CN107603896A - 一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株 - Google Patents

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艾连中
夏永军
杨昳津
王光强
张汇
熊智强
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Abstract

一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株，其中，该酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)为BR129f23菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.12787。

Description

一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株具有高耐酒精和高发酵速率的酿酒酵母菌株。
背景技术
酿酒酵母作为酒类产品酿造的关键发酵菌株，是发酵的主要动力源，对我国国民经济中起着非常重要的作用。酒的品种不同，所用的酿酒酵母及酿酒工艺有所不同，其中酿酒酵母的性能有着举足轻重的作用。酿酒酵母在我国有着悠久的应用历史，直至近代，随着微生物技术以及菌种选育技术的发展，其性能才有显著的提升，并取得了显著的经济效益和社会效益。
在酿酒过程中，酿酒酵母的优良特性主要表现在发酵速率以及抗逆性方面，其中抗逆性又以耐酒精性能最为关键。随着发酵的进行，发酵廖中的酒精含量越来越高，为避免在发酵时出现迟滞现象，酿酒酵母菌种就需要有较快的发酵速率以及对酒精胁迫的高效应答能力，因此，选育优良的酿酒酵母在酿酒工业中具有非常重要的意义。原生质体融合育种技术能够较好的整合酿酒酵母的优良特性，具有杂交频率较高、融合子遗传物质更为完整的特点，适合用于选育酿酒酵母菌株。
发明内容
本发明是为了解决上述传统酿酒酵母发酵速率不够高、对酒精胁迫的应答能力低的问题，目的在于提供一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株。
本发明提供的高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株，其特征在于：
其中，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)BR129f23菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCCNO.12787。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株与现有技术具有以下优点：
本发明中采用原生质体融合方法构建出的酿酒酵母菌株具有高耐酒精性、高发酵速率，可以在黄酒、葡萄酒、啤酒等多种酿酒行业内广泛应用。
说明书附图
图1为本发明所得融合子BR129f23菌落形态；
图2为本发明所得融合子BR129f23耐酒精性能测定；以及
图3为本发明所得融合子BR129f23发酵速率曲线。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明提供的一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株的有益效果作具体阐述。
本发明所提供的酿酒酵母菌株是基于单亲灭活原生质体融合的方法构建的。
实施例中使用到的酿酒酵母为：
1.实验室编号BR20(保藏编号为CGMCCNo.9445)的菌株为酿酒酵母，耐酒精较好，可耐受18％酒精，发酵速率一般。
2.实验室编号BR30(保藏编号为CGMCCNo.10378)的菌株为酿酒酵母，耐酒精性能一般，发酵速率较快。
实施例选育酿酒酵母菌株的过程如下所述：
步骤一，将酿酒酵母BR20菌株活化，调整细胞浓度为107-109个/mL，涂布于含20.0mg/L克霉唑的YNB培养基平板上30℃培养8d。再将平板上长出的菌落在含有克霉唑的YNB平板上划线10代检测抗性的稳定性，筛选得到克霉唑突变株BR20-C。
