CN105368730A - 一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法 - Google Patents
一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法，公开的是一株能同使发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法，解决了现酿酒酵母不能利用木糖和纤维二糖生产乙醇的问题。本发明包括所述酿酒酵母(<i>Saccharomyces</i><i>？cerevisiae？</i>SEB3)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11323。本发明还提供了该酿酒酵母SEB3的构建方法。本发明具有优良的木糖发酵能力，木糖消耗速率快，乙醇收率高等优点；同时，本发明的菌株SEB3具有较好的耐酸性和耐温性，在pH不低于3、温度不高于35℃时，pH和温度对木糖和纤维二糖的发酵速率和效率都没有明显影响。
Description
技术领域
本发明涉及一种酵母菌株，具体涉及的是一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株以及该菌株的构建方法。
背景技术
燃料乙醇作为可替代汽油的生物燃料是世界各国大力发展的可再生清洁能源的一种。利用农业秸秆等木质纤维素类生物质生产燃料乙醇具有“不与人争粮，不与粮争地”的特点，是我国燃料乙醇生产发展的主要方向。木质纤维素类生物质中纤维素和半纤维素水解后生成单糖，葡萄糖和木糖分别是主要的六碳糖和五碳糖。另外糖化阶段糖化不彻底会导致糖化液中含有较多纤维二糖。将原料水解后产生的单糖以及纤维二糖高效转化为乙醇是获得良好生产效益的基础。工业上用来发酵生产乙醇的微生物是酿酒酵母，但酿酒酵母不能利用木糖和纤维二糖，因此赋予酿酒酵母利用木糖和纤维二糖生产乙醇的能力是纤维素燃料乙醇生产的关键。
发明内容
本发明的目的在于解决现有酿酒酵母不能发酵木糖和纤维二糖生产乙醇的问题；提供解决上述问题的一株能同时发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖产乙醇的酿酒酵母菌株。
为达到上述目的，本发明的具体技术方案如下：
一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB3)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11323，保藏时间为2015年9月6日。
本发明以工业酿酒酵母菌株作为出发菌株，通过导入外源木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因、木糖转运蛋白相关基因、纤维二糖水解基因，获取具有同时高效发酵葡萄糖、木糖、和纤维二糖生产乙醇能力的基因工程菌，用于纤维素燃料乙醇工业化生产。
通过实验验证发现：
(1)本发明得到的菌株SEB3具有优良的木糖发酵能力，木糖消耗速率快，乙醇收率高；入口木糖浓度为75g/L，稀释率0.1h-1条件下连续发酵时，木糖消耗速率达6.62g/L/h，乙醇生产能力和收率分别达到2.61和0.39g/L/h.
(2)在不同温度及pH条件下，对菌株SEB3发酵实际糖化液的能力进行检测，发现菌株SEB3能同时发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖；且菌株SEB3具有较好的耐酸性和耐温性，pH在3~5范围内，温度在30~35度范围内，对木糖和纤维二糖的发酵速率和效率没有影响，此条件下发酵效果最佳。
如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：
1）构建宿主菌株
1.1）构建出发菌株：以酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeIR-2和酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeSEB1为亲本，通过细胞融合方式得到出发菌株；
其中，SEB1菌株，具有乙醇生产能力，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11321。IR-2菌株：分离自印度尼西亚发酵食品中，具有乙醇生产能力，有絮凝性，来源记载在下述文献中：HiroshiK,YoshioS,ToshioM,HarumiK,YorikazuS.1985.Continuousethanolfermentationwithcellrecyclingusingflocculatingyeast.J.Ferment.Technol.63:159–165；该文献翻译后的名称为：使用絮凝性酵母进行带细胞循环的连续乙醇发酵；上述IR-2生物材料从日本产业技术综合研究所（NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,AIST）获得。
