CN101497866A - 生产低醇啤酒的酿酒酵母 - Google Patents

Abstract

生产低醇啤酒的酿酒酵母，属于发酵食品。低醇啤酒既具有啤酒应有的啤酒风味，又具有多饮不醉的优点，同时也符合当今消费者日益重视身体健康的消费趋势。啤酒乙醇的含量是决定低醇啤酒的关键指标，如何解决啤酒中乙醇的含量是生产低醇啤酒的关键。一种生产低醇啤酒的酿酒酵母，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，其特征是：菌株拉丁名：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CCTCC保藏号：M207161。本产品用于生产低醇啤酒。

Description

生产低醇啤酒的酿酒酵母

技术领域：

本发明涉及一种利用生物工程方法构建生产低醇啤酒的酿酒酵母。

背景技术：

低醇啤酒既具有啤酒应有的啤酒风味，又具有多饮不醉的优点，同时也符合当今消费者日益重视身体健康的消费趋势，加上妇女对酒精过敏男士对低醇啤酒的喜爱，低醇啤酒正在走俏。

啤酒乙醇的含量是决定低醇啤酒的关键指标，它直接关系到啤酒的品质。如何解决啤酒中乙醇的含量是生产低醇啤酒的关键。目前，降低啤酒中乙醇含量的办法有很多种，其中最理想的方法之一就是构建低醇啤酒基因工程菌株，通过对工业用酿酒酵母本身进行改造来生产低醇啤酒。

发明内容：

本发明的目的是提供一种通过基因克隆技术，将出发工业用酿酒酵母菌株进行了基因改造的方法，从而构建可用于生产低醇啤酒的基因工程菌株。

上述的目的通过以下的技术方案实现：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，菌株拉丁名：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CCTCC保藏号：M207161。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，HDY-01(原始菌株)酵母、ΔADH I(缺失乙醇脱氢酶)酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌分别接种于100毫升YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟，过夜培养，作为种子液。然后以1:4的接种量接种于麦芽汁培养基中12℃低温发酵15天，分别测定每天的发酵参数。其中乙醛利用气相色谱Agilen仪6890型号测定，双乙酰利用气象色谱测PE Claus500型号测定，乙醇利用蒸馏密度瓶法测定，残糖利用糖度计(WYT-10-32％)测定，悬浮酵母数利用显微镜直接计数法测定。

结果显示HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌15天发酵的过程中，乙醛含量的平均值分别为1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，说明我们最后构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I与出发工业菌株是一致的。乙醇含量结果显示，三株菌的乙醇平均值分别为0.38(V/V)、0(V/V)和0.27(V/V)，这表明，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的乙醇含量较出发菌株低28％，达到了我们构建低醇啤酒酵母的目的。从双乙酰含量来看，三株菌的双乙酰的平均值为17.41纳克/克(ppb)、20.82(ppb)和8.54(ppb)，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的双乙酰含量较出发菌株低了51％。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，菌株大小介于2.0-3.0微米(μm)，圆形。在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)固体培养基表面生长较快，48小时后菌落大小为2.0-3.0毫米(mm)，菌落乳白色，质地均匀，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy在16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒SK241提取重组质粒DNA，回收。所述的设计引物为：首先进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)包括：根据GeneBank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列(NC 000964)，设计一对特异性引物，每个引物30个碱基，用于扩增ADH I基因，在上游和下游分别加上酶切工具酶Xba I的识别位点(斜线表示)，BADH上游引物5’—AGT TCT AGA ATGCAG AAA TTC CAC ACA TTT G—3’；BADH下游引物5’—G GAA TGC AGA TCT GGATTT TGC CAT ATT CAC—3’，所述的扩增为：用灭菌牙签挑取少许对数生长时期的枯草芽孢杆菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90℃扩增过程扩增2小时，即可将枯草芽孢杆菌细胞破碎，使全基因组DNA游离出来，作为模板。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的回收是将PCR产物用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物命名为pGMT-BADH I，连接产物pGMT-BADHI转化大肠杆菌E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，备用。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I过程中为使BADH I基因与表达载体pYC6/CT进行连接，首先通过Xba I单酶切pGMT-BADHI和pYC6/CT，酶切体系如下表：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I包括的酶切为单酶切产物，容易发生自连，我们将单酶切后的线性pYC6/CT质粒进行去磷酸化处理，防止自连的发生。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR扩增获得ΔADH I酿酒酵母菌株的过程包括：通过PCR扩增两端含有与酵母的乙醇脱氢酶IYADH I同源片段的潮霉素基因片段和PCR产物直接转化酵母菌。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段过程是：

