CN101878308B - 由淀粉制备乙醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于由淀粉制备乙醇的方法。具体地，本发明提供由淀粉诸如木薯淀粉、马铃薯、甜高粱、大米制备乙醇的方法，其通过液化和糖化淀粉和随后在存在嗜热性微生物的条件下将单糖发酵为乙醇而实现。
Description
发明领域
本发明涉及由淀粉制备乙醇的方法。更具体地，本发明涉及由淀粉诸如木薯淀粉、马铃薯、甜高粱、大米制备乙醇的方法，其通过液化和糖化淀粉和随后在存在嗜热性微生物的条件下将单糖发酵为乙醇而实现。
发明背景
植物产品-诸如木薯淀粉、玉米、大米、马铃薯、甜高粱含有作为制备乙醇的给料使用的淀粉。按照常规方法，研磨包含淀粉的农产品并用水制成淀粉浆或凝胶化以进行酶水解。将淀粉浆煮熟并由α淀粉酶或液化酶在95℃和pH 6液化2-3小时。由此获得的液化浆在较低温度(40-60℃)和pH4.0-4.5下由糖化酶，葡糖淀粉酶进一步水解6小时成为葡萄糖。然后利用酵母，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在30℃和pH 4.0-4.5发酵由此获得的葡萄糖浆约48小时。然后在75℃蒸馏发酵的培养液以回收纯度95％的乙醇。在常规方法中在发酵培养液中将淀粉转化为乙醇所需的总时间是约65-75小时。
通过开发同时糖化和发酵(SSF)方法实现对常规方法效率的提高，其中糖化酶可以在与30℃和pH 4.0-4.5发酵相同的条件下起作用。该方法在糖化和发酵过程中显著节省时间和能量。然而，SSF方法具有缺点，即为了在90℃液化和在30℃发酵后在70℃回收乙醇需要高能量输入。
在现有技术中诸如由Yamamoto等在美国专利4,474,883(1984)中所述，根茎淀粉在80-90℃和pH 5.0下由细菌淀粉酶液化。由此产生的溶液在25-30℃由葡糖淀粉酶水解并然后由酵母发酵。在现有技术Verma等2000，Bioresource Technology(生物资源技术)，72：261-266中报告了通过在单一步骤方法中共培养糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)和酿酒酵母生物转化淀粉为乙醇；所述方法在30℃进行并且乙醇产物在超过37℃时减少。因此，该方法具有为蒸馏乙醇高能量输入的局限性。
Bunni等在“processing and quality of foods”(食品的加工和质量)卷2，Zeuthen P.，Cheftel，J.C，Ericlsson，C，Goemly，T.R.，Linko，P.，Paulus，K.第174-280页，Elsevier应用报告(Elsevier Applied Pubs.)中报告了嗜热性真菌I CBS 814.70能够在45℃对淀粉产生相对热稳定的淀粉分解酶。利用在45℃共培养真菌Talaromyces emersonii CBS 814.70和马克斯克鲁维酵母(Kluyoveromyces marxiamus)IMB3将淀粉直接生物转化为乙醇由Ward等(Applied Microbiology and Biotechnology(应用微生物学和生物技术)43，第408-411页)证明，其中40小时内报告最大乙醇浓度为1.5％，这代表70％的理论产率。
通过利用马克斯克鲁维酵母IMB3以提高的温度和醇浓度进行的乙醇制备由Singh等World Journal Microbiology(世界微生物学杂志)14，823-834(1998)综述，其中他们报告了含有淀粉的培养基(4％w/v)的混合培养发酵能够在45℃在65小时内产生12gl-1。
在现有技术的方法中，在正常发酵温度下(45℃)处理淀粉很困难，这归因于淀粉的高粘度和凝胶形成倾向。在淀粉糖化和发酵前液化淀粉是必要的。将淀粉转化为乙醇总共所需的时间长于40小时。最重要的是，关于由淀粉制备乙醇的现有技术是通过使用两种在两个在不同条件操作的不同步骤中使用的微生物进行的。常规方法为了在95℃液化淀粉浆需要热和搅拌能量的高输入；需要将所述浆冷却到40-60℃从而由葡糖淀粉酶在pH 6.5进行糖化。需要另外冷却到30℃，从而由酵母酿酒酵母发酵。