上述IR-2菌株和SEB1菌株的融合方法如下：
SEB1和IR-2在产孢子培养基（0.5%醋酸锂，2%琼脂）上生长3天，所得的子囊经酵母裂解酶处理得到孢子，经甲基磺酸乙酯(EMS)处理2小时，超声分散后涂到YPD平板培养，然后影印至最小营养平板上生长4天，检验在最小营养平板上不生长的菌落的营养缺陷型。从SEB1得到异亮氨酸和缬氨酸缺陷型的
菌株SIV-2，从IR-2得到赖氨酸缺陷型的菌株IL-1。
上述YPD平板的构成为：2%葡萄糖，1%酵母粉，2%多聚蛋白胨，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述最小营养平板的构成为：2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，其余为蒸馏水。
SIV-2和IL-1经酵母裂解酶处理2小时后，得到的原生质体在30%的PEG6000中混匀处理15分钟，涂到再生平板和选择平板上。在选择平板上生长的菌落视为融合子，融合子数量与再生原生质的数量比值为融合效率。共获得8株融合子（融合效率为1.1×10-5），筛选获得利用25%糖蜜发酵产乙醇最快和乙醇浓度最高的融合子RHZ-1，该融合子RHZ-1的乙醇发酵速度可达1.3g/L/h，乙醇浓度最高可达65g/L。
上述再生平板的构成为：2%葡萄糖，0.5%酵母粉，1%多聚蛋白胨，4.5%氯化钾，2%琼脂，其余为蒸馏水；上述选择平板的构成为：2%葡萄糖，0.67%无氨基酸酵母氮源，2%琼脂，其余为蒸馏水。
1.2）融合子RHZ-1经紫外诱变后，获得尿嘧啶缺陷型菌株1（ura3/ura3）；
1.3）使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因的上游片段；使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25rev从质粒PET01中扩增获得P TEF1 -ERG25片段；使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中扩增获得URA3片段；将上述TRP1基因的上游片段、P TEF1 -ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3，将P TEF1 -ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因位点获得菌株2；PET01的构建方法如下：
使用引物ERG25fwd和ERG25rev从菌株1基因组DNA中进行PCR扩增，获得ERG25片段，将其插入到商业质粒pT7-Blue(Novagen)的NcoⅠ和HindⅢ位点，得到质粒pT7-Blue-ERG01。使用引物TEF1promoterfwd和TEF1promoterrev从菌株1基因组DNA中进行PCR扩增，获得pTEF片段，将其插入到商业质粒pT7-Blue(Novagen)的NcoⅠ和HindⅢ位点，得到质粒pT7-Blue-PTEF101。用内切酶HindⅢ和NcoⅠ处理质粒pT7-Blue-ERG01和pT7-Blue-PTEF101，连接得到PET01。
1.4）使用含5-氟乳清酸（5-FOA）的培养基培养菌株2，脱除URA3基因，获得菌株3；
1.5）将菌株3在产孢子培养基上培养一周，收集孢子，孢子在30℃下经酵母裂解酶Zymolyase处理2小时、超声处理3分钟后，稀释后涂至YPD平板挑取单菌落，然后使用MM平板筛选出不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型出发菌株；该菌株进行通过引物TRP1-437F和TRP1+717R进行PCR验证后即为菌株4；该菌株4为双重营养缺陷型，作为出发菌株用于木糖代谢途径构建。
2）外源木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因导入菌株4内获得菌株6
2.1）将质粒pRS404和pBlue-BGL1c分别由内切酶NotⅠ酶切后连接，得到质粒pIWBGL1；质粒pIWBGL1经内切酶SspI在P TDH3 内部酶切后，用醋酸锂法导入菌株4的PTDH3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，通过引物BGL1-27F、AGG215F和BGL1-1503R进行PCR验证，确认导入片段整合到目标位点后获得菌株5；质粒pIWBGL1记载在以下文献中：SaitohS,HasunumaT,TanakaT,KondoA.Co-fermentationofcellobioseandxyloseusingbeta-glucosidasedisplayingdiploidindustrialyeaststrainOC-2.ApplMicrobiolBiotechnol.2010,87(5):1975-82。该文献翻译后名称为：利用表层提示表达β-葡萄糖苷酶的双倍体工业酿酒酵母菌株OC-2进行纤维二糖和木糖的共发酵。