设计一对引物L1、L2，此引物是依据酿酒酵母YADH I基因和质粒pCAMBIA(质粒名称，购自Invitrogen公司)中的潮霉素基因设计的，该引物是用来扩增转入的目的基因片段，既带有与YADH I基因序列同源部分的潮霉素基因片段，引物序列如下：

L1(引物名称)5’TTT CAA GCT ATA CCA AGC ATA CAA TCA ACT ATC TCA TATACA ATG ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACCG 3’

L2(引物名称)5’AAC TTA TTT AAT AAT AAA AAT CAT AAA TCA TAA GAA ATTCGC TTA CTA TTT CTT TGC CCT CGG ACG 3’

其中引物两端各有40bp(碱基)序列(斜体部分)是和酿酒酵母HDY-01中YADH I基因同源部分，其他部分是潮霉素引物序列；

将含有质粒pCAMBIA的大肠杆菌于含有潮霉素的LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基中37℃，180转/分钟过夜摇床培养；提取pCAMBIA质粒DNA作为模板，PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段，PCR反应体系如下：

94℃ 1分钟，59℃ 1分钟，72℃ 3分钟，35个循环；

获得的重组子通过在含有100微克/毫升潮霉素平板上培养进行抗性验证，通过PCR扩增进行转化验证；

这对引物为直接扩增潮霉素基因片段引物，两段不含有与YADH I基因片段的同源序列。

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR产物直接转化酵母菌的过程是：

将活化的酿酒酵母HDY-01挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟培养48小时，取100毫升菌液3500转/分钟离心5分钟，弃上清；在离心管中加入40毫升1×TE(即1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)清洗菌体，然后3500转/分钟离心5分钟，弃上清液；加入2毫升1×LiAc/0.5×TE(即1倍醋酸锂/0.5倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)，室温放置10分钟；制成酵母菌感受态细胞；取一干净的1.5毫升离心管，在其中依次加入10μLPCR产物(含有与YADH I基因同源序列的潮霉素基因片段)，10.7μL鱼鲑精DNA，100μL酵母菌HDY-01感受态细胞，700μL1×LiAc/40PEG-4000/1×TE(即1倍醋酸锂/40％聚乙二醇/1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)混合，30℃反应30分钟；反应完毕再离心管中加入88μL二甲基亚砜DMSO原液混合均匀，40℃水浴中热激7分钟；热激结束后，13000转/分钟离心10秒，弃上清，然后再离心管中加入1毫升1×TE清洗2次；13000转/分钟离心10秒弃上清；在离心管中加入50-100μL1×TE，将其涂布于含有潮霉素的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基YPD平板上，30℃培养48小时。

这个技术方案有以下有益效果：

通过本发明，成功构建了酿酒酵母的ADH I缺失菌株和恢复突变酵母BADHI-ΔADH I。BADH I-ΔADH I经过连续15天发酵实验证明，其乙醇含量、乙醛含量和双乙酰含量均较出发菌株有所降低。

HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母酶活力测定

ADH I在代谢过程中产生的H⁺可以和NAD⁺⁽即氧化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸结合生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸即NADH，NADH在OD340nm下有最大吸光值，我们通过测定NADH的吸光值变化情况就可以反映出ADH I酶活力大小。酶活定义为单位湿细胞在单位时间使吸光值每发生0.001的改变定义为一个酶活。

测定结果表明在相同条件下HDY-01酵母ADH I酶活力最强，ΔADH 酵母菌酶活力最弱，而BADH I-ΔADH I酵母菌酶活力位于两者之间。这是由于ΔADHI酵母菌酶丧失了ADH I基因不能代谢生成乙醇，所以在检测过程中酶活力处于最低，而BADH I-ΔADH I酵母菌由于转入了枯草芽孢杆菌的BADH I基因，此基因与酿酒酵母的YADH I基因相比，酶活力不如YADH I基因，所以BADH I-ΔADHI酵母菌的酶活力在测定过程中要比HDY-01酵母的酶活力低。