步骤二，将克霉唑突变株BR20-C、酿酒酵母BR30分别培养至细胞浓度为105-107个/mL，加入Lyticase酶溶液于30℃，60-150rpm酶解60-200min，酶解后的细胞用CPB高渗溶液洗涤后重悬于CPB高渗溶液中，即制得亲本的原生质体。
步骤三，将BR20-C亲本原生质体于60-90℃下进行15-40min水浴热灭活，然后与BR30亲本的原生质体按1:1的比例在20-45％的PEG溶液中混合，40℃条件下水浴40min进行融合；用CPB溶液将融合后的混合原生质体悬液4℃离心洗涤，重悬于CPB溶液中，即得到融合后的原生质体。
步骤四，将步骤三中得到的原生质体涂布于含有20mg/L克霉唑的再生培养基平板上，于30℃下培养48h，长出的菌落即为融合子菌落。再对得到的融合子菌落进行连续10次传代划线培养，保证融合菌株的稳定性，保存于斜面YPD培养基中。
在步骤二中CPB高渗溶液中的渗透压稳定剂的浓度为0.4-0.9mol/L，种类为葡萄糖、蔗糖、MgSO4、NaCl中的一种或是几种。Lyticase酶溶液采用0.4-0.9mol/L的高渗溶液配制，酶液浓度为20-100U/mL。
在步骤三中PEG溶液含有：0.02-0.10mol/LCaCl2，以及浓度均为0.4-0.9mol/L的葡萄糖、蔗糖、MgSO4、NaCl中的一种或是几种。选用的PEG的分子量为4000。
以下根据具体实施例1-3对本发明中选育的高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株的效果做详细说明。
下述实施实例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
麦芽汁培养基：取200g麦芽，分别加入0.6g的1‰糖化酶与液化酶，加水至1000mL，在55℃条件下糖化4h，调整糖度为15°Bx，2％琼脂，121℃高压灭菌20min，冷却后备用。
YPD培养基：葡萄糖20g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，固体培养基中加入20g/L的琼脂，121℃灭菌15min后备用。
YNB培养基：0.67％无氨基氮源，2％葡萄糖，固体培养基中加入20g/L的琼脂，121℃灭菌15min后备用。
CPB溶液：0.1mol/L的柠檬酸与0.2mol/L的磷酸氢二钠混匀后，调其pH至6.0，121℃灭菌15min后备用。
实施例1
步骤一，将酿酒酵母BR20菌株活化，调整细胞浓度为107个/mL，涂布于含20.0mg/L克霉唑的YNB培养基平板上30℃培养8d，再将平板上长出的菌落在含有克霉唑的YNB平板上划线10代检测抗性的稳定性，筛选得到克霉唑突变株BR20-C1。
步骤二，将克霉唑突变株BR20-C1、酿酒酵母BR30分别培养至细胞浓度为105个/mL，加入Lyticase酶溶液于30℃，60rpm酶解60min，酶解后的细胞用含有0.4mol/LNaClCPB高渗溶液洗涤后重悬于CPB高渗溶液中，即制得亲本的原生质体。
步骤三，将BR20-C1亲本原生质体于60℃下进行15min水浴热灭活，然后与BR30亲本的原生质体按1:1的比例在20％的PEG溶液(含有0.02mol/LCaCl2，04mol/LNaCl，选用PEG分子量为4000)中混合，40℃条件下水浴40min进行融合；用CPB溶液将融合后的混合原生质体悬液4℃离心洗涤，重悬于CPB溶液中，即得到融合后的原生质体。
步骤四，将步骤三中得到的原生质体涂布于含有20mg/L克霉唑的再生培养基平板上，于30℃下培养48h，长出的菌落即为融合子菌落，再对得到的融合子菌落进行连续10次传代划线培养，保证融合菌株的稳定性，保存于斜面YPD培养基中。
实施例1效果：通过单亲灭活原生质体融合获得融合子14株，其中融合子BR129f10菌株耐酒精能力为21％，发酵速率较BR20提高20％。
实施例2
步骤一，将酿酒酵母BR20菌株活化，调整细胞浓度为108个/mL，涂布于含20.0mg/L克霉唑的YNB培养基平板上30℃培养8d，再将平板上长出的菌落在含有克霉唑的YNB平板上划线10代检测抗性的稳定性，筛选得到克霉唑突变株BR20-C8。