2.2）将质粒pIUX1X2XK经内切酶PstⅠ在URA3内部酶切后，用醋酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，通过引物XYL-1F、XYL1-3839R、XYL2-6177R、XKS1-8867R和XYL-13096R进行PCR验证，确认导入片段整合到目标位点后获得菌株6；质粒pIUX1X2XK记载在以下文献中：KatahiraS1，MizuikeA，FukudaH，KondoA.Ethanolfermentationfromlignocellulosichydrolysatebyarecombinantxylose-andcellooligosaccharide-assimilatingyeaststrain.ApplMicrobiolBiotechnol.2006,72(6):1136-43。该文献翻译后名称为：利用可同化木糖和纤维素寡糖的重组酵母进行木质纤维素水解液的乙醇发酵。
3）构建木糖转运菌株9
3.1）以Candidaintermedia9405的基因组DNA为模板，使用引物F-GXS1和R-GXS1进行PCR扩增获得GXS1片断，用内切酶NspV和BamHI酶切后，连接含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体，转化大肠杆菌后获得含GXS1基因的目的质粒；Candidaintermedia9405的中文名称是中间假丝酵母，其来源为无花果树昆虫虫粪，购买自日本微生物保藏中心JCM（JapanCollectionofMicroorganisms，JCM）；
以含GXS1基因的目的质粒为模板，使用引物F-pUG6-HXT16-300和R-GXS1+HXT16进行PCR扩增，获得用于转化的目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1；
以单倍体菌株NAM26-15A为宿主，将目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1导入单倍体菌株NAM26-15A的HXT16位点，同时敲除HXT16基因编码区以及其启动子区域，获得菌株7；
3.2）以含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体为模板，使用引物F-LTKTL/Hxt7和R-TDH3/Hxt7扩增出含HXT7启动子区域同源重组序列的且含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的DNA片断；
以单倍体菌株NAM34-4C为宿主，将上述DNA片断导入HXT7的启动子区域，同时敲除HXT7的启动子，获得菌株8；
3.3）将菌株7和菌株8进行交配获得二倍体菌株；将二倍体菌株在产孢子培养基上培养后挑取单孢子培养，获取同时含GXS1基因和P TDH3 -HXT7的单倍体菌株9；
单倍体菌株NAM26-15A、单倍体菌株NAM34-4C的构建方法记载在下述文献中：Tomitaka,M.,Taguchi,H.,Matsuoka,M.,Morimura,S.,Kida,K.,andAkamatsu,T.PotentL-lacticacidassimilationofthefermentativeandheterothallichaploidyeastSaccharomycescerevisiaeNAM34-4C.J.Biosci.Bioeng.,2013,117,65-70.上述文献翻译后名称为：发酵型异宗配合型单倍体酿酒酵母NAM34-4C的L-乳酸的高效同化。
该单倍体菌株NAM26-15A为MATa基因型菌株，该单倍体菌株NAM34-4C为MATα基因型菌株，该菌株9为MATα基因型菌株。
4）由菌株6和菌株9出发构建高效木糖发酵菌株
4.1）将菌株6在产孢子培养基上培养后，用Zymolyase处理后挑选出单孢子，将各个孢子分别和单倍体菌株NAM11-2C的单个细胞结合获得二倍体后再进行产孢子培养，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1和P TDH3 -BGL1的单倍体菌株10；该单倍体菌株NAM11-2C也记载在上述“发酵型异宗配合型单倍体酿酒酵母NAM34-4C的L-乳酸的高效同化”的文献中。该菌株10为MATa基因型菌株；
