CN102080050B - 产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的绿色木霉W2及其应用 - Google Patents
产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的绿色木霉W2及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的绿色木霉W2及其应用。该菌于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为：CGMCC No.4098。该菌能产生一种新的β-葡萄糖苷酶，该酶的酶活高达346.7U/mL，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，适合于高温水解，葡萄糖反馈抑制作用明显；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高1.6倍，乙醇耐受能力高达30％，能有效消除纤维二糖抑制，使乙醇产量提高将近3倍，有效消除终端产物抑制。因此该β-葡萄糖苷酶能用于木质纤维素原料同步糖化发酵当中，并且其促进效果为国内少见，有效增加纤维素乙醇产量，降低生产成本，加快纤维素乙醇的产业化进程。
Description
技术领域：
本发明属于纤维素乙醇的糖化发酵领域，具体涉及到一种产嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶的绿色木霉(Trichoderma viride)W2及所产的β-葡萄糖苷酶，以及该β-葡萄糖苷酶在同步糖化发酵上的应用。
背景技术：
开发行之有效的纤维素乙醇转化技术途径，对于加快纤维素乙醇的产业化进程，增加液体燃料供给多样性，确保我国能源安全、粮食安全等具有积极的意义。在纤维素乙醇转化过程中，酶水解是一个关键性的环节。纤维素的有效水解依赖于葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶3种酶组分的协同作用。在纤维素的糖化过程中，β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维素寡糖水解成葡萄糖，是纤维素水解糖化过程中的一个限速步骤。但目前使用的大部分产纤维素酶菌株中的β-葡萄糖苷酶含量或活力都或多或少的存在含量低和活力低的缺陷。虽然β-葡萄糖苷酶广泛存在于许多植物、昆虫、酵母、曲霉、木霉及细菌中，但通常含量都很低，不易大规模制备生产。同时，目前β-葡萄糖苷酶酶活力低下，温度稳定性不高也是限制其在工业上广泛应用的重要因素。
目前纤维素乙醇生产工艺存在分步糖化发酵和同步糖化发酵(SSF)两种工艺，同步糖化发酵的酶水解与发酵过程同时进行，水解产生的葡萄糖和低聚糖等可被酵母及时地转化为乙醇，减轻葡萄糖、纤维二糖等对纤维素酶活力的抑制。但是目前的纤维素酶对乙醇的耐受性都不高，使SSF的应用受到了很大局限性。
发明内容：
本发明的第一个目的是提供一种高产嗜温、耐乙醇的β-葡萄糖苷酶的绿色木霉(Trichoderma viride)W2，该菌于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4098。
本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2是从武夷山的枯枝烂叶、土壤、真菌子实体等材料中分离出来的。该菌菌丝呈白色，菌落小而致密，呈棉絮状，生长缓慢。PDA培养基培养3天后开始长白色菌丝，培养3天以上开始长绿色青霉。
本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2的分类学地位的确定。
常规方法提取绿色木霉(Trichoderma viride)W2的18s rDNA，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列已提交到GenBank，其序列登记号为HM061164，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建系统发育树，如图5所示。经比较分析，本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2属于绿色木霉种，将其命名为绿色木霉(Trichoderma viride)W2，该菌于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4098。
根据β-葡萄糖苷酶特异性底物4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside(pNPG)的测定反应，发现本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2能高产一种的β-葡萄糖苷酶，该酶的酶活高达346.7U/mL(在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位)，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，葡萄糖反馈抑制作用明显；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高1.6倍，乙醇耐受能力高达30％。目前已经报道的β-葡萄糖苷酶，其最适反应温度一般在40～65℃，在低浓度乙醇时会对β-葡萄糖苷酶酶活有促进作用，但随着乙醇浓度的增加，就会对β-葡萄糖苷酶的酶活产生抑制作用。因此本发明的绿色木霉(Trichodermaviride)W2产的β-葡萄糖苷酶与现有技术中的β-葡萄糖苷酶具有区别的，是一种新的β-葡萄糖苷酶。
因此本发明的第二个目的提供了一种以绿色木霉(Trichoderma viride)W2为发酵菌株，经液体发酵而制得的β-葡萄糖苷酶。
