含有水稻秸秆和麸皮，以无机营养液为水分，无机盐营养液每升中含有(NH₄)₂SO₄ 3.0％～4.0％(w/v)、MgSO₄·7H₂O 0.2％～0.6％(w/v)、KH₂PO₄ 1％～3％(w/v)、微量元素液5～10mL、吐温-80 1～2mL，原位酶解糖化后得到半固态反应体系1；

所述固态培养基2中含有水稻秸秆、麸皮、丢糟，质量分数为1％的膨润土和质量分数为2.5％的尿素，原位酶解糖化后得到半固态反应体系2。

8.根据权利要求3～7任一所述的方法，其特征在于，固态培养基1和2的初始pH为4.0～5.0。

9.根据权利要求3～8任一所述的方法，其特征在于，固态培养基1和2的初始含水量为50％～70％。

10.权利要求1所述的克鲁维毕赤酵母或权利要求2所述的微生物菌剂在生产菌体蛋白中的应用。

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