4.2）将菌株9和菌株10进行交配，获得二倍体菌株，再将二倍体在孢子培养基上培养挑取单孢子，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1、P TDH3 -BGL1、P TDH3 -GXS1、和P TDH3 -HXT7的单倍体MATa菌株和MATα菌株；
4.3）将上述MATa菌株和MATα菌株进行交配获得二倍体菌株，筛选获得高效木糖发酵菌株SEB3。
上述各步骤中所用引物的序列如表1所示。上述2%，5%YPD培养基由20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20或50g/L葡萄糖组成。上述2%，5%，7.5%YPX培养基由20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20或50或75g/L木糖组成。上述产孢子培养基由20g/L醋酸钾、2g/L酵母粉和0.5g/L葡萄糖组成，且pH为5.5。上述MM培养基由1.7g/LYNBw/oAA、5.0g/L(NH4)2SO4和20g/L葡萄糖组成。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明得到的菌株能同时发酵葡萄糖、木糖和纤维二糖；且本发明的菌株具有优良的木糖发酵能力，其木糖消耗速率快、乙醇收率高；连续发酵入口木糖浓度为75g/L时，木糖消耗速率达6.62g/L/h，乙醇生产能力和收率分别达到2.61和0.39g/L/h，效果十分显著。同时，本发明的菌株SEB3具有较好的耐酸性和耐温性，在pH不低于3、温度不高于35℃时，pH和温度对木糖和纤维二糖的发酵速率和效率都没有明显影响。
本发明中涉及保藏的微生物的保藏信息如下：
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年9月6日；保藏编号：CGMCC11321、CGMCC11323；分类命名：Saccharomycescerevisiae。
附图说明
图1为本发明菌株SEB3在不同温度条件下对实际糖化液的发酵结果。
图2为本发明菌株SEB3在不同pH条件下对实际糖化液的发酵结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB3)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11323。该酿酒酵母菌株SEB3的具体构建方法如下：
1）构建宿主菌株
1.1）构建出发菌株：以酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeIR-2和SaccharomycescerevisiaeSEB1为亲本，通过细胞融合方式得到出发菌株RHZ-1；
1.2）出发菌株RHZ-1经紫外诱变后，获得尿嘧啶缺陷型菌株1（ura3/ura3）；
1.3）使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因的上游片段；使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25rev从质粒PET01中扩增获得P TEF1 -ERG25片段；使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中扩增获得URA3片段；将上述TRP1基因的上游片段、P TEF1 -ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3，将P TEF1 -ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因位点获得菌株2；
1.4）使用含5-FOA的培养基培养菌株2，脱除URA3基因，获得菌株3；
1.5）将菌株3在产孢子培养基上培养一周，收集孢子，孢子在30℃下经Zymolyase处理2小时、超声处理3分钟后，稀释后涂至YPD平板挑取单菌落，然后使用MM平板筛选出不能在该平板上生长的色氨酸缺陷型出发菌株；该菌株进行通过引物TRP1-437F和TRP1+717R进行PCR验证后即为菌株4；该菌株4为双重营养缺陷型，作为出发菌株用于木糖代谢途径构建。
2）外源木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因导入菌株4内获得菌株6
2.1）将质粒pRS404和pBlue-BGL1c分别由内切酶NotⅠ酶切后连接，得到质粒pIWBGL1；质粒pIWBGL1经内切酶SspI在P TDH3 内部酶切后，用醋酸锂法导入菌株4的PTDH3区域，以不含色氨酸的平板筛选转化子，通过引物BGL1-27F、AGG215F和BGL1-1503R进行PCR验证，确认导入片段整合到目标位点后获得菌株5；