遗传稳定性试验

HDY-01酵母在含有100μg/毫升潮霉素的YPD平板上不能生长，也不能在含有50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上生长，而ΔADH I酵母菌在含有100μg/毫升潮霉素的平板上能够生长，因为其中引物了从质粒pCAMBIA克隆的潮霉素抗性基因片段。BADH I-ΔADH I酵母菌能够在含50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上生长，因为其中转入了pYC6/CT质粒，质粒上带有Blasticidin抗性标记。将传代的每一代ΔADH I酵母菌均匀涂布在含100μg/毫升潮霉素的YPD平板上，BADH I-ΔADH I酵母菌每一代涂布在含50μg/毫升的Blasticidin的YPD平板上，抗性传代12代后菌株性能保持稳定。酶活力检测表明，连续传代12代后，酶活力保持稳定。

HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母发酵实验

在啤酒发酵产物当中，决定啤酒是否是低醇啤酒的关键指标就是乙醇含量；乙醛含量则是决定啤酒口感的关键指标。双乙酰含量不仅关系到啤酒口味还影响着啤酒发酵的周期。由于以上原因，我们要对发酵液中的乙醇含量，乙醛含量和双乙酰含量，以及其他成分进行测定。

HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌分别接种于100毫升YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟，过夜培养，作为种子液。然后以1:4的接种量接种于麦芽汁培养基中12℃低温发酵15天，分别测定每天的发酵参数。其中乙醛利用气象色谱Agilent 6890型号测定，双乙酰利用气象色谱测PEClaus500型号测定，乙醇利用蒸馏密度瓶法测定，残糖利用糖度计(WYT-10-32％)测定，悬浮酵母数利用显微镜直接计数法测定。

结果显示HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌15天发酵的过程中，乙醛含量的平均值分别为1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，说明我们最后构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I与出发工业菌株是一致的。乙醇含量结果显示，三株菌的乙醇平均值分别为0.38(V/V)、0(V/V)和0.27(V/V)，这表明，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的乙醇含量较出发菌株低28％，达到了我们构建低醇啤酒酵母的目的。从双乙酰含量来看，三株菌的双乙酰的平均值为17.41纳克/克(ppb)、20.82(ppb)和8.54(ppb)，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的双乙酰含量较出发菌株低了51％。

由此可见，构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I在乙醇、双乙酰和乙醛指标中，均较出发菌株有所改善，说明菌株构建成功。

附图说明：

图1为质粒pGMT-BADH I。

图2为pYC6/CT-BADH I构建过程。

图3ΔADH I酵母的构建过程。

具体实施方式：

实施例1：

本专利用菌种：

所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞，以下简称E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，回收。

酿酒酵母BADH I-ΔADH I(分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeBADH I-ΔADH I)保藏在：CCTCC(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：湖北省武汉市武昌珞珈山)保藏号：M207161，保藏日：2007年10月16日。

酿酒酵母BADH I-ΔADH I 30℃培养在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，以下简称YPD培养基中，其成分为1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌30分钟。

实施例2：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株。

实施例3：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，HDY-01(原始菌株)酵母、ΔADH I(缺失乙醇脱氢酶)酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌分别接种于100毫升YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟，过夜培养，作为种子液。然后以1∶4的接种量接种于麦芽汁培养基中12℃低温发酵15天，分别测定每天的发酵参数。其中乙醛利用气相色谱Agilen仪6890型号测定，双乙酰利用气象色谱测PE Claus500型号测定，乙醇利用蒸馏密度瓶法测定，残糖利用糖度计(WYT-10-32％)测定，悬浮酵母数利用显微镜直接计数法测定。

结果显示HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌15天发酵的过程中，乙醛含量的平均值分别为1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，说明我们最后构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I与出发工业菌株是一致的。乙醇含量结果显示，三株菌的乙醇平均值分别为0.38(V/V)、0(V/V)和0.27(V/V)，这表明，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的乙醇含量较出发菌株低28％，达到了我们构建低醇啤酒酵母的目的。从双乙酰含量来看，三株菌的双乙酰的平均值为17.41纳克/克(ppb)、20.82(ppb)和8.54(ppb)，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的双乙酰含量较出发菌株低了51％。