因此，需要可以优选在较高温度例如高于40℃下，同时液化和糖化的新型酶，由此可以以较快的速度进行水解。获自淀粉水解的单糖的进一步发酵可以通过使用嗜热性产乙醇物以较快的速度进行。
发明目的
本发明的主要目的是提供使用嗜热性微生物以高于45℃的温度由淀粉制备乙醇的方法。
本发明的另一个目的是提供α淀粉酶和葡糖淀粉酶的热稳定性组合物，所述组合物能够在高于45℃同时液化和糖化淀粉。
本发明的另一个目的是提供嗜热性产乙醇物(ethanologen)，其能够在高于45℃将由淀粉酶水解产生的糖发酵为乙醇。
发明概述
因此，本发明提供使用嗜热性微生物由淀粉制备乙醇的方法，且所述方法包括下列步骤：
(a)培养、收获和保存选自地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)IIPTN(MTCC5319)和产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)的嗜热性微生物，
(b)在40-80℃的温度，pH 5-7.0范围内，由细菌地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)的胞外酶对淀粉进行同时的液化和糖化，从而获得淀粉水解产物，
(c)在40-100℃范围内的温度，pH 4.5-5.5范围内，通过嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)使步骤(b)中获得的上述淀粉水解产物发酵为乙醇，随后通过常规蒸馏回收乙醇，
或
(d)在40-60℃的温度，pH 4.5-5.5范围内，通过共培养嗜热性地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)和克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)对所述淀粉同时进行液化、糖化和发酵，随后通过已知方法回收乙醇。
在本发明的实施方案中，所用的淀粉选自由木薯、马铃薯、甘薯、大米、小麦、玉米及其混合物组成的组。
在另一个实施方案中，在pH 5.0-7.0的范围内和温度45-70℃的范围内，在培养基M1中培养在步骤(a)中获得的嗜热性细菌地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)，所述培养基M1包含：0.5-1g磷酸氢二钠/升；0.1-0.5g氯化镁/升；20ml含有2-5ppm的钙，锌，铁，锰，铜，镍，钼的痕量金属溶液/升M1培养基；6-12g Bacto胰蛋白胨(trypton)/升；2-4g酵母提取物/升和每升蒸馏水中5-10g溶解的淀粉。
在另一个实施方案中，在pH 4-6的范围内和温度40-60℃的范围内，在培养基M2中在生物反应器中培养在步骤(a)中获得的嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)，所述培养基M2包含：1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升和10-20g葡萄糖/升蒸馏水。
在另一个实施方案中，通过以8000-18000rpm离心10-30分钟收获步骤(a)中获得的嗜热性微生物的细胞，并分开地或作为共培养物一起保存在-70至-90℃。
在另一个实施方案中，步骤(b)中淀粉的液化和糖化通过在培养基M1中，使用嗜热性微生物地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)(基因文库登记号(Gene Bank accession No.)DQ 323407)进行。
在另一个实施方案中，淀粉水解产物的发酵利用嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)在包含1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升淀粉水解产物的培养基中进行。
在另一个实施方案中，淀粉水解产物的发酵以优选45-60℃范围内的温度进行。