2.2）将质粒pIUX1X2XK经内切酶PstⅠ在URA3内部酶切后，用醋酸锂法导入菌株5的URA3区域，以不含尿嘧啶的平板筛选转化子，通过引物XYL-1F、XYL1-3839R、XYL2-6177R、XKS1-8867R和XYL-13096R进行PCR验证，确认导入片段整合到目标位点后获得菌株6。
3）构建木糖转运菌株9
3.1）以Candidaintermedia9405的基因组DNA为模板，使用引物F-GXS1和R-GXS1进行PCR扩增获得GXS1片断，用内切酶NspV和BamHI酶切后，连接含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体，转化大肠杆菌后获得含GXS1基因的目的质粒；
以含GXS1基因的目的质粒为模板，使用引物F-pUG6-HXT16-300和R-GXS1+HXT16进行PCR扩增，获得用于转化的目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1；
以单倍体菌株NAM26-15A为宿主，将目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1导入单倍体菌株NAM26-15A的HXT16位点，同时敲除HXT16基因编码区以及其启动子区域，获得菌株7；
3.2）以含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体为模板，使用引物F-LTKTL/Hxt7和R-TDH3/Hxt7扩增出含HXT7启动子区域同源重组序列的且含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的DNA片断；
以单倍体菌株NAM34-4C为宿主，将上述DNA片断导入HXT7的启动子区域，同时敲除HXT7的启动子，获得菌株8；
3.3）将菌株7和菌株8进行交配获得二倍体菌株；将二倍体菌株在产孢子培养基上培养后挑取单孢子培养，获取同时含GXS1基因和P TDH3 -HXT7的单倍体菌株9；
该单倍体菌株NAM26-15A为MATa基因型菌株，该单倍体菌株NAM34-4C为MATα基因型菌株，该菌株9为MATα基因型菌株。
4）由菌株6和菌株9出发构建高效木糖发酵菌株
4.1）将菌株6在产孢子培养基上培养后，用Zymolyase处理后挑选出单孢子，将各个孢子分别和单倍体菌株NAM11-2C的单个细胞结合获得二倍体后再进行产孢子培养，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1和P TDH3 -BGL1的单倍体菌株10；该菌株10为MATa基因型菌株；
4.2）将菌株9和菌株10进行交配，获得二倍体菌株，再将二倍体在孢子培养基上培养挑取单孢子，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1、P TDH3 -BGL1、P TDH3 -GXS1、和P TDH3 -HXT7的单倍体MATa菌株和MATα菌株；
4.3）将上述MATa菌株和MATα菌株进行交配获得二倍体菌株，筛选获得高效木糖发酵菌株SEB3。
上述各步骤中所用引物的序列如表1所示。
表1
本实施例对菌株SEB3的发酵性能进行了测定，具体测定步骤如下：
①以木糖为唯一碳源的批次发酵
前培养使用5%YPD培养基（100mL培养基，带棉塞500mL三角瓶），于30℃、120r/min振荡条件下培养16h。取前培养液10mL（接种量约0.2g干细胞/L）接入含90mL5%或7.5%YPX（pH4.5）的250mL三角瓶中（带棉塞），三角瓶分别置于30℃恒温水浴中，磁力搅拌转速为120r/min。发酵过程中定期取发酵液10mL，用于分析残糖、乙醇、有机酸和酵母浓度。
在初始木糖浓度为50g/L时，发酵36小时后，48.7g/L的木糖被消耗，产生乙醇13.5g/L，乙醇收率为0.277，木糖醇收率为0.144。当初始木糖浓度为75g/L时，前36小时的木糖消耗为49.6g/L，和初始木糖浓度为50g/L时基本一致。乙醇收率和木糖醇收率和初始木糖浓度为50g/L时基本一致。
②以木糖为唯一碳源的连续发酵
使用1L机械搅拌发酵罐（MDL-1L,B.E.MarubishiCo.,Ltd,东京，日本），工作体积700mL。温度和搅拌转速分别控制在30℃和120r/min。将100mL前培养液接种到600mL5%YPX培养基中，发酵15小时后，开始连续供给5%YPX培养基，稀释率为0.01h-1，通气量为0.01vvm。在保持入口木糖浓度不变的条件下，将稀释率逐步提升至0.05h-1，然后在保持稀释率不变的条件下将通气量逐步提升至0.1vvm，然后在稀释率和通气量不变的条件下，将入口木糖浓度提升至75g/L和100g/L。在入口木糖浓度为75g/L条件下，将稀释率提高至0.1h-1。