本发明的第三个目的是提供本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2在生产β-葡萄糖苷酶上的应用。
将本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2生产的β-葡萄糖苷酶应用在SSF上生产乙醇。首先对生物质原料预处理水解，然后同时加入β-葡萄糖苷酶酶液和酵母进行发酵，能有效消除纤维二糖抑制，使乙醇产量提高将近3倍。
本发明的第四个目的是提供本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2生产的β-葡萄糖苷酶在木质纤维素原料同步糖化发酵上的应用。
本发明筛选的绿色木霉(Trichoderma viride)W2，该菌能产生一种新的β-葡萄糖苷酶，该酶的酶活高达346.7U/mL(在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位)，最适反应pH值为4.8，最适反应温度为70℃，适合于高温水解，葡萄糖反馈抑制作用明显；乙醇浓度为10％对酶活有最大促进作用，对β-葡萄糖苷酶酶活提高1.6倍，乙醇耐受能力高达30％，并在水解生物质原料时，能有效消除纤维二糖抑制，使乙醇产量提高将近3倍，有效消除终端产物抑制。因此该β-葡萄糖苷酶能用于木质纤维素原料同步糖化发酵当中，并且其促进效果为国内少见，解决当前纤维素糖化发酵产乙醇技术的技术瓶颈问题，有效增加纤维素乙醇产量，降低生产成本，加快纤维素乙醇的产业化进程。
本发明的绿色木霉(Trichoderma viride)W2于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4098。
附图说明：
图1是pH值对本发明的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图2是温度对本发明的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图3是本发明的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶对乙醇的耐受性；
图4是添加本发明的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶对同步糖化发酵效果的影响；
图5是应用本发明的绿色木霉W2的18S rDNA构建的系统发育树。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
一、菌株筛选。
在武夷山上取样枯枝烂叶、土壤、真菌子实体等材料。在250mL三角锥形瓶中装100mL蒸馏水，添加数十颗玻璃珠，121℃高压灭菌；将样品加进三角锥形瓶，溶解、震荡1h。将得到的溶解菌液稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的浓度剃度，分别涂布至刚果红初筛培养基，该培养基的配方是：每升培养基中含有KH2PO40.5g，(NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O 0.25g，纤维素粉(微晶纤维)2.0g，刚果红0.2g，琼脂18～20g，余量为水，pH值7.0。30℃培养2d，挑取水解透明圈较大的单菌落在PDA培养基上纯化，纯化的菌株进行PDA斜面保存。
菌株产β-葡萄糖苷酶活力复筛：将上面PDA斜面保存的纯化的菌株分别接种到等量的复筛发酵培养基中，30℃，120rpm，培养48h。冷冻离心取上清液，即为粗酶液，分别用标准pNPG法测定各菌株产的粗酶液的β-葡萄糖苷酶活力。具体方法为：用移液枪吸取0.1ml适度稀释的粗酶液，加入0.9ml pH5.0的0.2mol/LNa2HPO4-0.1m01/L柠檬酸缓冲液，于50℃恒温水浴5min，再迅速加入已预热5～10min的1ml 5mmol/L的pNPG溶液，用秒表精确计时反应10min，立即加入3ml 1mmol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值(OD)。然后选择β-葡萄糖苷酶活力较高的菌株使用PDA斜面保存。所述的复筛发酵培养基为每升培养基含有KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl20.3g，稻秆50g，余量为水。
经筛选获得一株β-葡萄糖苷酶活力最高的菌株。采用改良CTAB法提取菌株总DNA，选择扩增真菌18S rDNA ITS序列的通用引物ITS5(5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3’)和ITS4(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’)对绿色木霉(Trichoderma viride)W2总DNA进行rDNA ITS序列的扩增。在20μL的PCR反应体系中含有10×Buffer 2μL(含MgCl2，2.5mmol/L)，dNTP(10mmol/L)0.4μL，引物量为10pmol，rTag(5U/μL)0.2μL，约50ng的模板DNA，其余体积以无菌超纯水补足。PCR扩增条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，52℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环，72℃延伸10min。PCR扩增产物采用DNA凝胶回收试剂盒进行割胶回收。纯化产物连接到pMD18-T-Vecter，连接产物转化到Escherichiacoli JM109感受态细胞，进行氨卡青霉素选择和蓝白斑的筛选。挑取单克隆菌液进行测序。经测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，该序列已提交到GenBank，其序列登记号为HM061164，将该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的18S rDNA序列，构建系统发育树，如图5所示。经比较分析，该菌属于绿色木霉种，将其命名为绿色木霉(Trichoderma viride)W2，该菌于2010年08月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC No.4098。