实施例4：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，菌株大小介于2.0-3.0微米(μm)，圆形。在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)固体培养基表面生长较快，48小时后菌落大小为2.0-3.0毫米(mm)，菌落乳白色，质地均匀，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。

实施例5：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy在16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒SK241提取重组质粒DNA，回收。所述的设计引物为：首先进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)包括：根据GeneBank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列(NC000964)，设计一对特异性引物，每个引物30个碱基，用于扩增ADH I基因，在上游和下游分别加上酶切工具酶Xba I的识别位点(斜线表示)，BADH上游引物5’—AGT TCT AGA ATGCAG AAA TTC CAC ACA TTT G—3’；BADH下游引物5’—G GAA TGC AGA TCT GGATTT TGC CAT ATT CAC—3’，所述的扩增为：用灭菌牙签挑取少许对数生长时期的枯草芽孢杆菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90℃扩增过程扩增2小时，即可将枯草芽孢杆菌细胞破碎，使全基因组DNA游离出来，作为模板。

实施例6：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的回收是将PCR产物用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物命名为pGMT-BADH I，连接产物pGMT-BADHI转化大肠杆菌E.coli DH5α后，使用Sangon MNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，备用。

实施例7：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I过程中为使BADH I基因与表达载体pYC6/CT进行连接，首先通过Xba I单酶切pGMT-BADHI和pYC6/CT，酶切体系如下表：

实施例8：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I包括的酶切为单酶切产物，容易发生自连，我们将单酶切后的线性pYC6/CT质粒进行去磷酸化处理，防止自连的发生。

实施例9：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR扩增获得ΔADH I酿酒酵母菌株的过程包括：通过PCR扩增两端含有与酵母的乙醇脱氢酶IYADH I同源片段的潮霉素基因片段和PCR产物直接转化酵母菌。

实施例10：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段过程是：

设计一对引物L1、L2，此引物是依据酿酒酵母YADH I基因和质粒pCAMBIA(质粒名称，购自Invitrogen公司)中的潮霉素基因设计的，该引物是用来扩增转入的目的基因片段，既带有与YADH I基因序列同源部分的潮霉素基因片段，引物序列如下：

L1(引物名称)5’TTT CAA GCT ATA CCA AGC ATA CAA TCA ACT ATC TCA TATACA ATG ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACCG 3’

L2(引物名称)5’AAC TTA TTT AAT AAT AAA AAT CAT AAA TCA TAA GAA ATTCGC TTA CTA TTT CTT TGC CCT CGG ACG 3’

其中引物两端各有40bp(碱基)序列(斜体部分)是和酿酒酵母HDY-01中YADH I基因同源部分，其他部分是潮霉素引物序列；

将含有质粒pCAMBIA的大肠杆菌于含有潮霉素的LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基中37℃，180转/分钟过夜摇床培养；提取pCAMBIA质粒DNA作为模板，PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段，PCR反应体系如下：

94℃ 1分钟，59℃ 1分钟，72℃ 3分钟，35个循环；

获得的重组子通过在含有100微克/毫升潮霉素平板上培养进行抗性验证，通过PCR扩增进行转化验证；

这对引物为直接扩增潮霉素基因片段引物，两段不含有与YADH I基因片段的同源序列。

实施例11：

生产低醇啤酒的酿酒酵母，所述的通过PCR产物直接转化酵母菌的过程是：

将活化的酿酒酵母HDY-01挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟培养48小时，取100毫升菌液3500转/分钟离心5分钟，弃上清；在离心管中加入40毫升1×TE(即1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)清洗菌体，然后3500转/分钟离心5分钟，弃上清液；加入2毫升1×LiAc/0.5×TE(即1倍醋酸锂/0.5倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)，室温放置10分钟；制成酵母菌感受态细胞；取一干净的1.5毫升离心管，在其中依次加入10μLPCR产物(含有与YADH I基因同源序列的潮霉素基因片段)，10.7μL鱼鲑精DNA，100μL酵母菌HDY-01感受态细胞，700μL1×LiAc/40PEG-4000/1×TE(即1倍醋酸锂/40％聚乙二醇/1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)混合，30℃反应30分钟；反应完毕再离心管中加入88μL二甲基亚砜DMSO原液混合均匀，40℃水浴中热激7分钟；热激结束后，13000转/分钟离心10秒，弃上清，然后再离心管中加入1毫升1×TE清洗2次；13000转/分钟离心10秒弃上清；在离心管中加入50-100μL1×TE，将其涂布于含有潮霉素的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基YPD平板上，30℃培养48小时。