在另一个实施方案中，步骤(d)中使用的嗜热性地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)和克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)在包含1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升，0.5-1g柠檬酸/升；20ml含有2-5ppm钙，锌，铁，锰，铜，镍，钼的痕量金属溶液/升和2-5g Bacto胰蛋白胨/升和蒸馏水中1-5％的淀粉的培养基中共培养。
在另一个实施方案中，该方法以使用液相中的微生物的分批模式或以使用固定化微生物的连续模式，在40-60℃的温度范围内进行。
在另一个实施方案中，将微生物地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)和克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)固定在多相支持物上，所述多相支持物选自由纤维素纤维、丝纤维、藻酸钙凝胶、金属氧化物或硅酸盐和合成聚合物及其组合组成的组。
在另一个实施方案中，用于固定微生物地芽孢杆菌IIPTN(MTCC5319)和克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)的多相支持物优选是纤维素纤维。
发明详述
在本发明的方法中，液化和糖化选自木薯淀粉、马铃薯、甘薯、大米、小麦或玉米或其混合物的淀粉和发酵由此产生的水解产物是分别或在单一步骤中同时进行的。该反应可以以使用液相中的微生物的分批模式或以使用固定化微生物的连续模式进行。
在本发明的一种特征中，嗜热性细菌地芽孢杆菌IIPTN在由0.5-1g磷酸氢二钠/升；0.1-0.5g氯化镁/升；20ml含有2-5ppm钙，锌，铁，锰，铜，镍，钼的痕量金属溶液/升M1培养基；6-12g Bacto胰蛋白胨/升；2-4g酵母提取物/升和5-10g溶解于每升蒸馏水中的淀粉组成的培养基M1中培养。该培养基的pH调节到5.0-7.0的范围内，且细胞培养过程中温度维持在45-70℃的范围内。
在本发明的另一种特征中，嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453在通过溶解1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升和10-20g葡萄糖/升蒸馏水而制备的培养基M2中在生物反应器中培养。该培养基的pH调节到4-6的范围内，且在40-60℃的温度范围内并以300-400rpm搅拌，通气0.5-1μm。
嗜热性微生物的收获通过以800-18000rpm离心10-30分钟进行，并分开地或作为共培养物保存在-70至-90℃。
在本发明中，液化和糖化淀粉是利用嗜热性微生物地芽孢杆菌IIPTN(基因文库登记号DQ 323407)，在培养基M1中，以40-100℃，优选40-80℃，pH 5-7范围内和以100-200rpm搅拌进行的。淀粉水解产物的发酵是利用嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453，在通过溶解1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升淀粉水解产物而制备的培养基中进行的。淀粉水解产物的发酵以40-100℃，优选高于45℃，在pH 4.5-5.5范围内进行。
在本发明中，备选地，液化、糖化淀粉产生淀粉水解产物及其发酵是在单一步骤中以40-60℃范围内的温度和4.5-5.5范围内的pH进行的。在该情形中，嗜热性地芽孢杆菌IIPTN和克鲁维酵母菌IIP E453在通过溶解1-4g硫酸铵/升；0.1-0.3g磷酸氢二钠/升；0.1-0.3g磷酸氢钾/升；0.5-2.0g酵母提取物/升，0.5-1g柠檬酸/升；20ml含有2-5ppm钙，锌，铁，锰，铜，镍，钼的痕量金属溶液/升和2-5g Bacto胰蛋白胨/升和1-5％的淀粉在蒸馏水中制备的培养基中作为共培养物使用。