在上述各运行条件下，连续发酵均能维持稳定。连续发酵体系稳定运行近一年时间，发酵一直处于稳定状态，表明菌株具有很好的发酵稳定性。连续发酵最高入口木糖浓度可以达到100g/L。在入口木糖浓度为75g/L时，木糖消耗速率达6.62g/L/h，乙醇生产能力和收率分别达到2.61和0.39g/L/h。通过上述发酵结果表明，菌株SEB3具有优良的木糖发酵能力，木糖消耗速率快，乙醇收率高。
③利用实际糖化液发酵
糖化液的制备方法如下：粉碎后玉米秸秆用75%浓硫酸溶解30min后，加入热水将硫酸浓度调节至30%，于75℃糖化60min，压滤回收糖化液，利用离子交换方法分离糖化液中酸和糖，糖液用于乙醇发酵，不灭菌直接使用。该糖化液中根据需要添加玉米浆粉（CSL5%）和无机盐（(NH4)2SO45g/L、KH2PO45g/L、MgSO4.7H2O5g/L、CaCl2.2H2O1g/L）。
在不同温度条件下和不同pH条件下，对菌株SEB3发酵糖化液的能力进行检测，检测过程和结果分别如下：
（1）不同温度条件下发酵糖化液的能力
前培养使用5%YPD培养基（100mL培养基，带棉塞500mL三角瓶），于30℃、120r/min振荡条件下培养16h。取前培养液10mL接入含90mL糖化液（pH4.0）的250mL三角瓶中（带棉塞），三角瓶分别置于30℃、33℃、35℃和37℃恒温水浴中，磁力搅拌转速为120r/min。发酵过程中定期取发酵液10mL，用于分析残糖、乙醇、有机酸和酵母浓度。
如图1所示，通过对发酵结果进行统计可知：温度对菌株的生长有明显的影响，30℃和33℃的生长情况基本相同，而温度升至35℃后，生长受到抑制。在发酵前8h，在37℃条件下的发酵明显慢于37℃以下的温度条件，主要表现在木糖和纤维二糖的消耗及乙醇的生成均减缓。但各温度条件下24小时内的发酵结果相差不大，木糖的消耗速率在30-37℃范围内维持在0.82-0.91g/L/h。以上结果表明，温度影响菌株的生长，高于35℃的条件会对菌株的生长有明显影响。温度超过35℃，菌株对木糖和纤维二糖的利用速率会明显降低。
（2）不同pH条件下发酵糖化液的能力
前培养使用5%YPD培养基（100mL培养基，带棉塞500mL三角瓶），于30℃、120r/min振荡条件下培养16h。取前培养液10mL接入pH分别2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的90mL糖化液中（带棉塞250mL三角瓶中），三角瓶置于33℃恒温水浴中，磁力搅拌转速为120r/min。发酵过程中定期取发酵液10mL，用于分析残糖、乙醇、有机酸和酵母浓度。
如图2所示，通过对发酵结果进行统计可知：菌株生长在pH2.5条件下被明显抑制，而pH为3及3以上时pH对菌株的生长没有明显影响。pH2.5抑制了其生长，同时也导致其乙醇生成速率降低，pH3及pH3以上条件下的乙醇生成速率间没有显著差异，24h后的乙醇浓度达到22.2g/L。由各种糖的消耗情况可以看出，pH2.5条件下木糖和纤维二糖的消耗速率受到明显影响，24小时内的木糖消耗速率约为0.45g/L/h，明显低于pH3条件下的0.76g/L/h和pH3以上条件下的0.84-0.87g/L/h。纤维二糖在pH3及pH3以上条件下有明显消耗但在pH2.5条件下其浓度在24h未发生变化，pH越高约有利于纤维二糖的发酵。pH对半乳糖的利用影响不明显，pH2.5条件下的消耗速率比其他pH条件略有降低。以上结果表明，pH2.5的条件对菌株SEB3的生长有抑制，利用木糖和纤维二糖的速率明显下降，而pH3及pH3以上条件则对菌株的生长和发酵没有明显影响。
上述结果表明菌株SEB3具有较好的耐酸性和耐温性，在pH不低于3、温度不高于35℃时，pH和温度对木糖和纤维二糖的发酵速率和效率都没有明显影响。即当所述酿酒酵母菌株于pH不低于3，温度不高于35℃的条件下进行实际糖化液发酵时，其发酵效果最佳。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明保护范围的限制，但凡采用本发明的设计原理，以及在此基础上进行非创造性劳动而做出的变化，均应属于本发明的保护范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>四川大学
<120>一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株及构建方法
<130>2015
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Claims (3)
1.一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母(SaccharomycescerevisiaeSEB3)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11323。