二、β-葡萄糖苷酶制剂的制备及其酶活力、酶学性质测定。
1、β-葡萄糖苷酶制剂的制备：将绿色木霉W2活化，经种子培养，种子培养基为每升培养基含有羧甲基纤维素钠CMC 10g，蛋白胨3g，(NH4)2SO4 2g，KH2PO4 4g，CaCl2 0.3g，NH4NO3 1g，余量为水。30℃，120rpm，培养3天，获得种子培养液。将种子培养液以5％的接种量接种到发酵培养基中，该发酵培养基的配方为每升培养基含有KH2PO42g，(NH4)2SO42.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，CaCl2 0.3g，稻秆50g，余量为水。30℃，120rpm，发酵5d，然后取发酵液，8000rpm 4℃冷冻离心5min，取上清即为β-葡萄糖苷酶制剂，4℃保存备用。
2、β-葡萄糖苷酶的酶活力测定：用4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside(pNPG)作为底物，反应体系为2ml，先将1ml pNPG(5mmol/l)和0.9ml pH 5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液混匀，再加入0.1ml适当稀释的上一步骤得到的β-葡萄糖苷酶制剂，50℃反应10min，立即加入3ml1mmol/L的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5min，于400nm处测光吸收值(OD)。经测定，经步骤1得到的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶制剂的活力达到346.7U/mL，具有较高的酶活力。
酶活定义：在1min内催化产生1μmol/L对硝基酚的量定义为一个酶单位。
3、β-葡萄糖苷酶的酶学性质：
测定方法：β-葡萄糖苷酶制剂，按pNPG测定方法，其余条件不变情况下，调节不同pH缓冲液、不同温度进行酶活测定反应，以测得最高酶活为100％，该条件为测得β-葡萄糖苷酶最适反应条件。
结果表明，本发明的绿色木霉W2产的β-葡萄糖苷酶的最佳反应pH为4.8(图1)，最适反应温度为70℃(图2)；耐乙醇浓度高达30％，其中乙醇浓度为10％更有酶活力促进效果(图3)。由此表明，绿色木霉(Trichoderma viride)W2产的β-葡萄糖苷酶具有较强的耐乙醇、嗜温性能，尤其适合应用于纤维素同步糖化发酵中。
三、β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵。
(1)底物：气爆秸杆粉碎至60目，105℃烘干至恒重。
(2)酵母菌用YPD液体培养基30℃培养24h活化。
(3)向反应体系加入纤维素酶30FPU/g底物酶量，50℃预水解24h。
(4)再加入β-葡萄糖苷酶制剂15FPU/g底物进反应体系，按5％的接种量接种酵母至反应体系中，37℃发酵，以接种酵母时算为0h，于0，4，8，12，24，48，96，120h取样，HPLC检测乙醇、还原糖含量。
所述的反应体系为：500ml摇瓶装反应液200ml，该反应液中含有气爆秸秆20g、无机盐成分：(NH4)2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.025g/L，酵母膏1.0g/L，余量为pH 4.8Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
以不加本发明的β-葡萄糖苷酶制剂作为阴性对照，以添加商业生产β-葡萄糖苷酶(购自sigma公司)作为阳性对照，研究绿色木霉W2菌株所产β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵的效果。
结果如图4所示，筛选所得绿色木霉W2菌株产β-葡萄糖苷酶应用于同步糖化发酵中，发酵至96h得乙醇最高产量，所产乙醇含量高达46.561g/L，与阴性、阳性对照相比，乙醇产量提高近3倍。由此可见本发明的绿色木霉W2菌株所产的β-葡萄糖苷酶性质均有利于纤维素同步糖化发酵技术的应用，有效消除终端产物抑制，并且该菌株所产的β-葡萄糖苷酶酶活力高，应用于同步糖化发酵技术中的促进效果为国内少见，因此对于纤维素生产乙醇技术具有很大应用前景。
上述详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (4)
1.绿色木霉(Trichoderma viride)W2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.4098。
2.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，以权利要求1所述的绿色木霉W2为发酵菌株，经液体发酵而制得。
3.权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶在木质纤维素原料同步糖化发酵上的应用。
4.权利要求1所述的绿色木霉W2在生产β-葡萄糖苷酶上的应用。
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