在连续模式操作中，该方法是在40-60℃使用固定化微生物进行的。将微生物地芽孢杆菌IIPTN和克鲁维酵母菌IIP E453固定在多相(heterogeneous)支持物上，所述多相支持物选自由纤维素纤维、丝纤维、藻酸钙凝胶、金属氧化物或硅酸盐和合成聚合物及其组合组成的组，优选是纤维素纤维。产生的乙醇通过常规蒸馏回收。
在该研究中，发现在使用固定化微生物的连续模式中，液化、糖化和发酵的总体速度比液相中分批模式中的速度快3倍以上。
由前述显然地，本发明提供利用采用分批或连续模式的嗜热性微生物，在40-60℃范围内的较高温度下由淀粉制备乙醇以获得较高反应速度和通量的方法。
嗜热性菌株克鲁维酵母(Kluyoveromyces)IIP E453(MTCC 5314)生长
特性数据表。保藏日期：2006年10月27日
1.微生物：酵母
2.名称：克鲁维酵母菌(Kluyoveromyces sp.)IIP E453(MTCC 5314)
3.形态学：细胞>大椭圆形，发芽，革兰氏+ve
菌落>小、圆、半球形表面、乳白色。
4.生长温度：37℃-50℃
5.生长周期：30小时，停滞期：～4小时
6.pH：4.0-6.5
7.葡萄糖上的特定生长速度：0.55h-1
8.葡萄糖上的产率：0.22
9.木糖上的产率：0.24
10.碳水化合物利用：a)葡萄糖
b)木糖
c)蔗糖
d)麦芽糖
e)半乳糖
f)纤维二糖
发酵特性
1.温度：45℃-50℃
2.pH：3.0-6.5
3.糖底物：a)葡萄糖
b)麦芽糖
c)蔗糖
d)半乳糖
碳水化合物：a)淀粉
4.发酵方法模式：a)分批50h
b)连续的固定化生物反应器，100h
c)分批给料60h
5.发酵体积：具有温度、pH、DO、搅拌控制装置的2.0l&5.0l发酵罐(NBS型)。废气(CO2，O2，H2)分析器。
6.乙醇的产率，g/g：葡萄糖46％(～90％理论产率)
7.产率，g.l-1.h-1：14g.l-1.h-1(连续的)
8.乙醇耐受性：5％
嗜热性菌株地芽孢杆菌IIPTN(MTCC 5319)生长特性数据表，保藏日 期：2007年1月24日
1.微生物：细菌
2.名称：地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)IIPTN(MTCC 5319)
3.基因文库登记号：DQ 323407
4.形态学：细胞>杆菌，革兰氏+ve
菌落>不规则，平表面，乳白色。
5.生长温度：50℃-80℃
6.生长周期：24小时，停滞期：～4小时
7.pH：5.5-7.0
8.葡萄糖上的特定生长速度：0.55h-1
9.葡萄糖上的产率：0.42
10.碳水化合物利用：
A)淀粉1)马铃薯可溶物，2)木薯根，
3)加工过的木薯淀粉，4)小麦粉，5)玉米粉
B)葡萄糖
C)纤维素：CMC，微晶
D)麦芽糖
E)半乳糖
F)纤维二糖
淀粉水解
1.温度：60℃-100℃
2.pH：4.0-9.0
3.产生的酶：a)葡糖淀粉酶
b)α-淀粉酶
c)β葡糖苷酶
以下实施例通过举例说明的方式给出，并且因此不应该被解释为限制本发明的范围。
实施例-1
地芽孢杆菌IIPTN的培养物在一升容量的分批式生物反应器中培养，其中装有500ml称为M1的生长培养基，所述M1由1g磷酸氢二钠；3g氯化铵；1g氯化钾；1g硫酸钠；1g柠檬酸；1g氯化镁；0.1mg痕量元素(锌，铜，铁，钴)；1g胰蛋白胨和10g葡萄糖/升构成。细胞培养在50℃，pH 6，以300rpm搅拌并以0.5vvm通气进行25小时。细菌细胞通过在8000rpm离心15分钟回收并保存在-80℃以便进一步使用。
实施例-2
在2升容量的生物反应器中培养克鲁维酵母菌IIP E453(MTCC 5314)，其中装有500ml称为M2的生长培养基，所述M2由0.1g正磷酸氢二钠；0.2g正磷酸二氢钠；2g硫酸铵；1.5g酵母提取物；20g葡萄糖/升构成，pH4.5。酵母细胞以40℃，以0.5vvm通气和以400rpm搅拌培养26小时。当干细胞重量浓度达到8.0g/l时，通过在6000rpm离心10分钟回收酵母细胞，并保存在-80℃以便进一步使用。
实施例-3淀粉的同时液化和糖化
淀粉的水解在一升的烧瓶中完成，在50℃，pH 7，150rpm进行5小时，所述烧瓶中装有300ml M1培养基，但是将葡萄糖替换为10g/l淀粉并加入5g/l的地芽孢杆菌IIPTM细胞。胞外热稳定液化酶，α-淀粉酶和糖化酶，葡糖淀粉酶，由该细菌细胞产生并且该酶同时将淀粉水解为可发酵的糖，葡萄糖。水解溶液以6000rpm离心15分钟。