2.一株快速发酵木糖产乙醇的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株于pH不低于3，温度不高于35℃的条件下同时进行葡萄糖、木糖、和纤维二糖的发酵生产乙醇。
3.如权利要求1所述酿酒酵母菌株的构建方法，包括以下步骤：
1）构建宿主菌株
1.1）构建出发菌株：以酿酒酵母IR-2和耐热酿酒酵母SBE1为亲本，通过细胞融合方式得到出发菌株RHZ-1；
1.2）出发菌株RHZ-1经紫外诱变后，获得尿嘧啶缺陷型菌株1；
1.3）使用引物TRP1-437F和TRP1-93R从菌株1的基因组DNA中PCR扩增获得TRP1基因的上游片段；使用引物TRP1PTEF1-F和ERG25rev从质粒PET01中扩增获得P TEF1 -ERG25片段；使用引物ERG-TRP1URA3和TRP1URA3R-2从质粒pRS316中扩增获得URA3片段；将上述TRP1基因的上游片段、P TEF1 -ERG25片段和URA3片段通过融合PCR获得DNA片段P TEF1 -ERG25-URA3，将P TEF1 -ERG25-URA3导入到菌株1的TRP1基因位点获得菌株2；
1.4）使用含5-氟乳清酸的培养基培养菌株2，脱除URA3基因，获得菌株3；
1.5）将菌株3在产孢子培养基上培养收集孢子，孢子在30℃下经Zymolyase处理2小时、超声处理3分钟后，涂至YPD平板挑取单菌落，然后筛选出色氨酸缺陷型出发菌株4；
2）外源木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因导入菌株4内获得菌株6
2.1）将质粒pRS404和pBlue-BGL1c分别由内切酶NotⅠ酶切后连接，得到质粒pIWBGL1；质粒pIWBGL1经内切酶SspI在P TDH3 内部酶切后，用醋酸锂法导入菌株4的P TDH3 区域获得菌株5；
2.2）将质粒pIUX1X2XK经内切酶PstⅠ在URA3内部酶切后，导入菌株5的URA3区域获得菌株6；
3）构建木糖转运菌株9
3.1）以Candidaintermedia9405的基因组DNA为模板，使用引物F-GXS1和R-GXS1进行PCR扩增获得GXS1片断，用内切酶NspV和BamHI酶切后，连接含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体，转化大肠杆菌后获得含GXS1基因的目的质粒；
以含GXS1基因的目的质粒为模板，使用引物F-pUG6-HXT16-300和R-GXS1+HXT16进行PCR扩增，获得用于转化的目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1；
以单倍体菌株NAM26-15A为宿主，将目标片断P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 -GXS1导入HXT16位点，同时敲除HXT16基因编码区以及其启动子区域，获得菌株7；
3.2）以含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的质粒载体为模板，使用引物F-LTKTL/Hxt7和R-TDH3/Hxt7扩增出含HXT7启动子区域同源重组序列的且含P TEF -Kanmx-T TEF -P TDH3 的DNA片断；
以单倍体菌株NAM34-4C为宿主，将上述DNA片断导入HXT7的启动子区域，同时敲除HXT7的启动子，获得菌株8；
3.3）将菌株7和菌株8进行交配获得二倍体菌株；将二倍体菌株在产孢子培养基上培养后挑取单孢子培养，获取同时含GXS1基因和P TDH3 -HXT7的单倍体菌株9；
4）由菌株6和菌株9出发构建高效木糖发酵菌株；
4.1）将菌株6在产孢子培养基上培养后，用Zymolyase处理后挑选出单孢子，将各个孢子分别和单倍体菌株NAM11-2C的单个细胞结合获得二倍体后再进行产孢子培养，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1和P TDH3 -BGL1的单倍体菌株10；
4.2）将菌株9和菌株10进行交配，获得二倍体菌株，再将二倍体在孢子培养基上培养挑取单孢子，筛选出含P TDH3 -XYL1/P TDH3 -XYL2/P TDH3 -XKS1、P TDH3 -BGL1、P TDH3 -GXS1、和P TDH3 -HXT7的单倍体MATa菌株和MATα菌株；
4.3）将上述MATa菌株和MATα菌株进行交配获得二倍体菌株，筛选获得高效木糖发酵菌株SEB3。
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