序列表

<110>黑龙江大学

<120>生产低醇啤酒的酿酒酵母

<160>4

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Gene Bank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列设计的BADH上游引物。

<400>1

<210>2

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据Gene Bank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列设计的BADH下游引物。

<400>2

<210>3

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据酿酒酵母YADH I基因和质粒pCAMBIA中的潮霉素基因设计的PCR扩增引物L1。

<400>3

<210>4

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据酿酒酵母YADH I基因和质粒pCAMBIA中的潮霉素基因设计的PCR扩增引物L2。

<400>4

Claims (10)

1.一种生产低醇啤酒的酿酒酵母，其组成包括：选取工业用酿酒酵母菌株，其特征是：菌株拉丁名：Saccharomyces cerevisiae，保藏在：CCTCC保藏号：M207161。

2.根据权要求1所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：HDY-01(原始菌株)酵母、ΔADH I(缺失乙醇脱氢酶)酵母、BADH I-ΔADH I酵母菌分别接种于100毫升YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟，过夜培养，作为种子液。然后以1:4的接种量接种于麦芽汁培养基中12℃低温发酵15天，分别测定每天的发酵参数。其中乙醛利用气相色谱Agilen仪6890型号测定，双乙酰利用气象色谱测PE Claus500型号测定，乙醇利用蒸馏密度瓶法测定，残糖利用糖度计(WYT-10-32％)测定，悬浮酵母数利用显微镜直接计数法测定。

结果显示HDY-01酵母、ΔADH I酵母、BADH I-AADH I酵母菌15天发酵的过程中，乙醛含量的平均值分别为1.51毫克/升(mg/L)、1.72mg/L和1.51mg/L，说明我们最后构建的低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I与出发工业菌株是一致的。乙醇含量结果显示，三株菌的乙醇平均值分别为0.38(V/V)、0(V/V)和0.27(V/V)，这表明，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的乙醇含量较出发菌株低28％，达到了我们构建低醇啤酒酵母的目的。从双乙酰含量来看，三株菌的双乙酰的平均值为17.41纳克/克(ppb)、20.82(ppb)和8.54(ppb)，低醇啤酒酵母BADH I-ΔADH I的双乙酰含量较出发菌株低了51％。

3.根据权要求2所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：菌株大小介于2.0-3.0微米(μm)，圆形。在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)固体培养基表面生长较快，48小时后菌落大小为2.0-3.0毫米(mm)，菌落乳白色，质地均匀，半透明，粘稠，易挑取，有酒香味。

4.根据权利要求2或3所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的初始阶段包括：设计引物并进行扩增，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy在16℃连接过夜，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α后，使用SangonMNIQ-200质粒大量抽提试剂盒SK241提取重组质粒DNA，回收。所述的设计引物为：首先进行枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中ADH I基因的克隆(BADHI)包括：根据Gene Bank基因文库登陆的枯草芽孢杆菌ADH I基因序列(NC000964)，设计一对特异性引物，每个引物30个碱基，用于扩增ADH I基因，在上游和下游分别加上酶切工具酶Xba I的识别位点(斜线表示)，BADH上游引物5’—AGT TCT AGA ATG CAG AAA TTC CAC ACA TTT G—3’；BADH下游引物5’—G GAA TGC AGA TCT GGA TTT TGC CAT ATT CAC—3’，所述的扩增为：用灭菌牙签挑取少许对数生长时期的枯草芽孢杆菌，放入PCR管中，利用PCR程序中的90℃扩增过程扩增2小时，即可将枯草芽孢杆菌细胞破碎，使全基因组DNA游离出来，作为模板。