实施例-4：淀粉水解产物的发酵
用50ml处于M2培养基中的酵母细胞混悬液(5g/l)进行淀粉水解产物(200ml)的发酵，所述M2培养基具有40g/l的葡萄糖当量，处于500ml加套的玻璃容器中，所述加套的玻璃容器连续安装有冷凝器和气体洗涤器。60℃的热水通过连接所述容器和恒温循环水浴流经所述套进行循环。冷凝器与另一个维持在10℃的循环水浴相连。通过经由加套的容器冲氮气，将培养的厌氧条件在发酵过程初期维持。磁力搅拌器在容器中提供搅拌。发酵培养基中的乙醇浓度在48小时的发酵期间内通过标准方法测量。在40小时内获得发酵培养基中的最大乙醇浓度为1.8％。基于淀粉水解流中存在的还原糖，乙醇以90％的理论产率产生。乙醇(纯度95％)通过蒸馏由发酵的培养液中回收。
实施例-5：淀粉的同时液化、糖化和发酵
淀粉同时液化、糖化和发酵为乙醇是通过在培养基M1中，在pH 5.5和温度50℃下，共培养地芽孢杆菌IIPTM(5g/l)和克鲁维酵母菌IIP E453(5g/l)进行的，所述培养基M1不包括葡萄糖，而包含40g/l淀粉。该过程在具有连续的冷凝器和气体洗涤器的加套容器中进行48小时，并且以与实施例4中所述的相同方式维持加套容器和冷凝器的温度。发酵的培养液中的乙醇浓度通过标准方法以6小时的时间间隔测量48小时。将加套容器置于磁力搅拌器上，以便在容器中提供搅拌。
乙醇的总产率是在30小时内获得加入到培养基中的淀粉的80％(W/V)，具有的乙醇浓度为1.8％。乙醇(95％)的纯度通过蒸馏获得。
实施例-6
水解的淀粉的发酵如实施例-4中所述进行，只是温度增高至55℃，并且与如实施例-4中所述在40小时内获得1.8％的乙醇浓度相比，在30小时内获得1.8％的乙醇浓度。
实施例-7
水解的淀粉的发酵如实施例-4中所述进行，只是温度增高至45℃，并且与如实施例-6中所述在30小时内获得1.8％的乙醇浓度相比，在46小时内获得1.8％的乙醇浓度。
实施例-8
淀粉的同时液化、糖化和发酵如实施例-5中所述进行，只是在60℃进行，且与如实施例-5中所述在30小时内获得1.8％的乙醇浓度相比，在22小时内获得1.8％的乙醇浓度。
实施例-9
使用固体支持物诸如天然纤维素或丝物质、合成纤维或金属氧化物或水合硅酸铝上固定化的酵母细胞进行上清液(200ml)的发酵，所述固体支持物以70ml装在具有长度80cm和内直径1cm的加套玻璃柱中，所述加套玻璃柱连续安装有冷凝器和气体洗涤器。60℃的热水通过连接所述柱和恒温循环水浴流经所述套进行循环。冷凝器与另一个维持在10℃的循环水浴相连。经由所述柱以30ml/小时抽吸含有可发酵的糖的上清液，并将排出流收集在容器中。发酵的培养液中的乙醇浓度在48小时发酵期间内通过标准方法测量。发酵培养基中的最大乙醇浓度2％在特定操作条件下在8小时内获得。基于淀粉水解流中存在的还原糖，乙醇以93％的理论产率产生。乙醇(纯度95％)通过蒸馏从发酵的培养液中回收。与以实施例-4中提供的分批发酵方法获得的1.0g-1.l-1相比，获得的乙醇产率是13g-1.l-1。
本发明的优势
a)本方法具有以通过使用嗜热性微生物实现液化、糖化和发酵从而将淀粉生物量转化为乙醇的温度操作的优势。
b)如迄今已知的方法相比，本方法将节约显著量的用于生物乙醇生产的能量输入。
c)本方法没有在迄今已知的方法中可能发生的被有害细菌污染的风险。
d)乙醇生产成本更低。
e)来自淀粉生物量的乙醇总产率将高于已知的方法。
Claims (12)
1.一种使用嗜热性微生物由淀粉制备乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)培养、收获和保存选自地芽孢杆菌(Geobacillus sp.)IIPTN MTCC5319和产乙醇克鲁维酵母菌(Kluyoveromyces sp.)IIP E453MTCC 5314的嗜热性微生物，
(b)在40-80℃的温度下，在5-7.0范围内的pH下，通过细菌地芽孢杆菌IIPTN MTCC 5319的胞外酶将淀粉进行同时的液化和糖化，从而获得淀粉水解产物，