步骤二，将克霉唑突变株BR20-C8、酿酒酵母BR30分别培养至细胞浓度为106个/mL，加入Lyticase酶溶液于30℃，100rpm酶解150min，酶解后的细胞用含有0.6mol/LNaClCPB高渗溶液洗涤后重悬于CPB高渗溶液中，即制得亲本的原生质体。
步骤三，将BR20-C8亲本原生质体于70℃下进行25min水浴热灭活，然后与BR30亲本的原生质体按1:1的比例在30％的PEG溶液(含有0.05mol/LCaCl2，06mol/LNaCl，选用PEG分子量为4000)中混合，40℃条件下水浴40min进行融合，再用CPB溶液将融合后的混合原生质体悬液4℃离心洗涤，重悬于CPB溶液中，即得到融合后的原生质体。
步骤四，将步骤三中得到的原生质体涂布于含有20mg/L克霉唑的再生培养基平板上，于30℃下培养48h，长出的菌落即为融合子菌落，再对得到的融合子菌落进行连续10次传代划线培养，保证融合菌株的稳定性，保存于斜面YPD培养基中。
实施例2效果：通过单亲灭活原生质体融合获得融合子20株，其中融合子BR129f23菌株耐酒精能力为24％，发酵速率较BR20提高35％。
实施例3
步骤一，将酿酒酵母BR20菌株活化，调整细胞浓度为109个/mL，涂布于含20.0mg/L克霉唑的YNB培养基平板上30℃培养8d，再将平板上长出的菌落在含有克霉唑的YNB平板上划线10代检测抗性的稳定性，筛选得到克霉唑突变株BR20-C10。
步骤二，将克霉唑突变株BR20-C10、酿酒酵母BR30分别培养至细胞浓度为107个/mL，加入Lyticase酶溶液于30℃，150rpm酶解200min，酶解后的细胞用含有0.9mol/LNaClCPB高渗溶液洗涤后重悬于CPB高渗溶液中，即制得亲本的原生质体。
步骤三，将BR20-C10亲本原生质体于90℃下进行40min水浴热灭活，然后与BR30亲本的原生质体按1:1的比例在45％的PEG溶液(含有0.1mol/LCaCl2，09mol/LNaCl，选用PEG分子量为4000)中混合，40℃条件下水浴40min进行融合，再用CPB溶液将融合后的混合原生质体悬液4℃离心洗涤，重悬于CPB溶液中，即得到融合后的原生质体。
步骤四，将步骤三中得到的原生质体涂布于含有20mg/L克霉唑的再生培养基平板上，于30℃下培养48h，长出的菌落即为融合子菌落，再对得到的融合子菌落进行连续10次传代划线培养，保证融合菌株的稳定性，保存于斜面YPD培养基中。
实施例3效果：通过单亲灭活原生质体融合获得融合子6株，其中融合子BR129f27菌株耐酒精能力为19％，发酵速率较BR20提高10％。
图1为本发明所得融合子BR129f23菌落形态。
图2为本发明所得融合子BR129f23耐酒精性能测定。
图3为本发明所得融合子BR129f23发酵速率曲线。
如图1、2、3所示，本发明中获得融合子BR129f23具有良好的菌落形态以及较高的耐酒精性能，同时在较高酒精浓度下也具有稳定的高发酵速率。
从实施例1-3的比较中可以看出酿酒酵母菌株BR129f23，与BR129f10和BR129f27相比，耐酒精性能达到24％，发酵速率较亲本BR20菌株提高35％，各项指标均高于其他融合子菌株，发酵速率较BR20也有了很大的提高。
实施例的作用与效果
根据本发明所涉及的一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株与现有技术具有以下优点：
本发明中采用原生质体融合方法构建的酿酒酵母菌株具有高耐酒精性、高发酵速率，可以在黄酒、葡萄酒、啤酒等多种酿酒行业内广泛应用。
进一步的根据实施例中的数据显示酿酒酵母菌株BR129f23具有最高的耐酒精性能和发酵速率，耐酒精性能达到24％，发酵速率较亲本BR20菌株提高35％。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一株高耐酒精高发酵速率的酿酒酵母菌株，其特征在于，
其中，所述酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)为BR129f23菌株，已保藏于中国普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.12787。
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