5.根据权利要求4或5所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的回收是将PCR产物用上海华舜生物工程有限公司DNA胶回收试剂盒进行回收，回收纯化的BADH I基因片段与T-载体pGMT-easy的16℃连接过夜，连接产物命名为pGMT-BADH I，连接产物pGMT-BADH I转化大肠杆菌E.coli DH5α后，使用SangonMNIQ-200质粒大量抽提试剂盒(SK241)提取重组质粒DNA，备用。

6.根据权利要求4或5或6所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I过程中为使BADH I基因与表达载体pYC6/CT进行连接，首先通过Xba I单酶切pGMT-BADH I和pYC6/CT，酶切体系如下表：

7.根据权利要求1或2或3或4或5所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的构建重组质粒pYC6/CT-BADH I包括的酶切为单酶切产物，容易发生自连，我们将单酶切后的线性pYC6/CT质粒进行去磷酸化处理，防止自连的发生。

8.根据权利要求1或2或3或4或5或6所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的通过PCR扩增获得ΔADH I酿酒酵母菌株的过程包括：通过PCR扩增两端含有与酵母的乙醇脱氢酶IYADH I同源片段的潮霉素基因片段和PCR产物直接转化酵母菌。

9.根据权利要求7所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的通过PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段过程是：

设计一对引物L1、L2，此引物是依据酿酒酵母YADH I基因和质粒pCAMBIA(质粒名称，购自Invitrogen公司)中的潮霉素基因设计的，该引物是用来扩增转入的目的基因片段，既带有与YADH I基因序列同源部分的潮霉素基因片段，引物序列如下：

L1(引物名称)5’TTT CAA GCT ATA CCA AGC ATA CAA TCA ACT ATC TCA TATACA ATG ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACCG 3’

L2(引物名称)5’AAC TTA TTT AAT AAT AAA AAT CAT AAA TCA TAA GAA ATTOGC TTA CTA TTT CTT TGC CCT CGG ACG 3’

其中引物两端各有40bp(碱基)序列(斜体部分)是和酿酒酵母HDY-01中YADH I基因同源部分，其他部分是潮霉素引物序列；

将含有质粒pCAMBIA的大肠杆菌于含有潮霉素的LB(Luria-Bertani培养基)液体培养基中37℃，180转/分钟过夜摇床培养；提取pCAMBIA质粒DNA作为模板，PCR扩增两端含有与YADH I同源片段的潮霉素基因片段，PCR反应体系如下：

94℃ 1分钟，59℃ 1分钟，72℃ 3分钟，35个循环；

获得的重组子通过在含有100微克/毫升潮霉素平板上培养进行抗性验证，通过PCR扩增进行转化验证；

这对引物为直接扩增潮霉素基因片段引物，两段不含有与YADH I基因片段的同源序列。

10.根据权利要求7或8所述的生产低醇啤酒的酿酒酵母，其特征是：所述的通过PCR产物直接转化酵母菌的过程是：

将活化的酿酒酵母HDY-01挑取单菌落接种于YPD液体培养基中，30℃，200转/分钟培养48小时，取100毫升菌液3500转/分钟离心5分钟，弃上清；在离心管中加入40毫升1×TE(即1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)清洗菌体，然后3500转/分钟离心5分钟，弃上清液；加入2毫升1×LiAc/0.5×TE(即1倍醋酸锂/0.5倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)，室温放置10分钟；制成酵母菌感受态细胞；取一干净的1.5毫升离心管，在其中依次加入10μLPCR产物(含有与YADH I基因同源序列的潮霉素基因片段)，10.7μL鱼鲑精DNA，100μL酵母菌HDY-01感受态细胞，700μL1×LiAc/40PEG-4000/1×TE(即1倍醋酸锂/40％聚乙二醇/1倍三羟甲基氨基甲烷，乙二胺四乙酸)混合，30℃反应30分钟；反应完毕再离心管中加入88μL二甲基亚砜DMSO原液混合均匀，40℃水浴中热激7分钟；热激结束后，13000转/分钟离心10秒，弃上清，然后再离心管中加入1毫升1×TE清洗2次；13000转/分钟离心10秒弃上清；在离心管中加入50-100μL1×TE，将其涂布于含有潮霉素的酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基YPD平板上，30℃培养48小时。

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