(c)在40-60℃范围内的温度下，在4.5-5.5范围内的pH下，通过嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314使步骤(b)中获得的上述淀粉水解产物发酵为乙醇，随后通过常规蒸馏回收乙醇，
或
(d)在40-60℃的温度下和在4.5-5.5的pH下，通过共培养嗜热性、地芽孢杆菌IIPTN MTCC 5319和克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314将所述淀粉同时进行液化、糖化和发酵，随后通过已知方法回收乙醇。
2.按照权利要求1的方法，其中所用的淀粉选自由木薯、马铃薯、甘薯、大米、小麦、玉米及其混合物组成的组。
3.按照权利要求1的方法，其中在5.0-7.0的范围内的pH下和在45-70℃的范围内的温度下，在培养基M1中培养在步骤(a)中获得的嗜热性细菌地芽孢杆菌IIPTN MTCC 5319，所述培养基M1包含：0.5-1g/升的磷酸氢二钠；0.1-0.5g/升的氯化镁；20ml含有2-5ppm的钙，锌，铁，锰，铜，镍，钼的痕量金属溶液/升M1培养基；6-12g/升的Bacto胰蛋白胨；2-4妙升的酵母提取物和每升蒸馏水中5-10g溶解的淀粉。
4.按照权利要求1的方法，其中在4-6的范围内的pH下和在40-60℃的范围内的温度下，在生物反应器中在培养基M2中培养在步骤(a)中获得的嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314，所述培养基M2包含：1-4g/升的硫酸铵；0.1-0.3g/升的磷酸氢二钠；0.1-0.3g/升的磷酸氢钾；0.5-2.0妙升的酵母提取物和10-20g葡萄糖/升蒸馏水。
5.按照权利要求1的方法，其中通过以8000-18000rpm离心10-30分钟收获步骤(a)中获得的嗜热性微生物的细胞，并分开地或作为共培养物一起保存在-70℃至-90℃。
6.按照权利要求1的方法，其中步骤(b)中淀粉的液化和糖化是通过在培养基M1中，使用嗜热性微生物地芽孢杆菌IIPTN MTCC 5319基因文库登记号DQ 323407进行。
7.按照权利要求1的方法，其中所述淀粉水解产物的发酵是利用嗜热性产乙醇克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314在包含1-4g/升的硫酸铵；0.1-0.3g/升的磷酸氢二钠；0.1-0.3g/升的磷酸氢钾；0.5-2.0g酵母提取物/升淀粉水解产物的培养基中进行。
8.按照权利要求1的方法，其中所述淀粉水解产物的发酵优选在45-60℃范围内的温度下进行。
9.按照权利要求1的方法，其中步骤(d)中使用的嗜热性地芽孢杆菌IIPTN MTCC 5319和克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314在包含1-4g/升的硫酸铵；0.1-0.3g/升的磷酸氢二钠；0.1-0.3g/升的磷酸氢钾；0.5-2.0g/升的酵母提取物，0.5-1g/升的柠檬酸；20ml/升的含有2-5ppm的钙、锌、铁、锰、铜、镍、钼的痕量金属溶液和2-5g/升的Bacto胰蛋白胨和蒸馏水中1-5％的淀粉的培养基中共培养。
10.按照权利要求1的方法，所述方法是以使用液相中的微生物的分批模式或以使用固定化微生物的连续模式，在40-60℃范围内的温度下进行。
11.按照权利要求10的方法，其中将所述微生物地芽孢杆菌IIPTNMTCC 5319和克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314固定在多相支持物上，所述多相支持物选自由纤维素纤维、丝纤维、藻酸钙凝胶、金属氧化物或硅酸盐和合成聚合物及其组合组成的组。
12.按照权利要求11的方法，其中用于固定微生物地芽孢杆菌IIPTNMTCC 5319和克鲁维酵母菌IIP E453MTCC 5314的多相支持物是纤维素纤维。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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